PL201768B1 - Produkt multienzymatyczny, sposób wytwarzania produktu multienzymatycznego, oraz zastosowania produktu multienzymatycznego - Google Patents

Produkt multienzymatyczny, sposób wytwarzania produktu multienzymatycznego, oraz zastosowania produktu multienzymatycznego

Info

Publication number
PL201768B1
PL201768B1 PL350672A PL35067200A PL201768B1 PL 201768 B1 PL201768 B1 PL 201768B1 PL 350672 A PL350672 A PL 350672A PL 35067200 A PL35067200 A PL 35067200A PL 201768 B1 PL201768 B1 PL 201768B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
per gram
atcc
bran
glucoamylase
activity
Prior art date
Application number
PL350672A
Other languages
English (en)
Other versions
PL350672A1 (en
Inventor
Pierre Jean Labeille
Jean-Luc Alain Guy Baret
Francis Lucien Duchiron
Original Assignee
Gie Agro Ind
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=9541183&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=PL201768(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Gie Agro Ind filed Critical Gie Agro Ind
Publication of PL350672A1 publication Critical patent/PL350672A1/xx
Publication of PL201768B1 publication Critical patent/PL201768B1/pl

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2405—Glucanases
    • C12N9/2408—Glucanases acting on alpha -1,4-glucosidic bonds
    • C12N9/2411—Amylases
    • C12N9/2428—Glucan 1,4-alpha-glucosidase (3.2.1.3), i.e. glucoamylase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2477—Hemicellulases not provided in a preceding group
    • C12N9/248—Xylanases
    • C12N9/2482—Endo-1,4-beta-xylanase (3.2.1.8)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/58—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from fungi
    • C12N9/62—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from fungi from Aspergillus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01003—Glucan 1,4-alpha-glucosidase (3.2.1.3), i.e. glucoamylase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01008—Endo-1,4-beta-xylanase (3.2.1.8)
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02E—REDUCTION OF GREENHOUSE GAS [GHG] EMISSIONS, RELATED TO ENERGY GENERATION, TRANSMISSION OR DISTRIBUTION
    • Y02E50/00—Technologies for the production of fuel of non-fossil origin
    • Y02E50/10—Biofuels, e.g. bio-diesel

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Fodder In General (AREA)
  • Cereal-Derived Products (AREA)

Abstract

Wynalazek dotyczy produktu multienzymatycznego, posiadaj acego aktywno sc glukoamylazy, proteolityczn a i ksylanazy, charakteryzuj acego si e tym, ze stanowi otr eby pszenne fermentowane szczepem Aspergillus niger wybranym spo sród szczepów ATCC 201202, ATCC 76060, ATCC 76061, MUCL 28815, MUCL 28816 oraz NRRL 3112, w którym wspomniane aktywno sci glukoamylazy, pro- teolityczna i ksylanazy sa obecne w nast epuj acych warto sciach minimalnych: - glukoamylazy: co naj- mniej 100 UG na gram suchej substancji, - proteolityczna: co najmniej 100 UP na gram suchej sub- stancji, ksylanazy: co najmniej 100 UX na gram suchej substancji, z ograniczeniem ze aktywno sc glukoamylazy wynosi co najmniej 750 UG na gram suchej substancji i/lub aktywno sc ksylanazy wynosi co najmniej 300 UX na gram suchej substancji. Produkt jest u zyteczny do wytwarzania etanolu lub paszy dla zwierz at jedno zo ladkowych. PL PL PL PL PL

