PL199811B1 - Szczep bakterii grupy Bacillus subtilis i jego zastosowanie - Google Patents
Szczep bakterii grupy Bacillus subtilis i jego zastosowanieInfo
- Publication number
- PL199811B1 PL199811B1 PL347101A PL34710199A PL199811B1 PL 199811 B1 PL199811 B1 PL 199811B1 PL 347101 A PL347101 A PL 347101A PL 34710199 A PL34710199 A PL 34710199A PL 199811 B1 PL199811 B1 PL 199811B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- subtilis
- natto
- ywfl
- gene
- dna
- Prior art date
Links
- 241000195576 Bacillus subtilis group Species 0.000 title claims abstract description 6
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 title claims description 22
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 title claims description 22
- 235000013305 food Nutrition 0.000 title claims description 12
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 claims abstract description 41
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 claims abstract description 37
- GWYFCOCPABKNJV-UHFFFAOYSA-N beta-methyl-butyric acid Natural products CC(C)CC(O)=O GWYFCOCPABKNJV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 25
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 17
- 101150061093 lipL gene Proteins 0.000 claims description 36
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 16
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 11
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 10
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 7
- 235000013557 nattō Nutrition 0.000 claims description 6
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 5
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 claims description 4
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 4
- 108091029865 Exogenous DNA Proteins 0.000 claims description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 3
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 claims description 2
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 claims description 2
- XYHKNCXZYYTLRG-UHFFFAOYSA-N 1h-imidazole-2-carbaldehyde Chemical compound O=CC1=NC=CN1 XYHKNCXZYYTLRG-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 9
- GWYFCOCPABKNJV-UHFFFAOYSA-M 3-Methylbutanoic acid Natural products CC(C)CC([O-])=O GWYFCOCPABKNJV-UHFFFAOYSA-M 0.000 abstract description 9
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 9
- 230000006696 biosynthetic metabolic pathway Effects 0.000 abstract description 2
- 244000046052 Phaseolus vulgaris Species 0.000 abstract 1
- 235000010627 Phaseolus vulgaris Nutrition 0.000 abstract 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 32
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 19
- ULGZDMOVFRHVEP-RWJQBGPGSA-N Erythromycin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](C)C(=O)O[C@@H]([C@@]([C@H](O)[C@@H](C)C(=O)[C@H](C)C[C@@](C)(O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@H](C[C@@H](C)O2)N(C)C)O)[C@H]1C)(C)O)CC)[C@H]1C[C@@](C)(OC)[C@@H](O)[C@H](C)O1 ULGZDMOVFRHVEP-RWJQBGPGSA-N 0.000 description 18
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 17
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 14
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 14
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 13
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 12
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 10
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 10
- 229960003276 erythromycin Drugs 0.000 description 9
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 9
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 8
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 7
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 6
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 5
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 5
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 5
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 108010019653 Pwo polymerase Proteins 0.000 description 4
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 4
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 4
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 4
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 4
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 4
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 4
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 4
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 4
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 4
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 4
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 4
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 4
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 4
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 4
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 4
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 3
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 3
- 101710150114 Protein rep Proteins 0.000 description 3
- 101710152114 Replication protein Proteins 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 3
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 3
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 3
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 3
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 3
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 2
- 240000008886 Ceratonia siliqua Species 0.000 description 2
- 235000013912 Ceratonia siliqua Nutrition 0.000 description 2
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BAVYZALUXZFZLV-UHFFFAOYSA-N Methylamine Chemical compound NC BAVYZALUXZFZLV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VZUNGTLZRAYYDE-UHFFFAOYSA-N N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine Chemical compound O=NN(C)C(=N)N[N+]([O-])=O VZUNGTLZRAYYDE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 2
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 2
- 238000012181 QIAquick gel extraction kit Methods 0.000 description 2
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 2
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 2
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 2
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 2
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 2
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 2
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 2
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 2
- 241000385736 bacterium B Species 0.000 description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- YTRQFSDWAXHJCC-UHFFFAOYSA-N chloroform;phenol Chemical compound ClC(Cl)Cl.OC1=CC=CC=C1 YTRQFSDWAXHJCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- 239000002131 composite material Substances 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 2
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 2
- 239000003471 mutagenic agent Substances 0.000 description 2
- 231100000707 mutagenic chemical Toxicity 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 235000019419 proteases Nutrition 0.000 description 2
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 description 2
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 2
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 2
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 2
- PKAUICCNAWQPAU-UHFFFAOYSA-N 2-(4-chloro-2-methylphenoxy)acetic acid;n-methylmethanamine Chemical compound CNC.CC1=CC(Cl)=CC=C1OCC(O)=O PKAUICCNAWQPAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WLAMNBDJUVNPJU-UHFFFAOYSA-N 2-methylbutyric acid Chemical compound CCC(C)C(O)=O WLAMNBDJUVNPJU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020005065 3' Flanking Region Proteins 0.000 description 1
- 108020005029 5' Flanking Region Proteins 0.000 description 1
- OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 5-bromo-4-chloro-3-indolyl beta-D-galactoside Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=CNC2=CC=C(Br)C(Cl)=C12 OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 244000153158 Ammi visnaga Species 0.000 description 1
- 235000010585 Ammi visnaga Nutrition 0.000 description 1
