ES2244395T3 - Composicion multienzimatica con actividades glucoamilasica; proteolitica y xilanasica y procedimiento para su produccion por fermentacion en estado solido de salvado de trigo con aspergillus. - Google Patents

Composicion multienzimatica con actividades glucoamilasica; proteolitica y xilanasica y procedimiento para su produccion por fermentacion en estado solido de salvado de trigo con aspergillus.

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ES2244395T3 ES00400188T ES00400188T ES2244395T3 ES 2244395 T3 ES2244395 T3 ES 2244395T3 ES 00400188 T ES00400188 T ES 00400188T ES 00400188 T ES00400188 T ES 00400188T ES 2244395 T3 ES2244395 T3 ES 2244395T3
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Abstract

Una composición que presenta actividades glucoamilásica, proteólica y xilanásica, caracterizada porque contiene salvado de trigo fermentado con una cepa de Aspergillus elegida entre las cepas ATCC 201202, ATCC 76060, ATCC 76061, MUCL 28815, MUCL 28816, NRRL 3112 o con una cepa de Aspergillus oryzae elegida entre las cepas ATCC 22788 y ATCC 42149, estando presente dichas actividades enzimática glucoamilásica proteolítica y xilanásica en los siguientes valores mínimos: - glucoamilásica: al menos 100 UG por gramo de materia seca - proteolítica: al menos 100 UP por gramo de materia seca - xilanásica: al menos 100 UX por gramo de materia seca, siempre que la actividad glucoamilásica sea de al menos 750 UG por gramo de materia seca y/o la actividad xilanásica sea de al menos 300 UX por gramo de materia seca.

Description

Composición multienzimática con actividades glucoamilásica; proteolítica y xilanásica y procedimiento para su producción por fermentación en estado sólido de salvado de trigo con Aspergillus.
La invención se refiere a una composición con actividades glucoamilásica, proteolítica y xilanásica y a un procedimiento para su producción mediante fermentación en estado sólido de salvado de trigo con Aspergillus niger.
Se conoce la producción de etanol a partir de almidón de maíz mediante un procedimiento enzimático que comprende una etapa de licuefacción del almidón mediante una alfa-amilasa, destinada a hidrolizar el almidón en dextrinas, seguido de una etapa de sacarificación mediante una glucoamilasa (también denominada amiloglucosidasa) destinada a hidrolizar las dextrinas en glucosa, y finalmente una etapa de fermentación de este último etanol.
La aplicación de las enzimas alfa-amilasa y glucoamilasa es generalmente satisfactoria cuando se parte de leches de almidón relativamente puras obtenidas por trituración por vía húmeda del maíz, pero cuando se quiere sustituir los almidones de trigo o las harinas del trigo por el almidón del maíz, no se obtienen resultados satisfactorios con estas dos únicas enzimas debido a la presencia de hemicelulosas que incrementan la viscosidad de los mostos de harina sacarificados hasta el punto de que esto crea un problema para ejecutar el procedimiento. Es necesario utilizar la etapa de sacarificación de las enzimas auxiliares como celulosas y hemicelulasas para reducir la viscosidad y solventar este problema. Por otra parte, es deseable utilizar asimismo proteasas durante la sacarificación con el fin de hidrolizar las proteínas de la harina y de enriquecer de esta forma el mosto con nitrógeno soluble en previsión de la etapa posterior de fermentación alcohólica. El aporte de fuente nitrogenada necesario para el crecimiento de las levaduras tradicionalmente efectuado durante esta fermentación puede de este modo reducirse.
Todas estas enzimas están disponibles individualmente en el mercado en forma purificada, pero tienen el inconveniente de ser relativamente caras y, por consiguiente, de gravar el coste de la producción del etanol de trigo. Además, es necesario formular composiciones a partir de enzimas individuales, lo que complica el procedimiento.
El artículo de ABRAHAM y Col. "Development of an alternate route for the hydrolysis of cassava flour" Starch Starke, vol. 41, nº 2, 1989, páginas 472-476, describe la preparación y la utilización de salvado de trigo fermentado en estado sólido con Aspergillus niger como fuente de amiloglucosidasa para la hidrólisis de harina de mandioca. El salvado de trigo se humidifica y trata térmicamente, y después se fermenta en estado sólido de 1 a 2 días. El procedimiento descrito por ABRAHAM permite obtener una actividad glucoamilásica reducida (110-224 IU/g).
LABEILLE P y Col: "Comparative study of wheat flour saccharification and ethanol production with two glucoamylase preparations", Industrial crops and products, vol. 6, nº 3-4, 1 de agosto de 1997, páginas 291-295, describe una preparación a partir de cepas de Aspergillus niger, de una composición denominada AAI y que presenta actividades glucoamilásica, proteolítica y hemicelulasa, destinadas a la sacarificación de harina de trigo. El artículo de LABEILLE P y Col. no requiere el procedimiento de fabricación de la composición AAI.
Por consiguiente, hay una necesidad de una composición, barata, que combine actividades glucoamilásica, proteolítica y hemicelulásica con el fin de poder producir etanol a partir de harinas de trigo con un coste reducido.
El objetivo de la invención es dar respuesta a esta necesidad.
La presente invención se refiere a una composición según la reivindicación 1.
Preferentemente, la actividad glucoamilásica es de al menos 1500 UG por gramo de materia seca y/o la actividad xilanásica es de al menos 400 UX por gramo de materia seca.
Asimismo, preferentemente la actividad proteolítica es de al menos 400 UP por gramo de materia seca.
La invención se refiere también a un procedimiento según la reivindicación 8.
Preferentemente, la actividad glucoamilásica es de al menos 1500 UG por gramo de materia seca y/o la actividad xilanásica es de al menos 400 UX por gramo de materia seca.
