PL185541B1

PL185541B1 - Sposób wytwarzania N-acetylo-(L)-4-cyjanofenyloalaniny i N-acetylo-(L)-p-amidynofenyloalaninocykloheksyloglicyno-beta-(3-N-metylopirydynio)-alaniny

Info

Publication number: PL185541B1
Application number: PL96327314A
Authority: PL
Inventors: Chi-Hsin R. King
Original assignee: Aventis Pharmaceuticals
Priority date: 1995-12-20
Filing date: 1996-11-25
Publication date: 2003-05-30
Also published as: RU2170764C2; ZA9610600B; CZ195698A3; DE69623038T2; ES2179957T3; EP0868526B1; CN1087349C; ATE222293T1; IL125003A; DE69623038D1; HK1017384A1; DK0868526T3; NO982868L; NO982868D0; UA48993C2; TR199801107T2; CA2241210C; NO319678B1; NZ324159A; JP2000501618A

Abstract

1. Sposób wytwarzania N-acetylo-(L)-4- -cyjanofenyloalaniny o wzorze 1A, znamienny tym, ze obejmuje etapy: a) polaczenia zwiazku o wzorze 1, w roztwo- rze wodnym 5-95% objetosciowych w stosunku do srodowiska reakcyjnego acetonitrylu oraz subtylizy- ny w ilosci 0,5-10 milirównowazników w przelicze- niu na ciezar zwiazku o wzorze 1, do przereagowa- nia ze zwiazkiem o wzorze 1, co prowadzi do utwo- rzenia srodowiska reakcyjnego; oraz b) doprowadzenia pH srodowiska reakcyjne- go do wartosci 5-9 gdy dodawana jest subtylizyna i utrzymania tej samej wartosci pH podczas przebie- gania reakcji prowadzacej do utworzenia zwiazku o wzorze 1A. 2. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze stosuje sie acetonitryl w ilosci 50-60% objeto- sciowych roztworu wodnego. WZÓR 1A WZÓR 2 PL PL PL PL PL PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania N-acetylo-(L)-4-cyjanofenyloalaniny o wzorze 1 A, obejmujący etapy:

a) połączenia związku o wzorze 1, w roztworze wodnym 5-95% objętościowych w stosunku do środowiska reakcyjnego acetonitrylu oraz subtylizyny w ilości 0,5-10 milirównoważników w przeliczeniu na ciężar związku o wzorze 1, do przereagowania ze związkiem o wzorze 1, co prowadzi do utworzenia środowiska reakcyjnego; oraz

b) doprowadzenia pH środowiska reakcyjnego do wartości 5-9 gdy dodawana jest subtylizyna i utrzymania tej samej wartości pH podczas przebiegania reakcji prowadzącej do utworzenia związku o wzorze 1 A.

Przedmiot wynalazku stanowi również sposób wytwarzania związku Ac-(L)-pAph-ChgPalMe(3)-NH₂ o wzorze 2 albo jego farmaceutycznie dopuszczalnych soli, obejmujący etapy:

a) połączenia związku o wzorze 1, w roztworze wodnym, 5-95% objętościowych w stosunku do wodnego roztworu acetonitrylu oraz subtylizyny w ilości 0,5-10 milirównoważników w przeliczeniu na ciężar związku o wzorze 1, do przereagowania ze związkiem o wzorze 1, co prowadzi do utworzenia środowiska reakcyjnego; oraz

b) doprowadzenie pH środowiska reakcyjnego do wartości 5-9, gdy dodawana jest subtylizyna i utrzymania tej samej wartości pH podczas przebiegania reakcji prowadzącej do utworzenia związku o wzorze 1A;

c) sprzęgania związku o wzorze 1A ze związkiem o wzorze 3 z utworzeniem związku o wzorze 4;

d) przekształcenia grupy cyjanowej w związku o wzorze 4 w grupę amidynową oraz zmetylowania atomu azotu w grupie pirydylowej z utworzeniem związku o wzorze 2.

Następujące określenia mająponiższe znaczenia:

a) określenie „Ac” lub „grupa acetylową” oznacza grupę funkcyjną o wzorze 7;

b) określenie „grupa amidynowa” oznacza grupę funkcyjną o wzorze 8;

c) określenie „grupa pirydylowa” oznacza grupę funkcyjną o wzorze 9;

Stereoizomery to ogólne określenie wszystkich izomerów różniących się wyłącznie przestrzennym rozmieszczeniem atomów. Obejmuje ono izomery związków z więcej niż jednym centrum chiralności, nie będące wzajemnymi odbiciami lustrzanymi (diastereomery lub diastereoizomery). Określenie „enancjomer” dotyczy dwóch stereoizomerów będących nie nakładającymi się wzajemnie odbiciami lustrzanymi. Określenie „centrum chiralności” dotyczy atomu węgla, do którego są przyłączone cztery różne grupy. Pojęcia L/D lub R/S są stosowane zgodnie z wytycznymi Połączonej Komisji Nomenklatury Biochemicznej IUPACIUB opublikowanymi w Eur. J.Biochem. tom 138, str. 9-37 (1984). Substancja chiralna może bądź zawierać jednakowe ilości izomerów R i S (albo izomerów L i D) i wówczas nazywa się ją „racemiczną” lub „racematem”, bądź też może nie zawierać jednakowych ilości izomerów R i S (albo izomerów L i D) i w takim przypadku jest nazywana „optycznie czynną” albo „nieracemiczną”.

185 541

Określenie „rozdzielanie” oznacza podział mieszaniny racemicznej na jej optycznie czynne składniki.

Określenie „nadmiar enancjomeryczny” albo symbol „ee” oznacza zawartość procentową, w jakiej jeden enancjomer, El, występuje w nadmiarze w mieszaninie dwóch enancjomerów, E1 + E2; zatem —^-100% = ee + E2)

Symbol (+) dotyczy enancjomeru plus, symbol (-) dotyczy enancjomeru minus.

Oznaczenie ,, -«czi ” dotycay wiązrnia skierowanego ponad płaszezyzoę kartki, oznaczenie „ou»«z. ’’ dotyczy wiązowa skioeowanego cod n-sarzy/nę kartki.

Określenie „farmoceutacpnie dopuszczalne sole” obejmuje sole addycyjne z kwasami utworzone w wyniku reakcji z kwasami takimi, jak na przykład kwas chlorowodorowy, bromnwodorowa, siarkowy, azotowy lub fosforowy oraz z takimi organicznymi kwasami karboksylowymi, jak kwas octowy, trifluoroootowa, propionowy, glikolowy, maleinowy, winowy, cytrynowy, salicylowy, 2-acetaloZsybeadoesowy, albo z organicznymi kwasami sulfonowymi, takimi jak kwas metanosulfonowy, -Utoluenosulfonowy i naftalenosulfonowy. Można też oczywiście wykorzystać inne kwasy, dobrze znane w dziedzinie farmacji.

