KR100438879B1 - N-아세틸(L)-4-시아노페닐알라닌Ac-(L)-Phe(4-CN)-OH및N-아세틸-(L)-p-아미디노페닐알라닌-시클로헥실글리신-β-(3-N-메틸피리디늄)-알라닌Ac-(L)-pAph-Chg-PalMe(3)-NH2의신규제조방법 - Google Patents

N-아세틸(L)-4-시아노페닐알라닌Ac-(L)-Phe(4-CN)-OH및N-아세틸-(L)-p-아미디노페닐알라닌-시클로헥실글리신-β-(3-N-메틸피리디늄)-알라닌Ac-(L)-pAph-Chg-PalMe(3)-NH2의신규제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 라세미 화합물인 N-아세틸-(D,L)-4-시아노페닐알라닌 에틸 에스테르의 분할에 의한 N-아세틸-(L)-4-시아노페닐알라닌의 신규 제조 방법과, 중간체인 N-아세틸-(L)-4-시아노페닐알라닌을 사용하는 Ac-(L)-pAph-Chg-PalMe(3)-NH2의 입체 이성질체의 신규 제조 방법에 관한 것이다.

Description

Ｎ-아세틸(Ｌ)-4-시아노페닐알라닌 Ａｃ-(Ｌ)-Ｐｈｅ(4-ＣＮ)-ＯＨ 및 Ｎ-아세틸-(Ｌ)-ｐ-아미디노페닐알라닌-시클로헥실글리신-β-(3-Ｎ-메틸피리디늄)-알라닌 Ａｃ-(Ｌ)-ｐＡｐｈ-Ｃｈｇ-ＰａｌＭｅ(3)-ＮＨ2의 신규 제조 방법{Novel Process for Preparing N-Acetyl)L)-4-Cyanophenylalanine Ac-(L)-Phe(4-CN)-OH and N-Acetyl-(L)-p-Amidinophenylalanine-Cyclohexylglycine-β-(3-N-Methylpyridinium)-Alanine Ac-(L)-pAph-Chg-PalMe(3)-NH2}
라세미 화합물인 N-아세틸-(D,L)-4-시아노페닐알라닌 및 Ac-(L)-pAph-Chg-PalMe(3)-NH2는 본 명세서에 참조 문헌으로 인용된, 1994년 4월 26일에 출원된 미국 특허 제 08/233,054호의 일부 계속 출원인 1995년 4월 25일에 출원된 미국 특허 제08/428,404호에 개시 및 기술되어 있다. 최종 생성물인 Ac-(L)-pAph-Chg-PalMe(3)-NH2는 인자 (Factor) Xa의 억제제로서 유용하다.
입체 이성질체가 라세미체에 비해 우수한 효능, 더 적은 부작용, 더 낮은 수준의 독성 또는 무독성 등과 같은 잇점을 가질 수 있기 때문에 라세미체보다는 입체 이성질체를 약물로 개발하는 것이 바람직하다. 라세미체에 비해 우수한 입체 이성질체의 상기 잇점들은 때때로 약물 개발의 후기까지 알려지지 않거나 또는 때때로 심지어 약물이 시판될 때까지 알려지지 않는다. 시판용 약물을 승인하는 많은 정부 기관들은 이 약물의 라세미체보다는 입체 이성질체에 대한 일건 서류의 승인을 또한 더 선호한다. 따라서 Ac-(L)-pAph-Chg-PalMe(3)-NH2화합물의 입체 이성질체의 제조 방법을 갖는 것이 요구되었다. 상기 입체 이성질체를 제조하는 데에 중요한 중간체는 입체 이성질체인 N-아세틸-(L)-4-시아노페닐알라닌이다.
라세미체를 분할하기 위하여 공지된 다양한 기술로부터 분할 기술을 선택하여야 한다. 몇몇 예로 쟈크 (J. Jacques), 콜레트 (A. Collet) 및 윌렌 (S.H. Wilen)의 문헌 [Enantiomers, Racemates, and Resolutions, Wiley (1981)]에 기술된 바와 같이 부분입체 이성질체를 제조한 후 결정화시키거나 또는 차등 흡수 (크로마토그래피)시키는 방법, 키랄 고정상에서의 크로마토그래피적 분리법, 동력학적 분할법 및 효소적 분할법이 있다. 효소적 분할법, 특히 히드롤라제 또는 에스테라제는 문헌 [Chemistry and Biochemistry of the amino acids, 제 10장, 338 내지 353 페이지, 미국 뉴욕 소재의 Chapman and Hall, 1984; 존스 (J.B. Jones), 시 (C.J. Sih)와, 펄맨 (D. Perlman)의 Applications of Biochemical Systems in Organic Chemistry, Part I., 제 4장, 107 내지 401 페이지, 미국 뉴욕 소재의Wiley, 1976; Chemistry of the Amino Acids, vol. 1., 제9장, 728 내지 750 페이지, 미국 뉴욕 소재의 Wiley, 1961]에 기술된 바와 같이 아미노산들의 분할에 유용한 것으로 판명되었다.
심지어 방법이 선택된 후에도 당 업계의 숙련자들은 적당한 용매, 공용매 (필요할 경우), 온도, 시간, 및 다른 조건들을 광범위한 실험으로 찾아내어 관심있는 화합물의 용이한 회수, 고수율, 높은 거울상 이성질체 초과율, 및 수행하기에 그다지 어렵지 않은 방법을 제공하는 효과적이고 유효한 라세미체 분할법을 제공하여야 한다. 본 발명은 L 이성질체가 이후에 화학식 II의 화합물인 Ac-(L)-pAph-Chg-PalMe(3)-NH2의 제조에서 중간체로 사용되는, N-아세틸-(D,L)-4-시아노페닐알라닌의 분할에 있어서의 상기 문제점들을 해결한다.
발명의 요약
본 발명은
a) 충분한 양의 하기 화학식 I의 화합물, 충분한 양의 수용액, 충분한 양의 아세토니트릴과, 상당한 양의 화학식 I의 화합물과 반응하는 충분한 양의 서브틸리신 (Subtilisin)을 배합시켜 반응 매질을 제조하는 단계와,
b) 서브틸리신을 첨가할 때 반응 매질을 적당한 pH로 조정하고 반응이 일어나 하기 화학식 IA의 화합물이 생성되는 동안 이 적당한 pH를 유지시키는 단계
를 포함하는, 하기 화학식 IA의 화합물인 N-아세틸-(L)-4-시아노페닐알라닌의 제조 방법을 제공한다.