Asimismo, preferentemente la actividad proteolítica es de al menos 400 UP por gramo de materia seca.
Preferentemente, la cepa de Aspergillus niger se selecciona entre la cepa NRRL 3112, la cepa ATCC 76061 y las cepas obtenidas a partir de dichas cepas mediante selección o mutación cuando se busca una actividad glucoamilásica elevada. La cepa ATCC 76061 es particularmente preferida.
Cuando se busca una actividad glucoamilásica elevada, el salvado de trigo utilizado como materia de partida debe ser un salvado no desalmidonado. Al margen de esta restricción, se puede utilizar un salvado cualquiera. Preferentemente, no obstante, el salvado incluye una proporción significativa (al menos un 40% en peso) de partículas inferiores a 1 mm.
A continuación se indica, a título ilustrativo y no limitativo, las características de los dos salvados convenibles.
Características Salvado A Salvado B
Humedad (%) 12,3 19,5
Contenido en proteinas (%MH*) 13,8 14,8
Contenido en almidón (%MH*) 24,6 21,3
Granulometría
>1,25 mm 53,9 0,7
entre 1,0 y 1,25 mm 8,1 1,3
entre 0,5 y 1,0 mm 33,3 68,2
entre 0,25 y 0,5 mm 3,7 24,6
entre 0,16 y 0,25 mm 0,3 2,6
>0,16 mm 0,7 2,6
%MH = % en relación con la materia húmeda.
El salvado de trigo debe estar humidificado y tratado térmicamente con vistas a su pasteurización o esterilización. Es ventajoso que el tratamiento térmico no preceda a la humidificación, ya que se han observado resultados de fermentación mediocres en caso de que se trate térmicamente el salvado antes de humidificarlo. El tratamiento térmico puede consistir en un calentamiento, por ejemplo en un autoclave. Un tratamiento en autoclave de 20 mn, a 120-121ºC, ha resultado muy satisfactorio, pero condiciones menos severas (pasteurización a 105ºC, durante 15 mn en una estufa) también son convenientes. Es posible asimismo realizar el tratamiento térmico del salvado inyectando en el mismo vapor de agua, lo que puede permitir realizar simultáneamente la humidificación del salvado.
Ventajosamente, se puede regular el pH durante la humidificación en un rango de 4 a 5.5 con el fin de mejorar el efecto pasteurizante del tratamiento térmico y el arranque de la fermentación deseada.
Además de su función de esterilización, el tratamiento térmico tiene como efecto favorecer la gelatinización del almidón contenido en el salvado de trigo y, por consiguiente, la disponibilidad de este sustrato para el hongo Aspergillus niger, lo que permite fermentaciones más eficaces.
La humidificación del salvado es importante ya que el contenido en agua influye en el rendimiento de la fermentación. El contenido en agua inicial del salvado se regula inicialmente al 50-60%, preferentemente al 50-55%, de la masa total del salvado y del agua y se mantiene sensiblemente en este intervalo durante la fermentación, por ejemplo procediendo periódicamente a aportaciones de agua para compensar la pérdida en agua del medio. La expresión "se mantiene sensiblemente" significa que es tolerable que el índice de humedad llegue a un valor que se aparte un poco (\pm 5 unidades %) del intervalo de 50-60% durante un período relativamente breve entre dos ajustes sucesivos de la tasa de humedad o al final de la fermentación. Es ventajoso, en cualquier caso, no descender por debajo de un índice de humedad del 45%. La tasa de humedad del medio de cultivo tiende a bajar durante el cultivo por evaporación, bajo el efecto del aumento de la temperatura generada por el crecimiento fúngico, siendo dicho medio un mal conductor de calor. La calidad del agua utilizada también desempeña un papel no despreciable. Se puede utilizar agua corriente de buena calidad o agua destilada.
La inoculación del salvado de trigo puede realizarse con cualquier inoculante apropiado. El experto en la técnica conoce múltiples formas de preparar un inoculante apropiado a partir de una cepa seleccionada. La dosis de inoculación es ventajosamente de al menos 1 x 10^{7} esporas/gramos de materia seca inicial.
La fermentación puede llevarse a cabo en cualquier reactor apropiado. Algunos ejemplos de un reactor que se puede utilizar son los descritos en el artículo de A. DURAND y Col. publicado en Agra - Food - Industry Hi - Tech (Mayo - Junio 1997, páginas 39-42).
La fermentación puede llevarse a cabo durante un período de 1 a 3 días, preferentemente de 30 a 60 horas. Por debajo de 1 día, la fermentación es demasiado incompleta. Al cabo de 3 días, la fermentación está finalizada o prácticamente finalizada de manera que no resultaría económico prolongarla más. La temperatura del medio se mantiene típicamente entre 28ºC y 38ºC, preferentemente entre 32ºC y 36ºC, lo que corresponde al ámbito de actividad óptimo conocido de las cepas Aspergillus niger a utilizar en la invención. Ventajosamente, para ello, la temperatura del aire se regula a 34ºC-38ºC durante las primeras horas de la fermentación para favorecer la germinación de esporas, reduciéndose a
continuación a 28ºC-32ºC para el resto de la fermentación, para contribuir a la regulación de la temperatura del medio.
Normalmente, el pH del medio de fermentación no se regula. Si su valor de partida es cercano a 6.0-6.4, el pH baja a 3.8-4.2 durante el cultivo, remontando después al final. Este retorno está por lo general en correlación con la fase de esporulación del hongo. El seguimiento de la evolución del pH constituye un buen indicador del estado del cultivo.