Stosowane w niniejszym opisie określenie „aminokwas obejmuje występujące w naturze aminokwasy przenoszone w ramach kodu genetycznego i stanowiące segmenty w budowie protein. Jeżeli nie zostało to inaczej zapaaczoae, określenie „aminokwas” powinno też obejmować L-aminokwasy, D-aminokwasy, aminokwasy modyfikowane chemicznie, takie jak analogi aminokwasów oraz występujące w naturze aminokwasy nie wchodzące zwykle w skład protein. Symbole aminokwasów i analogów aminokwasów objętych zakresem tego opisu zawiera tabela 1.

Tabela 1

Aminokwas	Symbol
Alaina	Ala
Feaaloalaaiaa	Phe
ρ-Cyjaaofeayloalaaiaa	Phe(4-CN)
p-Amidaaofeaaloalaaiaa	PAphe
Cakloheksaloklioyaa	Chg
β-(3-piradalo)aalaaiaa	Pal
β-(3-N-metylopiradyaio)aalaaiaa	PalMe(3)

Schemat 1 przedstawia rozdzielanie estru etylowego N-acetaloa(D,L)-4-oyjaanfenylnalaniny o wzorze 1'.

Z estru etylowego w postaci racematu (związek o wzorze 1') wyodrębnia się stereoipomer L w postaci kwasu, tj. N-acetalo-4-oyjanofenyloalaaiay (związek o wzorze 1 A), podczas gdy stereoizomer D estru (związek o wzorze D-1’) w zasadzie nie ulega przemianie w kwas. Zatem, można oddzielić pożądany kwas od niepożądanego estru. Jak to zostanie nokła„aiej opisane w dalszym tekście, otrzymany w tym procesie kwas stanowi głównie izomer L, na co wskazuje duża wartość jego współozaaaika ee.

Ilość związku o wzorze 1 użyta do połączenia w celu utworzenia środowiska reakcyjnego co najmniej dwukrotnie przekracza ilość, którą chce się odzyskać w postaci stereoizomeru L zgodnie ze sposobem według niniejszego wynalazku. Środowisko reakcyjne zawiera dostateczną, wyżej podaną,ilość acetonitrylu i dostateczną, wyżej podaną, ilość roztworu wodnego. Te dostateczne ilości są wymagane po to, aby umożliwić wzajemne oddziaływanie substancji

185 541 dodanych zgodnie ze sposobem według niniejszego wynalazku. Użyte tu określenie „substancje dodane” oznacza dowolne substancje wprowadzone do środowiska reakcyjnego.

Dostateczna ilość acetonitrylu to ilość, która solubilizuje istotną ilość związku o wzorze 1 w środowisku reakcyjnym. Korzystnie, związek o wzorze 1 solubilizuje się w acetonitrylu i powoli dodaje się roztwór wodny aż do chwili bezpośrednio poprzedzającej zmętnienie roztworu wodnego. Zmętnienie roztworu wskazuje, że część związku o wzorze 1 wytrąca się i dlatego może być potrzebne wprowadzenie dodatkowej ilości acetonitrylu w celu rozpuszczenia wytrąconego osadu. Dostateczna ilość acetonitrylu wynosi, jak wyżej podano, 5-95% objętościowych w przeliczeniu na środowisko reakcyjne, a korzystnie od około 50 do 60% objętościowych. Korzystne stężenie związku o wzorze 1 zawiera się w przedziale od około 20 g do 140 g na litr środowiska reakcyjnego, zwłaszcza korzystne stężenie wynosi od około 35 g do 65 g na litr.

Dostateczną ilość roztworu wodnego stanowi ilość solubilizująca istotną ilość enzymu (subtylizyny) w środowisku reakcyjnym. Stosowane w niniejszym opisie określenie „roztwór wodny” stanowi roztwór zawierający wodę, a korzystniej wodę i inne substancje dodane, wspomagające wzrost wydajności lub wartości współczynnika ee. Określenie „roztwór” nie musi koniecznie oznaczać, że jakakolwiek substancja dodana wprowadzona do roztworu wodnego uległa rozpuszczeniu; może to także oznaczać, że substancje dodane są zdyspergowane i tworzą zawiesinę.

Roztwór wodny może też na przykład zawierać jako substancję dodaną dostateczną ilość soli nieorganicznej, takiej jak chlorek potasu, chlorek sodu, chlorek litu itd. Korzystną sól nieorganiczną stanowi chlorek potasu. Uważa się, że działanie soli nieorganicznej polega na stabilizacji subtylizyny. Dostateczna ilość soli nieorganicznej to ilość wystarczająca do stabilizacji subtylizyny. Wynosi ona od około 0,02 mola do około 0,20 mola na litr roztworu wodnego, korzystnie od około 0,05 do 0,15 mola na litr. Na przykład, roztwór chlorku potasu o stężeniu 1M wprowadza się do środowiska reakcyjnego w ilości od około 10 do około 15% objętościowych.

Ze związkiem o wzorze 1, acetonitrylem i roztworem wodnym łączy się dostateczną, wyżej podaną ilość subtylizyny. Dostateczną ilość subtylizyny stanowi ilość zdolną do przereagowania z istotną ilością (praktycznie biorąc, całkowitą ilością, jeżeli jest to możliwe) związku o wzorze 1. Jak wyżej wspomniano, ilość ta wynosi 0,5 - 10 milirównoważników w przeliczeniu na ciężar związku o wzorze 1.

Pomiaru pH środowiska reakcyjnego dokonuje się w chwili dodawania enzymu i, w razie potrzeby, doprowadza się pH do wartości 5-9. Jest to wartość pH umożliwiająca reagowanie enzymu. Korzystnie, wartość pH zawiera się w przedziale od około 6,5 do około 7,5. Odpowiednią wartość pH utrzymuje się w trakcie reakcji związku o wzorze 1 z subtylizyną. Reakcja ta trwa od około 15 minut do 4 godzin i korzystnie przebiega w warunkach mieszania albo z zastosowaniem innych odpowiednich sposobów wspomagających ten proces. W celu utrzymania odpowiedniej wartości pH można użyć dowolnych odpowiednich metod, np. można wprowadzić dostateczną ilość zasady, takiej jak wodorotlenek sodu, wodorotlenek potasu, wodorotlenek litu, wodorotlenek amonu, węglan sodu lub węglan potasu, korzystnie w postaci roztworu o stężeniu IM, albo można wprowadzić roztwór buforowy, taki jak na przykład octan amonu, wodorowęglan amonu lub wodorowęglan sodu, bądź też bufor fosforanowy, taki jak wodorofosforan amonu lub wodorofosforan sodu. Do pomiaru i kontroli pH środowiska reakcyjnego można zastosować pehametr.