본 발명은 또한
a) 충분한 양의 하기 화학식 I의 화합물, 충분한 양의 수용액, 충분한 양의 아세토니트릴과, 상당한 양의 화학식 I의 화합물과 반응하는 충분한 양의 서브틸리신을 배합시켜 반응 매질을 제조하는 단계,
b) 서브틸리신을 첨가할 때 반응 매질을 적당한 pH로 조정하고 반응이 일어나 하기 화학식 IA의 화합물이 생성되는 동안 이 적당한 pH를 유지시키는 단계,
c) 하기 화학식 IA의 화합물과 하기 화학식 3의 화합물을 커플링시켜 하기 화학식 4의 화합물을 생성시키는 단계,
d) 화학식 4의 화합물의 시아노기를 아미디노기로 전환시키고 피리딜기의 질소를 메틸화시킴으로써 화학식 II의 화합물을 생성시키는 단계
를 포함하는, 하기 화학식 II의 화합물인 Ac-(L)-pAph-Chg-PalMe(3)-NH2또는 제약적으로 허용가능한 그의 염의 제조 방법을 제공한다.
〈화학식 I〉
<화학식 IA>
바람직한 실시 형태의 상세한 설명
다음 용어들은 하기에 기술되는 의미를 갖는다.
(a) "Ac" 또는 "아세틸"이라는 용어는 식의 관능기를 의미하고,
(b) "아미디노"라는 용어는 식의 관능기를 의미하며,
(c) "피리딜"이라는 용어는 식의 관능기를 의미한다.
입체 이성질체들은 그들의 원자들의 공간상의 배향에서만 다른 모든 이성질체들에 대한 일반적인 용어이다. 상기 용어는 서로 거울상이 아닌 1개 이상의 키랄 중심을 갖는 화합물들의 이성질체를 포함한다 (부분입체 이성질체 또는 디아스테레오머). "거울상 이성질체"라는 용어는 서로 겹쳐질 수 없는 거울상인 2종의 입체 이성질체들을 의미한다. "키랄 중심"이라는 용어는 4개의 상이한 기들이 결합되는 탄소 원자를 의미한다. L/D 또는 R/S 명명은 생화학 명명에 대한 IUPAC-IUB 조인트 위원회에서 기술된 바와 같이 사용된다 (문헌 [Eur. J. Biochem., 138: 9-37 (1984)] 참조). 키랄 물질은 "라세미" 또는 "라세미체"라고 불리는 경우 동량의 R 및 S 이성질체 (또는 L 및 D 이성질체)를 포함할 수 있거나 또는 "광학적 활성" 또는 "비라세미"라고 불리는 경우 동량의 R 및 S (또는 L 및 D 이성질체)를 포함하지 않을 수 있다.
"분할"이라는 용어는 라세미 혼합물을 그의 광학적 활성 성분으로 분리시키는 것을 의미한다.
"거울상 이성질체 초과율 (enantiomeric excess)" 또는 "ee"라는 용어는 2종의 거울상 이성질체의 혼합물 (E1 + E2)에 있어서 1종의 거울상 이성질체 E1의 식
에 따른 과량 퍼센트를 의미한다.
(+)라는 용어는 플러스 거울상 이성질체를 의미하고 (-)라는 용어는 마이너스 거울상 이성질체를 의미한다.
""의 의미는 페이지의 평면으로부터 전방으로 튀어나오는 결합을 의미한다.
""의 의미는 페이지의 평면으로부터 후방으로 튀어나가는 결합을 의미한다.
"제약적으로 허용가능한 염"이라는 용어에는 산, 예를 들어 염산, 브롬화수소산, 황산, 질산 또는 인산과, 유기 카르복실산, 예를 들어 아세트산, 트리플루오로아세트산, 프로피온산, 글리콜산, 말레산, 타르타르산, 시트르산, 살리실산, 2-아세틸옥시벤조산 또는 유기 술폰산, 예를 들어 메탄술폰산, 4-톨루엔술폰산 및 나프탈렌술폰산과의 반응에 의해 유도된 산 부가염이 포함된다. 물론 제약 분야에 잘 알려진 다른 산들도 또한 사용될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 "아미노산"이라는 용어의 의미에는 유전 코드로부터 번역되고 단백질의 빌딩 블록(building block)을 이루는 천연 아미노산이 포함된다. 아미노산이라는 용어의 의미는 또한 구체적으로 다르게 언급되지 않는 한 (L)-아미노산, (D)-아미노산 모두, 아미노산 유사체와 같은 화학적으로 변성된 아미노산, 일반적으로 단백질 내로 혼입되지는 않는 천연 아미노산을 포함한다. 본 명세서의 범위 내에 포함되는 아미노산, 아미노산 유사체의 약자를 표 1에 나타낸다.
아미노산 기호
알라닌 Ala
페닐알라닌 Phe
p-시아노페닐알라닌 Phe(4-CN)
p-아미디노페닐알라닌 pAphe
시클로헥실글리신 Chg
β-(3-피리딜)-알라닌 Pal
β-(3-N-메틸피리디늄)-알라닌 PalMe(3)
방법 1: 화합물 (I)의 분할
방법 1: N-아세틸-(D,L)-4-시아노페닐알라닌 에틸 에스테르의 분할
에틸에스테르의 라세미체 (화합물 (I))는산인 N-아세틸-4-시아노페닐알라닌의 L 입체 이성질체 (화합물 (IA))로 분할되는 반면 이에스테르의 D 입체 이성질체 (화합물 D-(I))는 실질적으로 산으로 전환되지 않는다. 따라서 원하지 않는 에스테르로부터 원하는 산을 분리시킬 수 있다. 하기에 더 충분히 기술되는 바와 같이 상기 방법으로 수득된 산은 그의 높은 ee 계수로 나타나듯이 주로 L 이성질체이다.
반응 매질을 제조하기 위하여 배합시키는 화합물 (I)의 충분한 양은 본 발명의 방법으로 L 입체 이성질체로서 회수하기를 원하는 양의 2배 이상이다. 반응 매질은 충분한 양의 아세토니트릴 및 충분한 양의 수용액을 함유한다. 상기 충분한 양은 본 발명의 방법에 따라 첨가제들이 상호작용할 수 있게 하는 데 필요하다. 본 명세서에서 사용되는 "첨가제"는 반응 매질에 첨가되는 임의의 것을 의미한다.