- 206010061765 Chromosomal mutation Diseases 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- 241000238557 Decapoda Species 0.000 description 1
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010013911 Dysgeusia Diseases 0.000 description 1
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108091092566 Extrachromosomal DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000192125 Firmicutes Species 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 229920002488 Hemicellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000007836 KH2PO4 Substances 0.000 description 1
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 1
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 1
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 238000010222 PCR analysis Methods 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000017319 Pentaclethra macrophylla Nutrition 0.000 description 1
- 241001343006 Pentaclethra macrophylla Species 0.000 description 1
- 241000353135 Psenopsis anomala Species 0.000 description 1
- 101710188003 Replication and maintenance protein Proteins 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical class [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108010073771 Soybean Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000194017 Streptococcus Species 0.000 description 1
- 244000057717 Streptococcus lactis Species 0.000 description 1
- 235000014897 Streptococcus lactis Nutrition 0.000 description 1
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 1
- 235000021152 breakfast Nutrition 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 235000012343 cottonseed oil Nutrition 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L dipotassium hydrogen phosphate Chemical compound [K+].[K+].OP([O-])([O-])=O ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000396 dipotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019797 dipotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 1
- 235000021107 fermented food Nutrition 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 239000000796 flavoring agent Substances 0.000 description 1
- 235000019634 flavors Nutrition 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 238000012224 gene deletion Methods 0.000 description 1
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 1
- 235000003869 genetically modified organism Nutrition 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-ZSJDYOACSA-N heavy water Substances [2H]O[2H] XLYOFNOQVPJJNP-ZSJDYOACSA-N 0.000 description 1
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 1
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 238000002743 insertional mutagenesis Methods 0.000 description 1
- -1 isovaleric acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 1
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 1
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 108010009719 mutanolysin Proteins 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 235000008935 nutritious Nutrition 0.000 description 1
- 230000002085 persistent effect Effects 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- 235000021317 phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 150000003013 phosphoric acid derivatives Chemical group 0.000 description 1
- 230000027086 plasmid maintenance Effects 0.000 description 1
- GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M potassium dihydrogen phosphate Chemical compound [K+].OP(O)([O-])=O GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 239000013605 shuttle vector Substances 0.000 description 1
- 244000000000 soil microbiome Species 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 229940001941 soy protein Drugs 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- UAXOELSVPTZZQG-UHFFFAOYSA-N tiglic acid Natural products CC(C)=C(C)C(O)=O UAXOELSVPTZZQG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
- C12N1/205—Bacterial isolates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/32—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Bacillus (G)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/07—Bacillus
- C12R2001/125—Bacillus subtilis ; Hay bacillus; Grass bacillus
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Virology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Beans For Foods Or Fodder (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- General Preparation And Processing Of Foods (AREA)
- Seasonings (AREA)
Abstract
Wynalazek dotyczy nowych szczepów grupy Bacillus subtilis zdolnych do fermentacji fasoli, któ- re s a zasadniczo pozbawione kwasu izowalerianowego. Wynalazek w szczególno sci dotyczy nowych szczepów Bacillus natto, w których jeden lub wi ecej genów bior acych udzia l w szlaku biosyntezy dla produkcji kwasu izowalerianowego s a zasadniczo niefunkcjonalne. Korzystnie jest to szczep Bacillus natto BN10, który zosta l zdeponowany w Institut Pasteur pod numerem depozytu I-2077. PL PL PL PL
Description
Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku jest nowy szczep Bacillus subtilis i jego zastosowanie.
Niniejszy wynalazek dotyczy nowych szczepów Bacillus subtilis zdolnych do fermentacji ziaren, które są zasadniczo pozbawione produkcji kwasu izowalerianowego. Niniejszy wynalazek w szczególności dotyczy nowych szczepów Bacillus natto, w których jeden lub więcej genów biorących udział w szlaku biosyntezy dla produkcji kwasu izowalerianowego jest zasadniczo niefunkcjonalny.
Przy produkcji pożywienia ludzkość od dawna wykorzystuje różne mikroorganizmy, takie jak drożdże, grzyby czy bakterie, w celu modyfikowania, przygotowywania lub zmieniania charakteru lub smaku pożywienia. Jednym z rodzajów takich mikroorganizmów są bakterie glebowe należące do grupy Bacillus subtilis, które stosuje się do fermentacji różnych tkanek roślinnych, takich jak ziarna, np. soi i (Afrykańskiego) szarańczynu strąkowego (karob), i nasiona, np. nasiona oleistej fasoli afrykańskiej (Pentadethra macrophylla), nasiona bawełny, nasiona melona itd. W procesie fermentacji B. subtilis rozkłada celulozę i/lub białkowy materiał zawarty w materiale wyjściowym dając produkt fermentacji, który może być poddawany dalszej obróbce lub jest już gotowy do spożycia.
Jedną bakterią bardzo blisko spokrewnioną z B. subtilis jest tak zwany szczep B. natto, Gram-dodatni mikroorganizm jakości spożywczej głównie stosowany do fermentacji soi, w wyniku której uzyskuje się tani i pożywny produkt bogaty w aminokwasy. Określenie B. natto pochodzi od japońskiego fermentowanego produktu sojowego „Natto, który jest produkowany na rynek i często spożywany na śniadanie (zobacz też K. H. Steinkraus i wsp., Handbook of Indigenous Fermented Food, tom 9 (1983) 530-547).
Wadą fermentacji biologicznych materiałów wyjściowych mikroorganizmami do produkcji pokarmów jest tworzenie się różnorodnych produktów ubocznych, które nie są pożądane dla konsumenta i powodują zły smak lub niepożądaną twardość produktu.
W tym celu w JP-08275772 opisano zastosowanie konkretnego szczepu B. subtilis dla zmniejszenia ilości amoniaku w produkcie końcowym „Natto. Cel ten osiągnięto przez utrzymanie aktywności proteazy w czasie wczesnego stadium fermentacji na wysokim poziomie, tak że zasadniczo wszystkie białka soi ulegają degradacji w znacznym stopniu, podczas gdy w późniejszym stadium fermentacji aktywność proteazy jest bardzo znacznie obniżona tak aby nie produkowała nadmiernych ilości amoniaku, które w końcu pogorszyły by zapach produktu spożywczego.
W JP-09009903 opisano inny szczep B. subtilis o ulepszonych zdolnoś ciach do degradacji hemicelulozy tak, że produkt końcowy ma zwiększoną miękkość.
Jednak choć właściwości produktów spożywczych pochodzących z fermentacji mikroorganizmami, takimi jak B. subtilis uległy polepszeniu, istnieje nadal potrzeba dalszej poprawy smaku i/lub zapachu produktu końcowego.
Celem niniejszego wynalazku jest więc dalsza poprawa właściwości produktów spożywczych, które można uzyskać przez fermentację z udziałem B. subtilis, szczególnie poprawa ich smaku.
Cel ten osiągnięto przez dostarczenie nowego szczepu mikroorganizmu grupy B. subtilis zdolnego do fermentacji ziarna, korzystnie soi, który nie produkuje znacznych ilości kwasu izowalerianowego.
