CZ295362B6 - Způsob přípravy N-acetyl-(L)-4-kyanofenylalaninu Ac-(L)-Phe(4-CN)-OH a N-acetyl-(L)-p-amidinofenylalanincyklohexylglycin-beta-(3-N-methylpyridinium)-alaninu Ac-(L)-pAph-Chg-PalMe(3)-NH2 - Google Patents

Způsob přípravy N-acetyl-(L)-4-kyanofenylalaninu Ac-(L)-Phe(4-CN)-OH a N-acetyl-(L)-p-amidinofenylalanincyklohexylglycin-beta-(3-N-methylpyridinium)-alaninu Ac-(L)-pAph-Chg-PalMe(3)-NH2 Download PDF

Info

Publication number
CZ295362B6
CZ295362B6 CZ19981956A CZ195698A CZ295362B6 CZ 295362 B6 CZ295362 B6 CZ 295362B6 CZ 19981956 A CZ19981956 A CZ 19981956A CZ 195698 A CZ195698 A CZ 195698A CZ 295362 B6 CZ295362 B6 CZ 295362B6
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
compound
formula
reaction medium
sufficient
sufficient amount
Prior art date
Application number
CZ19981956A
Other languages
English (en)
Other versions
CZ195698A3 (cs
Inventor
Chi-Hsin Richard King
Original Assignee
Aventis Pharmaceuticals Inc.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Aventis Pharmaceuticals Inc. filed Critical Aventis Pharmaceuticals Inc.
Publication of CZ195698A3 publication Critical patent/CZ195698A3/cs
Publication of CZ295362B6 publication Critical patent/CZ295362B6/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P41/00—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture
    • C12P41/003—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture by ester formation, lactone formation or the inverse reactions
    • C12P41/005—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture by ester formation, lactone formation or the inverse reactions by esterification of carboxylic acid groups in the enantiomers or the inverse reaction
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/06—Dipeptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/08—Tripeptides
    • C07K5/0815—Tripeptides with the first amino acid being basic
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/02—Amides, e.g. chloramphenicol or polyamides; Imides or polyimides; Urethanes, i.e. compounds comprising N-C=O structural element or polyurethanes

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Pyridine Compounds (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Low-Molecular Organic Synthesis Reactions Using Catalysts (AREA)
  • Cosmetics (AREA)

Abstract

Popisuje se způsob přípravy N-acetyl-(L)-4-kyanofenylalaninu, Ac-(L)-Phe(4-CN)-OH, sloučeniny vzorce IA, štěpením racemické sloučeniny, ethylesteru N-acetyl-(D,L)-4-kyanofenylalaninu, a rovněž způsob přípravy stereoizomeru Ac-(L)-pAph-Chg-Pa1Me(3)-NH.sub.2.n., sloučeniny vzorce II, za použití uvedeného meziproduktu, N-acetyl-(L)-4-kyanofenylalaninu. Způsob se provádí v reakčním médiu, které obsahuje acetonitril a subtilisin.ŕ