아세토니트릴의 충분한 양은 반응 매질에서 상당한 양의 화합물 (I)을 용해시키는 양일 것이다. 바람직하게는 화합물 (I)을 아세토니트릴 내로 용해시키며 수용액이 흐려지기 직전까지 서서히 첨가한다. 이 흐린 용액은 화합물 (I)의 일부가 침전되어 추가량의 아세토니트릴이 이 침전물을 용해시키는 데 필요할 수 있음을 나타낸다. 예를 들어 아세토니트릴의 충분한 양은 반응 매질의 약 5 내지 95 부피%, 더 바람직하게는 약 50 내지 60 부피%이다. 바람직하게는 화합물 (I)의 농도는 반응 매질의 리터 당 약 20 g 내지 140 g, 더 바람직하게는 리터 당 약 35 g 내지 65 g이다.
수용액의 충분한 양은 반응 매질에서 상당한 양의 서브틸리신 효소를 용해시키는 양이다. 본 명세서에서 사용되는 "수용액"은 물을 함유하는 용액이고, 더 바람직하게는 물 및 수율 또는 ee 계수의 증가에 도움을 주는 다른 첨가제를 함유하는 용액이다. "용액"이라는 용어는 수용액에 첨가되는 임의의 첨가제가 모두 용해된 것을 의미할 필요는 없으며 첨가제들을 분산시켜 현탁물이 되게 하는 것을 의미할 수도 있다.
예를 들어 수용액은 첨가제로서 충분한 양의 무기염, 예를 들어 염화 칼륨, 염화 나트륨, 염화 리튬 등을 더 함유할 수 있다. 바람직하게는 무기염은 염화 칼륨이다. 무기염은 서브틸리신을 안정화시키는 기능을 하는 것으로 생각된다. 무기염의 충분한 양은 서브틸리신을 안정화시키기에 충분한 양이다. 이 양은 수용액의 리터 당 약 0.02 몰 내지 약 0.20 몰, 더 바람직하게는 리터 당 약 0.05 내지 0.15몰이다. 예를 들어 1 M 염화 칼륨 용액은 반응 매질의 약 10 내지 약 15 부피 퍼센트 범위에서 배합된다.
충분한 양의 서브틸리신을 화합물 (I), 아세토니트릴 및 수용액과 배합시킨다. 서브틸리신의 충분한 양은 상당한 양의 (가능하다면 실질적으로 모든) 화합물 (I)과 반응할 수 있는 양이다. 이 양은 화합물 (I)의 양의 중량 기준으로 약 0.5 내지 약 10 밀리당량이다.
반응 매질의 pH는 효소를 첨가할 경우 측정하며 필요하다면 적당한 pH로 조정한다. 적당한 pH는 효소가 반응할 수 있는 pH이다. 바람직하게는 적당한 pH는 약 5 내지 약 9, 더 바람직하게는 약 6.5 내지 약 7.5이다. 적당한 pH는 화합물 (I)과 서브틸리신 사이에 반응이 일어나는 동안 유지된다. 상기 반응 시간은 약 15분 내지 4시간이며 바람직하게는 교반 또는 다른 적당한 방법으로 반응을 돕는다. 임의의 적당한 수단을 사용하여, 예를 들어 충분한 양의 염기, 예를 들어 수산화 나트륨, 수산화 칼륨, 수산화 리튬, 수산화 암모늄, 탄산 나트륨, 탄산 칼륨을, 바람직하게는 1 M 용액으로 첨가함으로써 또는 예를 들어 아세트산 암모늄, 중탄산 암모늄, 중탄산 나트륨 또는 인산수소 암모늄, 인산수소 나트륨과 같은 인산 완충제와 같은 완충액을 첨가함으로써 적당한 pH를 유지시킬 수 있다. pH 미터를 사용하여 반응 매질의 pH를 모니터링할 수 있다.
화합물 (IA)는 예를 들어 중탄산 나트륨과 같은 무기염의 염기성 용액을 첨가시킴으로써 용액을 희석시키는 것과 같은 당 업계의 잘 알려진 방법에 따라 수집할 수 있다. 무기 상은 예를 들어 에테르, 염소 처리된 용매, 예를 들어 염화 메틸렌, 클로로포름, 톨루엔, 헵탄 또는 에틸 아세테이트와 같은 유기 용매로 세척시킨다. 이 수용액은 예를 들어 염산과 같은 농축 산을 사용하여 산성화시킴으로써 pH가 약 1 내지 3이 되게 하며 유기 용매로 추출함으로써 화합물 (IA)를 생성시킨다.
표 2 및 표 3
표 2 및 표 3은 수용액 및 아세토니트릴로 수행되는 반응 (표 2)과 수용액 및 아세토니트릴 대신 디메틸 술폭시드로 수행되는 반응 (표 3)을 비교하여 나타낸다.
칼럼 A는 시험에서 사용되는 화합물 (I)의 양을 그램으로 나타낸다.
칼럼 B는 수용액을 제조하는 데 사용되는 디메틸 술폭시드 (DMSO) 또는 아세토니트릴 (CH3CN), 물 및 1 M 염화 칼륨 용액의 양을 밀리미터 (mL)로 나타낸다.
칼럼 C는 화합물 I의 중량에 대하여 사용되는 서브틸리신의 양을 밀리그램 (mg) 및 상응하는 밀리당량 (meq)으로 나타낸다.
칼럼 D는 실험을 수행하는 시간을 나타낸다.
칼럼 E는 수득된 화합물 (IA)의 거울상 이성질체 초과율을 나타낸다.
칼럼 F는 수득되는 화합물 (IA)의 수율을 나타낸다.
칼럼 A B C D E F
엔트리 (Entry) D:L이 60:40인 화합물 (I) (g) CH3CN/H2O/1 M KCl (mL) 서브틸리신 (mg) (meq) 시간 (분) 화합물 (IA) % ee 화합물 (IA) % 수율
1 67 1000/600/214 100 (3.7) 180 99.4 88 (고체)3
2 1 15/9.5/0 01.6 (3.2) 120 98 90 (고체)3
3. 화합물 (IA)는 고체로서 쉽게 단리됨.