El fermentador debe ser ventilado, preferentemente de forma continua, con el fin de aportar el oxígeno necesario para la fermentación y evitar la acumulación excesiva de dióxido de carbono producido por la fermentación. Además, la ventilación contribuye al control de la temperatura y de la humedad del medio de cultivo. Preferentemente, el aire estará sensiblemente saturado de agua para limitar la tendencia a la desecación del medio. Es difícil dar indicaciones cuantitativas sobre el caudal de ventilación, ya que intervienen múltiples variables, en particular el tamaño y la geometría del reactor, la cantidad del salvado cargado, etc. No obstante, unos sencillos ensayos rutinarios permitirán al experto en la materia determinar fácilmente un caudal de ventilación conveniente en cada caso práctico.
La carga de salvado en el fermentador debe ajustarse periódicamente utilizando medios de agitación, como brazos agitadores, láminas o espátulas, o ejes helicoidales durante la fermentación, con vistas a evitar la formación de masas impermeables y para que la ventilación afecte de la forma más homogénea posible a toda la masa del salvado. No obstante, deberá evitarse una agitación demasiado enérgica que podría perjudicar al hongo.
La composición de la invención es una composición sólida que es útil en particular para la producción de etanol a partir de trigo. Puede añadirse directamente al almidón licuado (dextrinas) obtenido en la etapa de licuefacción, al objeto de proceder a la sacarificación. Para esta aplicación, el factor más importante es la actividad glucoamilásica. Por consiguiente, se utilizará, preferentemente, una composición de la invención que tenga una actividad glucoamilásica, por ejemplo de al menos 750 UG, preferentemente de al menos 1500 UG por gramo de materia
seca.
Otra posible utilización de la composición de la invención se refiere a la producción de alimentos a base de trigo para animales monogástricos, por ejemplo las aves y los cerdos. En esta aplicación, el factor más importante es la actividad xilanásica. Por consiguiente, se utilizará, preferentemente, en esta aplicación, una composición que tenga una actividad xilanásica elevada, por ejemplo de al menos 400 UX por gramo de materia seca.
La composición de la invención puede secarse o congelarse con vistas a su conservación, si así se desea.
El secado debe realizarse a una temperatura moderada para no afectar a la actividad enzimática. Un calentamiento en estufa a 40ºC ha resultado apropiado, por ejemplo. Por su parte, la congelación puede realizarse sobre la composición húmeda a baja temperatura, por ejemplo a -20ºC.
En los ejemplos, las diversas actividades enzimáticas se han medido utilizando los siguientes métodos:
a) Actividad glucoamilásica
La acción de una preparación de glucoamilasa (GA) en una solución de almidón provoca la liberación de azúcares y reductores. Calentados a 100ºC en presencia de ácido 3,5-dinitrosalicílico (DNS), estas composiciones adoptan un color marrón medido con el espectrofotómetro (Kontron Instruments, Milán, Italia) a 540 nm.
El medio reactivo contiene
\bullet Solución de almidón 1%: 500 \mul
\bullet Tampón citrato 0,1 a pH 4.5 450 \mul
\bullet Solución enzimática: 50 \mul
La reacción se desarrolla durante 30 minutos a 60ºC (55ºC para las GA de A. orizae). Se toman muestras cada 5 minutos, mezcladas con DNS y colocadas en un baño helado. A continuación se calientan durante 5 minutos a 100ºC, se enfrían rápidamente y a continuación se dosifican a 540 nm.
Hemos establecido estas condiciones de dosificación tras haber estudiado la influencia de temperatura y del pH en la actividad de nuestras preparaciones de GA. Se ha utilizado como sustrato de esta hidrólisis enzimática almidón soluble Merck (Darmstadt, Alemania). El DNS se prepara según el protocolo propuesto por P. Bernfeld, Methods in enzymology, 1, 149-158 (1955) que es el siguiente:
\alpha Disolver previamente:
\text{*}
10 g de ácido 3,5-dinitrosalicílico,
\text{*}
200 ml de sosa 2 molares
\text{*}
200 ml de agua destilada.
\alpha Añadir a continuación:
\text{*}
300 g de tartrato doble de potasio de sodio.
\alpha Completar el volumen hasta 1 litro con agua destilada tras disolución total.
Una vez preparado, este reactivo debe conservarse fuera de la luz. Las curvas de calibrado se han establecido con glucosa como producto de referencia para la dosificación de la actividad glucoamilasa o para el seguimiento de las reacciones de licuefacción- acarificación, y con xilosa para medir la actividad xilanasa.
Una unidad de actividad glucoamilasa (UG) corresponde a la cantidad de enzima necesaria para la liberación de un micromol de extremidades reductoras por minuto en las condiciones de la dosificación con la glucosa como referencia. La actividad glucoamilasa, calculada mediante la fórmula que se indica más abajo, se remite a la cantidad de materia seca inicial (MSI):
A = (P/Venz)*(Vferm/Mferm)
\text{*}
A corresponde a la actividad GA expresada en UG.gMSI^{-1}(\mumol.min^{-1}.gMSI^{-1}),
\text{*}
P corresponde a la velocidad de liberación de equivalentes glucosa en \mumol.min^{-1},
\text{*}
Venz representa el volumen de la solución de enzimas dosificado en ml,
\text{*}
Vferm es el volumen total de agua destilada utilizado para extraer la solución de enzimas en ml,
\text{*}
Mferm, expresado en g de MSI, corresponde a la masa inicial de producto seco del que se ha extraído la solución de enzimas.
b) Actividad proteasa
Esta dosificación se ha puesto a punto sobre azocaseína según el método de Béinon, descrito en la obra "Proteins Purification Methods - a Practical Approach", Harris E.L.V. y Angal, S (Editores), IRL-Press, Oxford University Press, 1-66 (1989). La degradación de este sustrato por proteasas provoca la liberación de agrupamientos azo que absorben en el UV a 340 nm. La evolución de la absorbencia durante la cinética de hidrólisis de esta proteína indica la importancia de la reacción.