Description

Způsob přípravy N-acetyl-(L)-4-kyanofenylalaninu Ac-(L)-Phe(4~CN)-OH a N-acetyl(L)-p-amidinofenyIalanincyklohexylgIycin-|3-(3-N--methylpyridinium)-aIaninu Ac-(L)~ pAph-Chg-PalMe(3)-NH2
Oblast techniky
Vynález se týká nového postupu přípravy N-acetyl-(L)-4-kyanofenylalaninu rozštěpením racemické sloučeniny ethylesteru N-acetyl-(D,L)-4-kyanofenylalaninu, a rovněž nového postupu přípravy stereoizomerů Ac-(L)-pAph-Chg-PalMe(3)-NH2 za použití tohoto meziproduktu N-acetyl-(L)-4-kyanofenylalaninu.
Dosavadní stav techniky
Tyto racemické sloučeniny, to znamená N-acetyl-(D,L)-4-kyanofenylalanin a Ac-(L)-pAphChg-PalMe(3)-NH2 jsou uváděny a popisovány v patentové přihlášce Spojených států amerických US 08 428 404, podané 24. dubna 1995, která je pokračovací patentovou přihláškou Spojených států amerických US 08 233 054, podané 26. dubna 1994, přičemž tyto patentové přihlášky zde slouží jako odkazové materiály. Uvedený konečný produkt, to znamená Ac-(L)pAph-Chg-PalMe(3)-NH2 je vhodně použitelný jako inhibitor Faktoru Xa.
Všeobecně je žádoucí vyvíjet léčiva ve formě stereoizomerů než jako racemáty, neboť stereoizomery mají oproti racemátům určité výhody, jako je například vynikající účinnost, menší vedlejší účinky, snížená úroveň toxicity nebo dokonce vůbec žádná toxicita, atd. Někdy tyto výhody stereoizomerů oproti racemátům nejsou známé až do doby, než se vyvine léčivo, nebo v některých případech dokonce kdy je toto léčivo uváděno na trh. V mnoha oficiálních státních institucích, které se zabývají povolováním léčiv pro uvedení na trh, se dává přednost potvrzování dokladů týkajících se stereoizomerů jako léčiva než racemátu. Z toho důvodu je vhodné a žádoucí mít k dispozici postup přípravy stereoizomerů sloučeniny Ac-(L)-pAph-ChgPalMe(3)-NH2. Klíčovým meziproduktem pro přípravu tohoto stereoizomerů je stereoizomer Nacetyl-(L)-4-kyanofenylalanin.
Ktomu, aby se dosáhlo rozštěpení racemátu, je nutno vybrat některý z celé řady různých technických prostředků, které jsou známé z dosavadního stavu techniky. Jako příklad některých z těchto známých metod je možno uvést přípravu diastereoizomerů, po které následuje krystalizace nebo diferenciální absorpce (chromatografie) [viz například publikace Enantiomers, Racemates and Resolutions, J. Jacques, A. Collet a S.H. Wiley, Wiley (1981)], dále chromatografické dělení na chirální stacionární fázi, kinetické štěpení a enzymatické štěpení.
V případě enzymatického štěpení, zejména pokud se týče hydroláz nebo esteráz, bylo prokázáno, což je například popisováno v publikaci Chemistry and Biochemistry of the amino acids, Chapman and Halí, New York, 1984, Chap. 10, str. 338-353; dále v publikaci Applications of Biochemical Systems in Organic Chemistry, Part I. J. B. Jones, C. J. Sih a D. Perlman, Wiley, New York, 1976, Chap. 4. str. 104-401; a dále v publikaci Chemistry of the Amino Acids, Vol. 1, Wiley New York, 1961, Chap 9, str. 728-750.
V dalším stadiu experimentálního výzkumu, i když se našel vhodný postup, musí odborník pracující v daném oboru provést mnoho experimentálních pokusů za účelem nalezení správného a vhodného rozpouštědla, ko-rozpouštědla (jestliže je zapotřebí), teploty, doby a dalších podmínek za účelem dosažení efektivního a účelného rozštěpení racemátu, pomocí kterých se dosáhne snadného získání požadované sloučeniny, vysokého výtěžku, vysokého přebytku enantiomeru a dále takového způsobu provedení daného procesu, který by nebyl při provádění příliš složitý a komplikovaný. Podle předmětného vynálezu bylo nalezeno řešení těchto problémů souvisejících se štěpením N-acetyl-(D,L)-4-kyanofenylalaninu, jehož L-izomer se potom
-1 CZ 295362 B6 použije jako meziprodukt k přípravě Ac-(L)-pAph-Chg-PalMe(3)-NH2, to znamená sloučeniny obecného vzorce II.
Podstata vynálezu
Vynález se týká způsobu přípravy N-acetyl-(L)-4-kyanofenylalaninu, sloučeniny vzorce IA:
sloučenina(IA) zahrnující následující stupně:
(a) kombinování dostatečného množství sloučeniny I:
sloučenina (I) dostatečného množství vodného roztoku, dostatečného množství acetonitrilu a dostatečného množství Subtilisinu ke zreagování podstatného množství sloučeniny vzorce I za vzniku reakčního média, a (b) úpravu reakčního média na vhodnou hodnotu pH při přidání Subtilisinu a udržování vhodné hodnoty pH při probíhající reakci k získání sloučeniny vzorce IA.
Vynález se rovněž týká postupu přípravy sloučeniny Ac-(L)-pAph-Chg-PalMe(3)-NH2, sloučeniny vzorce II:
sloučenina (II) nebo farmaceuticky přijatelných solí odvozených od této sloučeniny, který zahrnuje následující stupně:
(a) kombinování dostatečného množství sloučeniny vzorce I:
sloučenina (I) dostatečného množství vodného roztoku, dostatečného množství acetonitrilu a dostatečného množství Subtilisinu ke zreagování s podstatným množstvím sloučeniny vzorce I za vzniku reakčního média, a (b) úpravu reakčního média na vhodnou hodnotu pH při přidání Subtilisinu a udržování vhodné hodnoty pH při probíhající reakci k získání sloučeniny vzorce IA:
sloučenina (IA) (c) adování sloučeniny vzorce IA na sloučeninu vzorce 3:
sloučenina (3) za vzniku sloučeniny vzorce 4:
sloučenina (4)
-3CZ 295362 B6 (d) převedení kyanoskupiny ve sloučenině vzorce 4 na amidinovou skupinu a methylace dusíku pyridylové skupiny za vzniku sloučeniny vzorce II.
V popisu předmětného vynálezu mají zde použité termíny následující význam:
(a) Symbolem „Ac“ nebo termínem „acetyl“ se míní funkční skupina vzorce:
O
CH3—c-- (b) Termínem „amidinová“ skupina se míní funkční skupina vzorce:
(c) Termínem „pyridylová“ skupina se míní funkční skupina vzorce:
Termín „stereoizomery“ se používá jako všeobecný termín pro všechny izomery, které se odlišují pouze orientací svých atomů na určitém místě. Do rozsahu tohoto termínu náleží izomery sloučenin s více než jedním chirálním centrem, které nepředstavují svoje zrcadlové obrazy (diastereomery neboli diastereoizomery). Termínem „enantiomer“ se míní dva stereoizomery, které nepředstavují vzájemně se překrývající zrcadlové obrazy. Termínem „chirální střed“ se zde míní uhlíkový atom, ke kterému jsou připojeny čtyři různé skupiny. Nomenklatura L/D nebo R/S, použitá v popisu předmětného vynálezu, je popisována v publikaci IUPAC-IUB Joint Commision on Biochemical Nomenclature, Eur. J. Biochem. 138, 9-37 (1984). Chirální látka může buďto obsahovat ekvivalentní množství R a S izomeru (nebo L a D izomeru), přičemž v tomto případě se označuje „racemická“ nebo „racemát“ nebo nemusí obsahovat ekvivalentní množství R a S izomeru (nebo L a D izomeru), přičemž v tomto případě se nazývá „opticky aktivní“ nebo „neracemická“.
Termín „štěpení“ se míní rozdělování racemické směsi na opticky aktivní složky.
Termínem „enantiomemí přebytek“ nebo „ee“ se míní procentuální podíl, kterým jeden enantiomer, El, převyšuje ve směsi množství obou těchto enantiomerů, El plus E2, to znamená:
(El - E2)
------------ x 100 % = ee (El + E2)
Termínem (+)- se míní plus enantiomer, termínem (-)- se míní mínus enantiomer.
-4CZ 295362 B6
Označením „ “ se míní vazba, která vystupuje z roviny, kterou tvoří list papíru, směrem ven nahoru.
Označením „ IIU·’1 11 “ se míní vazba, která vystupuje z roviny, kterou tvoří list papíru, směrem zpět dolů.
Termínem „farmaceuticky přijatelné soli“, se míní adiční soli s kyselinami, které jsou získány reakcí s těmito kyselinami, například s kyselinou chlorovodíkovou, s kyselinou bromovodíkovou, s kyselinou sírovou, s kyselinou dusičnou nebo s kyselinou fosforečnou, a s organickými karboxylovými kyselinami, jako je například kyselina octová, kyselina trifluoroctová, kyselina propionová, kyselina glykolová, kyselina maleinová, kyselina vinná, kyselina citrónová, kyselina salicylová, kyselina 2-acetyloxybenzoová, nebo s organickými sulfonovými kyselinami, jako je například kyselina methansulfonová, kyselina 4-toluensulfonová a kyselina naftalensulfonová. Předpokládá se jako samozřejmé, že je možno použít rovněž i jiných dalších běžně známých kyselin v tomto oboru přípravy farmaceutických prostředků, které se obvykle používají k danému účelu.