Związek o wzorze 1A można wyodrębnić metodami dobrze znanymi specjalistom, na przykład w taki sposób, że roztwór rozcieńcza się dodatkiem zasadowego roztworu soli nieorganicznej, takiej jak na przykład wodorowęglan sodu. Fazę nieorganiczną przemywa się rozpuszczalnikami organicznymi, takimi jak na przykład etery, rozpuszczalniki chlorowane jak chlorek metylenu lub chloroform, toluen, heptan albo octan etylu. Roztwór wodny zakwasza się za pomocą stężonego kwasu, takiego jak na przykład kwas solny, do pH od około 1 do 3 i ekstrahuje rozpuszczalnikiem organicznym, otrzymując związek o wzorze 1 A.

185 541

Tabele 2 i 3 zawierają porównanie przebiegu reakcji z zastosowaniem roztworu wodnego i acetonitrylu (tabela 2) oraz roztworu wodnego i sulfotlenku dimetylowego zamiast acetonitrylu (tabela 3).

Tabela 2

W kolumnie „Wejście” pozycja 1 dotyczy reakcji prowadzonej w obecności soli nieorganicznej (chlorku potasu), pozycja 2 dotyczy reakcji prowadzonej bez udziału soli nieorganicznej.

Kolumna	A	B	C	D	E	F
Wejście	Związek o wzorze 1 (D:L= 60:40), g	CH₃CN: H₂O: 1M KCl (ml)	Subtylizyna mg (mrówn.)	Czas, min	Związek o wzorze 1A % ee	Związek o wzorze 1A, wydajność, %
1	67	1000:600:214	100 (3,7)	180	99,4	88 (ciało stałe) *
2	1	15:9,5:0	1,6 (3,2)	120	98	90 (ciało stałe)*

* Związek o wzorze 1A jest łatwy do wyodrębnienia w postaci ciała stałego.

Tabela 3

Reakcje z zastosowaniem sulfotlenku dimetylowego (DMSO) były prowadzone w rozmaitych warunkach, różniących się czasem trwania, ilością subtylizyny i ilością związku o wzorze 1.

Kolumna	A	B	C	D	E	F
Wejście	Związek o wzorze 1, g	DMSO : H₂O : 1M KCl (ml)	Subtylizyna mg (mrówn.)	Czas, min	Związek o wzorze 1A, % ee	Związek o wzorze 1A, wydajność w %
1	2,0	32:18:6,4	1,5 (1,5)	30	95,4	70 (olej w DMSO)*
2	7,8	125:100:25	12 (3,0)	30	94	88 (olej w DMSO)’’
3	25	400:200:81	19(1,5)	40	88	70 (olej w DMSO)
4	100	1600:900:320	75(1,5)	60	88	90 (olej w DMSO)’’
5	2,8	10:8:2	4,4 (3,0)	65	86	50 (ciało stale)”’
6	2,0	42:26:6,4	1,5 (1,5)	120	80	70 (olej w DMSO)*

” W związku o wzorze 1A jest obecny DMSO, bardzo trudny do usunięcia.

DMSO usunięto w wyniku odparowania w temperaturze 90°C pod ciśnieniem 1,05 kPa, rozpuszczenia związku o wzorze 1A w octanie etylu i trzykrotnego przemycia wodą.

Kolumna A w tabelach 2 i 3 podaje ilość (w gramach) użytego w doświadczeniu związku o wzorze 1.

Kolumna B podaje ilości (w mililitrach - ml) acetonitrylu (CH₃CN) lub sulfotlenku dimetylowego (DMSO), wody oraz 1M roztworu chlorku potasu użytych do sporządzenia roztworu wodnego.

Kolumna C podaje ilość użytej subtylizyny w miligramach (mg) i, odpowiednio, w milirównoważnikach (mrówn.) w przeliczeniu na ciężar związku o wzorze 1.

Kolumna D podaje czas trwania doświadczenia.

Kolumna E podaje nadmiar enancjomeryczny otrzymanego związku o wzorze 1A.

Kolumna F podaje wydajność otrzymanego związku o wzorze 1 A.

Wyniki przedstawionych doświadczeń wskazują na skuteczność i wydajność sposobu rozdzielania, który w przypadku zastosowania acetonitrylu charakteryzuje się łatwością wyodrębnienia związku o wzorze 1A w połączeniu z dużąjego wydajnością i znacznym nadmiarem enancjomerycznym.

185 541

Schemat 2 jest przedłużeniem schematu 1 i ilustruje sposób wytwarzania Ac-(L)-pAph-Chg-PalMe(3)-NH2 o wzorze 2. Na etapie A schematu 2, związek o wzorze 3' ulega sprzęganiu ze związkiem o wzorze 1A z utworzeniem związku o wzorze 4. W reakcji sprzęgania związku o wzorze 3' można zastosować metodę azydkową. W tym celu, na przykład, związek o wzorze 1A rozpuszcza się w odpowiednim bezwodnym rozpuszczalniku organicznym, takim jak bezwodny dimetyloformamid lub bezwodny chlorek metylenu, w atmosferze gazu obojętnego, na przykład azotu. Do takiego roztworu dodaje się azydku difenylofosforylu, 1-4 równoważniki odpowiedniej zasady, takiej jak diizopropyloetyloamina, i co najmniej jeden równoważnik chronionego aminokwasu o wzorze 3' rozpuszczonego w odpowiednim bezwodnym rozpuszczalniku organicznym, takim jak bezwodny dimetyloformamid lub bezwodny chlorek metylenu. Następnie reagujący układ miesza się w ciągu od około 1 do 15 godzin, wyodrębnia produkt sprzęgania o wzorze 4 i oczyszcza go metodami dobrze znanymi specjalistom, takimi jak techniki ekstrakcyjne, wytrącanie, krystalizacja i chromatografia równowagowa. Tak więc, na przykład, odparowuje się rozpuszczalnik, produkt sprzęgania o wzorze 4 wytrąca się eterem dietylowym, przemywa i wyodrębnia w wyniku odsączenia.

Na etapach B-D schematu 2 obecną w związku o wzorze 4 grupę cyjanową przekształca się w grupę amidynową występującą w związku o wzorze 2. Przekształcenie to realizuje się na drodze aminolizy odpowiedniego metylotioimidanu uzyskanego ze związku o wzorze 5 (utworzonego w wyniku reakcji grupy cyjanowej związku o wzorze 4 z siarkowodorem), zgodnie ze sposobem przedstawionym przez Wagnera i innych w opisie patentowym NRD nr 155 954 udzielonym 21 lipca 1982 roku, ponownie zbadanym 9 listopada 1988 roku, który to opis jest włączony do niniejszego opisu jako odsyłacz.