Wynalazek dotyczy szczepu bakterii grupy Bacillus subtilis, w którym gen ywfL zaangażowany w biosyntezę kwasów izowalerianowych jest tak zmodyfikowany, ż e bakteria nie moż e wytwarzać znacznych ilości kwasów izowalerianowych, bowiem produkt genowy pochodzący od genu ywfL ma obniżoną aktywność, jest zasadniczo niefunkcjonalny lub nieobecny.
Korzystnie szczepem bakterii z grupy B. subtilis jest Bacillus natto.
Korzystnie w szczepie z grupy B. subtilis, w tym B. natto gen ywfL ma obniżoną aktywność, jest zasadniczo niefunkcjonalny lub nieobecny.
Korzystnie szczep z grupy Bacillus subtilis nie zawiera egzogennych sekwencji DNA.
Korzystnie szczep ten był uzyskany metodą zrekombinowanego DNA, korzystnie za pomocą mutagenezy i selekcji.
Korzystnie szczepem wytworzonym techniką zrekombinowanego DNA jest B. natto I-2077.
Na figurze 1 przedstawiono schemat do konstrukcji produktu przerwania ywfL.
Na figurze 2 przedstawiono zrekombinowany wektor pMZ66 niosący produkt przerwania ywfL według figury 1.
Na figurze 3 przedstawiono chromatogram produktów fermentacji wytworzonych przez B. natto typu dzikiego i izogeniczną pochodną z przerwania ywfL.
W obszernych eksperymentach prowadzących do niniejszego wynalazku stwierdzono, że na smak i zapach produktów uzyskiwanych przez fermentację z B. subtilis, szczególnie B. natto, niekoPL 199 811 B1 rzystnie wpływają pewne związki tworzone przez mikroorganizm w czasie jego namnażania, a mianowicie kwasy izowalerianowe (kwas 2-metylomasłowy i kwas 3-metylomasłowy), które powodują trwały, silny i drażniący zapach produktu fermentacji.
Wiadomo, że w mikroorganizmach główne wykorzystanie rozgałęzionych kwasów tłuszczowych, takich jak kwasy izowalerianowe, służy do syntezy błony komórkowej, gdzie stanowią około 90% jej składu. Synteza błony komórkowej jest istotną funkcją każdej komórki. Tak więc oczekiwano, że wpływanie na biosyntezę jednego z jej składników będzie sprawą delikatną ponieważ zmniejszone wytwarzanie dowolnego z kwasów tłuszczowych wymaganych do tworzenia błony komórkowej lub nawet całkowity ich brak może w końcu doprowadzić do mikroorganizmów, które nie są żywotne w normalnych warunkach lub nie są zdolne do speł niania swoich funkcji jako czynnik fermentacyjny.
Choć dokładny szlak biosyntezy kwasów izowalerianowych przez B. subtilis nie jest znany opracowano potencjalny szlak syntezy uwzględniając informację z niedawno zakończonego badania całego genomu B. subtilis (Kunst F. i wsp. The complete genome sequence of the gram positive bacterium B. subtilis, Nature 390 (1997) 249-256.
W tym celu założono także, że polipeptyd pochodzący z genu ywfL może odgrywać ważną rolę w produkcji kwasów izowalerianowych i podobnych rozgałęzionych kwasów tłuszczowych przez bakterię.
Aby osiągnąć powyższy cel, w omawianym szczepie B. subtilis jeden lub więcej genów biorących udział w biosyntezie kwasów izowalerianowych zasadniczo unieczynnia się, tak że odpowiednie produkty genowe wykazują stosunkowo zmniejszoną aktywność lub geny zasadniczo mogą wcale nie ulegać translacji do produktów genowych.
Te produkty genowe mogą obejmować polipeptydy działające jako enzymy w szlaku syntezy lub działające jako czynniki regulacyjne dla produkcji kwasów izowalerianowych. W korzystnym wykonaniu gen ywfL (Nature, powyżej) może być wydeletowany z genomu lub tak zmodyfikowany, że nie ulega transkrypcji do funkcjonalnego białka.
W dalszej korzystnej postaci zmodyfikowanym szczepem należącym do grupy B. subtilis jest B. natto, najbardziej korzystnie jest to B. natto BN10, który został zdeponowany w Institucie Pasteura w ramach Traktatu Budapeszteńskiego i uzyska ł numer depozytu I-2077.
Nowe szczepy B. subtilis stosowane w pokarmach korzystnie nie powinny zawierać żadnych sekwencji egzogennych, takich jak sekwencje wektorów lub sekwencje kodujące markery selekcyjne, jak np. oporności na antybiotyki. Dotyczy to również obecności takich sekwencji jak pozachromosomalny DNA lub DNA wintegrowany do chromosomu.
Nowe szczepy można uzyskać metodami takimi jak mutacja znanych szczepów B. subtilis przy użyciu znanych mutagenów i selekcji pod względem pożądanej cechy, to znaczy niskiej lub upośledzonej syntezy kwasów izowalerianowych w czasie fermentacji. Mutageny i sposoby ich stosowania są dobrze znane w dziedzinie i nie są ograniczone do np. DMSO (dimetylosulfotlenek), MNNG (N-metylo-N'-nitro-N-nitrozoguanidyna), metyloamina lub napromieniania itd.
Ponadto, docelowe szczepy B. subtilis można uzyskać metodą rekombinowanego DNA, korzystnie bez inkorporacji egzogennego DNA, co będzie szczegółowo opisane poniżej.
Wynalazek dotyczy też zastosowania B. subtilis według wynalazku do fermentacji materiału roślinnego, korzystnie do przygotowania pokarmu, lub substancji aromatyzujących, bardziej korzystnie produktu Natto.
Poniżej opisana jest konstrukcja nowego, stabilnego genetycznie modyfikowanego organizmu jakości spożywczej B. natto zawierającego izogeniczną delecję chromosomalnego genu ywfL. Stwierdzono, że ta delecja jest stabilna i nie zawiera niepożądanych sekwencji DNA, takich jak sekwencje wektora lub markery oporności na antybiotyki użyte do konstrukcji. Co więcej, wykazano, że mikroorganizmy uzyskane przez delecję genu ywfL funkcjonują równie dobrze w porównaniu ze znanymi szczepami B. natto, wskazując, że zachowanie w fermentacji nowych szczepów nie uległo pogorszeniu przez brak produktu genu ywfL.