Termínem „aminokyselina“, který je použit v popisu předmětného vynálezu, se míní v přírodě se vyskytující aminokyseliny, které pocházejí z genetického kódu a obsahují jako stavební bloky proteiny. Tento termín „aminokyselina“ rovněž zahrnuje, pokud nebude výslovně uvedeno jinak, jak (L)-aminokyseliny tak (D)-aminokyseliny, chemicky modifikované aminokyseliny, jako jsou například analogy aminokyselin, v přírodě se vyskytující aminokyseliny, které nejsou obvykle inkorporovány do proteinů. Zkratky používané pro tyto aminokyseliny, aminokyselinové analogy, vyskytující se v rozsahu popisu předmětného vynálezu, jsou uvedeny v následující tabulce č. 1
Tabulka 1
Aminokyselina Symbol
alanin Ala
fenylalanin Phe
p-kyanofenylalanin Phe(4-CN)
p-amidinofenylalanin pAphe
cyklohexylglycin Chg
P-(3-pyridyl)-alanin Pal
3-(3-N-methylpyridinium)-alanin PalMe(3)
Schéma 1
Štěpení sloučeniny I.
Schéma 1: Štěpení ethylesteru N-acetyl-(D,L)-4-kyanofenylalaninu.
-5CZ 295362 B6
Stupeň A
COOH
COOEt
sloučenina I
Racemát ethylesteru (sloučenina I) se podle tohoto postupu rozštěpí na L-stereoizomer kyseliny, to znamená N-acetyl-4-kyanofenylalanin (sloučenina IA), přičemž ovšem D-stereoizomer tohoto esteru (sloučenina D-I) v podstatě není převeden na tuto kyselinu. Tímto způsobem může být provedeno oddělení požadované kyseliny od nežádoucího esteru. Jak ještě bude detailně popsáno v dalším textu, kyselina získaná tímto způsobem představuje hlavně L-izomer, což je znázorněno ve výše uvedeném schématu, a tato skutečnost je deklarována vysokým „ee“ faktorem této sloučeniny.
Při provádění postupu podle předmětného vynálezu je uvedeným dostatečným množstvím sloučeniny I, které je kombinováno k získání reakčního média, přinejmenším dvakrát tak veliké množství, než je požadováno k získání L-stereoizomeru tímto postupem podle vynálezu. Reakční médium obsahuje dostatečné množství acetonitrilu a dostatečné množství vodného roztoku. Tato dostatečná množství jsou požadována z toho důvodu, aby bylo umožněno vzájemné zreagování jednotlivých přísad (přidaných složek) způsobem podle předmětného vynálezu. V textu předmětného vynálezu je použito termínu „přísada“ (neboli přidaná složka), přičemž tímto termínem se míní veškeré látky dodávané do reakčního média.
Termínem „dostatečné množství“ acetonitrilu se míní množství, které rozpustí podstatný podíl sloučeniny I v reakčním médiu. Ve výhodném provedení je tato sloučenina vzorce I solubilizována do acetonitrilu, přičemž se pomalu přidává vodný roztok až do okamžiku, kdy se tento vodný roztok začíná zakalovat. Zakalený roztok naznačuje, že se část sloučeniny vzorce I začíná srážet, to znamená, že může nastat potřeba přidání dalšího podílu acetonitrilu k rozpuštění této sraženiny. Například je možno uvést, že toto dostatečné množství acetonitrilu představují podíl v rozmezí od asi 5 do asi 95 % objemových reakčního média a podle ještě výhodnějšího provedení podíl v rozmezí od asi 50 do asi 60 % objemových tohoto reakčního média. Rovněž je výhodné, jestliže sloučenina vzorce I se použije v koncentraci pohybující se v rozmezí od asi 20 gramů do asi 140 gramů na litr reakčního média a podle ještě výhodnějšího provedení v koncentraci pohybující se v rozmezí od asi 35 gramů do asi 65 gramů na litr tohoto reakčního média.
Uvedeným „dostatečným množstvím“ vodného roztoku je takové množství, které je potřebné k rozpuštění podstatného podílu enzymu Subtilisinu v reakčním médiu. V textu předmětného vynálezu je použit termín „vodný roztok“, přičemž tímto termínem se míní roztok obsahující vodu a podle ještě výhodnějšího provedení se tím míní roztok obsahující vodu a další přísady (přidané složky), které napomáhá zvýšení výtěžku „ee“ faktoru. Termín „roztok“ nemusí nezbytně znamenat to, že se veškeré přidávané složky (přísady) rozpustí. Tento termín rovněž může znamenat, že tyto přidávané složky jsou dispergovány, takže v tomto případě vznikne suspenze.
-6CZ 295362 B6
Například je možno uvést, že tento vodný roztok může dále obsahovat jako přísadu dostatečné množství anorganické soli, jako je například chlorid draselný, chlorid sodný, chlorid lithný, atd. Ve výhodném provedení podle vynálezu je touto anorganickou solí chlorid draselný. Předpokládá se, že tato anorganická sůl působí tak, že stabilizuje uvedený Subtilisin. Uvedeným termínem „dostatečné množství“ anorganické soli se míní takové množství, které je dostatečné ke stabilizování Subtilisinu. Tímto množstvím je asi 0,02 mol až asi 0,20 mol na litr vodného roztoku, podle výhodnějšího provedení je toto množství asi 0,05 mol až asi 0,15 mol na litr vodného roztoku. Například se použije řešení, podle kterého se zkombinuje 1M roztok chloridu draselného v množství představujícím asi 10 až asi 15 procent objemových reakčního média.
Se sloučeninou vzorce I, acetonitrilem a vodným roztokem se kombinuje dostatečné množství Subtilisinu. Tímto termínem „dostatečné množství“ Subtilisinu se míní množství, které je schopné reagovat s podstatným podílem (pokud možno s prakticky s veškerým množstvím) sloučeniny vzorce I. Tímto dostatečným množstvím je asi 0,5 až asi 10 hmotnostních miliekvivalentů podílu sloučeniny vzorce I.
Hodnota pH tohoto reakčního média se měří po přídavku uvedeného enzymu, přičemž v případě potřeby se tato hodnota upraví na vhodnou hodnotu pH. Touto vhodnou hodnotou pH se míní taková hodnota pH, při které je tento enzym schopen reagovat. Ve výhodném provedení je touto vhodnou hodnotou pH hodnota pohybující se v rozmezí od asi 5 do asi 9, podle ještě výhodnějšího provedení v rozmezí od asi 6,5 do asi 7,5. Tato vhodná hodnota pH se udržuje po dobu, kdy probíhá reakce mezi sloučeninou vzorce I a Subtilisinem. To znamená, že tato doba je v rozmezí od asi 15 minut do asi 4 hodin, ve výhodném provedení se tato reakce provádí za míchání nebo za současného aplikování jiné vhodné metody, která napomáhá k provedení reakce. K udržování uvedené vhodné hodnoty pH je možno použít jakékoliv libovolné metody nebo prostředku, jako je například přidávání dostatečného množství bazické látky, jako je například hydroxid sodný, hydroxid draselný, hydroxid lithný, hydroxid amonný, uhličitan sodný, uhličitan draselný, výhodně ve formě 1M roztoku, neboje možno použít přidávání roztoku pufru, jako je například acetát amonný, hydrogenuhličitan amonný, hydrogenuhličitan sodný nebo fosfátový pufr, jako je například hydrogenfosforečnan amonný, hydrogenfosforečnan sodný. K monitorování hodnoty pH reakčního média je možno použít pH-metr.
Sloučeninu vzorce IA je možno oddělit běžně známými metodami z dosavadního stavu techniky, jako je například metoda, při které se roztok zředí přídavkem bazického roztoku anorganické soli, jako je například hydrogenuhličitan sodný. Tato anorganická fáze se potom promyje organickými rozpouštědly, jako jsou například ethery, chlorovaná rozpouštědla, jako je například methylenchlorid, chloroform, toluen, heptan nebo ethylacetát. Tento vodný roztok se potom okyselí za použití koncentrované kyseliny, jako je například kyselina chlorovodíková, na pH v rozmezí od asi 1 do asi 3, načež potom následuje extrakce organickým rozpouštědlem, čímž se získá sloučenina vzorce IA.
V následujících tabulkách 2 a 3 je uvedeno porovnání reakcí prováděných za použití vodného roztoku a acetonitrilu (tabulka 2) a za použití vodného roztoku a dimethylsulfoxidu místo acetonitrilu (tabulka 3).
Ve sloupci A je uvedeno množství sloučeniny vzorce I v gramech použité při tomto postupu.
Ve sloupci B je uvedeno množství (v mililitrech, ml) dimethylsulfoxidu (DMSO) nebo acetonitrilu (CH3CN), vody a 1M roztoku chloridu draselného použitého k přípravě tohoto vodného roztoku.
Ve sloupci C je uvedeno použité množství Subtilisinu v miligramech (mg) a odpovídající hmotnostní miliekvivalent (meq) sloučeniny vzorce I.