Tak więc na przykład, na etapie B schematu 2 związek o wzorze 4 rozpuszcza się w rozpuszczalniku organicznym, takim jak sulfotlenek dimetylowy, i dodaje zasadę organiczną na przykład pirydynę, trietyloaminę, diizopropyloetyloaminę, 2,6-lutydynę lub kolidynę. Przez roztwór przepuszcza się w temperaturze pokojowej strumień siarkowodoru aż do przereagowania związku o wzorze 4. Układ reakcyjny można dodatkowo utrzymywać w temperaturze pokojowej jeszcze przez 1-18 godzin. Związek o wzorze 5 wyodrębnia się metodami dobrze znanymi specjalistom, takimi jak strącenie i odsączenie. Następnie osad przemywa się rozpuszczalnikiem organicznym, takim jak eter dietylowy, i suszy pod zmniejszonym ciśnieniem.

Na etapie C schematu 2 grupę pirydylową w związku o wzorze 5 poddaje się metylowaniu, otrzymując związek o wzorze 6. Z reguły do reakcji metylowania można stosować halogenki metylu, takie jak jodek metylu, bromek metylu lub chlorek metylu. Można również użyć fluorosulfonianu metylu, siarczanu dimetylowego, p-toluenosulfonianu metylu i innych środków metylujących, takich jak ujawnione przez Zoltewicza i Deady'ego w Adv. Heterocycl. Chem. 22, 71-121 (1978) i przez Duffina w Adv. Heterocycl. Chem. 3, 1-56 (1964), które to publikacje są włączone do niniejszego opisu jako odsyłacze. Korzystnie stosuje się nadmiar halogenków metylu, zwłaszcza korzystny jest nadmiar jodku metylu. Reakcję prowadzi się w rozpuszczalnikach, takich jak alkohole, na przykład metanol i etanol, aceton, chloroform, acetonitryl, nitrobenzen i dimetyloformamid. Zwłaszcza korzystne jest prowadzenie reakcji w mieszaninie acetonu z sulfotlenkiem dimetylowym, w warunkach mieszania w temperaturze pokojowej w ciągu 1 -24 godzin. Związek o wzorze 6 wyodrębnia się metodami dobrze znanymi specjalistom; tak więc odparowuje się nadmiar jodku metylu, związek o wzorze 6 wytrąca się eterem dietylowym, oddziela na drodze dekantacji, przemywa i suszy.

Na etapie D schematu 2 metylotioimidan związku o wzorze 6 ulega dalszemu przekształceniu w zawierający grupę amidynową odpowiedni związek o wzorze 2. W tym celu związek o wzorze 6 korzystnie rozpuszcza się w rozpuszczalniku organicznym takim jak metanol, zwłaszcza korzystnie w obecności kwasu octowego. Do roztworu dodaje się octanu amonu. Korzystnie, mieszaninę reakcyjną ogrzewa się do temperatury w zakresie 40-65°C, zwłaszcza korzystnie do temperatury w zakresie 50-60°C, i utrzymuje w tej temperaturze w ciągu 2-3 godzin. Związek o wzorze 2 wyodrębnia się w sposób dobrze znany specjalistom; można go wyodrębnić w postaci dopuszczalnej farmaceutycznie soli. Tak więc, na przykład,

185 541 odparowuje się rozpuszczalnik, pozostałość rozpuszcza w acetonitrylu, wytrąca dodatkiem kwasu trifluorooctowego, odsącza osad i suszy go pod zmniejszonym ciśnieniem.

Następujące przykłady ilustrują typowe syntezy opisane schematami 1 i 2. Przykłady te służą, do objaśnienia i w żadnej mierze nie ograniczają zakresu wynalazku.

Jest rzeczą zrozumiałą dla specjalistów, że kolejność realizowania poszczególnych etapów w schematach może być kwestią wyboru. Związki wyjściowe są dostępne w handlu bądź też można je łatwo uzyskać metodami dobrze znanymi specjalistom.

Poniższe stosowane w niniejszym opisie skróty i symbole mają następujące znaczenia; „g” oznacza gramy; „mol” oznacza mole; „mmol” oznacza milimole; „1” oznacza litry; „ml” oznacza mililitry; „μΐ” oznacza mikrolitry; „Tt” oznacza temperaturę topnienia; „°C” oznacza stopnie w skali Celsjusza; „TLC” oznacza chromatografię cienkowarstwową; ,>1 oznacza stężenie molowe (molamość); oraz „Rf” oznacza współczynnik retencji.

Przykład 1 (D,L)-N-acetylo-4-cyjanofenyloalanina, Ac-(D,L)-Phe(4-CN)-OH

Etap A: 4-cyjanobenzyloacetamidomalonian dietylowy o wzorze 10

W 400 ml dioksanu sporządza się zawiesinę 44 g (0,203 mola) acetamidomalonianu dietylowego, 40 g (0,204 mola) α-bromo-p-toluonitrylu oraz 10 g jodku potasu i dodaje się roztwór etanolami sodu (4,6 g sodu w 200 ml bezwodnego etanolu). Mieszaninę ogrzewa się w temperaturze wrzenia pod chłodnicą zwrotną w ciągu 3-4 godzin, pozostawia przez noc, wylewa na lód (2 l), odsącza osad, przemywa go wodą i suszy w warunkach liofilizacji. Produkt przekrystalizowuje się z metanolu, otrzymując 61 g (91% wydajności) 4-cyjanobenzyloacetamidomalonianu dietylowego w postaci białych kryształów.

Etap B: ester etylowy N-(D,L)-acetylo-4-cyjanofenyloalaniny, Ac-(D,L)-Phe(4-CN)-OEt o wzorze 1

W 0,6 1 etanolu sporządza się zawiesinę 41,97 g (0,126 mola) 4-cyjanobenzyloacetamidomalonianu dietylowego i wprowadza 6M roztwór wodorotlenku sodu w następujących odstępach czasu: 10 ml (60 mmoli) w minucie 0, 10 ml (60 mmoli) po 30 minutach, 5 ml (30 mmoli) po 3 godzinach. W trakcie dodawania roztworu wodorotlenku sodu układ miesza się aż do zaniku związku wyjściowego (TLC, octan etylu, R_f = 0,63). Roztwór rozcieńcza się dodatkiem 100 ml wody i za pomocą stężonego kwasu solnego doprowadza pH do wartości 3. Odparowuje się etanol i półstały produkt suszy przez noc w warunkach liofilizacji, otrzymując N-acetylo-4-cyj anobenzyloacetamidomalonian monoetylowy.