El medio de reacción contiene:
* Solución de azocaseína al 1%, pH 5,0: 1000 \mul
* Solución enzimática: 200 \mul
La azocaseína (Sigma, Saint-Louis, Estados Unidos) se disuelve en un tampón acetato 0,1 M a pH 5.0. Se han dosificado las actividades proteasas con este pH ya que la azocaseína es insoluble en el tampón acetato a pH inferiores. La reacción enzimática se realiza a 60ºC. Se toman muestras cada 5 minutos durante 20 minutos y se mezclan con ácido tricloroacético (TCA) al 5% para detener la reacción.
Una unidad de actividad proteasa (UP) corresponde a la cantidad de enzimas necesaria para el aumento de 0,01 unidades A_{340nm} por minuto, generado por la liberación de grupos azo en las condiciones anteriormente citadas. Esta actividad, calculada según la fórmula indicada a continuación, se remite a la materia seca inicial (UP.G^{-1} MSI) o la actividad glucoamilasa (UP-UG^{-1}):
A = (P/Venz)*(Vferm/Mferm)
\text{*}
A corresponde a la actividad proteasa expresada en UP.gMSI^{-1},
\text{*}
P corresponde a la velocidad de liberación de los agrupamientos expresada en aumento de 0,01 unidades A_{340nm}.min^{-1},
\text{*}
Venz representa el volumen de la solución de enzimas dosificado en ml,
\text{*}
Vferm es el volumen total de agua destilada utilizada para extraer la solución de enzimas en ml,
\text{*}
Mferm, expresado en g de MSI, corresponde a la masa inicial de producto seco del que se ha extraído la solución de enzimas.
c) Actividad xilanasa
Para poner en evidencia esta actividad enzimática, se hacen actuar las preparaciones de GA en una solución de xilano soluble y se han medido los azúcares reductores liberados por el método al DNS.
\newpage
El medio de reacción está compuesto por:
* Solución de xilano al 1%, pH 4.5: 900 \mul
* Solución enzimática: 100 \mul
La solución de xilano de melezo (Sigma al 1% se prepara en un tampón citrato con pH 4.5 y la reacción se desarrolla a 60ºC. Se realizan tomas de muestras cada 5 minutos durante 20 minutos, mezcladas con DNS y colocadas en un baño helado. A continuación se dosifican según un protocolo idéntico al expuesto para la medición de las actividades GA con la xilosa como referencia.
Una unidad de actividad xilanasa (UX) corresponde a la cantidad de enzimas necesaria para la liberación de un micromol de azúcares reductores por minuto. Esta actividad se refiere a la materia seca inicial (UX.g^{-1} MSI) o a la actividad glucoamilasa (UX.UG^{-1}). Para calcular esta actividad, hemos retomado la fórmula definida para el cálculo de las actividades GA en la que:
\text{*} A corresponde a la actividad xilanasa expresada en UX.gMSI^{-1} (\mumol.min^{-1}.gMSI^{-1}),
\text{*} P corresponde a la velocidad de liberación de equivalente xilosa en \mumol.min^{-1},
\text{*} Los demás términos de la fórmula no se modifican.
Los ejemplos no limitativos siguientes se recogen con vistas a ilustrar la invención.
Ejemplo 1 Selección de cepas de Aspergillus
Se ha estudiado de forma comparativa la capacidad de siete cepas diferentes de Aspergillus disponibles en el mercado para producir glucoamilasa por fermentación en medio sólido de salvado de trigo.
Los ensayos se han realizado sobre 50 g de medio de fermentación en un matraz de Erlenmeyer. El medio estará constituido por 21,5 g de salvado de trigo, 27,5 g de agua y 1 g de almidón de trigo. El pH inicial del medio era de 6.0-6.5. El medio se esterilizó durante 20 minutos en un autoclave a 120ºC.
Se inoculó cada uno de los medios con 2.10^{7} de esporas de la cepa objeto de la prueba por gramo de materia seca inicial. La edad de las esporas era de 3 días. Se dejó que la fermentación se desarrollará durante 40 ó 50 horas, colocando los matraces de Erlenmeyer en una estufa a 35ºC. Al final de la fermentación se mezcló el medio fermentado con 150 ml de agua destilada con el fin de poner a las enzimas producidas en solución, y después se filtró para recuperar la solución enzimática. Se centrifugó la solución para eliminar las esporas y partículas residuales, y después se envasó la solución en frascos de 100 ml conservados a -20ºC hasta el análisis de la actividad glucoamilásica.
Las cepas objeto de la prueba y los resultados obtenidos se recogen en la tabla 1 siguiente:
Ref. cepas de colecciones Duración de la FMS Ac GA (UG.g-1 MSI)
A. niger ATCC76060 50 627
A. niger ATCC 76061 50 943
A. niger MUCL 28815 40 710
A. niger MUCL 28816 40 631
A. niger NRRL 3112 50 1056
A. oryzae ATCC 22788 50 903
A. orizae ATCC 42149 50 861
Se observa que las cepas A. niger NRRL 3112, A, niger ATCC 76061 y A. oryzae ATCC 226788 presentan las mejores actividades en cuanto a producción de glucoamilasa.