Ve sloupci D je uveden čas provádění daného experimentu.
-7 CZ 295362 B6
Ve sloupci E je uveden enantiomemí přebytek získané sloučeniny vzorce IA.
Ve sloupci F je uveden výtěžek takto získané sloučeniny vzorce IA.
Tabulka 2
Termín „vstup 1“ znamená, že reakce byla prováděna v přítomnosti anorganické soli (chlorid draselný). Termín „vstup 2“ znamená, že reakce byla prováděna bez použití anorganické soli.
Sloupec
A B C D E F
Vstup (I)(D:L 40:60) (g) CH3CN/H2O/ 1 M KC1 (ml) Subtilisin (mg) (meq) Doba (minuty) (IA) %ee (IA) % výtěžek
1 67 1000/600/214 100 (3,7) 180 99,4 88 (pevná látka)3
2 1 15/9,5/0 1,6(3,2) 120 98 90(pevná látka)3
Tabulka 3
Reakce, při kterých byl použit dimethylsulfoxid, byly prováděny za různých podmínek, které se lišily v použití různé doby, podílu Subtilisinu a množství sloučeniny vzorce I.
Sloupec
A B C D E F
Vstup (I)(D:L 40:60) (g) CH3CN/H2O/ 1 M KC1 (ml) Subtilisin (mg) (meq) Doba (minuty) (IA) %ee (IA) % výtěžek
1 2,0 32/18/6,4 1,5(1,5) 30 95,4 70 (olej v DMSO)1
2 7,8 125/100/25 12 (3,0) 30 94 88 (olej v DMSO)1
3 25 400/200/81 19(1,5) 40 88 70 (olej v DMSO)1
4 100 1600/900/320 75 (1,5) 60 88 90 (olej v DMSO)1
5 2,8 10/8/2 4,4(3,0) 65 86 50(pevná látka)2
6 2,0 42/26/6,4 1,5(1,5) 120 80 70 (olej v DMSO)1
Poznámky:
1 DMSO je přítomen ve sloučenině vzorce IA, velmi obtížně odstranitelný 2 odstranění DMSO odpařováním při teplotě 90 °C a tlaku 1064 Pa, rozpuštění v ethylacetátu a promytí vodou (celkem třikrát) 3 sloučenina vzorce IA se snadno oddělí jako pevná látka.
Pomocí těchto testovacích pokusů bylo prokázáno efektivní a účinné rozštěpení výchozí látky se současným snadným oddělením sloučeniny vzorce IA za současného vysokého výtěžku a vysokého enantiomerního přebytku, jestliže se použije acetonitril při provádění tohoto postupu.
-8CZ 295362 B6
Schéma 2
Toto schéma 2 je pokračováním schématu 1, přičemž podle tohoto schématu se navrhuje postup přípravy sloučeniny Ac-(L)-pAph-Chg-PalMe(3)-NH2, sloučeniny vzorce II.
Podle tohoto reakčního schématu 2 se ve stupni A sloučenina vzorce 3 aduje na sloučeninu vzorce IA, přičemž se získá sloučenina vzorce 4. Tato sloučenina vzorce 3 může být adována za použití azidové metody, jako je například metoda, při které se sloučenina vzorce IA rozpustí ve vhodném bezvodém organickém rozpouštědle, jako je například bezvodý dimethylformamid nebo bezvodý methylenchlorid, a za použití inertní atmosféry, jako je například dusík. Do tohoto roztoku se potom přidá difenylfosforylazid, 1 až 4 ekvivalenty vhodné bazické látky, jako je například diizopropylethylamin a přinejmenším jeden ekvivalent chráněné aminokyseliny, sloučenina vzorce 3, rozpuštěná ve vhodném bezvodém organickém rozpouštědle, jako je například bezvodý dimethylformamid nebo bezvodý methylenchlorid. Tato reakční směs se potom ponechá za současného promíchávání po dobu asi 1 až 15 hodin. Takto získaný adiční produkt, sloučenina vzorce 4, se potom oddělí a vyčistí za použití běžně známých a používaných metod podle dosavadního stavu techniky, jako jsou například extrakční metody, srážení, kiystalizace a mžiková chromatografíe. Například je možno použít postupu, při kterém se odpaří rozpouštědlo, adiční produkt 4 se vysráží ethyletherem, promyje se a oddělí se filtrací.
Při provádění postupu podle tohoto reakčního schématu 2 se při provádění stupňů B a D kyanoskupina sloučeniny vzorce 4 převede na amidinovou skupinu sloučeniny vzorce II. Tato konverze se provádí aminolýzou odpovídajícího methylenthioimidátu, sloučeniny vzorce 5, která vznikne reakcí kyanoskupiny sloučeniny vzorce 4 se sirovodíkem, přičemž potom následuje postup podle patentu NDR 155 954 (publikovaný 21. 1982, autoři Wagner a kol.; opětně podrobený průzkumu 9. listopadu 1988), který je zde uváděn jako odkazový materiál.
Tento postup je možno například podle tohoto schématu 2, stupeň B provést tak, že se sloučenina vzorce 4 rozpustí v organickém rozpouštědle, jako je například dimethylsulfoxid. Potom se přidá organická bazická sloučenina, jako je například pyridin, triethylamin, diizopropylethylemin, 2,6lutidin, kolidin. Do tohoto roztoku se potom zavede proud sirovodíku, což se provádí při teplotě místnosti tak dlouho, dokud se nespotřebuje sloučenina vzorce 4. Tato reakční směs může být udržována při teplotě místnosti po dobu dalších 1 až 18 hodin. Takto získaná sloučenina vzorce 5 se potom oddělí běžně známými metodami podle dosavadního stavu techniky, jako je například vysrážení a filtrace. Takto získaná sraženina se potom promyje organickým rozpouštědlem, jako je například diethylether, a potom se usuší za použití vakua.
Schéma 2
Postup syntézy Ac-(L)-pAph-Chg-PalMe(3)-NH2 stupeň A:
-9CZ 295362 B6
sloučenina (IA) sloučenina (3)
Sloučenina (4) stupeň B:
příprava thioacetamidu — ....................— —>
sloučenina (5) stupeň C:
methylace
sloučenina (6)
-10CZ 295362 B6 stupeň D:
tvorba amidinové skupiny >
CH3%1
H
sloučenina (II)
Při provádění postupu podle tohoto schématu 2, stupeň C, se pyridylová skupina sloučenina 5 methyluje za vzniku sloučeniny vzorce 6. Podle nej obvyklejšího provedení se k provedení této methylace použijí methylhalogenidy, jako je například methyljodid, methylbromid nebo methylchlorid. Rovněž je možno použít methylfluorsulfonát, dimethylsulfát, methylester kyseliny toluen-p-sulfonové a další methylační činidla, která jsou uváděna například v publikaci Zoltevdcz and Deady, Adv. Heterocycl. Chem. 22, 71-121 (1978), a v publikaci Duffin, Adv. Heterocycl. Chem. 3, 1-56 (1964), které zde slouží jako odkazové materiály. Ve výhodném provedení se požije přebytek methylhalogenidu a podle ještě výhodnějšího provedení se použije přebytku methyljodidu. Tato reakce se provádí v rozpouštědle, jako jsou například alkoholy, jako například methanol a ethanol, aceton, chloroform, acetonitril, nitrobenzen a dimethylformamid. Ve výhodném provedení se tato reakce provádí ve směsi acetonu a dimethylsulfoxidu a za současného míchání při teplotě místnosti po dobu jedné až 24 hodin. Takto získaná sloučenina vzorce 6 se potom oddělí běžně známými metodami z dosavadního stavu techniky v tomto oboru, jako například v případě použití přebytku methyljodidu se tato látka odpaří a sloučenina vzorce 6 se vysráží ethyletherem, oddělí se dekantací, promyje se a usuší.
Při provádění stupně D podle tohoto reakčního schématu 2 se methylthioimidátový derivát sloučeniny vzorce 6 dále převede na sloučeninu vzorce II s odpovídající amidinovou skupinou. Ve výhodném provedení se sloučenina vzorce 6 rozpustí v organickém rozpouštědle, jako je například methanol, přičemž podle ještě výhodnějšího provedení se tento postup provede v přítomnosti kyseliny octové. Do tohoto roztoku se potom přidá acetát amonný. Ve výhodném provedení se tato reakční směs zahřívá na teplotu v rozmezí od 40 do 65 °C, podle ještě výhodnějšího provedení na teplotu v rozmezí od 50 do 60 °C, a při této teplotě se potom udržuje po dobu v rozmezí od 2 do 3 hodin. Takto získaná sloučenina vzorce II se potom oddělí běžnými metodami všeobecně známými z dosavadního stavu techniky v tomto oboru, přičemž může být izolována ve formě svojí farmaceuticky přijatelné soli. Například je možno uvést postup, při kterém se odpaří použitá rozpouštědla, zbytek se rozpustí v acetonitrilu a přídavkem kyseliny trifluoroctové se připraví sraženina, která se potom odfiltruje a vysuší ve vakuu.
Příklady provedení vynálezu
V následujících příkladech je ilustrován postup podle předmětného vynálezu, přičemž jsou zde blíže objasněny typické syntetické postupy popsané výše v uvedených schématech 1 a 2. Tyto
-11 CZ 295362 B6 příklady jsou ovšem pouze ilustrativní a v žádném směru nijak neomezují rozsah tohoto vynálezu.
Pro odborníky pracující v daném oboru je evidentní zjevná výhoda postupů podle těchto reakčních schématů spočívající vtom, že pořadí provádění jednotlivých stupňů je pouze případné.