엔트리 1에서는 무기염 (염화 칼륨)의 존재 하에 반응을 수행시켰다. 엔트리 2에서는 무기염 없이 반응을 수행시켰다.
칼럼 A B C D E F
엔트리 화합물 (I) (g) DMSO/H2O/1 M KCl (mL) 서브틸리신 (mg) (meq) 시간 (분) 화합물(IA) % ee 화합물 (IA) % 수율
1 2.0 32/18/6.4 1.5 (1.5) 30 95.4 70 (DMSO 중 오일)1
2 7.8 125/100/25 12 (3.0) 30 94 88 (DMSO 중 오일)1
3 25 400/200/81 19 (1.5) 40 88 70 (DMSO 중 오일)1
4 100 1600/900/320 75 (1.5) 60 88 90 (DMSO 중 오일)1
5 2.8 10/8/2 4.4 (3.0) 65 86 50 (고체)2
6 2.0 42/26/6.4 1.5 (1.5) 120 80 70 (DMSO 중 오일)1
1. 화합물 (IA) 내에 존재하는 DMSO는 제거하기가 매우 어려움.
2. 90℃/8 토르 (torr)에서 증발시킴으로써 DMSO를 제거하고, 에틸 아세테이트에 용해시키며 물로 3회 세척시킴.
디메틸 술폭시드를 사용한 반응은 시간, 서브틸리신의 비율, 화합물 (I)의양을 서로 다르게 한 다양한 조건 하에서 수행하였다.
상기 시험들은 아세토니트릴을 사용할 경우 화합물 (IA)가 고수율 및 높은 거울상 이성질체 초과율로, 쉽게 회수되어 효과적이고 유효하게 분할됨을 나타낸다.
방법 2
방법 2는 방법 1의 연속이며 화합물 (II)인 화합물 Ac-(L)-pAph-Chg-PalMe(3)-NH2의 제조 방법을 제시한다.
방법 2의 단계 A에서 화합물 (3)을 화합물 (IA)와 커플링시켜 화합물 (4)를 생성시킨다. 화합물 (3)은 예를 들어 화합물 (IA)를 질소와 같은 불활성 대기 하에서 무수 디메틸포름아미드 또는 무수 염화 메틸렌과 같은 적당한 무수 유기 용매에 용해시키는 것과 같은 아지드 방법을 사용하여 커플링시킬 수 있다. 상기 용액에 디페닐포스포릴아지드, 디이소프로필 에틸 아민과 같은 적당한 염기 1 내지 4당량 및 무수 디메틸포름아미드 또는 무수 염화 메틸렌과 같은 적당한 무수 유기 용매에 용해된 보호 아미노산인 화합물 (3) 1 당량 이상을 첨가한다. 이어서 이 반응물을 약 1 내지 15시간 동안 교반시킨다. 이어서 커플링된 화합물 (4)는 추출 기술, 침전법, 결정화 및 플래쉬 (flash) 크로마토그래피와 같은 당 업계에 잘 알려진 기술들을 사용하여 단리시키고 정제시킨다. 예를 들어 용매는 증발시키고 커플링된 생성물 (4)는 에틸 에테르로 침전시키며 여과로 세척시키고 수집한다.
방법 2의 단계 B 및 D에서 화합물 (4)의 시아노기를 화합물 (II)의 아미디노기로 전환시킨다. 상응하는 화합물 (5)의 메틸티오이미데이트 (화합물 (4)의 시아노기와 황화 수소를 반응시킴으로써 제조됨)를 가아민 분해, 이어서 와그너 (Wagner) 등의 방법 (1982년 21일에 발행된 DDR 특허 제155,954호, 1998년 11월 9일에 재심사되었으며 본 명세서에 참조 문헌으로 인용됨)으로 상기와 같이 전환시킨다.
예를 들어 방법 2의 단계 B에서 화합물 (4)를 디메틸 술폭시드와 같은 유기 용매에 용해시킨다. 예를 들어 피리딘, 트리에틸아민 디이소프로필에틸아민, 2,6-루티딘, 콜리딘과 같은 유기 염기들을 첨가시킨다. 화합물 (4)가 소비될 때까지 실온에서 이 용액으로 황화 수소 스트림 (stream)을 통과시킨다. 이 반응물은 추가로 1 내지 18시간 동안 실온에서 유지시킬 수 있다. 화합물 (5)는 당 업계에 잘 알려진 방법, 예를 들어 침전법 및 여과법에 따라 수집한다. 이어서 침전물을 디에틸 에테르와 같은 유기 용매로 세척시키고 진공 하에서 건조시킨다.
방법 2: Ac-(L)-pAph-Chg-Pal-Me(3)-NH2의 합성
방법 2의 단계 C에서 화합물 (5)의 피리딜기를 메틸화하여 화합물 (6)을 생성시킨다. 더 일반적으로는 메틸화에 있어서 요오드화 메틸, 브롬화 메틸 또는 염화 메틸과 같은 메틸 할로겐화물을 사용할 수 있다. 본 명세서에 참조 문헌으로 인용되어 있는 졸테비츠 (Zoltewicz) 및 데디 (Deady)의 문헌 [Adv. Heterocycl. Chem. 22, 71-121 (1978)] 및 두핀 (Duffin)의 문헌 [Adv. Heterocycl. Chem. 3,1-56 (1964)]에 공개되어 있는 메틸 플루오로술포네이트, 디메틸 설페이트, 메틸 톨루엔-p-술포네이트 및 다른 메틸화제도 또한 사용할 수 있다. 바람직하게는 과량의 메틸 할로겐화물을 사용하고 더 바람직하게는 과량의 요오드화 메틸을 사용한다. 반응은 예를 들어 메탄올 및 에탄올과 같은 알콜, 아세톤, 클로로포름, 아세토니트릴, 니트로벤젠 및 디메틸포름아미드와 같은 용매 중에서 수행시킨다. 더 바람직하게는 아세톤과 디메틸술폭시드와의 혼합물에서 반응을 수행시키며 반응물은 실온에서 1 내지 24시간 동안 교반시킨다. 화합물 (6)은 과량의 요오드화 메틸을 증발시키고 화합물 (6)을 에틸 에테르로 침전시키며 기울여 따름으로써 수집하고 세척 및 건조시키는 것과 같은 당 업계에 잘 알려진 방법에 따라 단리시킨다.