Otra propiedad importante que debe tenerse en cuenta, no obstante, es la estabilidad de la glucoamilasa producida. Por consiguiente, se ha procedido a ensayos de termoestabilidad efectuando tratamientos térmicos de las soluciones enzimáticas a 55 y 60ºC durante 30 minutos y midiendo la actividad de la glucoamilasa al cabo de este tiempo. Estos tratamientos se acercan a las condiciones de utilización para la sacarificación del almidón. Se ha observado que las cepas A niger ATCC 76061 y A. niger NRRL 3112 daban las glucoamilasas más estables (un 100% de actividad residual al cabo de 30 minutos a 55ºC y aproximadamente un 50% de actividad residual al cabo de 30 minutos a 60ºC), mientras que las cepas A oryzae ATCC 22788 y ATCC 42149 daban glucoamilasas con un 0% de actividad residual al cabo de 30 minutos al 60ºC y del 46% de actividad residual al cabo de 30 minutos a 55ºC. Por consiguiente esto nos ha llevado a seleccionar las cepas ATCC 76061 y NRRL 3112 de A. niger. Por otra parte, la cepa A. niger NRRL 3112 ha resultado ser genéticamente bastante inestable (pérdida de actividad al cabo de algunos ciclos reproductores) de manera que la cepa preferida es la cepa ATCC 76061 de A. niger. Por lo tanto esta es la cepa utilizada en los siguientes ejemplos.
Ejemplo 2 Producción de glucoamilasas en cubetas piloto suministradas por el INRA de 60 l no estériles: importancia del pre-tratamiento del salvado de trigo
Los ensayos se han realizado con un fermentador no estéril de 50 l, de según el descrito en el artículo de A. DURAND y colaboradores anteriormente citado (Figura 1) y del salvado de trigo BCE (suministrado por la destilería Brie Champagne Ethanol, Provins, Francia). Se han aplicado dos modos de preparación del salvado para obtener 5 kg medio de cultivo al 55% de humedad:
\bullet
salvado seco: el salvado es sometido a autoclave 1 hora a 105ºC y después mezclado con agua (ensayo F4C3);
\bullet
salvado húmedo: el salvado se humidifica al 45% en una amasadera y sometido a autoclave durante 20 minutos a 121ºC (ensayo F4C4).
En ambos casos, se efectúa una inoculación con 2.10^{7} de esporas.g^{-1} MS y se regula el contenido en agua de los medios a aproximadamente 55%. A continuación se fermentan en 10 cm de altura de cepa en cubetas ventiladas. Durante estos cultivos, el medio se estría por intermitencia mediante una espátula para reducir su temperatura. Durante la fermentación, la atmósfera se renueva de forma permanente mediante aire acondicionado cuya temperatura, humedad y caudal son los indicados en las tablas.
Los resultados se presentan en las tablas 2 (ensayo F4C3) y 3 (ensayo F4C4).
Estos datos permiten despejar varias conclusiones:
- La humidificación del salvado de trigo, antes del tratamiento térmico es necesaria para una producción de glucoamilasas eficaz. Más allá de la descontaminación, el tratamiento térmico del salvado de trigo favorece supuestamente la gelatinización del almidón.
- El pH aparece como un buen indicador cualitativo de la evolución del crecimiento y de la producción de GA fúngicas, sin permitir no obstante que calcular la cantidad de GA obtenido.
- Una ligera agitación del medio (estriado) no altera la producción de enzimas.
- La evolución del contenido en agua durante estas dos fermentaciones indica un desecamiento considerable del medio de cultivo que podría ser perjudicial para el crecimiento fúngico.
Ejemplo 3 Producción de glucoamilasas en fermentador piloto suministrado por la sociedad FUJIWARA: importancia del mantenimiento de la humedad del medio durante la fermentación
Este ensayo se llevó a cabo con un fermentador piloto vendido por la empresa FUJIWARA, Okayama, Japón y salvado de trigo BCE. Difiere considerablemente del fermentador utilizado en el ejemplo 2 por el diámetro de la cubeta que es de 0,66 m frente a 0,35 m para las cubetas INRA. En este fermentador son necesarios 20 kg de medio al 55% de agua, preparado según el modo de salvado húmedo descrito en el ejemplo 2 para realizar un cultivo en 12 cm de espesor. La agitación se asegura mediante 3 ejes helicoidales verticales de rotación constante que mezclan el medio en la cubeta en rotación (5-10 min/vuelta). Durante la fermentación, como en el caso de las cubetas INRA del ejemplo 2, la atmósfera gaseosa se renueva permanentemente mediante un aire acondicionado cuya temperatura, humedad y caudal son los indicados en la tabla 4.
Durante este ensayo denominado FII, se ha estudiado la conveniencia de una regulación de la humedad. Se utilizan mediciones puntuales de la humedad del cultivo, efectuadas con un aparato de infrarrojos, y de la masa del medio, para determinar la cantidad de agua a añadir para mantener el contenido en agua del medio por debajo del 50%.
Los resultados de este ensayo FII se recogen en la tabla 4. Los resultados obtenidos suscitan los siguientes comentarios:
- FII indica claramente que el mantenimiento del contenido en agua entre el 50 y el 55% favorece la producción de enzimas con 1600 UG/g MS liberados al cabo de 44 horas de fermentación, es decir más del doble de la actividad obtenida durante el ensayo F4C2 del ejemplo 2 que no había contado con esta regulación.
- La estabilización de la producción de enzimas a partir de 44 horas de cultivo correlacionada con la aparición de esporas fúngicas demuestra que no es necesario proseguir con el cultivo más allá de esta fase.
- Una regulación satisfactoria de la temperatura del medio en torno a 35ºC puede obtenerse mediante una buena combinación del condicionamiento del aire y de la agitación del medio.
- El cultivo soporta sin daños la agitación intermitente aplicada por el sistema de agitación del fermentador FUJIWARA.
Ejemplo 4 Producción de glucoamilasas en fermentador piloto INRA agitado de 50 l: utilidad de un pre-tratamiento térmico del salvado con vapor y de un cultivo en "condiciones estériles"
Este fermentador piloto es similar al presentado en WO-A-94 18306 y en la figura 4 del artículo de A. DURAND y colaboradores anteriormente citado. Esta herramienta permite tratar el salvado con vapor directamente en el fermentador, el modo de preparación preferido a escala industrial. El cultivo también se prepara, se inocula y se realiza en condiciones estériles excepción hecha de las tomas de muestras, lo que confiere una semi-esterilidad a este ensayo y difiere de los dos ejemplos anteriores.