Description

Opis wynalazku
Przedmiotem niniejszego wynalazku jest produkt multienzymatyczny o aktywności glukoamylazy, proteolitycznej i ksylanazy, sposób wytwarzania tego produktu multienzymatycznego przez fermentację otrąb pszennych, oraz zastosowania tego produktu multienzymatycznego.
Znany jest sposób wytwarzania etanolu ze skrobi kukurydzianej w procesie enzymatycznym zawierającym etap upłynniania skrobi za pomocą alfa-amylazy hydrolizującej amidon do dekstryn, następnie etap scukrzania glukoamylazą (zwaną także amyloglukozydazą) hydrolizującą dekstryny do glukozy, i wreszcie etap fermentacji tej ostatniej do etanolu.
Stosowanie enzymów alfa-amylazy i glukoamylazy jest zwykle zadowalające jeśli wychodzi się z relatywnie czystego mleka skrobiowego otrzymanego przez mielenie kukurydzy na mokro, ale jeś li skrobię kukurydzianą zastąpi się skrobią pszenną lub mąką pszenną, to z samymi tylko tymi dwoma enzymami nie uzyskuje się zadawalających wyników z powodu obecności hemiceluloz, które zwiększają lepkość scukrzonego zacieru z mąki do wartości, która powoduje problemy z przeprowadzeniem procesu. Trzeba stosować w etapie scukrzania dodatkowe enzymy, takie jak celulazy i hemicelulazy w celu zmniejszenia lepkoś ci i usunię cia tego problemu. Ponadto, pożądane jest takż e stosowanie podczas scukrzania proteaz w celu zhydrolizowania białek pszenicy i wzbogacenia zacieru w rozpuszczalny azot potrzebny w ostatnim etapie fermentacji alkoholowej. Dodatek źródła azotu niezbędnego dla wzrostu drożdży, tradycyjnie dodawanego podczas tej fermentacji, może być również zmniejszony.
Wszystkie te enzymy są dostępne w handlu pojedynczo w formie oczyszczonej, ale ich niedogodnością jest to, że są relatywnie drogie, obciążając w konsekwencji koszt wytwarzania etanolu z pszenicy. Ponadto, potrzebne jest formuł owanie kompozycji z pojedynczych enzymów, co komplikuje proces.
Istnieje zatem zapotrzebowanie na tani produkt multienzymatyczny, łączący aktywności glukoamylazy, proteolityczną i hemicelulazy, do wytwarzania etanolu z mąki pszennej przy zmniejszonym koszcie.
Wynalazek niniejszy zaspokaja tę potrzebę.
Przedmiotem wynalazku jest produkt multienzymatyczny, posiadający aktywność glukoamylazy, proteolityczną i ksylanazy, który stanowi otręby pszenne fermentowane szczepem Aspergillus niger wybranym spośród szczepów ATCC 201202, ATCC 76060, ATCC 76061, MUCL 28815, MUCL 28816 oraz NRRL 3112, w którym wspomniane aktywności glukoamylazy, proteolityczna i ksylanazy są obecne w następujących wartościach minimalnych:
- glukoamylazy: co najmniej 100 UG na gram suchej substancji,
- proteolityczna: co najmniej 100 UP na gram suchej substancji,
- ksylanazy: co najmniej 100 UX na gram suchej substancji, z ograniczeniem, ż e aktywność glukoamylazy wynosi co najmniej 750 UG na gram suchej substancji i/lub aktywność ksylanazy wynosi co najmniej 300 UX na gram suchej substancji.
Aktywność glukoamylazy korzystnie wynosi co najmniej 750 UG na gram suchej substancji, korzystniej co najmniej 1500 UG na gram suchej substancji.
Aktywność ksylanazy korzystnie wynosi co najmniej 300 UX na gram suchej substancji, korzystniej co najmniej 400 UX na gram suchej substancji.
Szczep Aspergillus niger korzystnie wybrany jest spośród szczepów NRRL 3112 i ATCC 76061.
Jeszcze korzystniej szczep Aspergillus niger stanowi szczep ATCC 76061.
Przedmiotem wynalazku jest także sposób wytwarzania powyższego produktu multienzymatycznego, charakteryzujący się tym, że obejmuje następujące etapy:
(a) dostarczenia otrąb pszennych;
(b) zwilżenia i obróbki termicznej wspomnianych otrąb przez pasteryzację lub sterylizację;
(c) szczepienia uzyskanych otrąb pszennych szczepem Aspergillus niger wybranym spośród szczepów ATCC 201202, ATCC 76060, ATCC 76061, MUCL 28815, MUCL 28816 oraz NRRL 3112;
(d) fermentacji otrąb, mających formę warstwy o wysokości co najmniej 10 cm, w reaktorze napowietrzanym i mieszanym okresowo, przez okres 1 do 3 dni, w temperaturze 28-38°C, korzystnie 32 do 36°C, ustawiając początkową wilgotność wspomnianych otrąb na 50 do 60% i utrzymując zasadniczo taką wilgotność podczas fermentacji, w warunkach napowietrzania odpowiednich dla uniknięcia akumulacji dwutlenku węgla szkodliwego dla fermentacji w reaktorze i podwyższenia temperatury
PL 201 768 B1 z powodu fermentacji powyżej wskazanego zakresu, aż do uzyskania produktu fermentacji posiadającego następujące minimalne wartości aktywności enzymatycznych:
- glukoamylazy: co najmniej 100 UG na gram suchej substancji,
- proteolityczna: co najmniej 100 UP na gram suchej substancji,
- ksylanazy: co najmniej 100 UX na gram suchej substancji, z ograniczeniem, ż e aktywność glukoamylazy wynosi co najmniej 750 UG na gram suchej substancji i/lub aktywność ksylanazy wynosi co najmniej 300 UX na gram suchej substancji.
Korzystnie, w przypadku, kiedy potrzebna jest podwyższona aktywność glukoamylazy, stosuje się szczep Aspergillus niger wybrany spośród szczepów NRRL 3112 i ATCC 76061. Szczególnie korzystnie stosuje się szczep ATCC 76061.
W przypadku, kiedy potrzebna jest podwyż szona aktywność glukoamylazy, otrę by pszenne stosowane jako surowiec wyjściowy powinny być niepozbawione skrobi. Z wyjątkiem tego ograniczenia, można stosować dowolne otręby. Korzystnie stosuje się otręby o znacznym udziale cząstek o wielkości poniżej 1 mm (co najmniej 40% wagowych).
Poniżej podano dla nieograniczającego przykładu, charakterystyki dwóch odpowiednich rodzajów otrąb.
Cecha Otręby A Otręby B
Wilgotność (%) 12,3 19,5
Zawartość białka (% sm*); 13,8 14,8
Zawartość skrobi (% sm*); 24,6 21,3
Granulometria > 1,25 mm 53,9 0,7 między 1,0 a 1,25 mm 8,1 1,3 między 0,5 a 1,0 mm 33,3 68,2 między 0,25 a 0,5 mm 3,7 24,6 między 0,16 a 0,25 mm 0,3 2,6 < 0,16 mm 0,7 2,6 % sm = % w stosunku do substancji wilgotnej
Otręby pszenne powinny być zwilżone i poddane obróbce termicznej w celu pasteryzacji lub sterylizacji. Korzystne jest jeśli obróbki termicznej nie prowadzi się przed zwilżeniem, ponieważ w przypadku kiedy otręby poddaje się obróbce termicznej przed zwilżeniem, obserwuje się słabe wyniki fermentacji. Obróbka termiczna może polegać na ogrzewaniu na przykład w autoklawie. Obróbkę w autoklawie przez czas 20 minut w temperaturze 120-121°C uważa się za bardzo zadowalającą, ale odpowiednie są także warunki łagodniejsze (pasteryzacja w 105°C w ciągu 15 minut w suszarni). Możliwe jest także prowadzenie obróbki termicznej otrąb przez wstrzykiwanie do nich pary wodnej, co pozwala na jednoczesne przeprowadzenie zwilżania otrąb.
Korzystnie, można regulować pH podczas zwilżania w zakresie od 4 do 5,5 w celu poprawienia efektu pasteryzacyjnego obróbki termicznej i zapoczątkowania pożądanej fermentacji.
Poza funkcją sterylizacji, obróbka termiczna ma na celu sprzyjanie żelatynizacji skrobi zawartej w otrębach pszennych i przez to dostępności tego podłoża dla szczepów Aspergillus niger, co zwiększa efektywność fermentacji.
Zwilżanie otrąb jest ważne, ponieważ zawartość wody wpływa na sprawność fermentacji. Początkową zawartość wody w otrębach na początku ustawia się na 50-60%, korzystnie 50-55% łącznej masy otrąb i wody i utrzymuje się ją zasadniczo w tym przedziale podczas fermentacji, na przykład poprzez okresowe dostarczanie wody w celu skompensowania ubytków wody ze środowiska. Wyrażenie „utrzymuje zasadniczo” oznacza, że jest dopuszczalne, aby zawartość wilgoci przekraczała nieco podaną wartość (±5 jednostek %) z zakresu 50-60% przez relatywnie krótki okres czasu między dwoma kolejnymi wyrównaniami lub na końcu fermentacji. W każdym przypadku korzystne jest niedopuszczenie do spadku wilgotności otrąb poniżej 45%. Zawartość wody w środowisku kultury wykazuje w trakcie hodowli tendencję do zmniejszania z powodu odparowywania na skutek wzrostu temperatury, generowanego przez wzrost grzybów w środowisku, będącym słabym przewodnikiem ciepła. Jakość zastosowanej wody również odgrywa znaczną rolę. Można stosować wodę bieżącą dobrej jakości lub wodę destylowaną.
Szczepienie otrąb pszennych można przeprowadzić dowolną odpowiednią szczepionką. Biegli w sztuce znają wiele sposobów sporządzania odpowiedniej szczepionki z wybranego szczepu. Dawka szczepionki korzystnie wynosi co najmniej 1 x 107 spor/gram początkowej suchej substancji.
PL 201 768 B1
Fermentację można prowadzić w dowolnym odpowiednim reaktorze. Przykłady reaktorów odpowiednich do stosowania opisano w artykule A. Durand i współpr., opublikowanym w Agro-Food-Industry Hi-Tech (May-June, strony 39-42).
Fermentacja może być prowadzona przez okres 1 do 3 dni, korzystnie 30 do 60 godzin. Przed upływem 1 dnia fermentacja nie jest zakończona. Po 3 dniach fermentacja jest zakończona lub prawie zakończona w takim stopniu, że dalsze jej prowadzenie jest nieekonomiczne. Temperaturę środowiska typowo utrzymuje się w zakresie między 28 a 38°C, korzystnie między 32 a 36°C, co odpowiada optymalnemu zakresowi aktywności szczepów Aspergillus niger stosowanych w wynalazku. Korzystnie w tym celu temperaturę powietrza reguluje się na poziomie 34-38°C podczas pierwszych kilku godzin fermentacji, co sprzyja germinacji sporów, a następnie obniża ją na pozostały czas fermentacji do 28-32°C w celu regulacji temperatury środowiska.
pH środowiska fermentacji nie jest zwykle regulowane. Jeśli wartość początkowa pH wynosi około 6,0-6,4, pH podczas wzrostu spada do 3,8-4,2, a na końcu podnosi się. Zmiana ta jest generalnie skorelowana z fazą sporulacji grzybów. Następująca w tej fazie zmiana pH jest dobrym wskaźnikiem stanu kultury.