Sporządza się zawiesinę tak uzyskanego N-acetylo-4-cyjano-benzyloacetamidomalonianu monoetylowego w 0,5 l bezwodnego dioksanu i ogrzewa ją w temperaturze wrzenia pod chłodnicą zwrotną w ciągu 2,5-3 godzin. Następnie odparowuje się dioksan,'sporządza zawiesinę stałej pozostałości w 250 ml octanu etylu i ekstrahuje trzema porcjami nasyconego wodnego roztworu wodorowęglanu sodu, wodą, kwasem solnym (0,5 M) i solanką. Roztwór w octanie etylu odwadnia się nad siarczanem magnezu, sączy i odparowuje rozpuszczalnik. Pozostałość przekrystalizowuje się z mieszaniny octan etylu/heksan, otrzymując 28,95 g (88% wydajności) estru etylowego N-(L,D)-acetylo-4-cyjanofenyloalaniny.

Przykład 2

Enzymatyczne rozdzielanie Ac-(D,L)-Phe(4-CN)-OEt (6:4; D:L) i otrzymywanie (L)-N-acetylo-4-cyjanofenyloalaniny, Ac-(L)-Phe(4-CN)-OH o wzorze 1A

Do roztworu 67 g Ac-(D,L)-Phe(4-CN)-OEt (6:4; D:L) w 1 l acetonitrylu dodaje się 241 ml IM roztworu chlorku potasu oraz 600 ml wody, doprowadza pH roztworu do wartości 7,3-6,9 i wprowadza roztwór 50 mg subtylizyny Carlsberga w 8 ml 0,1 M wodnego roztworu chlorku potasu. Wartość pH układu utrzymuje się miareczkując go IM roztworem wodorotlenku sodu. Po upływie 1 godziny znowu wprowadza się roztwór 50 mg subtylizyny w 8 ml 0,1M wodnego roztworu chlorku potasu i utrzymuje pH układu miareczkując go 1M roztworem wodorotlenku sodu. Po upływie 2,5 godziny dodaje się 800 ml roztworu wodorowęglanu sodu, ekstrahuje czterema porcjami po 800 ml octanu etylu, roztwór w octanie etylu odwadnia nad siarczanem magnezu i sączy. Przesącz zależą się otrzymując 38 g (wydajność 95%) Ac-(D)Phe(4-CN)-OEt w postaci substancji stałej o ee = 90%. Warstwę wodną zakwasza się do pH = 1 dodatkiem 56 ml stężonego kwasu solnego, ekstrahuje ją czterema porcjami po 800 ml octanu

185 541 etylu, warstwę organiczną odwadnia nad siarczanem magnezu i sączy. Przesącz zatęża się otrzymując 21 g (wydajność 88%) Ac-(L)-Phe(4-CN)-OH w postaci substancji stałej o Tt — 124-126°C i ee - 99,4%.

Przykład 3

N-acetylo-(L)-p-amidynofenyloalanino-cykloheksyloglicyno-3-(3-N-metylopirydynio)alanina, Ac-(L)-pAph-(L)-Chg-(L)-PalMe(3)-NH₂ o wzorze 2

Etap A: amid N-t-butyloksykarbonylo-L-(3)-(3-pirydylo)-alaniny, Boc-(L)-Pal-NH2 o wzorze 11

W 50 ml chlorku metylenu sporządza się zawiesinę 1,34 g (5 mmoli) Boc-(L)-Pal-OH, chłodzi ją do temperatury -15°C i dodaje 963 pl (5,5 mmola) diizopropyloetyloaminy oraz 715 p (5,5 mmola) chloromrówczanu izobutylu. Całość miesza się w ciągu 15 minut w temperaturze -15°C i w ciągu około 3 minut przepuszcza przez roztwór silny strumień bezwodnego amoniaku (znad stałego wodorotlenku sodu). Układ miesza się przez 10 minut w temperaturze -15°C i przez 20 minut w temperaturze pokojowej, odparowuje chlorek metylenu, dodaje 70 ml octanu etylu, przemywa nasyconym wodnym roztworem wodorowęglanu sodu, odwadnia nad siarczanem magnezu i odparowuje. Pozostałość krystalizuje się z mieszaniny octan etylu/heksan, otrzymując 0,98 g (75% wydajności) Boc-(L)-Pal-NH2.

Etap B: chlorowodorek amidu (L)-P-(3-pirydylo)-alaniny o wzorze 12

Słabo ogrzewając, sporządza się zawiesinę 0,98 g Boc-(L)-Pal-NH2, w 15 ml chlorku metylenu, dodaje 10 ml 4M roztworu kwasu chlorowodorowego w dioksanie i po upływie 30 minut odparowuje się chlorek metylenu oraz dioksan. Stalą pozostałość rozpuszcza się w metanolu, strąca osad dodatkiem eteru dietylowego i odsącza go, otrzymując 0,86 g (98% wydajności) H-(L)-Pal-NH₂-2HCl.

Etap C: amid N-t-butyloksykarbonylo-(L)-cykloheksyloglicyno-(L)-3-(3-pirydylo)alaniny, Boc-(L)-Chg-(L)-Pal-NH2 o wzorze 13

Miesza się przez noc układ złożony z 432 mg (1,82 mmola) H-(L)-Pal-NH2 · 2HCl, 609 mg (2,37 mmoli, 1,3 równoważnika) Boc-(L)-Chg-OH, 494 mg (2,4 mmoli) dicykloheksylokarbodiimidu, 324 mg (2,4 mmoli) hydroksybenzotriazolu i 4 mmoli diizopropyloetyloaminy w 15 ml dimetyloformamidu. Odparowuje się dimetyloformamid, dodaje octanu etylu i utrzymuje mieszaninę w temperaturze pokojowej w ciągu 1 godziny. Następnie odsącza się utworzony diizopropylokarbodiimidodecyloheksylomocznik, ekstrahuje roztwór trzema porcjami nasyconego roztworu wodorowęglanu sodu, odwadnia nad siarczanem magnezu i odparowuje. Pozostałość krystalizuje się dodatkiem heksanu, otrzymując 598 mg (81% wydajności) Boc-(L)-Chg-(L)-Pal-NH2.

Etap D: chlorowodorek amidu (L)-cykloheksyloglicyno-(L)-3-(3-pirydylo)-alaniny, H-(L)-Chg-(L)-Pal-NH2 · 2HCl o wzorze 14

W 50 ml chlorku metylenu sporządza się zawiesinę 1,27 g (3,12 mmola) Boc-(L)-Chg(L)-Pal-NH₂ i dodaje 10 ml 4M kwasu chlorowodorowego w dioksanie. Po upływie 30 minut odparowuje się dioksan i chlorek metylenu, rozpuszcza stałą pozostałość w metanolu, wytrąca produkt dodatkiem 200 ml eteru dietylowego i odsącza go, otrzymując 1,12 g (95% wydajności) H-(L)-Chg-(L)-Pal-NH₂ · 2HCl.