방법 2의 단계 D에서 화합물 (6)의 메틸티오이미데이트를 그의 상응하는 화합물 (II)의 아미디노기로 더 전환시킨다. 바람직하게는 화합물 (6)을 메탄올과 같은 유기 용매에, 더 바람직하게는 아세트산의 존재 하에 용해시킨다. 아세트산 암모늄을 이 용액에 첨가한다. 바람직하게는 이 반응물을 40℃ 내지 65℃ 범위의 온도, 더 바람직하게는 50℃ 내지 60℃의 범위에서 가열하며 이 온도에서 2 내지 3시간 동안 유지시킨다. 화합물 (II)를 당 업계에 잘 알려진 방법에 따라 단리시키며 제약적으로 허용가능한 염으로 단리시킬 수 있다. 예를 들어 용매를 증발시키고 잔류물을 아세토니트릴에 용해시키며 트리플루오로아세트산을 첨가하여 침전시키고 진공 하에서 여과 및 건조시킬 수 있다.
하기 실시예는 방법 1 및 방법 2에서 기술된 전형적인 합성법을 제시한다. 상기 실시예들은 본 발명을 예시하기 위함이지 어떤 방식으로든 본 발명의 범위를제한하려는 것은 아님을 이해하여야 한다.
당 업계의 숙련자들에게 그 진가가 인정되듯이 방법에 있어서 단계들이 수행되는 순서는 임의적일 수 있다.
출발 물질들은 구매 가능하거나 또는 당 업계에 잘 알려진 방법으로 쉽게 제조된다.
본 명세서에서 사용되는 하기의 용어들은 지시된 의미를 갖는다: "g"는 그램을 나타내고, "mol"은 몰을 나타내며, "mmole"는 밀리몰을 나타내고, "L"은 리터를 나타내며, "mL"은 밀리리터를 나타내고, "μL"는 마이크로리터를 나타내며, "mp"는 융점을 나타내고, "℃"는 섭씨 온도를 나타내며, "TLC"는 박층 크로마토그래피 (thin layer chromatography)를 나타내고, "M"은 몰농도를 나타내며, "RF"는 체류 계수 (retention factor)를 나타낸다.
실시예 1
(D,L)-N-아세틸-4-시아노페닐알라닌 Ac-(D,L)-Phe(4-CN)-OH
단계 A: 디에틸 4-시아노벤질아세트아미도말로네이트
44 g의 디에틸아세트아미도말로네이트 (0.203 mol), 40 g의 알파-브로모-p-톨루오니트릴 (0.204 mol), 10 g의 요오드화 칼륨을 400 mL의 디옥산 중에 현탁시키고 200 mL의 건조 에탄올 중 4.6 g의 나트륨 에톡시드의 용액을 첨가한다. 이 혼합물을 환류 하에서 3 내지 4시간 동안 가열하며 밤새 둔다. 혼합물을 2 L의 얼음에 붓고 침전물을 여과시키며 물로 세척시키고 동결 건조기 상에서 건조시킨다. 메탄올로부터 재결정화시켜 백색 결정체로서 디에틸 4-시아노벤질아세트아미도말로네이트 61 g을 생성시킨다 (91%).
단계 B: N-(D,L)-아세틸-4-시아노페닐알라닌 에틸 에스테르, Ac-(D,L)Phe(4-CN)-OEt
0.6 L의 에탄올 중에 41.97 g의 4-시아노벤질 디에틸아세트아미도말로네이트 (0.126 mol)을 현탁시킨다. 6 M의 수산화 나트륨을 0분에서 10 mL (60 mmol), 3시간 30분 후에 10 mL (60 mmol), 3시간 후에 5 mL (30 mmol)의 간격으로 첨가한다. 출발 물질이 사라질 때까지 (TLC, 에틸 아세테이트, Rf=0.63) 수산화 나트륨 (GM)을 첨가하면서 반응물을 교반시킨다. 100 mL의 물로 이 용액을 희석시키고 진한 염산을 첨가하여 pH를 3으로 조정한다. 에탄올을 증발시키고 반고체 생성물을 동결 건조기 상에서 밤새 건조시켜 N-아세틸-4-시아노벤질 모노에틸 아세트아미도말로네이트를 생성시킨다.
상기와 같이 생성시킨 N-아세틸-4-시아노벤질 모노에틸 아세트아미도말로네이트를 0.5 L의 건조 디옥산에 현탁시키고 환류 하에서 2.5 내지 3시간 동안 가열한다. 디옥산을 증발시키고 250 mL의 에틸 아세테이트에 고체를 현탁시키며 중탄산 나트륨의 포화 수용액으로 3회, 물, 0.5 M의 염산, 및 염수로 추출시킨다. 황산 마그네슘 상에서 에틸 아세테이트 용액을 건조시키고 여과 및 증발시킨다. 에틸 아세테이트/헥산으로부터 이 생성물을 재결정화시킴으로써 28.95 g의 N-(L,D)-아세틸-4-시아노페닐알라닌 에틸 에스테르를 생성시킨다 (88%).
실시예 2
Ac-(D,L)Phe(4-CN)-OEt (D:L이 6:4)의 효소적 분할 및 (L)-N-아세틸-4-시아노페닐알라닌, Ac-(L)Phe(4-CN)-OH의 제조
1 L의 아세토니트릴 중 67 g의 Ac-(D,L)Phe(4-CN)-OEt (D:L이 6:4)의 용액에 1 M의 염화 칼륨 용액 241 mL 및 물 600 mL을 첨가한다. 용액의 pH를 7.3 내지 6.9로 조정하고 0.1 M의 염화 칼륨 수용액 8 mL 중 50 mg의 서브틸리신 칼스버그 (Carlsberg)의 용액을 첨가한다. 1 M의 수산화 나트륨으로 적정하여 용액의 pH를 유지시킨다. 1시간 후에 0.1 M의 염화 칼륨 수용액 8 mL 중 50 mg의 서브틸리신의 용액을 첨가하고 1 M 수산화 나트륨으로 적정함으로써 이 용액의 pH를 유지시킨다. 2.5시간 후에 800 mL의 중탄산 나트륨 용액을 첨가하고 800 mL의 에틸 아세테이트로 4회 추출한다. 황산 마그네슘 상에서 이 에틸 아세테이트 용액을 건조시키고 혼합물을 여과시킨다. 여과액을 농축시켜 고체로서 Ac-(D)Phe(4-CN)-OEt 38 g을 생성시킨다 (95%, 90% ee). 56 mL의 진한 염산으로 수성 층을 pH 1로 산성화시킨다. 800 mL의 에틸 아세테이트로 수성층을 4회 추출시킨다. 황산 마그네슘 상에서 유기층을 건조시키고 혼합물을 여과시킨다. 여과액을 농축시켜 고체로서 Ac-(L)Phe(4-CN)-OH 21 g을 생성시킨다 (88%).