Fermentor powinien być napowietrzany, korzystnie w sposób ciągły, w celu dostarczenia tlenu niezbędnego dla fermentacji i uniknięcia nadmiernej akumulacji dwutlenku węgla wytwarzanego przez fermentację. Ponadto, napowietrzanie jest środkiem regulacji temperatury i wilgotności środowiska hodowlanego. Korzystnie stosuje się powietrze zasadniczo nasycone w wodę w celu ograniczenia tendencji do wysuszania środowiska. Jest trudne podanie wskazówek ilościowych odnośnie natężenia napowietrzania, ponieważ oddziaływają na to wielorakie zmienne, w szczególności wielkość i geometria reaktora, ilość wsadu otrą b, itp. Jednakż e zwykł e i proste rutynowe testy pozwolą znawcy łatwo ustalić dogodne natężenie napowietrzania w każdym praktycznym przypadku.
Wsad otrąb w fermentorze powinien być podczas fermentacji okresowo przerzucany za pomocą środków do mieszania, takich jak mieszadła ramowe, płytowe lub łopatkowe, lub ślimakowe, w celu uniknięcia tworzenia nieprzepuszczalnych mas i objęcia możliwie najbardziej jednorodnie napowietrzaniem całej masy otrąb. Należy jednak unikać mieszania zbyt energicznego, które mogłoby zaszkodzić grzybom.
Produkt według wynalazku jest produktem stałym, który ma zastosowanie zwłaszcza do produkcji etanolu z pszenicy. Może on być bezpośrednio dodany do upłynnionej skrobi (dekstryn) otrzymanej w etapie upłynnienia, w celu przeprowadzenia scukrzania. W tym zastosowaniu najważniejszym czynnikiem jest aktywność glukoamylazy. Korzystnie będzie się zatem stosować produkt według wynalazku mający aktywność glukoamylazy, na przykład co najmniej 750 UG, korzystnie co najmniej 1500 UG na gram suchej masy.
Innym możliwym zastosowaniem produktu według wynalazku jest zastosowanie jako dodatku do paszy, na przykład na bazie pszenicy, dla zwierząt jednożołądkowych, na przykład drobiu i tuczników. W tym zastosowaniu, najważniejszym czynnikiem jest aktywność ksylanazy. W tym zastosowaniu korzystnie stosuje się zatem produkt mający podwyższoną aktywność ksylanazy, na przykład co najmniej 400 UX na gram suchej masy.
Produkt według wynalazku w razie potrzeby może być suszony lub zamrażany w celu jego konserwacji.
Suszenie powinno być przeprowadzane w umiarkowanej temperaturze, aby nie wpłynęło na aktywność enzymatyczną. Na przykład za odpowiednie uważa się suszenie w suszarce w temperaturze 40°C. Zamrażanie natomiast może być przeprowadzane na produkcie wilgotnym w temperaturze obniżonej, na przykład -20°C.
W przykładach, róż ne aktywności enzymatyczne mierzy się następującymi metodami:
a) Aktywność glukoamylazy
Działanie preparatu glukoamylazy (GA) na roztwór skrobi powoduje uwolnienie cukrów redukujących. Ogrzewane do temperatury 100°C w obecności kwasu 3,5-dinitrosalicylowego (DNS) kompozycje te przybierają kolor brązowy, mierzalny za pomocą spektrofotometru (Kontron Instruments, Mediolan, Włochy) przy długości fali 540 nm.
Środowisko reakcji zawiera:
• 1% roztwór skrobi: 500 μ l • Bufor cytrynianowy 0,1, pH 4,5 450 μ l • Roztwór enzymatyczny: 50 μ l
PL 201 768 B1
Reakcja zachodzi przez 30 minut w temperaturze 60°C (55°C w przypadku GA z A. oryzae). Co minut pobiera się próbki, miesza z DNS i umieszcza w ł a ź ni z lodem. Nastę pnie ogrzewa się je przez 5 minut w 100°C, natychmiast schładza i przeprowadza pomiar przy 540 nm.
Twórcy wynalazku ustalili warunki oznaczania odpowiednie do badania wpływu temperatury i pH na aktywność naszych preparatów GA. Jako substrat tej hydrolizy enzymatycznej zastosowano skrobię rozpuszczalną firmy Merck (Darmstadt, Niemcy). DNS wytworzono zgodnie z procedurą zaproponowaną przez P. Bernfeld, Methods in enzymology, 1, 149-158 (1955), która jest następująca:
• Rozpuś cić najpierw:
• 10 g kwasu 3,5-dinitrosalicylowego • 200 ml 2 molowego wodorotlenku sodu • 200 ml wody destylowanej • Następnie dodać:
• 300 g winianu sodowo potasowego • Uzupełnić obję tość do jednego litra wodą destylowaną po całkowitym rozpuszczeniu.
Po sporządzeniu reagent ten należy przechowywać bez dostępu światła. Krzywe wzorcowe dla oznaczania aktywności glukoamylazy lub śledzenia reakcji upłynnienia-scukrzania sporządza się z glukozą jako produktem odniesienia lub z ksylozą w przypadku oznaczania aktywności ksylanazy.
Jednostka aktywności glukoamylazy (UG) odpowiada ilości enzymu niezbędnej dla uwolnienia mikromola zakończeń redukujących na minutę w warunkach oznaczania, z glukozą jako odnośnikiem. Aktywność glukoamylazy, obliczona za pomocą wzoru wskazanego poniżej, odnosi się do ilości początkowej suchej masy (SMI):
A = (P/Venz) * (Vferm/Mferm) * A odpowiada aktywności GA wyrażonej w UG-g SMr^gmoi-min'1 g SMI-1), * P odpowiada szybkości uwalniania równoważników glukozy w gmol. min-1, * Venz odpowiada objętości roztworu oznaczanych enzymów w mi, * Vferm jest całkowitą objętością wody destylowanej użytej do ekstrakcji roztworu enzymów, w ml * Mferm, wyrażona w g SMI, odpowiada początkowej masie suchego produktu, z którego wyekstrahowano roztwór enzymatyczny.
b) Aktywność proteazy
To oznaczanie prowadzi się przy użyciu azokazeiny według metody Beinon, opisanej w dziele „Proteins Purification Methods - a Practical Approach”, Harris E. L. V. i Angal, S. (Ed.), IRL-Press, Oxford University Press, 1-66 (1989). Degradacja tego substratu działaniem proteaz powoduje uwolnienie grup azowych, które absorbują w UV przy 340 nm. Zmiana absorbancji podczas kinetyki hydrolizy tego białka wskazuje na postęp tej reakcji.
Środowisko reakcji zawiera:
* 1% roztwór azokazeiny, pH 5,0: 1000 gl * Roztwór enzymatyczny: 200 gl
Azokazeinę (Sigma, Saint-Louis, Stany Zjednoczone) rozpuszcza się w 0,1 M buforze octanowym w pH 5,0. Aktywności proteazy oznacza się przy tym pH, ponieważ azokazeina jest nierozpuszczalna w buforze octanowym przy niższych pH. Reakcje enzymatyczne przeprowadza się w 60°C. Próbki pobiera się co 5 minut w ciągu 20 minut i miesza się z 5% kwasem trichlorooctowym (TCA) w celu zatrzymania reakcji.
Jedna jednostka aktywności proteazy (UP) odpowiada ilości enzymów niezbędnej do wzrostu o 0,01 jednostki A340 nm na minutę, generowanej przez uwolnienie grup azowych w warunkach podanych poprzednio. Aktywność ta, obliczona według wzoru wskazanego poniżej, odnosi się do początkowej suchej masy (UP-G-1 SMI) lub aktywności glukoamylazy (UP-UG-1):
A = (P/Venz) * (Vferm/Mferm) * A odpowiada aktywności proteazy wyrażonej w (UP-G-1 SMI-1, * P odpowiada szybkości uwalniania grup azowych, wyrażonej przez wzrost o 0,01 jednostki
A340 nm-min-1, * Venz oznacza objętość oznaczanego roztworu enzymatycznego w ml, * Vferm oznacza całkowitą objętość wody zastosowanej do ekstrakcji roztworu enzymów w ml, * Mferm, wyrażona w g SMI, odpowiada początkowej masie produktu suchego, z którego wyekstrahowano enzymy.
PL 201 768 B1
c) Aktywność ksylanazy
Dla udokumentowania tej aktywności enzymatycznej działa się preparatami GA na roztwór rozpuszczalnego ksylanu i mierzy uwolnione cukry redukujące metodą DNS.
Środowisko reakcji składa się z:
* 1% roztworu ksylanu, pH 4,5: 900 μ l * roztworu enzymatycznego: 100 μ l
Sporządza się 1% roztwór ksylanu z modrzewia (Sigma) w buforze cytrynianowym o pH 4,5 i prowadzi reakcję w 60°C. Pobiera się próbki co 5 minut w cią gu 20 minut, miesza z DNS i umieszcza w łaźni lodowej. Następnie przeprowadza się oznaczenia zgodnie z procedurą taką samą jak dla oznaczania aktywności GA z ksylozą jako odnośnikiem.
Jednostka aktywności enzymatycznej ksylanazy (UX) odpowiada ilości enzymów niezbędnych dla uwolnienia jednego mikromola cukrów redukujących na minutę. Aktywność tę odnosi się do początkowej suchej masy (UX-g-1 SMI) lub aktywności glukoamylazy (UX-UG). W celu obliczenia tej aktywności wzięto wzór zdefiniowany do obliczania aktywności GA, w którym:
* A odpowiada aktywności ksylanazy wyrażonej w UX-g-1 SMI-1 ^ol-mjn^-gSMr1), * P odpowiada szybkości uwalniania równoważników ksylozy w μmol·min- * pozostałe zmienne we wzorze są niezmienione
Poniższe nieograniczające przykłady podano w celu zilustrowania wynalazku.
P r z y k ł a d 1
Selekcja szczepów Aspergillus
Przeprowadzono badania porównawcze zdolności siedmiu różnych dostępnych w handlu szczepów Aspergillus do wytwarzania glukoamylazy przez fermentację otrąb pszennych na podłożu stałym.
Testy prowadzono na 50 g podłoża stałego w kolbie Erlenmeyera. Podłoże stanowiło 21,5 g otrąb pszennych, 27,5 g wody i 1 g skrobi pszennej. Początkowe pH podłoża wynosiło 6,0-6,5. Podłoże sterylizowano przez 20 minut w autoklawie w temperaturze 120°C.
Każde podłoże szczepiono 2·107 spór testowanego szczepu na gram początkowej suchej masy. Wiek spór wynosił 3 dni. Pozostawiono do fermentacji na 40 lub 50 godzin, po czym kolby Erlenmeyera umieszczano w suszarce w temperaturze 35°C. Na koniec fermentacji mieszano sfermentowane podłoże ze 150 ml wody destylowanej w celu rozpuszczenia wytworzonych enzymów, po czym filtrowano mieszaninę w celu odzyskania roztworu enzymatycznego. Roztwór wirowano w celu usunięcia spór i pozostałych cząstek, po czym konfekcjonowano roztwór do butelek o pojemności 100 ml, które przechowywano w -20°C do czasu przeprowadzenia analizy aktywności glukoamylazy.
Testowane szczepy i otrzymane wyniki zebrano w poniższej tabeli 1.
Nr referencyjny szczepu w kolekcji Czas trwania FSM (h) Ac-GA (UG-g-1 SMI)
A. niger ATCC 76060 50 627
A. niger ATCC 76061 50 943
A. niger MUCL 28815 40 710
A. niger MUCL 28816 40 631
A. niger NRRL 3112 50 1056
A. oryzae ATCC 22788 50 903
A. oryzae ATCC 42149 50 861
Widoczne jest, że szczepy A. niger NRRL 3112, A. niger ATCC 76061 i A. oryzae ATCC 22788 mają najlepszą aktywność pod względem wytwarzania glukoamylazy.
Inną ważną właściwością, którą ponadto należy wziąć pod uwagę, jest trwałość wytworzonej glukoamylazy. Przeprowadzono zatem testy termostabilności, poddając roztwory enzymatyczne obróbce termicznej w temperaturze 55 i 60°C przez 30 minut i mierząc aktywność glukoamylazy w czasie. Warunki tej obróbki są zbliżone do warunków scukrzania skrobi. Stwierdzono, że szczepy A. niger ATCC 76061 i A. niger NRRL 3112 dają najbardziej trwałe glukoamylazy (100% aktywności pozostałej po 30 minutach w 55°C i około 50% aktywności pozostałej po 30 minutach w 60°C), podczas gdy szczepy A. oryzae ATCC 22788 i ATCC 42149 dają glukoamylazy mające 0% aktywności pozostałej po 30 minutach w 60°C i 46% aktywności pozostałej po 30 minutach w 55°C. Doprowadziło to nas