O ile nie podano inaczej, wszystkie techniki, warunki i podłoża są jak opisano w Sambrook i wsp., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, wyd. 2 (1992), Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY).
Plazmidy, szczepy bakterii i podłoża
Amplifikację DNA (zrekombinowanego) wektora E. coli pBS SK+ (Stratagene, numer produktu 212205) przeprowadzono w szczepie E. coli BZ234 (Mollet, B. i wsp. „Directed genomic integration, gene replacement and integrative gene expression in Streptococcus themrophilus Journal of Bacteriology 175 (14) (1993), 4315-4324) z selekcją szczepów rekombinantów za pomocą antybiotyku ampicyliny (Boehringer Mannheim, numer produktu 835 242). Plazmidy zrekombinowane zidentyfikowano za
PL 199 811 B1 pomocą X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolilo-e-D-galaktopiranozyd, Boehringer Mannheim, numer produktu
680 293) i IPTG (izopropylo-e-D-tiogalaktozyd, Boehringer Mannheim, numer produktu 1 411 446).
Plazmid pG+host9 (Maguin, E. i wsp. „Efficient insertional mutagenesis in lactococci and other gram-positive bacteria Journal of Bacteriology 178 (3) (1996) 931-933) jest wektorem wahadłowym gram dodatnim/gram ujemnym niosącym gen oporności na antybiotyk erytromycynę (Fluka, numer produktu E6376) i wrażliwe na temperaturę białko replikacji plazmidu. pG+host9 jest namnażany w E. coli EC101 (Law, J. i wsp. „A system to generate chromosomal mutations in Lactococcus lactis which allows fast analysis of targeted genes Journal of Bacteriology 177 (24) (1995), 7011-7018), który dostarcza niewrażliwe na temperaturę białko zintegrowane z genomem do wygodnego utrzymywania i amplifikacji plazmidu.
Szczep B. natto (określany jako BN1) stosowany w niniejszej pracy wyizolowano z fermentowanego produktu Natto nabytego na rynku.
Podłożem do hodowli LB dla E. coli w 37°C i w 28°C albo 37°C dla B. natto z wytrząsaniem. Erytromycynę dodano w 150 μg/ml dla E. coli i 2-5 μg/ml dla B. natto.
Ekstrakcja chromosomalnego DNA B. natto
Ekstrakcję chromosomalnego DNA B. natto dla PCR i analizy Southern blot przeprowadzono na 16-godzinnej hodowli w pożywce LB z lub bez selekcji antybiotykiem, w zależności od potrzeb. Hodowlę wirowano przy 6000 obr./min. przez 8 min. aby osadzić bakterie. Osad zawieszono w μl 50 mM glukozy, 25 mM Tris-HCl, pH 8,0, 10 mM EDTA plus 500 μg/ml lizozymu (Boehringer Mannheim 1243004) i inkubowano w 37°C przez 30 min. Dodano Mutanolysin (Fluka M9901) do 1 μg/ml i kontynuowano inkubację w 37°C przez kolejne 30 min. Dodano proteinazę K (Fluka P6556) do 20 μg/ml, EDTA do 2,5 mM i komórki ostatecznie zlizowano przez dodanie 0,1% SDS (Serva 20763). Ten roztwór inkubowano w 60°C przez 1 godz. i lizat ekstrahowano jeden raz równą objętością fenolu-chloroformu. Mieszaninę wirowano przy 14000 obr./min. przez 8 min. w celu rozdzielenia faz. Starannie usunięto fazę wodną i strącono chromosomalny DNA przez dodanie 2 objętości 95% etanolu (Fluka 02860). Osad DNA nawinięto na sterylną wykałaczkę, przeniesiono do 400 μl 10 mM Tris-HCl pH 8,0, 10 mM EDTA z 50 μg/ml RNAzy (Boehringer 109 169) i inkubowano w 60°C przez 1 godz. Roztwór ekstrahowano układem fenol-chloroform. DNA wytrącono, nawinięto i ostatecznie zawieszono w 200 μ buforu TE (10 mM Tris-HCl pH 8,0, 1 mM EDTA).
Konstrukcja plazmidu delecyjnego ywfL pMZ66
Fragmenty DNA flankujące gen ywfL zamplifikowano ze szczepu B. natto BN1 i ostatecznie połączono (Fusion Cycle PCR) przez homologie włączone do starterów aby stworzyć fragment DNA do przerwania genu ywfL w tej bakterii. Jest to schematycznie przedstawione na figurze 1.
Region flankujący 5' zamplifikowano przy użyciu oligonukleotydu 6624 (Id. Sekw. Nr: 1) uzyskanego od Microsynth, Balgach, Szwajcaria, który wprowadza miejsce restrykcyjne BamHI około 950 bp powyżej początku genu ywfL, i 6626 (Id. Sekw. Nr: 2), złożonego oligonukleotydu zawierającego 22 bp sekwencji regionu oddalonego o 50 bp od początku genu ywfL i 22 bp regionu oddalonego o 100 bp od końca genu ywfL. Sekwencja tego oligonukleotydu określa region, który ma ulec delecji, a mianowicie sekwencję, która jest pominięta między dwoma odcinkami złożonych starterów. Drugi odcinek od oligonukleotydu 6626 zaprojektowano tak, aby wprowadzić dwa kodony stop TGA, w celu zakończenia translacji skróconego genu ywfL.
Region 3' flankujący zamplifikowano stosując oligonukleotyd 6625 (Id. Sekw. Nr: 3), który wprowadza miejsce restrykcyjne EcoRI około 1000 bp poniżej końca genu ywfL, i 6627 (Id. Sekw. Nr: 4), drugi złożony oligonukleotyd, który jest zasadniczo odwrotnym dopełnieniem oligonukleotydu 6626 (Id. Sekw. Nr: 2). Te komplementarne sekwencje oligonukeotydów dostarczają homologi między fragmentami 5' i 3', która jest wykorzystywana w przedłużeniu Pwo bez startera, aby zakończyć drugą nić. Dwa oligonukleotydy 6626 i 6625 dodano na końcu i zamplifikowano specyficznie prawidłowy fragment delecyjny.
