PL179765B1 - Sposób stymulowania aktywnosci supresorowej limfocytów PL PL PL PL PL PL PL PL - Google Patents

Abstract

1. Sposób stymulowania aktywnosci supresorowej limfocytów, znamienny tym, ze izoluje sie krew pacjenta, bada sie in vitro stan odpornosciowy 1 w przypadku stwierdzenia de- ficytu supresorów prowadzi sie hodowle komórek autoimmumzacyjnych wyodrebnio- nych z krwi obwodowej w obecnosci trofoblastycznej ß-I-glikoproteiny w stezeniu od 3 do 120 µg/ml krwi. PL PL PL PL PL PL PL PL

Description

Wynalazek dotyczy medycyny, a zwłaszcza immunologicznych preparatów korygujących do leczenia chorób autoimmunizacyjnych.

Wynalazek można stosować jako lek do diagnozowania składnika supresorowego układu odpornościowego i do oceny możliwości leczenia chorób autoimmunizacyjnych, zwłaszcza stwardnienia rozsianego, gośćca przewlekłego, itd..

Znana jest β-I-glikoprotema pochodząca z łożyska, będąca analogiem trofoblastycznej glikoproteiny β-I (TBG) wykorzystywanej jako stymulator wzrostu i proliferacji hemotopoetycznych komórek krwi (opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 5169835, klasa A61K 35/50, 1989).

Mimo to ten znany związek nie został zastosowany jako środek do leczenia chorób autoimmunizacyj nych.

Znane jest zastosowanie TBG do diagnozowania i prognozowania przebiegu ciąży (patrz L.G. Sotnikova i inni, The Role of β-I-glykoprotein Trophoblast in Diagnosing and Prognosticating Pregnancy, Metodicheskije Recomendatsii, Moskwa 1984).

W pracy tej nie ujawniono jednak możliwości zastosowania TBG do diagnozowania składnika supresorowego i leczenia chorób autoimmunizacyjnych.

Znany jest sposób leczenia łuszczycy krostkowej przez podawanie leku pochodzenia łożyskowego (patrz opis świadectwa autorskiego ZSRR nr 1061818, klasa a61K 35/50 z dnia 19.07.82).

Jednak zastosowanie tego leku metodą podawania dożylnego me zapobiega efektom ubocznym, mogącym wystąpić wskutek zanieczyszczeń.

Znany jest sposób leczenia chorób autoimmunizacyjnych obejmujący podawanie dawki immunologicznych preparatów korygujących pochodzenia łożyskowego (patrz opis świadectwa autorskiego ZSRR nr 1657100, klasa A61K 35/50 z 1989 roku).

W sposobie tym stosuje się preparaty zawierające zanieczyszczenia, które mogą spowodować odczyny alergiczne, ponadto preparat ten jest skuteczny tylko podczas okresu pochirurgicznego i jest ograniczony do autoimmunizacyjnego zapalenia jądei^.

Głównym celem wynalazku jest zapewnienie skutecznego sposobu leczenia chorób autoimmunizacyjnych przez podawanie preparatu wykazującego działanie korygującego aktywność immunologiczną i dawki nie wywołującej takich efektów jak również rozszerzenie zakresu chorób autoimmunizacyjnych, które można nimi leczyć.

Cel ten osiąga się stosując trofoblastyczną(3-I-glikoproteinę (TBG) jako środek do leczenia chorób autoimmunizacyjnych, a ujawniony sposób leczenia chorób autoimmunizacyjnych, polegający na podawaniu immunologicznych preparatów korygujących dodatkowo obejmuje wstępne badanie stanu odpornościowego, i w przypadku stwierdzenia deficytu supresorów,

179 765 stosowanie trofoblastycznej β-I-glikoproteiny (TBG) jako immunologicznego preparatu korygującego.

Zatem przedmiotem wynalazku jest sposób stymulowania aktywności supresorowej limfocytów charakteryzujący się tym, że izoluje się krew pacjenta, bada się in vitro stan odpornościowy i w przypadku stwierdzenia deficytu supresorów prowadzi się hodowlę komórek autoimmunizacyjnych wyodrębnionych z krwi obwodowej w obecności trofoblastycznej β-Ighkoproteiny w stężeniu od 3 do 120 mg/ml krwi.