PL 201 768 B1 zatem do wybrania szczepów A. niger ATCC 76061 i NRRL 3112. Ponadto szczep A. niger NRRL 3112 okazał się genetycznie na tyle niestabilny (utrata aktywności po kilku cyklach reprodukcji), że najbardziej korzystnym szczepem jest szczep A. niger NRRL 76061. Ten szczep zastosowano zatem w poniższych przykładach.
P r z y k ł a d 2
Wytwarzanie glukoamylaz w niesterylizowanych zbiornikach pilotowych o pojemności 50 l, dostarczanych przez INRA; znaczenie obróbki wstępnej otrąb pszennych.
Testy przeprowadzono w niesterylizowanym fermentorze o pojemności 50 l, zgodnym z tym opisanym w wyżej cytowanym artykule A. Durand i współpr. (Figura 1) na otrębach pszennych BCE (dostarczane przez destylarnię Brie Champagne Ethanol, Provins, Francja). Dla otrzymania 5 kg podłoża hodowlanego o wilgotności 55% zastosowano dwa sposoby przygotowania pszenicy:
• otręby suche: otręby autoklawowano przez 1 h w 105°C, po czym mieszano z wodą (test F4C3):
• otręby mokre: otręby zwilżano do 45% w mieszarce i autoklawowano 20 minut w temperaturze 121°C (test F4C4).
W obu przypadkach przeprowadzano szczepienie 2·10-7 sporg-1 SM i ustawiano zawartość wody w podłożu na około 55%. Następnie fermentowano je w warstwach o wysokości 10 cm w napowietrzanych zbiornikach. Podczas tych hodowli podłoże co jakiś czas żłobiono za pomocą szpatułki w celu obniżenia jego temperatury. Podczas fermentacji atmosferę cały czas odświeżano kondycjonowanym powietrzem, którego temperatura, wilgotność i przepływ były takie jak wskazano w tabelach.
Wyniki przedstawiono w tabelach 2 (test F4C3) i 3 (test F4C4).
Dane te pozwalają na wyciągnięcie kilku wniosków:
- Nawilżenie otrąb pszennych przed obróbką termiczną jest konieczne dla efektywnego wytworzenia glukoamylazy. Poza odkażeniem, obróbka termiczna otrąb pszennych sprzyja najprawdopodobniej żelatynizacji skrobi;
- pH wydaje się dobrym wskaźnikiem jakościowym postępu wzrostu i wytwarzania GA grzybowych, natomiast nie pozwala na ocenę jakości otrzymanej GA;
- Lekkie mieszanie podłoża (żłobienie) nie wpływa niekorzystnie na wytwarzanie enzymów;
- Zmiana zawartości wody podczas tych dwóch fermentacji wskazuje na znaczące odwodnienie podłoża hodowlanego, co może być szkodliwe dla wzrostu grzybów.
P r z y k ł a d 3
Wytwarzanie glukoamylazy w fermentorze pilotowym dostarczonym przez spółkę FUJIWARA: znaczenie utrzymania wilgotności podłoża podczas fermentacji.
Test ten prowadzono w fermentorze pilotowym zakupionym w spółce FUJIWARA, Okayama, Japonia, oraz na otrębach pszennych BCE. Fermentor ten różni się od fermentora zastosowanego w przykładzie 2 średnicą zbiornika, która wynosi 0,66 m, zaś w przypadku zbiorników INRA 0,35 m. W fermentorze tym dla uzyskania wysokości 12 cm warstwy kultury konieczne jest użycie 20 kg podłoża o zawartości 55% wody, wytworzonego sposobem opisanym w przykładzie 2. Mieszanie prowadzono za pomocą trzech pionowych ślimaków o stałej prędkości obrotowej, które mieszały obrotowo podłoże w zbiorniku (5-10 minut/obrót). Podczas fermentacji, tak jak dla zbiorników INRA z przykładu 2, atmosferę gazową w sposób ciągły odnawiano za pomocą kondycjonowanego powietrza, którego temperatura, wilgotność i przepływ były takie jak wskazano w tabeli 4.
Podczas tego testu zwanego FII, badano możliwość regulacji wilgotności. Dla oznaczenia ilości wody do dodania w celu utrzymania zawartości wody w podłożu powyżej 50% zastosowano okresowe pomiary wilgotności kultury za pomocą spektrofotometru i masy podłoża.
Wyniki tego testu FII podano w tabeli 4. Otrzymane wyniki można skomentować następująco:
- test FII wykazuje wyraźnie, że utrzymanie zawartości wody między 50 a 55% sprzyja wytwarzaniu enzymów, z 1600 UG/g SM uwolnionymi przez 44 h fermentacji, co jest ponad dwukrotnym zwiększeniem aktywności w porównaniu z przebiegiem testu F4C2 w przykładzie 2, w którym nie korzystano z takiej regulacji;
- stabilizacja wytwarzania enzymów począwszy od 44 h hodowli skorelowana z pojawieniem się spor grzybowych wskazuje, że nie jest konieczne prowadzenie hodowli poza tę fazę;
- zadowalającą regulację temperatury podłoża w pobliżu 35°C można uzyskać przez dobre połączenie kondycjonowania powietrza i mieszania podłoża;
-kultura wytrzymuje bez szkód okresowe mieszanie systemem mieszania fermentora FUJIWARA.
PL 201 768 B1
P r z y k ł a d 4
Wytwarzanie glukoamylaz w fermentorze pilotowym z mieszaniem o pojemności 50 l INRA: zastosowana wstępna obróbka termiczna otrąb parą i hodowla w „warunkach jałowych”.
Ten pilotowy fermentor jest podobny do fermentora przedstawionego w WO-A-94/18306 i na fig. 4 uprzednio cytowanego artykułu A. Durand i współpr. Urządzenie to umożliwia obróbkę otrąb parą bezpośrednio w fermentorze, co jest preferowane w produkcji na skalę przemysłową. Hodowlę również przygotowywano, szczepiono i realizowano w warunkach jałowych, z wyjątkiem pobierania próbek, co nadawało temu testowi cechy pół-jałowości i różniło się od dwóch poprzednich przykładów.
A) Warunki eksperymentalne
Do fermentora wprowadzono 9 kg otrąb BCE, zwilżonych wstępnie 1,5 l wody, po czym sterylizowano in situ przez 20 minut w 121° C, mieszając okresowo przez 5 sekund co 5 minut. Obróbka ta pozwoliła na uzyskanie zawartości wilgoci 46%, którą następnie ustawiono na 55% podczas szczepienia.
Otręby zaszczepiono za pomocą preparatu typu koji:
180 g otrąb BCE (55% wilgotności początkowej) fermentowanych przez 4 dni w temperaturze 35°C zmieszano z 3 litrami jałowej wody, otrzymując zawiesinę spór, która stanowiła szczepionkę.
Początkowe warunki fermentacji są następujące:
18,3 kg kultury o wilgotności 55% i pH początkowym 5,7;
Wysokość warstwy 40 cm;
Wydatek napowietrzania: 314 lmin- ;
Temperatura powietrza wlotowego: 35°C;
Wilgotność względna powietrza wlotowego: 95%.
B) Przebieg fermentacji
Poza pomiarem pH, temperatury podłoża, procentu suchej masy i produkcji GA, dla fermentora mieszanego o pojemności 50 ml rejestrowano w sposób ciągły zmianę masy kultury, natomiast dla reaktora niejałowego, pomiar wagi kultury prowadzono w 21 h i 42 h fermentacji.
Te pomiary masy mają podwójne znaczenie:
Utrzymanie wilgotności podczas hodowli przez oznaczenie procentu SM.
Do zmniejszenia masy kultury podczas fermentacji przyczyniają się dwa zjawiska, to jest:
- z jednej strony suszenie podłoża w celu skompensowania dodatku wody,
- z drugiej strony ubytek masy związany ze wzrostem grzybów.
Ten ubytek suchej masy nie jest zaniedbywalny, bo podczas 40 h hodowli traci się 20% SM, to jest 0,5% SM na godzinę, jeśli dokona się liniowej aproksymacji ubytku.
Wychodząc z tego, znając w każdym przypadku masę kultury (M(t)) możliwe jest obliczenie teoretycznego procentu SM w czasie t z równania:
% SM teoretyczny (t) =
SMI(SMI · 0,5%) · t M(t) gdzie SMI oznacza początkową ilość suchej masy.
Wyrażenie wyników na gram SM początkowej
Zmiany masy i mierzonego procentu SM pozwalają na obliczenie rzeczywistego ubytku suchej masy (PSM wyrażone w %) podczas hodowli. Tak więc, ilość GA wyrażana dotychczas w UG^g-1 SM może być wyrażona w UG^g-1 SM początkowej dzięki następującemu równaniu:
(UG^g-1 SMI) = (UG^g-1 SM) . (100-PSM) /100
C) Wyniki
W tabelach 5 i 6 zebrano warunki robocze i wyniki otrzymane w reaktorze mieszanym z otrębami parowanymi.
Mimo napowietrzania hodowli powietrzem nasyconym w wilgoć, schnięcie podłoża jest takie, że w dwóch przypadkach niezbędne było dwukrotne uzupełnianie zawartości wody, kiedy spadała ona poniżej 50%, co pokazano w tabeli 5.
Temperaturę podłoża można było utrzymywać na wartości średniej 35°C dzięki obniżeniu natężenia przepływu powietrza wlotowego, ale przede wszystkim przez okresowe mieszanie.
W takich warunkach hodowli, wzrost grzybów, którego postęp śledzi się przez pomiar pH, utrzymuje się przez 60 h i pozwala uzyskać produkcję 1436 UG^g-1 SM w 44 h i 1990 UG^g-1 SM w 63 h. Sprowadzona do SM początkowej, ilość wytworzonej GA wynosi odpowiednio 1160 i 1540 UG^g-1 SMI. Dla porównania, w przykładzie 3 uzyskaliśmy w ciągu 44 h hodowli 1605 UG^g-1 SM, odpowiadające
PL 201 768 B1
1067 UG^g-1 SMI. Informacja ta jest interesująca, ponieważ wskazuje ona, że produktywność tych dwóch testów jest taka sama, ale że warunki eksperymentalne przykładu 4 pozwalają na przedłużenie produkcji enzymu nawet mimo 40 cm wysokości warstwy.
Obróbka otrąb parą, a następnie fermentacja w reaktorze INRA z mieszaniem o pojemności 50 l przedłuża zatem wzrost grzyba i produkcję enzymów.
Wyrażona względem SM początkowej, ilość wytworzonego GA wynosi 1540 UG^g-1 SMI.
Na tych samych próbkach przeprowadzono pomiar aktywności ksylanazy i proteaz. Otrzymane wyniki są bardzo zadowalające, z maksimum, średnio, po 50 h fermentacji, wynoszącym:
350 UX^g-1 SMI dla ksylanaz;
400 UP^g-1 SMI dla proteaz.
Dzięki ciągłej rejestracji masy, możliwe jest obliczenie strat suchej masy podczas hodowli. Wynosi ona około 23% po 60 h hodowli (z 2% błędem dokładności pomiaru wagi).
P r z y k ł a d 5
Zastosowanie otrąb fermentowanych wytworzonych w przykładzie 4 do hydrolizy maki pszennej
Przeprowadzono serie scukrzań z otrębami fermentowanymi otrzymanymi w przykładzie 4 na mąkach pszennych uprzednio poddanych klasycznemu upłynnianiu enzymatycznemu. Jako wzorzec służył handlowy preparat glukoamylaz AMG 300L®, sprzedawany przez spółkę NOVO. Testy te wykonano ze zwykłą mąką pszenną typu 45. Warunki robocze zebrano w tabeli 7 dla 750 g brzeczki.
T a b e l a 7
Produkt AMG 300L® (NOVO) Otręby fermentowane Otręby fermentowane suche
Odnośnik AMG 300L Prz. 4 Prz. 4
Wygląd Ciekły Wilgotne otręby Otręby suche
Sposób konserwacji w +5°C w -20°C W temperaturze pokojowej
Mąka Handlowa typ 45 Handlowa typ 45 Handlowa typ 45
Ilość użyta (g) 300 300 300
Sucha masa podłoża (%) 35 35 35
Warunki upłynnienia 1h/88°C/pH 6,1 1h/88°C/pH 6,1 1h/88°C/pH 6,2