A) Condiciones experimentales
Se introducen 9 kg de salvado BCE en el fermentador, prehumidificados con 1,5 l de agua, y después esterilizados in situ durante 20 minutos a 121ºC, con una agitación periódica de 5 segundos cada 5 minutos. Este tratamiento permite alcanzar un índice de humedad del 46%, ajustado a continuación al 55% durante la inoculación.
El salvado se inocula con una preparación de tipo koji:
Se mezclan 180 g de salvado BCE (55% de humedad inicial) fermentados durante 4 días a 35ºC con 3 litros de agua esterilizada para obtener una suspensión de esporas que constituye el inoculante.
Las condiciones iniciales de la fermentación son las siguientes:
18,3 kg de cultivo al 55% de humedad y un pH inicial de 5.7;
40 cm de altura de capa;
Caudal de ventilación: 3141.min^{-1};
T_{aire \ de \ entrada}: 35ºC;
Humedad relativa del aire a la entrada: 95%.
B) Seguimiento de la fermentación
Además de la medición del pH, de la temperatura del medio, del porcentaje de materia seca y de la producción de GA, la evolución de la masa del cultivo se registra de forma continua en el fermentador de 50 l agitado, mientras que, para el reactor no estéril, se realizan pesados del cultivo al cabo de 21 horas y al cabo de 42 horas de fermentación.
Estas mediciones de la masa presentan un doble interés:
Mantenimiento de la humedad durante el cultivo por estimación del porcentaje de MS
Durante la fermentación dos fenómenos contribuyen a la disminución de la masa del cultivo, se trata de:
-
el secado del medio, por una parte, que se desea compensar con una aportación de agua,
-
la pérdida de materia seca, por otra parte, asociada al crecimiento del hongo.
Esta pérdida de materia seca no es despreciable, perdiéndose un 20% de MS al cabo de 40 horas de cultivo, es decir un 0,5% de MS por hora si se hace la aproximación de una pérdida lineal.
A partir de ahí, conociendo en cada momento la masa del cultivo (M_{(t)}), es posible deducir el porcentaje de MS teórico en el tiempo t, por la relación:
% MS teórico (t) = \frac{MSI \ (MSI. \ 0,5%).t}{M_{(t)}}
donde MSI es la cantidad de materia seca inicial.
Cuando este % MS así calculado supera el 50%, se realiza un añadido de agua esterilizada para llevar de nuevo este porcentaje al 45%.
Expresiones de los resultados por gramo de MS inicial
Las evoluciones de la masa y las del porcentaje de MS medido permiten calcular la pérdida de materia seca real (P_{MS} expresado en %) durante el cultivo. Así, la cantidad de GA expresada hasta ahora en UG.g^{-1} MS puede expresarse en UG.g^{-1} MS inicial gracias a la siguiente relación:
(UG.g^{-1} MSI) = (UG.g^{-1} MS). \ (100 - P_{MS})/100
C) Resultados
Las tablas 5 y 6 recogen las condiciones operativas y los resultados obtenidos en reactor agitado con su vapor.
A pesar de la ventilación del cultivo por un aire saturado en humedad, la desecación del medio es tal que en dos ocasiones ha sido necesario reajustar su contenido en agua cuando descendía por debajo del 50% tal y como se indica en la tabla 5.
La temperatura del medio se ha podido mantener en un valor medio de 35ºC gracias a la reducción del aire de entrada, pero sobre todo mediante una agitación intermitente.
En estas condiciones de cultivo, el crecimiento del hongo, del que se sigue la evolución mediante la medición del pH, se mantiene durante 60 horas y permite alcanzar una producción de 1436 UG.g^{-1} MS en 44 horas y de 1990 UG.g^{-1} MS en 63 horas. Llevada a la MS inicial, la cantidad de GA producida es respectivamente de 1160 y de 1540 UG.g^{-1} MSI. Por comparación, habíamos obtenido, en el marco del ejemplo 3, en 44 horas de cultivo, 1605 UG.g-^{1} MS equivalentes a 1067 UG.g-^{1} MSI. Esta información es interesante ya que indica que la productividad de estos dos ensayos es idéntica, pero que las condiciones experimentales del ejemplo 4 han permitido prolongar la producción de enzimas incluso con 40 cm de altura de cepa.
El tratamiento del salvado al vapor y su posterior fermentación en el reactor INRA de 50 l agitado prolonga por consiguiente el cultivo fúngico y la producción de enzimas.
Llevada a la MS inicial, la cantidad de GA producida es de 1540 UG.g^{-1} MSI.
En las mismas muestras, se han realizado dosificaciones de actividades xilanasas y proteasas. Los resultados obtenidos son muy satisfactorios con un máximo, de promedio, de 50 horas de fermentación de
350 UX.g^{-1} MSI para las xilanasas;
400 UP.g-^{1} MSI para las proteasas.
Gracias al registro continuado de la masa, ha sido posible calcular la pérdida de materia seca durante el cultivo. Es de aproximadamente un 23% al cabo de 60 horas de cultivo (con un margen del 2% teniendo en cuenta la precisión de los pesados).
Ejemplo 5 Utilización de salvados fermentados producidos en el Ejemplo 4 para la hidrólisis de harinas de trigo
Se ha llevado a cabo una serie de sacarificaciones con los salvados fermentados obtenidos en el ejemplo 4 sobre harinas de trigo previamente sometidas a un tratamiento de licuefacción enzimática clásico. La preparación de glucoamilasas AMG 300L® comercializada por la sociedad NOVO ha servido como testigo. Estas pruebas se han realizado con una harina de trigo convencional tipo 45. Las condiciones operativas se recogen en la tabla 7 para 750 g de mosto.