융점 124 내지 126℃. 99.4% ee.
실시예 3
N-아세틸-(L)-p-아미디노페닐알라닌, Ac-(L)-pAph-(L)-Chg-(L)-PalMe(3)-NH2
단계 A: N-t-부틸옥시카르보닐-(L)-β-(3-피리딜)-알라닌 아미드, Boc-(L)-Pal-NH2
50 mL의 염화 메틸렌 중에 1.34 g의 Boc-(L)-Pal-OH (5 mmol)을 현탁시켜 -15℃로 냉각시킨다. 디이소프로필에틸아민 (963 μL, 5.5 mmol) 및 이소부틸클로로포르메이트 (715 μL, 5.5 mmol)를 첨가한다. 이 혼합물을 -15℃에서 15분 동안 교반시킨다. 이 용액에 격렬한 무수 암모니아 스트림을 약 3분 동안 통과시킨다 (고체 수산화 나트륨 위에서). 이 혼합물을 -15℃에서 10분, 그리고 실온에서 20분 동안 교반시킨다. 염화 메틸렌을 증발시키고 70 mL의 에틸 아세테이트를 첨가하며 중탄산 나트륨의 포화 수용액으로 세척시킨다. 황산 마그네슘 상에서 건조시키고 증발시킨다. 에틸 아세테이트/헥산으로부터 결정화시켜 Boc-(L)-Pal-NH20.98 g (75%)을 생성시킨다.
단계 B: (L)-β-(3-피리딜)-알라닌 아미드 염산염, H-(L)-Pal-NH2·2HCl
가볍게 가열하면서 15 mL의 염화 메틸렌 중에 0.98 g의 Boc-(L)-Pal-NH2를 현탁시키고 디옥산 중 4 M의 염산 용액 10 mL을 첨가한다. 30분 후에 염화 메틸렌 및 디옥산을 증발시킨다. 이 고체를 메탄올 중에 용해시키고 에테르를 첨가함으로써 침전시키며 여과시켜 H-(L)-Pal-NH2·2HCl 0.86 g (98%)을 생성시킨다.
단계 C: N-t-부틸옥시카르보닐-(L)-시클로헥실글리신-(L)-β-(3-피리딜)-알라닌 아미드 Boc-(L)-Chg-(L)-Pal-NH2
H-(L)-Pal-NH2·2HCl (432 mg, 1.82 mmol), Boc-(L)-Chg-OH (609 mg, 2.37 mmol, 1.3 당량), 디시클로헥실카르보디이미드 (494 mg, 2.4 mmol), 히드록시벤조트리아졸 (324 mg, 2.4 mmol) 및 디이소프로필에틸아민 (4 mmol)을 15 mL의 디메틸 포름아미드 중에서 밤새 교반시킨다. 디메틸 포름아미드를 증발시키고 에틸 아세테이트를 첨가하며 이 혼합물을 실온에서 1시간 동안 보관한다. 제조된 디이소프로필카르보디이미드시클로헥실우레아를 여과로 제거하고 중탄산 나트륨의 포화 용액으로 이 용액을 3회 추출하며 황산 마그네슘 상에서 건조시키고 증발시킨다. 헥산을 첨가함으로써 결정화시켜 598 mg의 Boc-(L)-Chg-(L)-Pal-NH2(81%)를 생성시킨다.
단계 D: (L)-시클로헥실글리신-(L)-β-(3-피리딜)-알라닌 아미드 염산염 H-(L)-Chg-(L)-Pal-NH2·2HCl
50 mL의 염화 메틸렌 중에 1.27 g의 Boc-(L)-Chg-(L)-Pal-NH2(3.12 mmol)을 현탁시키고 10 mL의 염산 (디옥산 중 4 M)을 첨가한다. 30분 후에 디옥산 및 염화 메틸렌을 증발시키고 메탄올 중에 이 고체를 용해시키며 200 mL의 에테르를 첨가함으로써 생성물을 침전시키고 여과시켜 1.12 g의 H-(L)-Chg-(L)-Pal-NH2·2HCl (95%)을 생성시킨다.
단계 E: N-아세틸-p-시아노페닐알라닌-(L)-시클로헥실글리신-(L)-β-(3-피리딜)-알라닌 아미드 Ac-(L)-Phe(4-CN)-(L)-Chg-(L)-Pal-NH2
30 mL의 디메틸 포름아미드 중 H-(L)-Chg-(L)-Pal-NH2·2HCl (1.13 g, 3 mmol), Ac-(L)Phe(4-CN)-OH (0.84 g, 3.6 mmol), 디이소프로필에틸아민 (10 mmol) 및 디페닐포스포릴 아지드 (803 μL, 3.6 mmol)을 밤새 교반시킨다. 디메틸 포름아미드를 증발시키고 에테르로 침전시키며 여과시키고 에테르로 세척시켜 1.282 g의 Ac-(L)-Phe(4-CN)-(L)-Chg-(L)-Pal-NH2(82%)를 생성시킨다.
단계 F: N-아세틸-(L)-p-티오아미드페닐알라닌-(L)-시클로헥실글리신-(L)-β-(3-피리딜)-알라닌 아미드 Ac-(L)-Phe(4-티오아미드)-(L)-Chg-(L)-Pal-NH2
Ac-(L)-Phe(4-CN)-(L)-Chg-(L)-Pal-NH2(1.18 g, 2.28 mmol)를 20 내지 40mL의 디메틸 술폭시드 중에 용해시키고 40 mL의 피리딘 및 14 mL의 트리에틸아민을 첨가한다. 실온에서 30분 동안 이 용액에 황화 수소를 통과시킨다. 실온에서 밤새 이 용액을 유지시키고 증발시켜 적은 부피로 만들며 디에틸 에테르로 생성물을 침전시킨다. 여러 시간 동안 냉장고에 두고 여과시키며 디에틸 에테르로 세척시키고 진공에서 건조시켜 황색 고체로서 Ac-(L)-Phe(4-티오아미드)-(L)-Chg-(L)-Pal-NH21.26 g을 생성시킨다.