Enzym 125 μl Termamyl 120L® 125 μl Termamyl 120L® 125 μl Termamyl 120L®
Warunki scukrzania 44h/58°C/pH 4,6 40h/58°C/pH 4,55 44h/60°C/pH 4,52
Ilość równoważna 3500UG 205 μl 4,3 g 2,1 g
Podczas tych hydroliz maki pszennej pobierano za każdym razem trzy próbki podłoża. Wyniki stężeń cukrów redukujących (SR) w różnych momentach scukrzania przedstawione w tabeli 8 są średnią z trzech próbek. Pomiary te, przeprowadzone techniką DNS, wykonywano na supernatantach odwirowanych próbek. Mierzono także końcową lepkość scukrzonych produktów.
T a b e l a 8
Mierzona wielkość AMG300L® (Novo) Otręby fermentowane Otręby fermentowane suche
Stężenie S. R. początkowe (g/l) 180,9±4,6 185,0±3,1 171,5±4,5
Stężenie S. R. końcowe (g/l) 327,5±18,5 325,0±22,5 348,3±19,1
Lepkość (mPa-s) 6,80 2,82 2,80
Ponadto, stwierdzono wzrost zawartości w brzeczce azotu rozpuszczalnego po scukrzeniu, związanego z działaniem proteolitycznym fermentowanych otrąb.
Wyniki te wskazują, że fermentowane otręby wytworzone w przykładzie 4 mają zdolność hydrolizowania mąki pszennej z taką samą skutecznością jak wzorcowy preparat GA, niezależnie od sposobu przechowywania.
PL 201 768 B1
Hydroliza mąki za pomocą fermentowanych otrąb powoduje także znaczne zmniejszenie lepkości w porównaniu z typowym preparatem enzymatycznym.
P r z y k ł a d 6
Przykład ten ilustruje możliwość wytwarzania znacznej ilości ksylanaz i niewielkiej ilości glukoamylaz przy zastosowaniu szczepu Aspergillus niger.
Test ten przeprowadzono w fermentorze pilotowym Fujiwara z otrębami BCE i szczepem A. niger nr ref. ATCC 201202, znanym ze swej zdolności do wytwarzania ksylanaz. Funkcjonowanie fermentora pilotowego jest opisane w przykładzie 3. W przykładzie tym użyto 20 kg podłoża o wilgotności 55%, sporządzonego tak jak w przykładzie 2. Tak jak w przykładzie 3, podczas fermentacji utrzymywano wilgotność podłoża powyżej 50% a temperaturę podłoża regulowano na poziomie około 35°C.
Na końcu, szczep A. niger 201202 wytworzył po 37 h w tych warunkach fermentacji, fermentowane otręby mające 727 UX/g SM i 162 UG/g SM.
P r z y k ł a d 7
Korzystne skutki włączenia otrąb fermentowanych według wynalazku do paszy dla drobiu na bazie pszenicy, przeznaczonej dla kurcząt.
Wiadomo jest, że hemicelulozy z mąki pszennej są częściowo rozpuszczalne w wodzie i zwiększają lepkość treści jelitowej, zmniejszają c w ten sposób uwalnianie i absorpcję skł adników odżywczych.
Wykazano, że dodanie hemicelulaz pobudza degradację hemicelulaz, pozwalając także na zmniejszenie lepkości treści jelitowej i poprawienie sprawności zootechnicznej zwierząt jednożołądkowych, takich jak brojlery, odżywianych paszami, w których jedynym zbożem jest pszenica.
Dla wykazania korzystnych skutków zastosowania otrąb fermentowanych zawierających aktywność hemicelulazy (ksylanazy) przeprowadzono eksperymenty na 1200 brojlerów Ross w porównaniu z paszą bez enzymu i paszą zawierają c ą standardowe ź ródł o ksylanazy, produkt Avizyme®. Pasze z enzymem lub bez przyrządzano w ilości do karmienia 4 partii po 300 piskląt. Ich kompozycja jest podana w tabeli 9. Przez pierwsze 21 dni wzrostu stosowano pasze wzrostowe, po czym zastąpiono je paszą kończącą (AL. FI) przez 18 dni.
T a b e l a 9
Pasza AL. CR AL FI
Wilgotność (%) 10,6 11,4
Białka (%) 21,3 19,1
Substancje tłuszczowe (%) 6,1 6,4
Pasza 1 nie zawierała żadnego enzymu. Do pasz 2 i 3 dodano 3 i 5 kg, odpowiednio, otrąb fermentowanych na tonę paszy. Do paszy 4 dodano 0,6 kg Avizyme® na tonę paszy.
Wyniki tego testu po 39 dniach wzrostu zestawiono w tabeli 10.
T a b e l a 10
Pasza 1 2 3 4
Otręby fermentowane według wynalazku (kg/tonę)a - 3,0 5,0 -
Avizyme® Finfeed (kg/tonę)b - - - 0, 6
Aktywność ksylanazy (UX/kg paszy) - 1700 2840 1620
Współczynnik konwersji paszy po 39 dniachc 1,755 1,748 1,738 1,745
Współczynnik zmniejszenia konwersji paszy (% paszy 1)d - 1,52 2,08 1,69
Śmiertelność (%) 2,3 2,0 3,0 2,3
a. te otręby fermentowane posiadały aktywność glukoamylazy 1000 UG/g suchej masy, aktywność proteolityczną 125 UP/g suchej masy i aktywność ksylanazy 600 UX/g suchej masy;
b. Avizyme® dostarczyła spółka Finfeed, Finlandia;
c. stosunek wagowy spożyta pasza/przyrost wagi
d. jest to zmniejszenie w %, wagi spożytej paszy w stosunku do wagi spożytej paszy 1 (bez enzymu)
PL 201 768 B1
Włączenie fermentowanych otrąb do paszy dla drobiu (3 lub 5 kg tonę) pozwoliło na znaczne zmniejszenie współczynnika konwersji paszy. W warunkach testu zastosowanie dawki fermentowanych otrąb powyżej 3 kg/tonę nie dawało praktycznych korzyści. Obserwowana poprawa była porównywalna z poprawą uzyskiwaną z handlowym produktem odniesienia Avizyme® (0,6 kg/tonę). Zastosowanie fermentowanych otrąb jest jednak tańsze niż stosowanie handlowego produktu enzymatycznego.
Opisane formy realizacji są jedynie przykładami i można je modyfikować, w szczególności przez zastąpienie ekwiwalentami technicznymi, nie wychodząc poza zakres wynalazku.
T a b e l a 5
Parametry fizykochemiczne FMS w fermentorze z mieszaniem o pojemności 50 l otrębów po obróbce parą
Czas hodowli (h) Temperatura powietrza wlotowego (°C) Natężenie przepływu powietrza (l/min) Powietrze, wilgotność względna w % Średnia temperatura podłoża pH średnie Masa całko- wita Obróbka
0 35,0 314,0 94,6 5,70 18,30
13 36,1 312,7 92,6 38,8 4,72 18,00
13 (po mieszaniu) 471,0 38,6 4,68 mieszanie
16 29,8 448,6 94,6 32,4 4,60 17,50 mieszanie
18 33,2 466,5 77,2 31,0 4,37 17,10
20,33 32,6 466,5 93,7 34,3 4,20 16,80
23,66 34,2 4,13 15,80
26 29,8 467,5 94,6 32,9 4,17 15,10
26 29,8 467,5 94,6 33,3 3,81 17,30 mieszanie + 2,5 l wody
36,75 29,0 467,5 94,6
36,75 27,0 467,5 94,6 29,9 3,71 14,30
40,58 27,0 467,5 94,6 31,0 4,20 13,10
40,66 27,0 467,5 94,6 31,7 3,60 15,10 mieszanie + 2,1 l wody
44,58 448,6 33,6 3,71 14,10
47,17 467,5 34,8 4,04 13,30
50 27,0 303,3 94,6 32,0 4,09 12,80 mieszanie
63,33 28,7 303,0 31,0 5,75 10,30
T a b e l a 6
Wyniki fermentacji FMS w fermentorze z mieszaniem o pojemności 50 l otrębów po obróbce parą
Czas hodowli (h) Zawartość wody w % Ubytek SM (%) Ubytek SM w % (wyrównany) UG/g SM średniej UG/g SMI średniej UX/g SM UX/g SMI UP/g MS UP/g SMI
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
0 54,50 -2,07 0,00 0,00 0,0 0,0 0,0 0,0
13 57,52 7,78 0,4 92,69 85,48 16,1 16,0 131,0 130,49
16 53,72 2,11 1,0 170,53 166,92 19,2 19,0 196,2 194,15
18 55,23 7,21 1,8 129,25 222,01 27,9 27,4 103,9 102,02
20,33 51,90 1,91 3,1 429,36 421,18 35,0 33,9 193,7 187,63
PL 201 768 B1 cd. tabeli 6
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
23,66 50,88 5,57 5,9 551,93 521,21 51,0 48,0 283,4 266,81
26 49,06 6,15 8,2 651,45 611,36 75,4 69,2 296,5 272,14
26 57,76 10,57 8,2 548,42 490,44 54,1 49,7 262,1 240,57
36,75 49,27 10,75 18,4 1127,09 1005,88 203,5 166,2 359,1 293,20
40,58 51,14 20,55 20,5
40,66 58,72 22,54 22,0 1278,58 990,35 227,3 180,7 347,9 276,52
44,58 54,10 19,21 22,6 1436,16 1160,27 408,3 318,6 367,1 286,45
47,17 54,01 23,07 23,2 1535,69 1181,43 511,5 395,7 496,8 384,30
50 54,66 26,67 24,4 1742,78 1277,91 429,8 330,1 628,2 482,48
63,33 44,96 22,62 22,6 1989,07 1539,07 410,3 310,1 478,3 361,5
T a b e l a 2
Czas ho- dowli (h) Temperatura powietrza wlotowego (°C) Natężenie przepływu powietrza (l/min) Natężenie przepływu powietrza (m/s) Powietrze, wilgotność względna % Średnia temperatura pod- łoża pH śred- nie Wilgot- ność % UGA/g MS śred- niej Czas ho- dowli (h)
F4C3 0,0 35 174,4 8,0 96 25,0 0,0
otręby suche żłobienie (17h) żłobienie (18h) 3,0 35 174,4 8,0 95 33,8 6,33 3,0
11,0 32 174,4 8,0 94 34,6 5,13 54,33 20,56 11,0
14,0 30 174,4 8,0 95 35,4 4,38 54,19 71,13 14,0
16,0 30 174,4 8,0 94 33,3 4,36 52,17 123,12 16,0
18,0 28 174,4 8,0 92 37,4 4,51 51,31 85,78 18,0
20,0 28 174,4 8,0 96 31,8 3,79 49,54 132,81 20,0
22,0 28 174,4 8,0 95 34,7 4,12 45,17 188,0 22,0
25,00 28 174,4 8,0 37,6 4,34 45,13 181,03 25,0
28,00 28 174,4 8,0 94 32,6 4,63 36,47 129,58 28,0
31,00 28 174,4 8,0 32,8 5,05 30,68 198,10 31,0
40,00 28 174,4 8,0 95 31,9 5,69 23,96 246,86 40,0
T a b e l a 3
Czas hodowli (h) Temperatura powietrza wlotowego (°C) Natężenie przepływu powietrza (l/min) Natężenie przepływu powietrza (m/s) Powietrze, wilgotność względna w % Średnia temperatura pod- łoża pH śred- nie Wilgot- ność, % UGA/g SM średniej Czas ho- dowli (h)
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
F4C3 0,0 35 174,4 8,0 96 25,0 5,96 0,0
otręby mokre 3,0 35 174,4 8,0 95 33,8 6,12 3,0
PL 201 768 B1 cd. tabeli 3
1 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
żłobienie (14h) żłobienie (18h) 11,0 32 174,4 8,0 94 35,1 5,06 53,93 135,77 11,0
14,0 30 174,4 8,0 95 39,9 4,66 53,04 121,02 14,0
16,0 30 174,4 8,0 94 33,1 4,59 51,53 182,96 16,0
18,0 28 174,4 8,0 92 38,0 4,48 50,80 327,41 18,0
20,0 28 174,4 8,0 96 34,3 3,72 51,76 360,25 20,0
22,0 28 174,4 8,0 95 36,9 3,70 47,65 618,00 22,0
25,0 28 174,4 8,0 36,3 4,15 41,68 658,05 25,0
28,0 28 174,4 8,0 94 30,9 4,53 35,73 660,03 28,0
31,0 28 174,4 8,0 30,8 5,18 33,98 583,62 31,0
40,0 28 174,4 8,0 95 30,2 4,88 30,02 702,74 40,0
T a b e l a 4
Czas (h) Szybkość wentylacji obr/min Powietrze, wilgotność względna w % Temperatura powietrza wlotowego (°C) Temperatura podłoża, °C Wilgot- ność podłoża % pH UG/g SM UG/g SMI Czas (h)
mieszanie 0 15 99,0 35,0 25,0 54,0 6,36 4,3 4,3 0
10 15 98,5 35,0 34,7 53,7 5,95 23,9 10
12 33,0 12
15 15 98,6 33,0 34,5 51,6 4,92 133,3 15
mieszanie + 3 l wody 18 15 98,8 33,0 37,3 49,7 4,18 304,8 273,1 18
21 15 98,3 30,0 30,7 54,7 3,83 472,1 21
24 15 98,2 30,0 31,9 52,4 3,76 709,2 24
mieszanie + 2 l wody 28 15 97,9 30,0 33,4 46,6 4,08 1198,0 28
29 25 98,0 30,0 51,6 1054,0 29
mieszanie + 6 l wody 38 15 98,6 32,0 31,5 39,2 5,00 1469,7 976,1 38
39 15 99,0 32,0 60,6 1338,0 39
42 15 99,2 32,0 33,9 59,7 5,28 1514,8 42
44 15 98,1 32,0 34,1 54,8 5,76 1605,1 1067,6 44
46 15 96,8 32,0 33,7 52,6 6,33 1601,0 46
66 15 99,0 32,0 32,4 34,0 7,28 1594,4 1161,7 66
Zastrzeżenia patentowe