Použité výchozí látky jsou běžně dostupné na trhu nebo je možno tyto látky snadno připravit pomocí běžně známých metod v tomto oboru.
V dále uváděných příkladech jsou použity některé symboly, které mají následující význam: „g“ znamená gramy, „mol“ znamená mol, „mmol“ znamená milimol, „1“ znamená litry, „ml“ znamená mililitry, ,,μΐ“ znamená mikrolitry, „mp“ znamená teplotu tavení, „°C“ znamená stupně Celsia, „TLC“ znamená chromatografíí v tenké vrstvě, „M“ znamená molaritu a „Rf ‘ znamená retenční faktor.
Příklad 1 (D,L)-N-acetyl-4-kyanofenylalanin Ac-(D,L)-Phe(4-CN)-OH.
Stupeň A: Diethylester kyseliny 4-kyanobenzylacetamidomalonové
COOEt r-NHAc OOEt
Podle tohoto postupu byl suspendován diethylacetamidomalonát (použito 44 gramů, což je 0,203 mol), alfa-brom-p-toluonitril (použito 40 gramů, což je 0,204 mol) a jodid draselný (10 gramů) v dioxanu (400 mililitrů), načež byl přidán roztok ethoxidu sodného (4,6 gramu sodíku ve 200 mililitrech suchého ethanolu). Tato reakční směs byla zahřívána při teplotě varu pod zpětným chladičem po dobu 3 až 4 hodin a potom byl ponechán stát po dobu přes noc. Tato směs byla potom nalita na led (2 litry), vytvořená sraženina byla zfiltrována, promyta vodou a produkt byl usušen v lyofílizéru. Rekiystalizací z methanolu byl získán diethylester kyseliny 4kyanobenzylacetamidomalonové ve formě bílých krystalků.
Výtěžek: 61 gramů (91 %).
Stupeň B: Ethylester N-(D,L)-acetyl-4-kyanofenylalaninu, Ac-(D,L)Phe(4-CN)-OEt.
COOEt
Podle tohoto provedení byl suspendován 4-kyanobenzyldiethylacetamidomalonát (použito 41,97 gramu, což je 0,126 mol) v ethanolu (0,6 litru). Potom byl přidán hydroxid sodný (6M) v následujících intervalech : 10 mililitrů (60 mol) v okamžiku 0, 10 mililitrů (60 mmol) po 30 minutách, 5 mililitrů (30 mmol) po 3 hodinách. Tato reakční směs byla promíchávána za současného přidávání hydroxidu sodného (GM) dokud nevymizela výchozí látka (metoda TLC, ethylacetát jako eluční činidlo, Rf = 0,63). Tento roztok byl potom zředěn vodou (100 mililitrů) a hodnota pH byla upravena na 3 za pomoci přídavku koncentrované kyseliny chlorovodíkové.
- 12CZ 295362 B6
Potom byl odpařen ethanol a takto získaný polopevný produkt byl sušen v lyofílizéru po dobu přes noc, přičemž tímto způsobem byl připraven N-acetyl-4-kyanobenzylmonoethylacetamidomalonát.
V dalším postupu byl takto připravený N-acetyl-4-kyanobenzylmonoethylacetamidomalonát v suchém dioxanu (0,5 litru) a tato reakční směs byla potom zahřívána při teplotě varu pod zpětným chladičem po dobu 2,5 až 3 hodin. Použitý dioxan byl odpařen, získaný pevný podíl byl suspendován v ethylacetátu (250 mililitrů) a tento podíl byl potom extrahován nasyceným vodným roztokem nasyceného hydrogenuhličitanu sodného (třikrát), vodou, kyselinou chlorovodíkovou (0,5M) a solankou. Takto získaný ethylacetátový roztok byl vysušen za použití síranu hořečnatého, zfiltrován a odpařen. Rekrystalizací takto připraveného produktu ze směsí ethylacetátu a hexanů byl připraven ethylester N-(L-D)-acetyl-4-kyanofenylalaninu.
Výtěžek: 28,95 gramu (88 %).
Příklad 2
Enzymatické štěpení Ac-(D,L)Phe(4-CN)-OEt (6 : 4; D : L) a postup přípravy (L)-N-acetyl-4kyanofenylalaninu, Ac-(L)Phe(4-CN)-OH.
Podle tohoto provedení byl přidán roztok chloridu sodného (1M, 242 mililitrů) a voda (600 mililitrů) do roztoku Ac-(D,L)Phe(4-CN)-OEt (6 : 4; D : L, použito 67 gramů) v acetonitrilu (1 litr). Hodnota pH tohoto roztoku byla potom upravena z hodnoty 7,3 na hodnotu 6,9, načež byl přidán roztok Subtilisinu Carlsberg (50 miligramů) ve vodném roztoku chloridu draselného (8 mililitrů, 0,lM roztok). Hodnota pH takto připraveného roztoku byla potom udržována titrováním hydroxidem sodným (1M roztok). Po jedné hodině byl přidán roztok Subtilisinu (50 miligramů) ve vodném roztoku chloridu draselného (8 mililitrů, 0,lM roztok), přičemž hodnota pH tohoto roztoku byla udržována titrací hydroxidem sodným (1M roztok). Po 2,5 hodině byl přidán roztok hydrogenuhličitanu sodného (800 mililitrů) a tento podíl byl potom extrahován ethylacetátem (čtyři podíly po 800 mililitrech). Ethylacetátový roztok byl usušen za použití síranu hořečnatého, načež byla tato směs zfíltrována. Zkoncentrováním tohoto filtrátu byl získán Ac-(D)Phe(4-CN)OEt ve formě pevné látky (38 gramů, výtěžek 95 %, 90 % ee). Vodná vrstva byly okyselena koncentrovanou kyselinou chlorovodíkovou (56 mililitrů) na pH 1. Vodná vrstva byla extrahována ethylacetátem (čtyři podíly po 800 mililitrech). Organická vrstva byla usušena za použití síranu hořečnatého a takto získaná reakční směs byla zfíltrována. Zkoncentrováním takto získaného filtrátu byl získán požadovaný Ac-(L)Phe(4-CN)-OH ve formě pevné látky.
Výtěžek: 21 gramů (88 %); teplota tání: 124 až 126 °C;
99,4 % ee.
-13 CZ 295362 B6
Příklad 3
N-acetyl-(L)-p-amidinofenylalanin, Ac-(L)-pAph-(L)-Chg-(L)-PalMe(3 )-NH2.
Stupeň A: N-t-butyloxykarbonyl-(L)-p-(3-pyridyl)-alaninamid, Boc-(L)-Pal-NH2.
Podle tohoto provedení byl Boc-(L)-Pal-OH (v množství 1,34 gramu, což je 5 mmol) suspendován v methylenchloridu (50 mililitrů), načež byl tento roztok ochlazen na teplotu -15 °C. K tomuto roztoku byl přidán diizopropylethylamin (963 μΐ, což je 5,5 mmol) a izobutylchlormravenčan (715 μΐ, což je 5,5 mmol). Tato reakční směs byla promíchávána po dobu 15 minut při teplotě -15 °C. Tímto roztokem byl potom intenzivně probubláván proud bezvodého amoniaku (sušen pevným hydroxidem sodným) po dobu asi 3 minut. Tato reakční směs byla potom promíchávána po dobu 10 minut při teplotě -15 °C a potom po dobu 20 minut při teplotě místnosti. Použitý methylenchlorid byl odpařen, načež byl přidán ethylacetát (70 mililitrů) a tento podíl byl promyt nasyceným vodným roztokem hydrogenuhličitanu sodného. Produkt byl usušen za pomoci síranu hořečnatého a odpařen. Krystalizací ze směsi ethylacetátu a hexanu byl připraven požadovaný BOC-(L)-Pal-NH2.
Výtěžek: 0,98 gramu (75 %).
Stupeň B: hydrochloridová sůl (L)-P-(3-pyridyl)-alaninamidu, H-(L)-Pal-NH2.2 HC1.
2HCI
NH2
-14CZ 295362 B6
Podle tohoto postupu byl Boc-(L)-Pal-NH2 (použito 0,98 gramu) suspendován v methylenchloridu (15 mililitrů) za současného mírného zahřívání, načež byl přidán roztok kyseliny chlorovodíkové (4M roztok, 10 mililitrů) v dioxanu. Po 30 minutách byl použitý methylenchlorid a dioxan odpařen. Pevný zbytek byl rozpuštěn v methanolu, přidáním etheru byl vysrážen pevný podíl, který byl zfiltrován a tímto způsobem byl získán požadovaný H-(L)-Pal-NH2.2 HC1.
Výtěžek: 0,86 gramu (98 %).
Stupeň C: N-t-butyloxykarbonyl-(L)-cyklohexylglycin-(L)-p-(3-pyridyl)-alaninamid, Boc(L)-Chg-(L)-Pal-NH2.
Při provádění tohoto postupu byl použit H-(L)-Pal-NH2 . 2 HC1, (v množství 432 miligramů, což je 1,82 mmol), Boc-(L)-Chg-OH (použito 609 miligramů, což je 2,37 mmol, neboli 1,3 ekvivalentu), dicyklohexylkarbodiimid (použito 494 miligramů, což je 2,4 mmol), hydroxybenzotriazol (použito 324 miligramů, což je 2,4 mmol) a diizopropylethylamin (4 mmol) v dimethylformamidu (15 mililitrů). Použití dimethylformamid byl potom odpařen, do reakční směsi byl přidán ethylacetát a tato směs byla uchovávána při teplotě místnosti po dobu 1 hodiny. Takto vytvořená diizopropylkarbodiimidcyklohexylmočovina byla zfíltrována, roztok byl extrahován nasyceným roztokem hydrogenuhličitanu sodného (třikrát), načež byl usušen síranem hořečnatým a odpařen. K tomuto podílu byly přidány hexany, načež byl krystalizací získán požadovaný produkt, Boc-(L)-Chg-(L)-Pal-NH2.
Výtěžek: 598 miligramů (81 %).
Stupeň D: hydrochloridová sůl (L)-cyklohexylglycin-(L)-P-(3-pyridyl)-alanmamidu, H-(L)Chg-(L)-Pal-NH2.2HC1
Podle tohoto postupu byl Boc-(L)-Chg-(L)-Pal-NH2 (v množství 1,27 gramu, což je
3,12 mmol) suspendován v methylenchloridu (50 mililitrů), načež byla přidána kyselina chloro
-15CZ 295362 B6 vodíková (10 mililitrů, 4M roztok v dioxanu). Po 30 minutách byl odpařen dioxan a methylenchlorid, získaný pevný podíl byl rozpuštěn v methanolu, přičemž požadovaný produkt byl vysrážen přídavkem etheru (200 mililitrů), který byl potom odfiltrován, přičemž tímto způsobem byl získán požadovaný H-(L)-Chg-(L)-Pal-NH2.2HC1.