TABLA 7
Producto AMG 300L®(Novo) Salvado fermentado Salvado fermentado secado
Referencia AMG 300 L Ex. 4 Ex. 4
Presentación Líquida Salvado húmedo Salvado seco
Modo de conservación A +5ºC A -20ºC A temperatura ambiente
Harina Comercial tipo 45 Comercial tipo 45 Comercial tipo 45
Cantidad utilizada (g) 300 300 300
Materia seca del 35 35 35
medio (%)
Cond. Licuefacción 1 h/88ºC/pH 6,1 1 h/88ºC/pH 6,2 1 h/88ºC/pH 6,2
Enzima 125 \muL Termamyl. 120L® 125 \muL Termamyl. 120L® 125 \muL Termamyl. 120L®
Cond. Sacarif. 44 h/58ºC/pH 4,6 40 h/58ºC/pH 4,55 44 h/60ºC/pH 4,52
Cant. Equiv. A 205 \mul 4,3 g 2,1 g
3500 UG
Durante estas hidrólisis de harina de trigo, hemos tomado tres muestras del medio cada vez. Los resultados de concentraciones en azúcares reductores (A.R.) en diferentes momentos de la sacarificación presentados en la tabla 8 constituyen la media de estas 3 muestras. Estas dosificaciones, efectuadas según la técnica al DNS, se han realizado en los flotantes de las zonas centrifugadas. También se ha medido la viscosidad final de los productos sacarificados.
TABLA 8
Medidas AMG 300L®(Novo) Salvado fermentado Salvado fermentado secado
Conc. A.R. (inicial) (g/l) 180,9 \pm 4,6 185,0 \pm 3,1 171,5 \pm 4,5
Conc. A.R. (final) (g/l) 327,5 \pm 18,5 325,0 \pm 22,5 348,3 \pm 19,1
Viscosidad (mPa.s) 6,80 2,82 2,80
Por otra parte, se ha constatado un aumento del contenido en nitrógeno soluble de los mostos tras sacarificación, debido a la acción proteolítica del salvado fermentado.
Estos resultados indican que los salvados fermentados producidos en el ejemplo 4 pueden hidrolizar la harina de trigo con la misma eficacia que una preparación estándar de GA cualquiera que sea su modo de almacenamiento.
La hidrólisis de la harina del salvado fermentado provoca asimismo una reducción notable de la viscosidad en comparación con una preparación enzimática convencional.
Ejemplo 6
Este ejemplo ilustra la posibilidad de producir una cantidad considerable de xilanasas y pocas glucoamilasas con la cepa de Aspergillus niger.
Este ensayo se ha llevado a cabo en los fermentadotes piloto Fujiwara con salvado BCE y una cepa de A. niger Ref. ATCC 201202 conocida por su capacidad para producir xilanasas. El funcionamiento del fermentador piloto se detalla en el ejemplo 3. En este ejemplo se utilizan 20 kg de medio al 55% de humedad, preparados como en el ejemplo 2. Al igual que en el ejemplo 3, durante la fermentación, la humedad del medio se mantuvo por encima del 50% y la temperatura del medio se reguló en torno a 35ºC.
Al final, la cepa A. niger ATCC 201202 ha producido, al cabo de 37 horas en estas condiciones de fermentación, un salvado fermentado con 727 UX/g MS y 162 UG/g MS.
Ejemplo 7 Interés de la incorporación de salvado fermentado según la invención en un alimento avícola a base de trigo destinado a pollos para carne
Se sabe que las hemicelulasas de harina de trigo son parcialmente solubles en agua y aumentan la viscosidad del contenido intestinal, reduciendo de este modo la liberación y la absorción de nutrientes.
El artículo de A. VELDMAN y H.A. VAHL: "Xylanase in broiler diets with differences in characteristics and content of wheat" Br Poult Sci 1994 sept; 35(4) páginas 537-550 describe experiencias destinadas a medir el efecto de un
añadido de xilanasas puras en los rendimientos zootécnicos de aves alimentadas con una alimentación a base de trigo.
Se ha demostrado que el añadido de hemicelulasas genera una degradación de las hemicelulasas, permitiendo de este modo reducir la viscosidad del contenido intestinal y mejorar el rendimiento zootécnico de animales monogástricos, como los pollos para carne, alimentados con alimentos cuyo único cereal es el trigo.
Se ha llevado a cabo un experimento en 1.200 pollos para carne Ross para demostrar el interés de la utilización del salvado fermentado portador de actividad hemicelulasa (xilanasa), en comparación con un alimento sin enzima y de un alimento que contiene una fuente de xilanasa estándar, el producto Avizyme. Se han preparado alimentos con y sin enzima para alimentar a 4 lotes de 300 pollitos. Su composición se recoge en la tabla 9. Los alimentos de crecimiento (AL CR) se han utilizado durante los 21 primeros días de cría y después se han reemplazado por alimentos de acabado (AL AC) durante 18 días.
TABLA 9
Alimento AL CR AL AC
Humedad (%) 10,6 11,4
Proteínas (%) 21,3 19,1
Materias grasas (%) 6,1 6,4
El alimento 1 no recibió ninguna enzima. A los alimentos 2 y 3 se añadieron 3 y 5 kg, respectivamente, de salvado fermentado por tonelada de alimento. Al alimento 4 se añadió 0,6 kg de Avizyme® por tonelada de alimento.
Los resultados de esta prueba al cabo de 39 días de cría se resumen en la tabla 10.