Reakcje PCR przeprowadzono w następujący sposób: 500 μg chromosomalnego DNA zmieszano w objętości 100 μl zawierającej 80 μl sterylnej H2O, 6 μl 2 mM dNTP, 10 μl buforu do reakcji polimerazy Pwo, 2 μl każdego oligonukleotydu przy około 100 nM i 0,5 μl polimerazy Pwo (Boehringer Mannheim, product numer 1 644 947). Żądany fragment amplifikowano przy użyciu Perkin Elmer DNA Thermal Cycler z 20 cyklami przez 1 min. w 95°C, 1 min. W 40°C, 2 min, w 72°C i na końcu trzymano w 4°C. Z każdej reakcji PCR przygotowano 1 μl próbkę w 100 μl objętości zawierającej 80 μl sterylnej H2O, 6 μl 2 mM dNTP, 10 μl buforu do reakcji polimerazy Pwo i 0,5 μl polimerazy Pwo (bez jakichkolwiek oligonukleotydów). Tę kontrolę poddano dwóm cyklom w termocyklerze jak opisano powyżej, aby przedłuPL 199 811 B1 żyć od homologii indukowanych przez oligonukleotydy. Na koniec dodano 2 μΐ każdego z oligonukleotydów
6624 i 6625 przy około 100 nM i reakcję PCR kontynuowano jeszcze przez 20 cykli.
Ostateczny produkt PCR oczyszczono na zestawie do oczyszczania QUIAQuick PCR (Quiagen, numer produktu 28104). Próbkę strawiono enzymami restrykcyjnymi EcoRI i BamHI i poddano elektroforezie w 1% żelu agarozowym. Odpowiadający fragment 2 kb wycięto z żelu i DNA wyeluowano stosując zestaw do ekstrakcji z żeli QIAquick (Quiagen, numer produktu 28704). Uzyskany fragment DNA strawiono enzymami restrykcyjnymi EcoRI i BamHI i zligowano z wektorem E. coli pBS SK+, który poddano odpowiedniej wstępnej obróbce (strawiono EcoRI i BamHI i defosforylowano). Mieszaninę ligacyjną wprowadzono za pomocą elektrotransformacji do szczepu E. coli BZ234 i wyselekcjonowano transformanty na płytkach LB uzupełnionych 100 μg/ml ampicyliny, Xgal i IPTG. Potencjalnie dodatnie białe kolonie przeszukiwano przy użyciu analizy restrykcyjnej wyizolowanych z nich plazmidów (Sambrook, powyżej). Określono sekwencję DNA wstawki dodatniego klonu, aby potwierdzić konstrukcję PCR. Plazmid strawiono enzymami restrykcyjnymi EcoRI i Spel i fragmenty rozdzielono w 1% żelu agarozowym. Odpowiedni fragment 2 kb wycięto z żelu i DNA wyeluowano stosując zestaw do ekstrakcji z żeli QIAquick.
Wektor pG+Host 9 o replikacji wrażliwej na temperaturę strawiono enzymami restrykcyjnymi EcoRI i Spel i końcowe fosforany usunięto stosując fosfatazę alkaliczną z krewetki (USB, numer produktu 70092). Fragment delecyjny ywfL zmieszano z wektorem pG + Host 9 poddanym odpowiedniej wstępnej obróbce i przeprowadzono ligację. Mieszaninę ligacyjną poddano elektrotransformacji do gospodarza E. coli EC101. Kolonie przeszukiwano za pomocą analizy restrykcyjnej wyizolowanych plazmidów. Jeden z dodatnich plazmidów określono jako pMZ66 (Figura 2).
Dla transformacji do BN1 wyizolowano duże ilości pMZ66 stosując zestaw Jetstar Maxi prep (Genomed, 22010).
Transformacja B. natto
Doświadczenia z transformacją przeprowadzono według protokołu:
Roztwory:
Podłoże I: Sole Spizizena 5 x, 2 ml; glukoza 50%, 0,1 ml; kazaminokwasy 20%, 0,01 ml; ekstrakt drożdżowy 5%, 0,02 ml; MgSO4 1M, 0,05 ml, uzupełnione do 10 ml H2O destylowaną.
Podłoże II: Sole Spizizena 5 x, 2 ml; glukoza 50%, 0,1 ml; kazaminokwasy 20%, 0,005 ml; MgSO4 1M, 0,05 ml, uzupełniony do 10 ml H2O destylowaną.
Sole Spizizena 5 x: (NH4)2SO4 10 g; K2HPO4 70 g, KH2PO4 30 g, Na3-cytrynian. 2H2O 5 g, MgSO<7 H2O 1 g, uzupełnione do 1 litra H2O destylowaną.
Naturalna kompetencja B. natto
2-3 kolonie z płytek LB inkubowanych przez noc w 37°C ponownie zawieszano w 2,5 ml podłoża I i inkubowano w 37°C z napowietrzaniem (240 obr./min.) w sterylnej 10 ml szklanej probówce przez 4 do 5 godzin.
Transformacja B. natto
Sporządzono dziesięciokrotne rozcieńczenie w podłożu II (0,05 ml w 0,45 ml) z dodatkiem plazmidowego DNA (5 do 10 μg w maksymalnie 50 μ^. Przeprowadzono inkubację w 30°C przez noc z napowietrzaniem (240 obr./min.). Próbki lub całą objętość następnie wysiewano na pożywkę selekcyjną (podłoże LB z 4 μg/ml erytromycyny dla pG + host9) i inkubowano w 28°C przez dwa dni.
Delecję genu ywfL B. natto przeprowadzono w dwóch odrębnych etapach. W pierwszym etapie (wpętlenie) wyselekcjonowano integrację pMZ66 przez rekombinację homologiczną (kierowaną przez homologie flankującego DNA). W drugim etapie (wypętlenie) wykorzystano wycięcie z genomu ułatwione przez replikację plazmidu i zidentyfikowano żądane klony bakteryjne.