Claims (14)

  1. Zastrzeżenia patentowe
    1. Produkt multienzymatyczny, posiadający aktywność glukoamylazy, proteolityczną i ksylanazy, znamienny tym, że stanowi otręby pszenne fermentowane szczepem Aspergillus niger wybranym spośród szczepów ATCC 201202, ATCC 76060, ATCC 76061, MUCL 28815, MUCL 28816 oraz NRRL 3112, w którym wspomniane aktywności glukoamylazy, proteolityczna i ksylanazy są obecne w następujących wartościach minimalnych:
    PL 201 768 B1
    - glukoamylazy: co najmniej 100 UG na gram suchej substancji,
    - proteolityczna: co najmniej 100 UP na gram suchej substancji,
    - ksylanazy: co najmniej 100 UX na gram suchej substancji, z ograniczeniem, że aktywność glukoamylazy wynosi co najmniej 750 UG na gram suchej substancji i/lub aktywność ksylanazy wynosi co najmniej 300 UX na gram suchej substancji.
  2. 2. Produkt według zastrz. 1, znamienny tym, że posiada aktywność glukoamylazy co najmniej 750 UG na gram suchej substancji.
  3. 3. Produkt według zastrz. 1, znamienny tym, że posiada aktywność glukoamylazy co najmniej 1500 UG na gram suchej substancji.
  4. 4. Produkt według zastrz. 1, znamienny tym, że posiada aktywność ksylanazy co najmniej 300 UX na gram suchej substancji.
  5. 5. Produkt według zastrz. 1, znamienny tym, że posiada aktywność ksylanazy co najmniej 400 UX na gram suchej substancji.
  6. 6. Produkt według zastrz. 1, znamienny tym, że szczep Aspergillus niger wybrany jest spośród szczepów NRRL 3112 i ATCC 76061.
  7. 7. Produkt według zastrz. 6, znamienny tym, że szczep Aspergillus niger stanowi szczep ATCC 76061.
  8. 8. Sposób wytwarzania produktu multienzymatycznego określonego w zastrz. 1, znamienny tym, że obejmuje następujące etapy:
    (a) dostarczenia otrąb pszennych; (b) zwilżenia i obróbki termicznej wspomnianych otrąb przez pasteryzację lub sterylizację; (c) szczepienia uzyskanych otrąb pszennych szczepem Aspergillus niger wybranym spośród szczepów ATCC 201202, ATCC 76060, ATCC 76061, MUCL 28815, MUCL 28816 oraz NRRL 3112; (d) fermentacji otrąb, mających formę warstwy o wysokości co najmniej 10 cm, w reaktorze napowietrzanym i mieszanym okresowo, przez okres 1 do 3 dni, w temperaturze 28-38°C, korzystnie 32 do 36°C, ustawiając początkową wilgotność wspomnianych otrąb na 50% do 60% i utrzymując zasadniczo taką wilgotność podczas fermentacji, w warunkach napowietrzania odpowiednich dla uniknięcia akumulacji dwutlenku węgla szkodliwego dla fermentacji w reaktorze i podwyższenia temperatury z powodu fermentacji powyżej wskazanego zakresu, aż do uzyskania produktu fermentacji posiadającego następujące minimalne wartości aktywności enzymatycznych:
    - glukoamylazy: co najmniej 100 UG na gram suchej substancji,
    - proteolityczna: co najmniej 100 UP na gram suchej substancji,
    - ksylanazy: co najmniej 100 UX na gram suchej substancji, z ograniczeniem, że aktywność glukoamylazy wynosi co najmniej 750 UG na gram suchej substancji i/lub aktywność ksylanazy wynosi co najmniej 300 UX na gram suchej substancji.
  9. 9. Sposób według zastrz. 8, znamienny tym, że stosuje się szczep Aspergillus niger wybrany spośród szczepów NRRL 3112 i ATCC 76061.
  10. 10. Sposób według zastrz. 9, znamienny tym, że stosuje się szczep Aspergillus niger ATCC 76061.
  11. 11. Sposób według zastrz. 8, znamienny tym, że utrzymuje się stopień wilgotności otrąb podczas fermentacji nie niższy niż 45%.
  12. 12. Sposób według zastrz. 8 albo 9, albo 10, albo 11, znamienny tym, że obejmuje etap dodatkowy, polegający na zamrażaniu lub suszeniu produktu otrzymanego w etapie (d).
  13. 13. Zastosowanie produktu określonego w zastrz. 1 do 7 do wytwarzania etanolu z pszenicy.
  14. 14. Zastosowanie produktu określonego w zastrz. 1 do 7 jako dodatku do paszy dla zwierząt jednożołądkowych.
PL350672A 1999-01-25 2000-01-25 Produkt multienzymatyczny, sposób wytwarzania produktu multienzymatycznego, oraz zastosowania produktu multienzymatycznego PL201768B1 (pl)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR9900775A FR2788782B1 (fr) 1999-01-25 1999-01-25 Produit multienzymatique a activites glucoamylasique, proteolytique et xylanasique et procede pour sa production par fermentation a l'etat solide de son de ble avec aspergillus niger
PCT/FR2000/000163 WO2000043496A1 (fr) 1999-01-25 2000-01-25 Produit multienzymatique a activites glucoamylasique, proteolytique et xylanasique et procede pour sa production par fermentation a l"etat solide de son de ble avec aspergillus niger