단계 G: N-아세틸-p-메틸티오아미데이트페닐알라닌-시클로헥실글리신-(L)-β-(3-메틸피리디늄)-알라닌 요오드화 수소산 염 Ac-(L)-Phe(4-메틸 티오아미데이트)-(L)-Chg-(L)-Pal(Me)-NH2·2HI
10 내지 20 mL의 디메틸 술폭시드 및 80 mL의 아세톤 중에 1.2 g의 Ac-(L)-Phe(4-티오아미드)-(L)-Chg-(L)-Pal-NH2를 현탁시킨다. 50 당량의 요오드화 메틸 14 mL을 첨가시킨다. 반응물을 실온에서 밤새 유지시키고 아세톤 및 과량의 요오드화 메틸을 증발시킨다. 디에틸 에테르 (0.5 내지 1.1)로 침전시킨다. 4℃에서 여러 시간 동안 둔 후 디에틸 에테르를 기울여 따라 내거나 여과시키고 벽에 존재하는 반고체를 디에틸 에테르 및 에틸 아세테이트로 세척시킨다. 진공에서 생성물을 건조시켜 1.31 g의 Ac-(L)-Phe(4-메틸 티오아미데이트)-(L)-Chg-(L)-Pal(Me)-NH2·2HI를 생성시킨다.
단계 H: N-아세틸-(L)-p-아세트아미도페닐알라닌-시클로헥실글리신-(L)-β-(3-N-메틸피리디늄)-알라닌 아미드 트리플루오로아세트산염 Ac-(L)-pAphe-(L)-Chg-(L)-PalMe-NH2TFA
50 mL의 메탄올 및 0.5 mL의 아세트산 중에 1.31 g의 Ac-(L)-Phe(4-메틸 티오아미데이트)-(L)-Chg-(L)-Pal(Me)-NH2·2HI를 용해시킨다. 0.8 g의 아세트산 암모늄을 첨가한다. 이 혼합물을 55℃까지 3시간 동안 가열시키고 증발시키며 1:1의 아세토니트릴/물 (0.1%의 트리플루오로아세트산)에 용해시키며 여과 및 동결건조시켜 1.22 g의 Ac-(L)-pAphe-(L)-Chg-(L)-PalMe-NH2·TFA를 생성시킨다.
본 발명은 화합물 (II)인 Ac-(L)-pAph-Chg-PalMe(3)-NH2의 제조에 유용한 중간체 N-아세틸-L-페닐알라닌 화합물 (IA)의 제법에 관한 것이다. 상기 최종 화합물은 혈액 응고 단백질들의 억제에 유용하며, 더 특별하게는 본 명세서에 참조 문헌으로 인용되어 있는, 1995년 4월 25일에 출원된 미국 특허 출원 제08/428,404호에 더 상세히 기술되어 있는 혈액 응고 효소 인자 "Xa"의 억제에 유용하다.
본 명세서에서 사용되는 "인자 Xa 활성"이라는 용어는 그 단독으로 또는 프로트롬비나제 복합체로서 알려진 서브유니트들의 집합물의 형태로 프로트롬빈이 트롬빈으로 전환되는 것을 촉매하는 인자 Xa의 능력을 의미한다. "억제"라는 용어는 인자 Xa 활성에 관련하여 사용될 경우 인자 Xa 활성의 직접적 억제 및 간접적 억제 모두를 포함한다. 인자 Xa 활성의 직접적 억제는 예를 들어 본 발명의 펩티드가 인자 Xa에 또는 프로트롬비나제에 결합하여 프로트롬빈이 프로트롬비나제 복합체의 활성 위치에 결합하는 것을 방지함으로써 성취될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 "특이적"이라는 용어의 의도는 인자 Xa 활성의 억제에 관련하여 사용될 경우 본 발명의 화합물이 다른 특정 프로테아제의 활성은 실질적으로 억제시키지 않고 인자 Xa 활성을 억제시킴을 의미하려는 것이다 (동일 농도의 억제제를 사용할 경우). 상기와 같은 다른 특정 프로테아제로는 예를 들어 트롬빈, 플라스민, 트립신 및 엘라스타제와 같은 응고 캐스케이드에 관련된 프로테아제들이 있다.
몇몇 질환 증상에 있어서 순환계 내에서의 응혈의 형성이 그 자체 병적 상태의 원천이라 해도 응고 시스템을 완전히 억제하는 것은 바람직하지 못한데, 이는 생명을 위협하는 출혈이 일어날 수 있기 때문이다.
혈액 응고의 과정은 제한된 단백질 가수분해에 의해 혈장 지모겐 (zymogen)이 연속적으로 활성화되는, 반응이 진행될수록 효소 활성이 증폭되는 일련의 효소활성화 반응을 포함하는 복잡한 것이다. 기계작용적으로 혈액 응고 캐스케이드는 "내인성" 및 "외인성" 경로의 2가지 경로로 나뉘어진다. 상기 경로들은 인자 X의 활성화에서 수렴되며 그 후 단일한 "공통 경로"를 통하여 트롬빈이 생성된다.
상기 증거는 내인성 경로가 피브린 형성의 유지 및 성장에 중요한 역할을 하는 반면 외인성 경로가 혈액 응고의 초기 단계에서 중요함을 나타낸다. 이제 혈액 응고가 조직 인자/인자 VIIa 복합체의 형성에 의해 물리적으로 시작된다는 것이 일반적으로 받아들여지고 있다. 상기 복합체는 일단 형성되면 인자 IX 및 X를 활성화시킴으로써 재빨리 응고 작용을 시작한다. 이어서 새롭게 생성된 Xa는 인자 Va및 인지질과 1:1 복합체를 형성한다. 상기 이른바 프로트롬비나제 복합체는 용해성 피브리노겐을 불용해성 피브린으로 전환시키는 데 책임이 있다. 시간이 진행될수록 인자 Xa와 복합체를 이룰 경우 인자 VIIa/조직 인자 복합체 (외인성 경로)의 단백질 가수분해 활성을 직접적으로 억제할 수 있는 쿠니츠 형 (Kunitz-type) 프로테아제 억제제 단백질인 TFPI에 의해 인자 VIIa/조직 인자 복합체 (외인성 경로)의 활성이 억제된다. 억제된 외인성 시스템의 존재 하에 응고 과정을 유지시키기 위하여 내인성 경로의 트롬빈 매개 활성을 통하여 인자 Xa가 추가로 생성된다. 따라서 트롬빈은 그 자신의 생성 및 피브리노겐의 피브린으로의 전환을 매개하는 "자가 촉매적" 2중 역할을 수행한다.