Výtěžek: 1,12 gramu (95 %).
Stupeň E: N-acetyl-p-kyanofenylalanin-(L)-cyklohexylglycin-(L)-P-(3-pyridyl)-alaninamid, Ac-(L)-Phe(4-CN)-(L)-Chg-(L)-Pal-NH2.
Při provádění tohoto postupu byl použit H-(L)-Chg-(L)-Pal-NH2.2HC1 (v množství 1,13 gramu, což jsou 3 mmol), Ac-(L)-Phe(4-CN)-OH (použito 0,84 gramu, což je 3,6 mmol), diizopropylethylamin (v množství 10 mmol) a difenylfosforylazid (803 μΐ, což je 3,6 mmol) a dimethylformamid (30 mililitrů), přičemž tato reakční směs byla promíchávána po dobu přes noc. Použitý dimethylformamid byl odpařen, přičemž přídavkem etheru byl vysrážen pevný podíl, kteiý byl odfiltrován a promyt etherem, přičemž tímto způsobem byl připraven požadovaný Ac-(L)-Phe(4-CN)-(L)-Chg-(L)-Pal-NH2.
Výtěžek: 1,282 gramu (82 %).
Stupeň F: N-acetyl-(L)-p-thioamidfenylalanin-(L)-cyklohexylglycin-(L)-p-(3-pyridyl)alaninamid, Ac-(L)-Phe(4-thioamid)-(L)-Chg-(L)-Pal-NH2.
Podle tohoto postupu byl použit Ac-(L)-Phe(4-CN)-(L)-Chg-(L)-Pal-NH2 (v množství 1,18 gramu, což je 2,28 mmol), který byl rozpuštěn v dimethylsulfoxidu (20 až 40 mililitrů), načež byl přidán pyridin (40 mililitrů) a triethylamin (14 mililitrů). Tímto roztokem byl potom prováděn vodík při teplotě okolí a po dobu 30 minut. Takto získaný roztok byl potom uchováván při teplotě místnosti po dobu přes noc, načež byl odpařen na malý objem a produkt byl vysrážen
-16CZ 295362 B6 přídavkem diethyletheru. Tento produkt byl uchováván po dobu několika hodin v mrazničce, načež byl zfíltrován, promyt diethyletherem a usušen ve vakuu, přičemž tímto způsobem byl získán požadovaný Ac-(L)-Phe(4-thioamid)-(L)-Chg-(L)-Pal-NH2 ve formě žluté pevné látky.
Výtěžek: 1,26 gramu.
Stupeň G: hydrojodidová sůl N-acetyl-p-methylthioamidátfenylalanin-cyklohexylglycin-(L)p-(3-methylpyridinium)-alaninu, Ac-(L)-Phe(4-methylthioamidát)-(L)-Chg-(L)-Pal(Me)NH2.2HI
θ
Při provádění tohoto postupu byl použit Ac-(L)-Phe(4-thioamid)-(L)-Chg-(L)-Pal-NH2 (v množství 1,2 gramu), který byl suspendován v dimethylsulfoxidu (10 až 20 mililitrů) a acetonu (80 mililitrů). Potom byl přidán methyljodid (14 mililitrů, což je 50 ekvivalentů). Tato reakční směs byla potom udržována po dobu přes noc při teplotě místnosti, načež byl odpařen aceton a přebytkový methyljodid. Takto získaný podíl byl potom podroben vysrážení přídavkem diethyletheru (0,5 až 1,1). Po několika hodinách, kdy byl tento produkt uchováván při teplotě 4 °C, byl tento diethylether oddekantován nebyl zfíltrován a polopevný produkt na stěnách byl omyt diethyletherem a diethylacetátem. Získaný produkt byl usušen ve vakuu a tímto způsobem byl získán požadovaný produkt, Ac-(L)-Phe(4-methylthioamidát)-(L)-Chg-(L)-Pal(Me)NH2.2HI.
Výtěžek: 1,31 gramu.
Stupeň H: trifluoracetátová sůl N-acetyl-(L)-p-acetamidofenylalanin-cyklohexylglycin-(L)-p(3-N-methylpyridinium)-alaninamidu, Ac-(L)-pAphe-(L)-Chg-(L)-PalMe-NH2. TFA
-17CZ 295362 B6
Při provádění tohoto postupu byl použit Ac-(L)-Phe(4-methylthioamidát)-(L)-Chg-(L}Pal(Me)-NH2 . 2HI (v množství 1,31 gramu), který byl rozpouštěn v methanolu (50 mililitrů) a v kyselině octové (0,5 mililitru). Potom byl přidán acetát amonný (v množství 0,8 gramu). Tato reakční směs byla zahřívána při teplotě 55 °C po dobu 3 hodin, načež byla odpařena, získaný podíl byl rozpuštěn ve směsi acetonitrilu a vody (0,1 % kyseliny trifluoroctové) v poměru 1:1, načež byl tento podíl zfíltrován a lyofilizován, čímž byl získán požadovaný produkt Ac-(L)pAphe-(L)-Chg-(L)-PalMe-NH2. TFA.
Výtěžek: 1,22 gramu.
Předmětný vynález se týká způsobu přípravy meziproduktu, N-acetyl-L-fenylalaninu, což je sloučenina vzorce IA, který je vhodný k přípravě Ac-(L)-pAph-Chg-PalMe(3)-NH2, to znamená sloučeniny vzorce II. Tato posledně uvedená sloučenina je vhodná k inhibování proteinů pro srážení krve, a konkrétně pro inhibování enzymu pro srážení krve, faktoru „Xa“, což je podrobněji uváděno v patentové přihlášce Spojených států amerických US 08 428 404, podané 25. dubna 1995, která je zde uváděna jako odkazový materiál.
V textu předmětného vynálezu je používán termín „aktivita faktoru Xa“, přičemž tímto termínem se míní schopnost faktoru Xa, jako takového nebo ve spojení s podjednotkami známými jako protrombinázový komplex, katalyzovat konverzi protrombinu na trombin. V případech, kdy se v souvislosti s aktivitou faktoru Xa používá termínu „inhibování“ se tímto termínem míní jak přímé tak nepřímé inhibování aktivity faktoru Xa. Tuto přímou inhibici aktivity faktoru Xa je možno dosáhnout například vázáním peptidu na faktor Xa nebo protrombinázu, čímž se zabrání vázání protrombinu na aktivní místo protrombinázového komplexu.
V popisu předmětného vynálezu je v souvislosti s inhibováním aktivity faktoru Xa používán termín „specifický“ účinek, přičemž tímto termínem se míní to, že tato sloučenina inhibuje aktivitu faktoru Xa aniž by v podstatě došlo k inhibování aktivity dalších specifických proteáz (při použití stejné koncentrace tohoto inhibitoru). Mezi tyto další specifické proteázy je možno zařadit například proteázy podílející se na koagulační kaskádě, jako jsou například trombin, plasmin, trypsin a elastáza.
I když je v určitých případech nemocí tvorba krevních sraženin vyskytujících se v krevním oběhu sama o sobě příčinou úmrtí, není vhodné dosáhnout úplného inhibování srážecího systému, neboť by mohla nastat hemoragie, která je rovněž životu nebezpečná.
Proces srážení krve je komplexním procesem, který zahrnuje řadu postupně se zesilující řadu enzymových aktivačních reakcí, ve které jsou plasmové zymogeny postupně aktivovány omezeno proteolýzou. Po stránce mechanické byly kaskády srážení krve rozděleny do dvou systémů, „vnitřního“ a „vnějšího“. Tyto systémy se spojují při aktivaci faktoru X, přičemž následné generování trombinu probíhá prostřednictvím „společného systému“.
Podle současných znalostí v tomto oboru se uvádí, že uvedený vnitřní systém hraje důležitou roli při udržování a zvyšování tvorby fibrinu, zatímco vnější systém je důležitý v iniciační fázi srážení krve. Všeobecně je nyní akceptována skutečnost, že srážení krve je fyzicky iniciováno tvorbou komplexu tkáňového faktoru a faktoru Vila. Po svém vytvoření tento komplex iychle iniciuje koagulaci aktivací faktoru IX a X. Nově vytvořený faktor Xa potom vytváří komplex s faktorem Via v poměru jedna k jedné s fosfolipidy. Tento tak zvaný protrombinázový komplex je příčinou přivedení rozpustného fíbrinogenu na nerozpustný fibrin. S postupujícím časem je aktivita tohoto komplexu faktoru Vila a tkáňového faktoru (vnější systém) postupně potlačena proteinem Kunitzova typu představujícím inhibitor proteázy, TFPI, který po zkomplexování s faktorem Xa může přímo inhibovat proteolytickou aktivitu komplexu faktoru Vila a tkáňového faktoru. K tomu aby byl udržen koagulační proces v přítomnosti inhibovaného vnějšího systému je třeba vyprodukovat další množství faktoru Xa prostřednictvím trombinem zprostředkované
-18CZ 295362 B6 aktivity ve vnitřním systému. Ze shora uvedeného je patrné, že trombin hraje dvojí „autokatalytickou“ roli, jak při zprostředkování své vlastní výroby tak při konverzi fíbrinogenu na fíbrin.
Tato výše uvedená autokatalytická povaha generování trombinu představuje důležitý bezpečnostní prvek proti nekontrolovatelnému krvácení. Tento systém zaručuje, že jakmile je dosaženo prahové úrovně protrombinázy, proběhne úplné vysrážení krve, což způsobí například konec hemoragie. Vzhledem k výše uvedenému je zřejmé, že je nanejvýš žádoucí vyvinout činidla, která inhibují koagulaci aniž by byl přímo inhibován trombin.
Sloučenina Ac-pAph-Chg-PalMe(3)-NH2, která je peptidovým analogem, synteticky připravená postupem podle předmětného vynálezu představuje vhodný inhibitor aktivity faktoru Xa, přičemž současně v podstatě neinhibuje aktivitu ostatních proteáz zúčastňujících se na procesu srážení krve.