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL350672A1 PL350672A1 (en) 2003-01-27
PL201768B1 true PL201768B1 (pl) 2009-05-29

Family

ID=9541183

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL350672A PL201768B1 (pl) 1999-01-25 2000-01-25 Produkt multienzymatyczny, sposób wytwarzania produktu multienzymatycznego, oraz zastosowania produktu multienzymatycznego

Country Status (22)

Country Link
US (1) US6667066B2 (pl)
EP (1) EP1022329B1 (pl)
JP (1) JP2002534973A (pl)
CN (1) CN1203170C (pl)
AT (1) ATE294852T1 (pl)
AU (1) AU775240B2 (pl)
BR (1) BRPI0007600B1 (pl)
CA (1) CA2361264C (pl)
DE (1) DE60019825T2 (pl)
DK (1) DK1022329T3 (pl)
ES (1) ES2244395T3 (pl)
FR (1) FR2788782B1 (pl)
HU (1) HUP0104907A2 (pl)
ID (1) ID29922A (pl)
MA (1) MA25276A1 (pl)
MX (1) MXPA01007528A (pl)
PL (1) PL201768B1 (pl)
PT (1) PT1022329E (pl)
RU (1) RU2246536C2 (pl)
TR (1) TR200102156T2 (pl)
WO (1) WO2000043496A1 (pl)
ZA (1) ZA200107009B (pl)