Etap E: amid N-acetylo-p-cyjanofenyloalanino-(L)-cykloheksyloglicyno-(L)-3-(3-pirydylo) alaniny, Ac-(L)-Phe(4-CN)-(L)-Chg-(L)-Pal-NH₂ o wzorze 4'

Miesza się przez noc układ złożony z 1,13 g (3 mmoli) H-(L)-Chg-(L)-Pal-NH2^-2HCl, 0,84 g (3,6 mmoli) Ac-(L)-Phe(4-CN)-OH, 10 mmoli diizopropyloetyloaminy i 803 μΐ (3,6 mmoli) azydku difenylofosforylu w 30 ml dimetyloformamidu. Odparowuje się dimetyloformamid, wytrąca osad eterem dietylowym, odsącza go i przemywa eterem dietylowym, otrzymując 1,282 g (82% wydajności) Ac-(L)-Phe(4-CN)-(L)-Chg-(L)-Pal-NH2.

Etap F: amid N-acetylo-(L)-p-tioamidofenyloalanino-(L)-cykloheksyloglicyno-(L)-p-(3-pirydylo)-alaniny, Ac-(L)-Phe(4-tioamido)-(L)-Chg-(L)-Pal-NH2 o wzorze 5'

W 20-40 ml sulfotlenku dimetylowego rozpuszcza się 1,18 g (2,28 mmola) Ac-(L)-Phe(4-CN)-(L)-Chg-(L)-Pal-NH₂, dodaje 40 ml pirydyny oraz 14 ml trietyloaminy i przez roztwór przepuszcza się w temperaturze pokojowej strumień siarkowodoru w ciągu 30 minut. Roztwór przetrzymuje się przez noc w temperaturze pokojowej, odparowuje do małej objętości

185 541 i wytrąca produkt eterem dietylowym. Układ umieszcza się na kilka godzin w lodówce, odsącza osad, przemywa go eterem dietylowym i suszy pod zmniejszonym ciśnieniem, otrzymując

1,26 g Ac-(L)-Phe(4-tioamido)-(L)-Chg-(L)-Pal-NH₂ w postaci żółtej substancji stałej.

Etap G: jodowodorek N-aCetyle-p-metylotioamidanofenyloalanine-cykloheksyloglicyno-(L)-3-(3-metylopirydynio)-alaniny, Ac-(L)-Phe(4-metylotioamidano)-(L)-Chg-(L)-Pal(Me)-NH₂ · 2Hl o wzorze 15

W 10-20 ml sulfotlenku dimetylowego i 80 ml acetonu sporządza się zawiesinę 1,2 g Ac-(L)-Phe(4-tieamido)-(L)-Chg-(L)-Pal-NH₂ i dodaje 14 ml (50 równoważników) jodku metylu. Mieszaninę reakcyjną przetrzymuje się przez noc w temperaturze pokojowej, odparowuje aceton i nadmiar jodku metylu i wytrąca osad dodatkiem 0,5-1 1 eteru dietylowego. Po przetrzymaniu układu przez kilka godzin w temperaturze 4°C eter dietylowy oddziela się w wyniku dekantacji lub przesączenia, a półstałą substancję na ściankach przemywa się eterem dietylowym i octanem etylu. Produkt suszy się pod zmniejszonym ciśnieniem, otrzymując 1,(1 g Ac-(L)-Phe(4-metylotioamidano)-(L)-Chg-(L)-Pal(Me)-NH₂-2HI.

Etap H: trifluorooctan amidu N-acetylo-(L)-p-acetamidofenyloalanine-cykloheksyloglic^no-(L)-p-((-N-metylopirydynio)-alaniny, Ac-(L)-pAphe-(L)-Chg-(L)-PalMe-NH2 · TFA o wzorze 16

W 50 ml metanolu i 0,5 ml kwasu octowego rozpuszcza się 1,(1 g Ac-(L)-Phe(4-metylotioamidano)-(L)-Chg-(L)-PalMe-NH2-2HJ, dodaje 0,8 g octanu amonu, ogrzewa mieszaninę w temperaturze 55°C w ciągu ( godzin, odparowuje, pozostałość rozpuszcza w mieszaninie (1:1) acetonitryl: woda zawierającej 0,1% kwasu trifluorooctowego, sączy i liofilizuje, otrzymując 1,22 g Ac-(L)-pAphe-(L)-Chg-(L)-PalMe-NH2 · TFA.

Niniejszy wynalazek dotyczy wytwarzania N-acetylo-(L)-4-cyjanofenyloalaniny o wzorze 1A jako związku pośredniego, użytecznego w wytwarzaniu Ac-(L)-pAph-Chg-PalMe(()-NH2 o wzorze 2. Ten ostatni związek jest stosowany do hamowania działania protein powodujących krzepnięcie krwi, a w szczególności do hamowania enzymatycznego czynnika „Xa” powodującego krzepnięcie krwi, co zostało bardziej szczegółowo opisane w zgłoszeniu Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 08/428 404 z dnia 25 kwietnia 1995 roku, włączonym do niniejszego opisu jako odsyłacz.

Stosowane w niniejszym opisie określenie „aktywność czynnika Xa” dotyczy zdolności czynnika Xa - samego lub w zespole podjednostek znanym jako kompleks protrombinazy - do katalizowania przemiany protrombiny w trombinę. Gdy określenie „hamowanie” jest stosowane w odniesieniu do aktywności czynnika Xa, to obejmuje ono zarówno bezpośrednie, jak i pośrednie hamowanie aktywności czynnika Xa. Bezpośrednie hamowanie aktywności czynnika Xa może na przykład polegać na związaniu peptydu z czynnikiem Xa lub z protrombinazą, co zapobiega związaniu protrombiny z centrum aktywnym kompleksu protrombinazy.

Stosowane w niniejszym opisie określenie „specyficzne, gdy jest stosowane w odniesieniu do hamowania aktywności czynnika Xa, oznacza, że związek hamuje aktywność czynnika Xa bez istotnego hamowania aktywności innych określonych proteaz (dotyczy to użycia jednakowego stężenia czynnika hamującego - inhibitora). Do tych innych określonych proteaz zalicza się na przykład proteazy włączone w kaskadę koagulacyjną, takie jak trombina, plazmina, trypsyna i elastaza.

Aczkolwiek w niektórych stanach chorobowych powstawanie skrzepów krwi w układzie krążeniowym stanowi jako takie źródło zachorowalności, nie jest pożądane całkowite zahamowanie procesu krzepnięcia krwi, ponieważ może to spowodować zagrażający życiu krwotok.