TABLA 10
Alimento 1 2 3 4
Salvado fermentado según la invención (kg/tonelada)^{a} - 3,0 5,0 -
AVIZYME Finfeed (kg/tonelada)^{b} - - - 0,6
Actividad xilanasa (UX/kg alimento) - 1700 2840 1620
Índice consumo 39 días^{c} 1775 1748 1738 1745
Reducción índice de consumo (% alimen. 1)^{d} - 1,52 2,08 1,69
Mortalidad (%) 2,3 2,0 3,0 2,3
*a. \begin{minipage}[t]{150mm} este salvado fermentado presentaba una actividad glucoamilásica de 1000 UG/g de materia seca, una actividad proteolítica de 125 UP/g de materia seca y una actividad xilanásica de 600 UX/g de materia seca;\end{minipage}
*b. \begin{minipage}[t]{150mm} la Avizyme\registrado es suministrada por la empresa Finfeed, Finlandia;\end{minipage}
*c. \begin{minipage}[t]{150mm} relación peso de alimento consumido/aumento de peso;\end{minipage}
*d. \begin{minipage}[t]{150mm} se trata de la reducción en % del peso de alimento consumido en relación con el peso de alimento 1 (sin enzima) consumido.\end{minipage}
La incorporación de salvado fermentado a un alimento avícola (3 ó 5 kg/tonelada) ha permitido reducir significativamente el índice de consumo. En las condiciones del ensayo, la utilización de una dosis de salvado fermentado superior a 3 kg/tonelada parece no tener interés práctico. Las mejoras observadas son comparables a las obtenidas con el producto comercial de referencia Avizyme (0,6 kg/tonelada). La utilización de salvado fermentado presenta no obstante la ventaja de ser menos costoso que la utilización del producto enzimático comercial.
1
2
3
4
5

Claims (14)

1. Una composición que presenta actividades glucoamilásica, proteólica y xilanásica, caracterizada porque contiene salvado de trigo fermentado con una cepa de Aspergillus elegida entre las cepas ATCC 201202, ATCC 76060, ATCC 76061, MUCL 28815, MUCL 28816, NRRL 3112 o con una cepa de Aspergillus oryzae elegida entre las cepas ATCC 22788 y ATCC 42149, estando presente dichas actividades enzimática glucoamilásica proteolítica y xilanásica en los siguientes valores mínimos:
- glucoamilásica: al menos 100 UG por gramo de materia seca
- proteolítica: al menos 100 UP por gramo de materia seca
- xilanásica: al menos 100 UX por gramo de materia seca,
siempre que la actividad glucoamilásica sea de al menos 750 UG por gramo de materia seca y/o la actividad xilanásica sea de al menos 300 UX por gramo de materia seca.
2. Composición según la reivindicación 1, caracterizada porque presenta una actividad glucoamilásica de al menos 750 UG/g de materia seca.
3. Composición según la reivindicación 1, caracterizada porque presenta una actividad glucoamilásica de al menos 1500 UG/g de materia seca.
4. Composición según la reivindicación 1, caracterizada porque presenta una actividad xilanásica de al menos 300 UX por gramo de materia seca.
5. Composición según la reivindicación 1, caracterizada porque presenta una actividad xilanásica de al menos 400 UX por gramo de materia seca.
6. Composición según la reivindicación 1, caracterizada porque la cepa de Aspergillus niger se selecciona entre la cepa NRRL 3112, la cepa ATCC 76061.
7. Composición según la reivindicación 6, caracterizada porque la cepa de Aspergillus niger es la cepa ATCC 76061.
8. Un procedimiento de producción de la composición definida en la reivindicación 1, presentándose el salvado en forma de una capa de al menos 10 cm de espesor, caracterizado porque comprende las etapas que consisten en (a) tomar salvado de trigo; (b) humidificar y después tratar térmicamente dicho salvado para pasteurizarlo o esterilizarlo; (c) inocular el salvado de trigo resultante con una cepa de Aspergillus seleccionada entre las cepas ATCC 201202, ATCC 76060, ATCC 76061, MUCL 28815, MUCL 28816, NRRL 3112 o con una cepa de Aspergillus oryzae seleccionada entre las cepas ATCC 22788 y ATCC 42149; (d) hacerlo fermentar en estado sólido en un reactor ventilado y agitado periódicamente durante un período de 1 a 3 días, a una temperatura de 28-38ºC, estando dicho salvado regulado con un contenido en humedad inicial de 50 a 60% en peso, mantenida durante la duración de la fermentación, en condiciones de ventilación que permitan evitar una acumulación de dióxido de carbono perjudicial para la fermentación en el reactor y un aumento de la temperatura debido a la fermentación más allá del rango indicado, hasta que la composición de fermentación presente los valores mínimos siguientes de actividades enzimáticas:
- glucoamilásica: al menos 100 UG por gramo de materia seca
- proteolítica: al menos 100 UP por gramo de materia seca
- xilanásica: al menos 100 UX por gramo de materia seca,
siempre que la actividad glucoamilásica sea de al menos 750 UG por gramo de materia seca y/o la actividad xilanásica sea de al menos 300 UX por gramo de materia seca.
9. Procedimiento según la reivindicación 8, caracterizado porque la cepa de Aspergillus niger se selecciona entre la cepa NRRL 3112, la cepa ATCC 76061.
10. Procedimiento según la reivindicación 9, caracterizado porque la cepa de Aspergillus niger es la cepa ATCC 76061.
11. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10, caracterizado porque una dosis de inoculación es de al menos 1*10^{7} esporas/gramo de materia seca inicial.
12. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11, caracterizado porque incluye la etapa suplementaria que consiste en congelar o secar la composición obtenida en la etapa (d).
13. Utilización de una composición según cualquiera de las reivindicaciones 1-3 y 4-7 en la producción de etanol a partir de trigo.
14. Alimento para animales monogástricos que incorpora una composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 y 4-7.
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