Claims (30)

1. Způsob přípravy N-acetyl-(L)-4-kyanofenylalaninu, sloučeniny vzorce IA:
sloučenina (IA), vyznačující se tím, že zahrnuje následující stupně:
(a) kombinování dostatečného množství sloučeniny I: sloučenina (I), dostatečného množství vodného roztoku, dostatečného množství acetonitrilu a dostatečného množství Subtilisinu ke zreagování podstatného množství sloučeniny vzorce I za vzniku reakčního média, a (b) úprava reakčního média na vhodnou hodnotu pH při přidání Subtilisinu a udržování vhodné hodnoty pH při probíhající reakci k získání sloučeniny vzorce IA.
2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že uvedené dostatečné množství acetonitrilu představuje asi 5 až asi 95 procent objemových reakčního média.
-19CZ 295362 B6
3. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že uvedené dostatečné množství acetonitrilu představuje asi 50 až asi 60 procent objemových vodného roztoku.
4. Způsob podle nároku 1, vy z n a č uj í c í se tím, že vodný roztok obsahuje dostatečné množství anorganické soli.
5. Způsob podle nároku 4, vyznačující se tím, že uvedené dostatečné množství anorganické soli představuje asi 10 až asi 15 procent objemových vodného 1 molámího roztoku anorganické soli.
6. Způsob podle nároku 5, vyznačující se tím, že anorganickou solí je chlorid draselný.
7. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že se upraví vhodná hodnota pH reakčního média a tato hodnota se udržuje přidáváním dostatečného množství bazické látky.
8. Způsob podle nároku 7, vyznačující se tím, že uvedenou bazickou látkou je hydroxid sodný.
9. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že se upraví vhodná hodnota pH reakčního média a tato hodnota se udržuje přidáváním dostatečného množství pufru.
10. Způsob podle nároku 9, vyznačující se tím, že tímto pufrem je roztok fosforečnanu.
11. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že se upraví vhodná hodnota pH reakčního média a tato hodnota se udržuje na hodnotě v rozmezí od asi 5 do asi 9.
12. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že se upraví vhodná hodnota pH reakčního média a tato hodnota se udržuje na hodnotě v rozmezí od asi 6,5 do asi 7,5.
13. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že dále zahrnuje míchání reakčního média při probíhající reakci mezi dostatečným množstvím Subtilisinu a podstatným množstvím sloučeniny vzorce I po dobu v rozmezí od asi 15 minut do asi 4 hodin.
14. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že uvedené dostatečné množství Subtilisinu představuje množství v rozmezí od asi 0,5 do asi 10 hmotnostních miliekvivalentů množství sloučeniny vzorce I.
15. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že dále zahrnuje další stupeň oddělování sloučeniny vzorce IA z reakčního média.
16. Způsob přípravy sloučeniny Ac-(L)-pAph-Chg-PalMe(3)-NH2, sloučeniny vzorce II:
-20CZ 295362 B6 sloučenina (II) nebo farmaceuticky přijatelných solí odvozených od této sloučeniny, vyznačující se tím, že zahrnuje následující stupně:
(a) kombinování dostatečného množství sloučeniny vzorce I:
sloučenina (I) dostatečného množství vodného roztoku, dostatečného množství acetonitrilu a dostatečného množství Subtilisinu ke zreagování s podstatným množstvím sloučeniny vzorce I za vzniku reakčního média, a (b) úpravu reakčního média na vhodnou hodnotu pH při přidání Subtilisinu a udržování vhodné hodnoty pH při probíhající reakci k získání sloučeniny vzorce IA:
sloučenina (IA) (c) adování sloučeniny vzorce IA na sloučeninu vzorce 3:
-21 CZ 295362 B6 p
hxonh2 sloučenina (3) sloučenina (4) (d) převedení kyanoskupiny ve sloučenině vzorce 4 na amidinovou skupinu a methylace dusíku pyridylové skupiny za vzniku sloučeniny vzorce II.
17. Způsob podle nároku 16, vyznačující se tím, že uvedené dostatečné množství acetonitrilu představuje asi 5 až asi 95 procent objemových vodného roztoku.
18. Způsob podle nároku 16, vyznačující se tím, že uvedené dostatečné množství acetonitrilu představuje asi 50 až asi 60 procent objemových vodného roztoku.
19. Způsob podle nároku 16, vyznačující se tím, že vodný roztok obsahuje dostatečné množství anorganické soli.
20. Způsob podle nároku 19, vyznačující se tím, že uvedené dostatečné množství anorganické soli představuje asi 10 až asi 15 procent objemových vodného 1 molámího roztoku anorganické soli.
21. Způsob podle nároku 20, vyznačující se tím, že anorganickou solí je chlorid draselný.
22. Způsob podle nároku 16, vyznačující se tím, že se upraví vhodná hodnota pH reakčního média a tato hodnota se udržuje přidáváním dostatečného množství bazické látky.
23. Způsob podle nároku 22, vyznačující se tím, že uvedenou bazickou látkou je hydroxid sodný.
24. Způsob podle nároku 16, vyznačující se tím, že se upraví vhodná hodnota pH reakčního média a tato hodnota se udržuje přidáváním dostatečného množství pufru.
25. Způsob podle nároku 24, vyznačující se tím, že tímto pufrem je roztok fosforečnanu.
-22CZ 295362 B6
26. Způsob podle nároku 16, vyznačující se tím, že se upraví vhodná hodnota pH reakčního média a tato hodnota se udržuje na hodnotě v rozmezí od asi 5 do asi 9.
27. Způsob podle nároku 16, vyznačující se tím, že se upraví vhodná hodnota pH reakčního média a tato hodnota se udržuje na hodnotě v rozmezí od asi 6,5 do asi 7,5.
28. Způsob podle nároku 16, vyznačující se tím, že dále zahrnuje míchání reakčního média při probíhající reakci mezi dostatečným množstvím Subtilisinu a podstatným množstvím sloučeniny vzorce I po dobu v rozmezí od asi 15 minut do asi 4 hodin.
29. Způsob podle nároku 16, vyznačující se tím, že uvedené dostatečné množství Subtilisinu představuje množství v rozmezí od asi 0,5 do asi 10 hmotnostních miliekvivalentů množství sloučeniny vzorce I.
30. Způsob podle nároku 16, vyznačující se tím, že dále zahrnuje další stupeň oddělování sloučeniny vzorce IA z reakčního média.
CZ19981956A 1995-12-20 1996-11-25 Způsob přípravy N-acetyl-(L)-4-kyanofenylalaninu Ac-(L)-Phe(4-CN)-OH a N-acetyl-(L)-p-amidinofenylalanincyklohexylglycin-beta-(3-N-methylpyridinium)-alaninu Ac-(L)-pAph-Chg-PalMe(3)-NH2 CZ295362B6 (cs)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US57556995A 1995-12-20 1995-12-20