트롬빈 생성의 자가 촉매적 성질은 조절되지 않는 출혈에 대하여 중요한 보호 수단이다. 상기 성질은 일단 정해진 역치 (threshold) 수준의 프로트롬비나제가 존재하면 혈액 응고가 진행되어 예를 들어 출혈의 결말이 초래됨으로써 혈액 응고가 완성되게 한다. 따라서 트롬빈을 직접적으로 억제하지 않고 응고 기작을 억제하는 약제의 개발이 가장 바람직하다.
본 발명의 방법에 따라 합성된 펩티드 유사체 화합물인 Ac-pAph-Chg-PalMe(3)-NH2는 인자 Xa 활성에 대한 유용한 억제제이며 혈액 응고와 관련된 다른 프로테아제들의 활성은 실질적으로 억제하지 않는다.
본 발명은 라세미 화합물인 N-아세틸-(D,L)-4-시아노페닐알라닌 에틸 에스테르의 분할에 의한 N-아세틸-(L)-4-시아노페닐알라닌의 신규 제조 방법과, 중간체인 N-아세틸-(L)-4-시아노페닐알라닌을 사용하는 Ac-(L)-pAph-Chg-PalMe(3)-NH2의 입체 이성질체의 신규 제조 방법에 관한 것이다.

Claims (14)

  1. a) 회수하기를 원하는 양의 2배 이상의 하기 화학식 I의 화합물, 반응 매질에서 서브틸리신 (Subtilisin)을 용해시킬 수 있는 양의 수용액, 반응 매질에서 화학식 I의 화합물을 용해시킬 수 있는 양의 아세토니트릴과, 화학식 I의 화합물과 반응하는 양의 서브틸리신을 배합시켜 반응 매질을 제조하는 단계와,
    b) 서브틸리신을 첨가할 때 반응 매질을 상기 효소가 반응할 수 있는 pH로 조정하고 반응이 일어나 하기 화학식 IA의 화합물이 생성되는 동안 상기 pH를 유지시키는 단계
    를 포함하는, 하기 화학식 IA의 화합물인 N-아세틸-(L)-4-시아노페닐알라닌의 제조 방법.
    〈화학식 I〉
    〈화학식 IA〉
  2. a) 회수하기를 원하는 양의 2배 이상의 하기 화학식 I의 화합물, 반응 매질에서 서브틸리신을 용해시킬 수 있는 양의 수용액, 반응 매질에서 화학식 I의 화합물을 용해시킬 수 있는 양의 아세토니트릴과, 화학식 I의 화합물과 반응하는 양의 서브틸리신을 배합시켜 반응 매질을 제조하는 단계,
    b) 서브틸리신을 첨가할 때 반응 매질을 상기 효소가 반응할 수 있는 pH로 조정하고 반응이 일어나 하기 화학식 IA의 화합물이 생성되는 동안 상기 pH를 유지시키는 단계,
    c) 하기 화학식 IA의 화합물과 하기 화학식 3의 화합물을 커플링시켜 하기 화학식 4의 화합물을 생성시키는 단계,
    d) 화학식 4의 화합물의 시아노기를 아미디노기로 전환시키고 피리딜기의 질소를 메틸화시킴으로써 화학식 II의 화합물을 생성시키는 단계
    를 포함하는, 하기 화학식 II의 화합물인 Ac-(L)-pAph-Chg-PalMe(3)-NH2또는 제약적으로 허용가능한 그의 염의 제조 방법.
    〈화학식 I〉
    〈화학식 IA〉
    〈화학식 II〉
    〈화학식 3〉
    〈화학식 4〉
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 아세토니트릴의 양이 수용액의 약 5 내지 95 부피%인 방법.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 수용액이 서브틸리신을 안정화시킬 수 있는 양의 무기염을 함유하는 것인 방법.
  5. 제4항에 있어서, 무기염의 양이 1 M 무기염 용액의 수용액의 약 10 내지 약 15 부피%인 방법.
  6. 제5항에 있어서, 무기염이 염화 칼륨인 방법.
  7. 제1항 또는 제2항에 있어서, 염기를 첨가하여 반응 매질을 서브틸리신 효소가 반응할 수 있는 pH로 조정 및 유지시키는 방법.
  8. 제7항에 있어서, 염기가 수산화 나트륨인 방법.
  9. 제1항 또는 제2항에 있어서, 완충제를 첨가함으로써 반응 매질을 서브틸리신 효소가 반응할 수 있는 pH로 조정 및 유지시키는 방법.
  10. 제9항에 있어서, 완충제가 인산염 용액인 방법.
  11. 제1항 또는 제2항에 있어서, 반응 매질의 pH를 약 5 내지 약 9로 조정 및 유지시키는 방법.
  12. 제1항 또는 제2항에 있어서, 화학식 I의 화합물과 반응할 수 있는 양의 서브틸리신과 화학식 I의 화합물 사이에 반응이 일어나는 동안 반응 매질을 약 15분 내지 약 4시간 동안 교반시키는 것을 더 포함하는 방법.
  13. 제1항 또는 제2항에 있어서, 서브틸리신의 양이 화학식 I의 화합물 양의 중량 기준으로 약 0.5 내지 약 10 밀리당량인 방법.
  14. 제1항 또는 제2항에 있어서, 반응 매질로부터 화학식 IA의 화합물을 수집하는 단계를 더 포함하는 방법.
KR10-1998-0704683A 1995-12-20 1996-11-25 N-아세틸(L)-4-시아노페닐알라닌Ac-(L)-Phe(4-CN)-OH및N-아세틸-(L)-p-아미디노페닐알라닌-시클로헥실글리신-β-(3-N-메틸피리디늄)-알라닌Ac-(L)-pAph-Chg-PalMe(3)-NH2의신규제조방법 KR100438879B1 (ko)

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US57556995A 1995-12-20 1995-12-20
US8/575569 1995-12-20
US08/575569 1995-12-20

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