Wpętlenie pMZ66
Szczepem BN1 B. natto transformowanym plazmidem pMZ66 zaszczepiono świeżą pożywkę LB uzupełnioną 2 μg/ml erytromycyny i inkubowano w 42°C przez 16 godz. Tę hodowlę rozcieńczono i wysiano na płytki LB uzupełnione 2 μg/ml erytromycyny i inkubowano w 42°C. W tej temperaturze białko replikacyjne plazmidu pG+Host 9 już nie jest aktywne. W efekcie wyselekcjonowane bakterie są rzadkimi przypadkami integracji plazmidu w genie ywfL. Integracja ta jest sterowana przez homologię sekwencji DNA fragmentu delecyjnego ywfL i może wystąpić w regionie homologii 5' lub 3'. Przypadek integracji 5' lub 3' określono stosując specyficznie zaprojektowane startery do PCR w hodowlach na małą skalę integrantów (w 42°C). Wykazało to, że większość przypadków integracji chromosomalnej wystąpiła w części 5' genu ywfL, a tylko około 10% przypadków występuje na końcu 3'. Klony te potwierdzono za pomocą analiz Southern.
PL 199 811 B1
Wypętlenie pMZ66
Dodatnim klonem z pMZ66 wintegrowanym na 5' końcu genu ywfL w stężeniu 1% zaszczepiono podłoże LB z 2 μg/ml erytromycyny i inkubowano w 42°C przez 16 godz. Tę hodowlę w stężeniu 1% zastosowano następnie do zaszczepienia świeżej hodowli w podłożu LB i hodowano w 28°C przez 16 godz. Hodowlę rozcieńczono, wysiano na płytki LB i następnie inkubowano w 42°C.
Wnioskowanie dla procedury było następujące:
W 28°C białko replikacyjne plazmidu pG + Host 9 jest ponownie aktywne i przywrócenie replikacji wzmaga wycinanie plazmidu z genomu, podczas gdy ostateczne wysianie i inkubacja w 42°C ponownie wyłączają białko replikacyjne plazmidu pG + Host 9 powodując utratę swobodnie replikującego się plazmidu (brak selekcji erytromycyną).
Tak jak w reakcji wpętlenia uważa się, że plazmid pMZ66 ma dwie możliwości wypętlenia poprzez dwa odrębne szlaki:
i) przez rekombinację w obrębie tego samego 5' flankującego DNA, jak przy integracji, w ten sposób powracając do oryginalnego rodzicielskiego BN1, lub ii) przez rekmbinację w obrębie 3' flankującego DNA, to znaczy przez inkorporację fragmentu delecyjnego do genomu i usunięcie chromosomalnego genu ywfL z wektorem pG + Host 9.
Uzyskane kolonie inkubowane w 42°C wykazały przede wszystkim duże kolonie z kilkoma obecnymi małymi koloniami. Wysianie replik na płytki z LB i płytki z LB uzupełnione 2 μg/ml erytromycyny pokazało, że wszystkie badane małe kolonie i niektóre z dużych kolonii były wrażliwe na erytromycynę.
Zastosowano amplifikację PCR ze starterami zaprojektowanymi w celu amplifikacji przez miejsce delecyine, aby ustalić, że wszystkie duże kolonie niosły gen ywfL BN1 typu dzikiego, podczas gdy wszystkie małe kolonie zawierały zaprojektowaną delecję genu ywfL.
Wyniki PCR potwierdzono przez sekwencjonowanie DNA w punkcie delecji genu ywfL, co dało oczekiwaną sekwencję konstruktów. Ułożenie regionu wokół genu ywfL potwierdzono za pomocą hybrydyzacji Southerna i ostatecznie zostało ustalone za pomocą hybrydyzacji z tym plazmidem, że nie pozostały żadne sekwencje wektora pG + Host 9. Zidentyfikowano pięć takich szczepów delecyjnych ywfL w niezależnych eksperymentach i nazwano je BN10 (I-2077) do BN14.
Analiza HPLC szczepów delecyjnych ywfL
Szczep B. natto BN1 i 5 szczepów delecyjnych ywfL (BN10 do BN14) hodowano w podłożu LB przez 16 godz. w 37°C. Bakterie usunięto przez przesączenie przez filtr 0,2 μm (Schleicher i Schuell, FP 030/3) i analizowano skład kwasów tłuszczowych za pomocą HPLC. HPLC przeprowadzono na urządzeniu do HPLC Hewlett Packard seria 1100 stosując kolumnę Aminex Fast Acid 100 x 7,5 mm (Bio-Rad, numer produktu 125-0100) stabilizowaną w 40°C i eluowano 10 mM H2SO4 przy tempie przepływu 1 ml/min. Detekcję uzyskano stosując Refraktometr HP1047A (Hewlett Packard) także stabilizowany w 40°C.
Wyniki przedstawiono w tabeli 1, z której wynika, że kwasy izowalerianowe są wytwarzane przez fermentację przez bakterię B. natto, a delecja genu ywL znacznie obniża wytwarzanie tego produktu fermentacji do minimum.
T a b e l a 1
Określenie poziomów kwasu izowalerianowego wytwarzanych przez BN1 i 5 pochodnych z delecją ywfL BN10-BN14
| Próbka | kwas izowalerianowy (mg/l) (kwas 3-metylomasłowy) | kwas izowalerianowy mmole/l |
| podłoże LB | 0 | 0 |
| BN1 | 971,1 | 9,51 |
| BN10 | <7,0 | <0,07 |
| BN11 | <7,0 | <0,07 |
| BN12 | <7,0 | <0,07 |
| BN13 | <7,0 | <0,07 |
| BN14 | <7,0 | <0,07 |
Następujące przykłady ilustrują wynalazek i nie są uważane za ograniczenia dla załączonych zastrzeżeń.
PL 199 811 B1
P r z y k ł a d 1
Przygotowanie kostek
Według technik dobrze znanych w dziedzinie soję rozgnieciono, ugotowano i zaszczepiono przetrwalnikami szczepu B. natto BN10 (I-2077), a następnie przeprowadzono fermentację w fazie stałej (fermentacja typu Koji) przez 2-5 dni w 30-50°C. Do powstałej mieszaniny fermentacyjnej dodano solankę (nasycony roztwór NaCl). Produkt wysuszono, sprasowano w kostki lub stosowano jako proszek np. do produkcji bulionu. Ostateczny produkt nie miał smaku typowego dla produktów zawierających kwasy izowalerianowe.
Nowy szczep B. subtilis zachowywał się zatem równie dobrze przy fermentacji soi w porównaniu z powszechnie stosowanymi szczepami B. subtilis.
P r z y k ł a d 2
Tę samą procedurę jak zilustrowano w przykładzie 1 powtórzono z tą różnicą, że do zaszczepienia zastosowano dziki B. natto (BN1). Powstały produkt wykazywał smak typowy dla produktów zawierających kwasy izowalerianowe.