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CZ195698A3 CZ195698A3 (cs) 1999-01-13
CZ295362B6 true CZ295362B6 (cs) 2005-07-13

Family

ID=24300839

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ19981956A CZ295362B6 (cs) 1995-12-20 1996-11-25 Způsob přípravy N-acetyl-(L)-4-kyanofenylalaninu Ac-(L)-Phe(4-CN)-OH a N-acetyl-(L)-p-amidinofenylalanincyklohexylglycin-beta-(3-N-methylpyridinium)-alaninu Ac-(L)-pAph-Chg-PalMe(3)-NH2

Country Status (26)

Country Link
EP (1) EP0868526B1 (cs)
JP (1) JP4044614B2 (cs)
KR (1) KR100438879B1 (cs)
CN (1) CN1087349C (cs)
AR (1) AR005119A1 (cs)
AT (1) ATE222293T1 (cs)
AU (1) AU717995B2 (cs)
BR (1) BR9612059A (cs)
CA (1) CA2241210C (cs)
CZ (1) CZ295362B6 (cs)
DE (1) DE69623038T2 (cs)
DK (1) DK0868526T3 (cs)
EE (1) EE03698B1 (cs)
ES (1) ES2179957T3 (cs)
IL (1) IL125003A (cs)
MX (1) MX9804997A (cs)
NO (1) NO319678B1 (cs)
NZ (1) NZ324159A (cs)
PL (1) PL185541B1 (cs)
PT (1) PT868526E (cs)
RU (1) RU2170764C2 (cs)
SK (1) SK281432B6 (cs)
TR (1) TR199801107T2 (cs)
UA (1) UA48993C2 (cs)
WO (1) WO1997022712A1 (cs)
ZA (1) ZA9610600B (cs)

Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IL144096A0 (en) 1999-01-02 2002-05-23 Aventis Pharma Gmbh Novel malonic acid derivatives, processes for their preparation, their use and pharmaceutical compositions containing them (inhibition of factor xa activity)
EP1016663A1 (en) * 1999-01-02 2000-07-05 Aventis Pharma Deutschland GmbH Novel malonic acid derivatives, processes for their preparation, their use and pharmaceutical compositions containing them (inhibition of factor Xa activity)
PL356801A1 (en) * 2000-01-28 2004-07-12 Aventis Pharma Deutschland Gmbh Process for the preparation of acetyl-amidiniophenylalanyl-cyclohexylglycyl-pyridinioalaninamides
EP1127884A1 (en) * 2000-02-26 2001-08-29 Aventis Pharma Deutschland GmbH Novel malonic acid derivatives, processes for their preparation, their use as inhibitor of factor XA activity and pharmaceutical compositions containing them
AU2003302238A1 (en) 2002-12-03 2004-06-23 Axys Pharmaceuticals, Inc. 2-(2-hydroxybiphenyl-3-yl)-1h-benzoimidazole-5-carboxamidine derivatives as factor viia inhibitors
GB0306267D0 (en) 2003-03-19 2003-04-23 Ineos Fluor Ltd Process
JP2008260755A (ja) * 2007-03-20 2008-10-30 Sumitomo Chemical Co Ltd Ｌ−ビフェニルアラニン化合物の塩の回収方法、およびそれを用いたビフェニルアラニンエステル化合物の回収方法
CN106946724B (zh) * 2017-04-07 2019-03-22 苏州汉德创宏生化科技有限公司 单胺基抑制剂类中间体2-乙酰氨基-2-苄基丙二酸单乙酯的合成方法

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4981799A (en) * 1987-08-21 1991-01-01 Takeda Chemical Industries, Ltd. Acylamino acid racemase, production and use thereof
DE4111394A1 (de) * 1991-04-09 1992-10-15 Behringwerke Ag Amidinophenylalaninderivate, verfahren zu deren herstellung, deren verwendung und diese enthaltende mittel
DE4115468A1 (de) * 1991-05-11 1992-11-12 Behringwerke Ag Amidinophenylalaninderivate, verfahren zu deren herstellung, deren verwendung und diese enthaltende mittel als antikoagulantien
DE69213546T2 (de) * 1991-05-13 1997-02-27 Fujisawa Pharmaceutical Co Neue Peptid-Verbindungen und Verfahren zur Herstellung davon
JP3655632B2 (ja) * 1994-04-26 2005-06-02 アベンティス・ファーマスーティカルズ・インコーポレイテッド 第Ｘａ因子インヒビター

Also Published As

Publication number Publication date
UA48993C2 (uk) 2002-09-16
PL185541B1 (pl) 2003-05-30
EE9800188A (et) 1998-12-15
HK1017384A1 (en) 1999-11-19
AR005119A1 (es) 1999-04-14
SK85598A3 (en) 1998-12-02
DE69623038D1 (de) 2002-09-19
TR199801107T2 (xx) 1998-10-21
MX9804997A (es) 1998-09-30
EP0868526B1 (en) 2002-08-14
NO982868D0 (no) 1998-06-19
JP2000501618A (ja) 2000-02-15
BR9612059A (pt) 1999-02-23
WO1997022712A1 (en) 1997-06-26
KR100438879B1 (ko) 2004-07-16
PL327314A1 (en) 1998-12-07
CA2241210A1 (en) 1997-06-26
DE69623038T2 (de) 2002-12-12
EE03698B1 (et) 2002-04-15
CN1205742A (zh) 1999-01-20
ATE222293T1 (de) 2002-08-15
NZ324159A (en) 1999-07-29
RU2170764C2 (ru) 2001-07-20
DK0868526T3 (da) 2002-12-02
NO319678B1 (no) 2005-09-05
CA2241210C (en) 2002-05-14
CN1087349C (zh) 2002-07-10
PT868526E (pt) 2002-12-31
NO982868L (no) 1998-08-19
ES2179957T3 (es) 2003-02-01
ZA9610600B (en) 1997-06-20
AU1125197A (en) 1997-07-14
CZ195698A3 (cs) 1999-01-13
IL125003A0 (en) 1999-01-26
IL125003A (en) 2001-12-23
KR20000064486A (ko) 2000-11-06
EP0868526A1 (en) 1998-10-07
AU717995B2 (en) 2000-04-06
SK281432B6 (sk) 2001-03-12
JP4044614B2 (ja) 2008-02-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
RU2088591C1 (ru) Производные амидинофенилаланина, способ их получения и производные амидинофенилаланина, обладающие антикоагулирующей активностью
US6492402B1 (en) Thrombin inhibitors
KR100339456B1 (ko) 신규펩티드유도체
US4318904A (en) Peptide affinity labels for thrombin and other trypsin-like proteases
US6034067A (en) Serine protease inhibitors
JPH10503477A (ja) 第Ｘａ因子インヒビター
EP0236163A1 (fr) Dérivés N alpha-substitués des N alpha-arylsulfonylaminoacyl p-amidinophénylalaninamides, leur préparation, leur application comme médicaments et intermédiaires pour leur synthèse
US5274098A (en) Amidinophenylalanine derivatives, process for their preparation, their use and compositions containing them
CZ277898A3 (cs) Inhibitory serinproteázy a farmaceutický prostředek
CZ295362B6 (cs) Způsob přípravy N-acetyl-(L)-4-kyanofenylalaninu Ac-(L)-Phe(4-CN)-OH a N-acetyl-(L)-p-amidinofenylalanincyklohexylglycin-beta-(3-N-methylpyridinium)-alaninu Ac-(L)-pAph-Chg-PalMe(3)-NH2
EP0313969B1 (en) Tripeptide derivatives and antiplasmin agents containing the same
US5686419A (en) Basic α-aminoalkylphosphonate derivatives
CA2212356A1 (en) Novel 4-substituted-3-peptidyl-azetidin-2-one derivatives useful as cysteine proteinase inhibitor
JP2005533749A (ja) 凝固Ｘａ因子の阻害剤、それらの製造および使用
EP0956293B1 (en) Thrombin inhibitors
JP2003509409A (ja) アザシクロアルカノンセリンプロテアーゼ阻害剤
US5766932A (en) Process for preparing N-acetyl(L)-4-cyanophenylalanine from a mixture of the corresponding D,L ethyl esters using subtilisin
US5077285A (en) Imidazole compounds and their use as transglutaminase inhibitors
TW389755B (en) Novel process for preparing n-acetyl (1) -4-cyanophenylalanine ac -(1) -phe (4-cn) -oh and n-acetyl -(1)-p-amidinophenylalanine-cyclohexylglycine-<beta>-(3-n-methylpyridinium)-alanine ac-(1)-paph-chg-palme(3)-nh2
HK1017384B (en) NOVEL PROCESS FOR PREPARING N-ACETYL(L)-4-CYANOPHENYLALANINE AC-(L)-PHE(4-CN)-OH AND N-ACETYL-(L)-P-AMIDINOPHENYLALANINE-CYCLOHEXYLGLYCINE-β-(3-N-METHYLPYRIDINIUM)-ALANINE AC(L)-PAPH-CHG-PALME(3)-NH2
JPH05292991A (ja) ペプチド酸の製造方法

Legal Events

Date Code Title Description
PD00 Pending as of 2000-06-30 in czech republic
MM4A Patent lapsed due to non-payment of fee

Effective date: 20111125