Proces koagulacji krwi jest złożony i polega na serii wzmacniających się progresywnie reakcji aktywowania enzymu, w toku których zymogeny plazmy zostają aktywowane sekwencyjnie w wyniku ograniczonej proteolizy.

Z mechanistycznego punktu widzenia kaskadowy proces koagulacji krwi dzieli się na dwie „ścieżki” „wewnętrzną” i „zewnętrzną”. Ścieżki te zmierzają do uaktywnienia czynnika X z późniejszym powstawaniem trombiny przebiegającym po pojedynczej „wspólnej ścieżce”.

185 541

Obecne dane wskazują, że ścieżka wewnętrzna odgrywa ważną rolę w zachowaniu i rozwoju powstawania fibryny, podczas gdy ścieżka zewnętrzna jest decydująca na początkowym etapie procesu koagulacji krwi. Powszechnie przyjmuje się teraz, że koagulacja krwi, fipaczaie biorąc, rozpoczyna się utworzeniem kompleksu odanaik tkankowa/cpaanlk VIIa. Kompleks ten po utworzeniu szybko inicjuje koagulację poprzez aktywujący czynnik IX i X. Nowo powstały czynnik Xa tworzy następnie w stosunku jeden na jeden kompleks z czynnikiem VIa i z fosfolipidami. Ten tak zwany kompleks protrnmbiaaza jest odpowiedzialny za przekształcenie rozpuszczalnego fibrynogenu w nierozpuszczalną fibrynę. W miarę upływu czasu aktywność kompleksu czynnik tkankowy/czynnik VIIa (ścieżka zewnętrzna) zostaje stłumiona przez proteinę będącą inhibitorem rroteapy typu Kunitza (TFPI), która, gdy jest skompleksowana z czynnikiem Xa, może bezpośrednio hamować proteolityczną aktywność kompleksu czynnik tkankowy/czynnik VIIa. Aby zachować przebieganie procesu koagulacji w obecności zahamowanego układu zewnętrznego, wytwarza się dodatkowo ozynaik Xa poprzez zaktawowaaie ścieżki wewnętrznej za pośrednictwem trombiny. Trombina odgrywa więc podwójną „autokatalitycpaą” rolę, pośrednicząc w wytwarzaniu samej siebie i w przekształceniu fibrynogenu w fibrynę.

Autokatalityozna charakter powstawania trombiny stanowi istotne zabezpieczenie przed niekontrolowanym krwawieniem. Zapewnia on, że gdy obecny jest określony progowy poziom protrombiaapa, proces koagulacji krwi będzie przebiegać do całkowitego zakończenia, powodując, na przykład, koniec krwotoku. Bardzo pożądane jest zatem opracowanie środków hamujących koagulację i jednocześnie nie będących bezpośrednimi inhibitorami trombiny.

Związek Ac-pAph-Chg-PalMe(3)-NH₂, który jest analogiem peptydu otrdamywaaym zgodnie ze sposobem według niniejszego wynalazku, stanowi użyteczny inhibitor hamujący aktywność czynnika Xa i jednocześnie nie hamujący w istotnym stopniu aktywności innych proteap działających w procesie koagulacji krwi.

185 541

CN

WZÓR 1A

WZÓR 1

185 541

WZÓR 2

Η

WZÓR 3

185 541

WZÓR 4

WZÓR 4'

185 541

WZÓR 5'

185 541

Ο ch₃-c—

WZÓR 7

NH

WZÓR 8

NC

WZÓR 9

COOEt

-NHAc

COOEt

WZÓR 10

185 541 'Ν

L^conr, <.conh₂

Boc-NH

NH2HC1

WZÓR 11

WZÓR 12

WZÓR 13

185 541

WZÓR 15

185 541

WZÓR 16

185 541

WZÓR 4

185 541

Schemat 2(2) wzór 6

185 541

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 60 egz.

Cena 4,00 zł.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Sposób wytwarzania N-acetylo-(L)-4-cyjanofenyloalaniny o wzorze 1A, znamienny tym, że obejmuje etapy:

a) połączenia związku o wzorze 1, w roztworze wodnym 5-95% objętościowych w stosunku do środowiska reakcyjnego acetonitrylu oraz subtylizyny w ilości 0,5-10 milirównoważników w przeliczeniu na ciężar związku o wzorze 1, do przereagowania ze związkiem o wzorze 1, co prowadzi do utworzenia środowiska reakcyjnego; oraz

b) doprowadzenia pH środowiska reakcyjnego do wartości 5-9 gdy dodawana jest subtylizyna i utrzymania tej samej wartości pH podczas przebiegania reakcji prowadzącej do utworzenia związku o wzorze 1 A.
2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się acetonitryl w ilości 50-60% objętościowych roztworu wodnego.
3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że roztwór wodny zawiera sól nieorganiczną w ilości 10-15% obętościowych w przeliczeniu na roztwór wodny jednomolamego roztworu soli nieorganicznej.
4. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że jako sól nieorganiczną stosuje się chlorek potasu.
5. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że pH środowiska reakcyjnego nastawia się i utrzymuje za pomocą dodawania zasady.
6. Sposób według zastrz. 5, znamienny tym, że jako zasadę stosuje się wodorotlenek sodu.
7. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że pH środowiska reakcyjnego nastawia się i utrzymuje za pomocą dodawania buforu.
8. Sposób według zastrz. 7, znamienny tym, że jako bufor stosuje się roztwór fosforanu.
9. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że pH środowiska reakcyjnego nastawia się i utrzymuje w zakresie 6,5-7,5.
10. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że obejmuje dalsze mieszanie środowiska reakcyjnego w ciągu od około 15 minut do około 4 godzin podczas przebiegania reakcji subtylizyny ze związkiem o wzorze 1.
11. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że obejmuje dalszy etap wyodrębniania związku o wzorze 1A ze środowiska reakcyjnego.
12. Sposób wytwarzania N-acetylo-(L)-p-amidynofenyloalaninocykloheksyloglicyno-P-(3-N-metylopirydynio)-alaniny o wzorze 2 albo jej farmaceutycznie dopuszczalnych soli, znamienny tym, że obejmuje etapy:

a) połączenia związku o wzorze 1, w roztworze wodnym 5-95% objętościowych w stosunku do wodnego roztworu acetonitrylu oraz subtylizyny w ilości 0,5-10 milirównoważników w przeliczeniu na ciężar związku o wzorze 1, do przereagowania że związkiem o wzorze 1, co prowadzi do utworzenia środowiska reakcyjnego; oraz

b) doprowadzenia pH środowiska reakcyjnego do wartości 5-9, gdy dodawana jest subtylizyna i utrzymania tej samej wartości pH podczas przebiegania reakcji prowadzącej do utworzenia związku o wzorze 1 A;

c) sprzęgania związku o wzorze 1A ze związkiem o wzorze 3 z utworzeniem związku o wzorze 4;

d) przekształcenia grupy cyjanowej w związku o wzorze 4 w grupę amidynową oraz zmetylowania atomu azotu w grupie pirydylowej z utworzeniem związku o wzorze 2.
13. Sposób według zastrz. 12, znamienny tym, że stosuje się acetonitryl w ilości 50-60% objętościowych roztworu wodnego.