LISTA SEKWENCJI (1) INFORMACJE OGÓLNE:
(i) ZGŁASZAJĄCY: Societe des Produits Nestle
PO Box 353 CH-1800 Vevey
WYNALAZCA: B. Mollet
RD Prodmore M-C Zwahlen (ii) TYTUŁ: Nowe szczepy grupy Bacillus subtilis do fermentacji żywności (iii) LICZBA SEKWENCJI 4:
(iv) ADRES:
(A) ADRESAT: Kirschner & Kurig.
(B) ULICA: Sollner str. 38 (C) MIASTO: Monachium (D) KRAJ: Niemcy (F) KOD POCZTOWY: 81479 (iv) POSTAĆ MOŻLIWA DO ODCZYTANIA PRZEZ KOMPUTER:
(A) TYP NOŚNIKA: dyskietka (B) KOMPUTER: kompatybilny z IBM PC (C) SYSTEM OPERACYJNY: PC-DOS/MS-DOS (D) OPROGRAMOWANIE: Patentin nr 1, ver. 1.25 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR: 1 :
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 13 nukleotydów (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: DNA (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 1 :
GCGGCGGATC CGCTGATGAT CTCCCAGCCC (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR: 2 :
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 44 nukleotydy (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza
PL 199 811 B1 (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: DNA (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 2 : CTCAAATTCC ATTTCCTCAT CAGGACATGC ATAGCGTATC ATCC (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR: 3 :
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 31 nukleotydów (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: DNA (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 3 : GGGGTCGAAT TCCACGAGAT ATCTAACTGC C (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR: 4 :
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 44 nukleotydy (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: DNA (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 4 : GGATGATACG CTATGCATGT CCTGATGAGG AAATGGAATT TGAG
Claims (11)
1. Szczep bakterii grupy Bacillus subtilis, w którym gen ywfL zaangażowany w biosyntezę kwasów izowalerianowych jest tak zmodyfikowany, że bakteria nie może wytwarzać znacznych ilości kwasów izowalerianowych, bowiem produkt genowy pochodzący od genu ywfL ma obniżoną aktywność, jest zasadniczo niefunkcjonalny lub nieobecny.
2. Szczep B. subtilis wedł ug zastrz. 1, znamienny tym, ż e jest B. natto.
3. Szczep B. subtilis według zastrz. 1 lub 2, znamienny tym, że gen ywfL ma obniżoną aktywność, jest zasadniczo niefunkcjonalny lub nieobecny.
4. Szczep B. subtilis według zastrz. 1, znamienny tym, ż e nie zawiera egzogennych sekwencji DNA.
5. Szczep B. subtilis wedł ug zastrz. 1, znamienny tym, ż e był uzyskany metodą zrekombinowanego DNA.
6. Szczep B. subtilis wedł ug zastrz. 5, znamienny tym, ż e był uzyskany za pomocą mutagenezy i selekcji.
7. Szczep B. subtilis wedł ug zastrz. 5, znamienny tym, ż e jest B. natto I-2077.
8. Zastosowanie B. subtilis okre ś lonego w zastrz. 1 do fermentacji materiał u roś linnego.
9. Zastosowanie B. subtilis wedł ug zastrz. 8 do przygotowania pokarmu.
10. Zastosowanie B. subtilis według zastrz. 8 do przygotowania substancji aromatyzujących.
11. Zastosowanie B. subtilis według zastrz. 9 do przygotowania produktu Natto.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP98118659A EP0999272A1 (en) | 1998-10-02 | 1998-10-02 | Novel strains of the bacillus subtilis group for food fermentation |
| PCT/EP1999/006818 WO2000020597A1 (en) | 1998-10-02 | 1999-09-15 | Novel strains of the bacillus subtilis group for food fermentation |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL347101A1 PL347101A1 (en) | 2002-03-25 |
| PL199811B1 true PL199811B1 (pl) | 2008-11-28 |
Family
ID=8232739
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL347101A PL199811B1 (pl) | 1998-10-02 | 1999-09-15 | Szczep bakterii grupy Bacillus subtilis i jego zastosowanie |
Country Status (16)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6852523B2 (pl) |
| EP (2) | EP0999272A1 (pl) |
| JP (1) | JP2002526113A (pl) |
| KR (1) | KR20010075562A (pl) |
| CN (1) | CN1159442C (pl) |
| AR (1) | AR021853A1 (pl) |
| AT (1) | ATE325195T1 (pl) |
| AU (1) | AU763912B2 (pl) |
| BR (1) | BR9915016B1 (pl) |
| DE (1) | DE69931176T2 (pl) |
| ES (1) | ES2263287T3 (pl) |
| HK (1) | HK1040416A1 (pl) |
| PL (1) | PL199811B1 (pl) |
| RU (1) | RU2001111821A (pl) |
| WO (1) | WO2000020597A1 (pl) |
| ZA (1) | ZA200102229B (pl) |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP4624278B2 (ja) * | 2006-02-13 | 2011-02-02 | タカノフーズ株式会社 | 納豆菌及び納豆の製造方法 |
| CN104381932A (zh) * | 2014-12-10 | 2015-03-04 | 杭州元佩特生物科技有限公司 | 一种富含纳豆激酶和吡咯喹啉醌的白菜泡菜的制作方法 |
| CN104522796A (zh) * | 2014-12-10 | 2015-04-22 | 杭州元佩特生物科技有限公司 | 一种食疗黄米汁的制备方法 |
| CN108004184B (zh) * | 2018-01-04 | 2021-01-29 | 云南中烟工业有限责任公司 | 一种芽孢杆菌及其用于生产异戊酸的方法 |