Families Citing this family (48)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002088342A1 (en) * 2001-04-30 2002-11-07 Biocon India Limited An enzyme preparation for improved baking quality and a process for preparing the same
DK1516053T3 (da) * 2002-06-14 2013-03-25 Verenium Corp Xylanaser, nucleinsyrer, som koder herfor, og fremgangsmåder til at fremstille og benytte disse
US20040191362A1 (en) * 2003-03-26 2004-09-30 Dasappa Indrani Synergistic improver mix
WO2004103086A2 (en) * 2003-05-12 2004-12-02 Alltech, Inc. Methods for improving the nutritional quality of residues of the fuel, beverage alcohol, food and feed industries
JP2007529993A (ja) 2003-07-02 2007-11-01 シンジェンタ パーティシペーションズ アーゲー グルカナーゼ、それらをコードする核酸並びにそれらを製造及び使用する方法
CA2561020C (en) * 2004-03-25 2014-05-13 Novozymes Inc. Methods for degrading or converting plant cell wall polysaccharides
US8802170B2 (en) * 2004-04-09 2014-08-12 Asahi Breweries, Ltd. Method of manufacturing liquid koji
WO2005118800A1 (en) * 2004-05-27 2005-12-15 Genencor International, Inc. Heterologous expression of an aspergillus kawachi acid-stable alpha amylase and applications in granular starch hydrolysis
RU2409659C2 (ru) * 2005-07-22 2011-01-20 Асахи Брюэриз, Лтд. Способ получения жидкого коджи
MY143774A (en) * 2005-09-20 2011-07-15 Asahi Breweries Ltd Method of producing liquid koji having enhanced plant fiber degradation enzyme, liquid koji obtained by the method and use thereof
BRPI0616479A2 (pt) * 2005-10-05 2012-12-25 Asahi Breweries Ltd mÉtodo para produzir produto de cultura de fungo filamentoso, produto de cultura de fungo filamentoso, mÉtodo para produzir preparaÇço de enzima, preparaÇço de enzima, mÉtodo para produzir enzimas pelo uso de meio lÍquido, enzimas, e, mÉtodos para produzir bebidas e alimentos fermentados e bebidas e alimentos fermentados
JP4096009B2 (ja) * 2005-10-12 2008-06-04 アサヒビール株式会社 組換えタンパクの製造方法
CN100448979C (zh) * 2005-12-09 2009-01-07 山东省中协食品添加剂研究开发中心 一种酶法生产木糖的方法
FR2898605B1 (fr) * 2006-03-17 2008-06-27 J Soufflet Sa Ets Complement nutritionnel pour milieu de saccharification-fermentation dans la production d'ethanol
US8304212B2 (en) * 2006-07-10 2012-11-06 Dyadic International, Inc. Methods and compositions for degradation of lignocellulosic material
CN101117628B (zh) * 2006-08-01 2010-12-08 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 生产植酸酶的方法
EP2444413A1 (en) 2006-08-04 2012-04-25 Verenium Corporation Methods for oil or gas well drilling, washing and/or fracturing
ES2438268T3 (es) 2006-09-21 2014-01-16 Verenium Corporation Fitasas, ácidos nucleicos que las codifican y métodos para su producción y uso
ES2451266T3 (es) 2006-09-21 2014-03-26 Dsm Ip Assets B.V. Fosfolipasas, ácidos nucleicos que las codifican, y métodos para obtenerlas y usarlas
DK2479266T3 (en) 2006-12-21 2016-06-20 Basf Enzymes Llc Amylases and glucoamylases, nucleic acids encoding them, and methods of making and using the same
CA2723113C (en) * 2008-04-29 2018-06-26 Icm, Inc. Pretreatment of grain slurry with alpha-amylase and a hemicellulase blend prior to liquefaction
EA020036B1 (ru) * 2008-10-24 2014-08-29 Унилевер Н.В. Замороженное кондитерское изделие и способ его получения
AR074835A1 (es) 2008-12-19 2011-02-16 Danisco Proceso para la produccion de un producto de enzimas mediante la fermentacion sumergida con aspergillus
AU2010249500B2 (en) 2009-05-21 2016-03-24 Basf Enzymes Llc Phytases, nucleic acids encoding them and methods for making and using them
UA109884C2 (uk) 2009-10-16 2015-10-26 Поліпептид, що має активність ферменту фосфатидилінозитол-специфічної фосфоліпази с, нуклеїнова кислота, що його кодує, та спосіб його виробництва і застосування
UA111708C2 (uk) 2009-10-16 2016-06-10 Бандж Ойлз, Інк. Спосіб рафінування олії
FR2960551B1 (fr) * 2010-05-27 2012-09-14 Comptoir Agricole Production de molecules d'interet en milieu solide
CN102550895A (zh) * 2010-12-28 2012-07-11 雀巢公司 来自于食物固态发酵的酶制剂
BR112013027582A2 (pt) * 2011-04-29 2017-02-14 Danisco Us Inc Genencor Div uso de celulase e glicoamilase para aprimorar os rendimentos de etanol de fermentação
CN102676483A (zh) * 2012-01-15 2012-09-19 河南科技大学 一种一菌多酶菌株产蛋白酶的方法
MD4186C1 (ro) * 2012-02-20 2013-06-30 Институт Микробиологии И Биотехнологии Академии Наук Молдовы Tulpină de fungi Fusarium gibbosum - producătoare de proteaze acide şi neutre, xilanaze şi b-glucozidaze
BR112013005916B1 (pt) * 2012-05-03 2021-01-05 Universidade Federal Do Rio De Janeiro - Ufrj processo integrado para produção de biocombustíveis
MD4285C1 (ro) * 2013-02-28 2014-12-31 Институт Микробиологии И Биотехнологии Академии Наук Молдовы Tulpină de fungi Trichoderma koningii Oudemans - producătoare de proteaze acide, neutre şi alcaline
CN103305428B (zh) * 2013-06-26 2015-02-18 武汉合缘绿色生物工程有限公司 一种黑曲霉菌株及其应用
FR3016768B1 (fr) * 2014-01-27 2016-02-26 J Soufflet Ets Utilisation d'une composition enzymatique dans l'alimentation des ruminants
US11447757B2 (en) 2016-03-08 2022-09-20 Basf Enzymes Llc Methods for using phytase in ethanol production
CN106754838B (zh) * 2017-01-20 2020-06-09 上海绿农饲料科技有限公司 一种提高黑曲霉产蛋白酶能力的方法
EP3530743A1 (en) 2018-02-21 2019-08-28 Cambridge Glycoscience Ltd Method of production
CA3109239A1 (en) 2018-08-15 2020-02-20 Cambridge Glycoscience Ltd Novel compositions, their use, and methods for their formation
CN110373401A (zh) * 2019-07-22 2019-10-25 武汉新华扬生物股份有限公司 一种麻花用复配酶制剂及其制备方法和应用
EP4013240A1 (en) 2019-08-16 2022-06-22 Cambridge Glycoscience Ltd Methods of treating biomass to produce oligosaccharides and related compositions
WO2021116437A2 (en) 2019-12-12 2021-06-17 Cambridge Glycoscience Ltd Low sugar multiphase foodstuffs
CN111549006B (zh) * 2020-06-08 2023-03-28 杭州保安康生物技术有限公司 富含淀粉酶的复合酶的制备及其菌株和应用
CN111549020B (zh) * 2020-06-08 2023-03-28 杭州保安康生物技术有限公司 富含酸性果胶酶的复合酶的制备及其菌株和应用
CN112300945B (zh) * 2020-06-16 2022-09-27 青海民族大学 一种黑曲霉固态发酵产饲用复合酶制剂及其制备工艺
CN115747262A (zh) * 2021-09-03 2023-03-07 国投生物科技投资有限公司 利用小麦生产乙醇的方法
CN114081189B (zh) * 2021-10-09 2022-12-09 中国科学院微生物研究所 黑曲霉菌株酶制剂提高豌豆膳食纤维纯度的方法
CN114015580B (zh) * 2021-10-14 2023-08-08 吉林中粮生化有限公司 一种显著提高发酵饲料小肽含量的菌株及方法

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3151983A (en) * 1961-05-09 1964-10-06 Nopco Chem Co Animal feed
SU489787A1 (ru) * 1974-01-02 1975-10-30 Внии Биосинтеза Белковых Веществ Главного Управления Микробиологической Промышленности Штамп плесневого гриба 22/12-продуцент карбогидразного комплекса ферментов
SU988867A1 (ru) * 1981-07-23 1983-01-15 Всесоюзный Научно-Исследовательский Институт Продуктов Брожения Способ приготовлени посевного материала дл культивировани плесневых грибов вида aSpeRGILLUS аUтамоRI,продуцирующих глюкоамилазу (его варианты)
FR2701487B1 (fr) 1993-02-10 1995-03-31 Agronomique Inst Nat Rech Réacteur pour conduire de façon stérile des procédés de fermentation d'un produit à l'état solide.

Also Published As

Publication number Publication date
CA2361264C (en) 2011-01-04
FR2788782B1 (fr) 2003-01-31
US6667066B2 (en) 2003-12-23
CA2361264A1 (en) 2000-07-27
DE60019825D1 (de) 2005-06-09
BR0007600A (pt) 2001-10-30
WO2000043496A1 (fr) 2000-07-27
AU775240B2 (en) 2004-07-22
PT1022329E (pt) 2005-08-31
PL350672A1 (en) 2003-01-27
ES2244395T3 (es) 2005-12-16
ATE294852T1 (de) 2005-05-15
RU2246536C2 (ru) 2005-02-20
US20020037342A1 (en) 2002-03-28
ID29922A (id) 2001-10-25
ZA200107009B (en) 2002-07-31
EP1022329B1 (fr) 2005-05-04
HUP0104907A2 (hu) 2002-04-29
EP1022329A1 (fr) 2000-07-26
AU3059800A (en) 2000-08-07
DK1022329T3 (da) 2005-09-05
JP2002534973A (ja) 2002-10-22
MA25276A1 (fr) 2001-10-01
BRPI0007600B1 (pt) 2017-03-14
FR2788782A1 (fr) 2000-07-28
CN1203170C (zh) 2005-05-25
DE60019825T2 (de) 2006-04-27
CN1337998A (zh) 2002-02-27
MXPA01007528A (es) 2003-03-27
TR200102156T2 (tr) 2002-05-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
PL201768B1 (pl) Produkt multienzymatyczny, sposób wytwarzania produktu multienzymatycznego, oraz zastosowania produktu multienzymatycznego
JP5412272B2 (ja) エタノール製造のための同時糖化‐発酵培養基用の栄養剤
Milagres et al. Production of xylanase by Thermoascus aurantiacus from sugar cane bagasse in an aerated growth fermentor
RU2001124277A (ru) Полиферментный продукт с глюкоамилазной, протеолитической и ксиланазной активностями, а также способ его получения путем твердофазного сбраживания пшеничных отрубей с помощью Aspergillus niger
BRPI0611787A2 (pt) preparação de fermento lìquido estabilizada, um método para a produção da mesma, e o seu uso
ES2357117T3 (es) Composición de levadura natural líquida.
HU194583B (en) Process for ensilaging food and cereals
Roche et al. Study on the solid-state production of a thermostable α-L-arabinofuranosidase of Thermoascus aurantiacus on sugar beet pulp
CN104263653A (zh) 一种醋曲的制作方法及醋曲
Han et al. Amylolysis of raw corn by Aspergillus niger for simultaneous ethanol fermentation
US20140212948A1 (en) Xylanase composition with increased stability
CN108076968A (zh) 一种金针菇培养基
JPH06506107A (ja) キシラナーゼ、キシラナーゼを産生するバチルス株およびその利用
Gerbi et al. Polysaccharide hydrolase production by the rumen fungus Caecomyces communis
Savoie et al. Stimulation of environmentally controlled mushroom composting by polysaccharidases
Brabban et al. Characterization of growth and product formation by a thermophilic streptomycete grown in a particulate rapemeal‐derived liquid medium
US3071517A (en) Process of producing ferment preparations and products obtained thereby
CN109576243A (zh) 一种用于白酒酿造的复配酶制剂及其制备方法、白酒及其酿造方法
JPS60176585A (ja) 生化学的方法および組成物