185 541
14. Sposób według zastrz. 12, znamienny tym, że roztwór wodny zawiera sól nieorganiczną..
15. Sposób według zastrz. 14, znamienny tym, że stosuje się sól nieorganiczną w ilości 10-15% objętościowych w przeliczeniu na roztwór wodny jednomolamego roztworu soli nieorganicznej.
16. Sposób według zastrz. 15, znamienny tym, że jako sól nieorganiczną stosuje się chlorek potasu.
17. Sposób według zastrz. 12, znamienny tym, że pH środowiska reakcyjnego nastawia się i utrzymuje za pomocą dodawania zasady.
18. Sposób według zastrz. 17, znamienny tym, że jako zasadę stosuje się wodorotlenek sodu. .
19. Sposób według zastrz. 12, znamienny tym, że pH środowiska reakcyjnego nastawia się i utrzymuje za pomocą dodawania buforu.
20. Sposób według zastrz. 19, znamienny tym, że jako bufor stosuje się roztwór fosforanu.
21. Sposób według zastrz. 12, znamienny tym, że pH środowiska reakcyjnego doprowadza się do i utrzymuje w zakresie 6,5-7,5.
22. Sposób według zastrz. 12, znamienny tym, że obejmuje dalsze mieszanie środowiska reakcyjnego w ciągu od około 15 minut do około 4 godzin podczas przebiegania reakcji subtylizyny ze związkiem o wzorze 1.
23. Sposób według zastrz. 12, znamienny tym, że obejmuje dalszy etap wyodrębniania związku o wzorze 1A ze środowiska reakcyjnego.

Niniejszy wynalazek dotyczy nowego sposobu wytwarzania N-acetylo-(L)-4-cyjanofenyloalaniny czyli Ac-(L)-Phe(4-CN)-OH w wyniku rozdzielenia racemicznego estru etylowego N-acetylo-(D,L)-4-cyjanofenyloalaniny i nowego sposobu wytwarzania ste-reoizomeru N-acetylo-(L)-p-amidynofenyloalaninocykloheksyloglieyno-P-(3-N-metylopirydynio)alaniny czyli Ac-(L)-pAph-Chg-PaiMe(3)-NH₂ z wykorzystaniem N-acetylo-(L)-4-cyjanofenyloalaniny jako związku pośredniego.

Racemiczna N-acetylo-(D,L)-4-cyjanofenyloalanina oraz Ac-(L)-pAph-Chg-PaiMe(3)-NH₂ zostały ujawnione i opisane w zgłoszeniu Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 08/428 404 z dnia 25 kwietnia 1995 roku, stanowiącego częściową kontynuację zgłoszenia Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 08/233 054 z dnia 26 kwietnia 1994 roku i włączonego do niniejszego opisu jako odsyłacz. Produkt końcowy, czyli Ac-(L)-pAph-Chg-PalMe(3)-NH₂, jest użyteczny w charakterze inhibitora czynnika Xa.

Z punktu widzenia otrzymywania leków pożądane jest dysponowanie raczej stereoizomerami a nie związkami racemicznymi, ponieważ stereoizomery w porównaniu z racematami mogą mieć takie zalety, jak większa skuteczność, mniejszy udział działań ubocznych, niższy poziom toksyczności bądź jej brak itd. Niekiedy te zalety stereoizomeru w porównaniu z racematem nie są znane aż do chwili otrzymania leku, a niekiedy nawet aż do rozpowszechnienia leku na rynku. Wiele instytucji rządowych dopuszczających leki na rynek uważa za korzystniejsze zatwierdzanie dokumentacji dotyczącej leku w postaci raczej stereoizomeru niż związku racemicznego. Dlatego też pożądane było opracowanie sposobu wytwarzania stereoizomerycznego Ac-(L)-pAph-Chg-PalMe(3)-NH2. Podstawowy związek pośredni · służący do wytworzenia tego stereoizomeru stanowi stereoizomeryczna N-acetylo(L)-4-cyjanofenyloalanina.

Aby rozdzielić mieszaninę racemiczną należy dokonać wyboru spośród różnorodnych znanych metod stosowanych w tym celu. Jako niektóre przykłady można wymienić powstawanie diastereomerów i następną krystalizację lub absorpcję różnicową (chromatografia) [zgodnie z opisem w „Enantiomers, Racemates and Resolutions”, J. Jacques, A. Collet i S.H. Wilen, Wiley (1981)], rozdzielanie chromatograficzne na chiralnej fazie stacjonarnej,

185 541 rozdzielanie kinetyczne oraz rozdzielanie enzymatyczne. W rozdzielaniu aminokwasów okazało się użyteczne rozdzielanie enzymatyczne, w szczególności za pomocą hydrolaz i esteraz, co zostało opisane w następujących książkach: „Chemistry and Biochemistry of the Amino Acids”, Chapman and Hall, Nowy Jork, 1984, rozdział 10, strony 338-353; „Applications of Biochemical Systems in Organie Chemistry”, część I, J.B. Jones, C.J. Sih i D. Perlman, Wiley, Nowy Jork, 1976, rozdział 4, strony 107-401; oraz „Chemistry of the Amino Acids”, tom 1, Wiley, Nowy Jork, 1961, rozdział 9, strony 728-750.

Już nawet po wyborze metody, specjalista musi przeprowadzić liczne doświadczenia w celu wytypowania właściwego rozpuszczalnika, współrozpuszczalnika (w razie potrzeby), temperatury, czasu oraz innych warunków, w jakich przebiega skuteczny i wydajny proces rozdzielania mieszaniny racemicznej zapewniający łatwe uzyskanie pożądanego związku z dużą wydajnością i dużym nadmiarem enancjomerycznym, a przy tym niezbyt trudny do zrealizowania. Niniejszy wynalazek rozwiązuje te zagadnienia w odniesieniu do rozdzielenia N-acetylo-(D,L)-4-cyjanofenyloalaniny, której izomer L stosuje się następnie jako związek pośredni w wytwarzaniu Ac-L-pAph-Chg-PalMe(3)-NH₂ o wzorze 2.