| CN114591857B (zh) * | 2022-03-10 | 2023-05-09 | 内蒙古工业大学 | 一株高纤维降解率的枯草芽孢杆菌及其应用 |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS52108045A (en) * | 1976-03-06 | 1977-09-10 | Riyouji Sekiguchi | Method of making fermented soybeans |
| US4215229A (en) | 1978-06-15 | 1980-07-29 | Koppers Company, Inc. | Process for alkylating phenolic compounds to produce ortho- and para-monoalkylated phenols and 2,4- and 2,6-dialkylated phenols |
| SK281209B6 (sk) * | 1993-09-21 | 2001-01-18 | Societe Des Produits Nestle S. A. | Spôsob výroby aromatizačného prostriedku |
| JP2851811B2 (ja) * | 1995-04-06 | 1999-01-27 | フジッコ株式会社 | 納豆菌およびそれを用いた納豆の製法並びに納豆 |
| JPH099903A (ja) * | 1995-06-30 | 1997-01-14 | Fujitsuko Kk | 納豆菌およびそれを用いた納豆の製法並びに納豆 |
-
1998
- 1998-10-02 EP EP98118659A patent/EP0999272A1/en not_active Withdrawn
-
1999
- 1999-09-15 CN CNB998116874A patent/CN1159442C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1999-09-15 KR KR1020017004232A patent/KR20010075562A/ko not_active Abandoned
- 1999-09-15 BR BRPI9915016-6A patent/BR9915016B1/pt not_active IP Right Cessation
- 1999-09-15 PL PL347101A patent/PL199811B1/pl not_active IP Right Cessation
- 1999-09-15 AU AU58635/99A patent/AU763912B2/en not_active Ceased
- 1999-09-15 HK HK02100614.4A patent/HK1040416A1/zh unknown
- 1999-09-15 WO PCT/EP1999/006818 patent/WO2000020597A1/en not_active Ceased
- 1999-09-15 EP EP99946175A patent/EP1117799B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1999-09-15 ES ES99946175T patent/ES2263287T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1999-09-15 AT AT99946175T patent/ATE325195T1/de not_active IP Right Cessation
- 1999-09-15 JP JP2000574692A patent/JP2002526113A/ja not_active Ceased
- 1999-09-15 RU RU2001111821/13A patent/RU2001111821A/ru not_active Application Discontinuation
- 1999-09-15 DE DE69931176T patent/DE69931176T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1999-10-01 AR ARP990104998A patent/AR021853A1/es active IP Right Grant
-
2001
- 2001-03-16 ZA ZA200102229A patent/ZA200102229B/en unknown
- 2001-03-30 US US09/823,772 patent/US6852523B2/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2000020597A1 (en) | 2000-04-13 |
| DE69931176T2 (de) | 2007-02-22 |
| ATE325195T1 (de) | 2006-06-15 |
| RU2001111821A (ru) | 2003-06-10 |
| US6852523B2 (en) | 2005-02-08 |
| AU5863599A (en) | 2000-04-26 |
| HK1040416A1 (zh) | 2002-06-07 |
| EP1117799A1 (en) | 2001-07-25 |
| CN1159442C (zh) | 2004-07-28 |
| BR9915016B1 (pt) | 2011-06-28 |
| DE69931176D1 (de) | 2006-06-08 |
| PL347101A1 (en) | 2002-03-25 |
| AR021853A1 (es) | 2002-08-07 |
| ES2263287T3 (es) | 2006-12-01 |
| JP2002526113A (ja) | 2002-08-20 |
| EP1117799B1 (en) | 2006-05-03 |
| US20020094329A1 (en) | 2002-07-18 |
| EP0999272A1 (en) | 2000-05-10 |
| ZA200102229B (en) | 2002-03-18 |
| BR9915016A (pt) | 2001-08-14 |
| KR20010075562A (ko) | 2001-08-09 |
| CN1321192A (zh) | 2001-11-07 |
| AU763912B2 (en) | 2003-08-07 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP5787089B2 (ja) | リボフラビンの改善された生産 | |
| CN1298447A (zh) | 生产刺糖噻杀虫剂所用的生物合成基因 | |
| KR102624718B1 (ko) | 변이형 rpoc 암호화 서열을 포함하는 핵산 분자 | |
| Savijoki et al. | Molecular genetic characterization of the L-lactate dehydrogenase gene (ldhL) of Lactobacillus helveticus and biochemical characterization of the enzyme | |
| PL199811B1 (pl) | Szczep bakterii grupy Bacillus subtilis i jego zastosowanie | |
| CN116670295A (zh) | 用于在抑制香草酸形成的情况下产生香草醛的拟无枝酸菌属菌株 | |
| US7241610B2 (en) | Lactic acid bacteria overproducing exopolysaccharides | |
| JP7086984B2 (ja) | Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｆｕｎｇｉｃｉｄｉｃｕｓの遺伝子組換え株におけるエンデュラシジンの産生を増強するための組成物及び方法 | |
| KR20020022045A (ko) | 유게놀 및 페룰라산 분해대사의 유전자를 특이적으로불활성화함으로써 치환된 페놀을 생성하기 위한 생산균주의 구축 | |
| KR100953104B1 (ko) | 류코노스톡에서 유래된 신규 플라스미드 및 이를 포함하는셔틀 벡터 | |
| CN116601300A (zh) | 阿魏酸生物转化为香草醛 | |
| JP4104985B2 (ja) | Ｐｆ１０２２物質誘導体を生産する形質転換体およびその製造法並びに新規生合成遺伝子 | |
| US20020006665A1 (en) | Ketogulonigenium endogenous plasmids | |
| JP3767066B2 (ja) | 新規遺伝子 | |
| AU743215B2 (en) | Food-grade cloning vector and their use in lactic acid bacteria | |
| JPH06253853A (ja) | マクロライド抗生物質生合成遺伝子を含有するｄｎａ | |
| JP2000078981A (ja) | Ｄｎａ断片 | |
| WO1998039452A1 (fr) | Fragments d'adn contenant le gene de la biotine biosynthetase et utilisation de ceux-ci | |
| JPH11285384A (ja) | マクロライド抗生物質アシル化酵素遺伝子を含有するｄｎａ | |
| JP2002539791A (ja) | ハイブリッド型合成酵素、ハイブリッド型ペプチドおよびこれを含む組成物 | |
| KR20000016470A (ko) | 스트렙토마이세스 글라우체센스 지엘에이.오로부터 슈도-올리고사카라이드 생합성용 유전자의 분리 방법 및 이의 용도 | |
| JPH06225769A (ja) | マイシナマイシン耐性を付与する新規遺伝子ｍｙｒＢ | |
| JPH11215985A (ja) | 虫歯予防物質産生形質転換体または形質導入体及び虫歯予防剤 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Decisions on the lapse of the protection rights |
Effective date: 20130915 |