Korzystnie w sposobie według wynalazku bada się poziom supresora T. Równie korzystnie prowadzi się hodowlę komórek jednojądrowych (MNC) wyodrębnionych z krwi obwodowej w obecności trofoblastycznej β-I-glikoproteiny w stężeniu 60 mg/ml krwi.

Wstępne badanie stanu odpornościowego może obejmować pobieranie próbki krwi obwodowej, wytwarzanie zawiesiny komórek jednojądrowych (MNC), podzielenie tej próbki na dwie części, hodowanie pierwszej części bez TBG oraz hodowanie drugiej części z TBG, odmywanie MNC z pożywki hodowlanej, blokowanie proliferacji, dodawanie do każdej ze wspomnianych części MNC świeżo wydzielonych MNC od zwykłego dawcy, przy czym te ostatnie MNC były stymulowane fitohemaglutyniną w równych proporcjach w celu uzyskania hodowli testowych, prowadzenie tych hodowli, dalszą ocenę proliferacji w tych hodowlach testowych oraz określanie stopnia supresji na podstawie stosunków poziomów proliferacji w hodowlach testowych. Doświadczenia i testy kliniczne wykazały nowe właściwości TBG jako immunologicznego preparatu korygującego przydatnego w leczeniu różnych chorób autoimmunizacyjnych. Badania wartości układu odpornościowego u 154 pacjentów cierpiących na choroby autoimmumzacyjne (stwardnienie rozsiane gościec przewlekły, ltd.) wykazały niedobór supresora T, co stanowi mechanizm startowy dla autoimmunizacji, to znaczy do utraty autotolerancji.

Działanie lecznicze TBG oparte jest najego zdolności do indukowania supresyjnej aktywności limfocytów u pacjentów cierpiących na stwardnienie rozsiane, gościec przewlekły itd.

Kliniczne badania immunologiczne prowadzone na pacjentach cierpiących na wymienione wyżej choroby i na grupie kontrolnej (105 dawców) obejmowały ocenę aktywności funkcjonalna supresorów T. Komórki jednojądrowe (MNC) wyodrębniano z krwi obwodowej przez odwirowanie z jednostopniowym gradientem gęstości fikol-urotrust (metoda Boyum’a).

Stwierdzono, że u pacjentów cierpiących na stwardnienie rozsiane względna liczba komórek T podczas ostrego stanu choroby (41,3 ± 0,2%) była poniżej normalnej wartości (63,2 ± 2%) o czynnik 1,5.

W oparciu o wstępne dane z badań można dojść do wniosku, że TBG można stosować do leczenia wszystkich pacjentów z ostrym stanem choroby, przy czym 40% pacjentów powraca do zdrowia, a w odniesieniu do pozostałych 60% pacjentów podawania TBG należy czasowo unikać.

Preparat do podawania można sporządzać w postaci roztworu do wstrzyknięć jako kombinację z dowolnym farmaceutycznie dopuszczalnym rozpuszczalnikiem.

Dawkowanie i sposoby podawania zależą od charakteru i stanu zaawansowania choroby. Zakres dawki dla TBG może wynosić od 3 do 120 pg/ml pacjenta. TBG jest wysoce skuteczny i osiąga się znaczące wyniki przy jednokrotnym podaniu minimalnej dawki.

Korzystnie TBG należy podawać pozajelitowo lub dożylnie po wstępnym hodowaniu TBG w stężeniu 60 pg/ml z auto-MNC z krwi obwodowej.

Dalsze szczegóły dotyczące wynalazku ujawniono w przykładach jego konkretnych postaci jak również na rysunku, na którym fig. 1 ujawnia działanie stymulujące (przeciwsupresorowe) i supresorowe jako procent limfocytów indukowanych przez TBG w krwi obwodowej pacjentów cierpiących na stwardnienie rozsiane w stanie ostrym (1), w początkowym stanie powrotu do zdrowia (2), i w stanie powrotu do zdrowia (3).

Wstępne badania stanu odpornościowego prowadzi się badając wrażliwość TBG komórek jednojądrowych (MNC) w następujących etapach.

Krew obwodową pobiera się od pacjenta przez nakłucie żyły i umieszcza się w probówkach zawierających roztwór hepatyny. Następnie uzyskuj się zawiesinę jednojądrowych komórek przez osadzanie komórek w jednostopniowym gradiencie fikolurotrust i dzieli się ją na dwie

179 765 części. Pierwszą część hoduje się w ciągu 48 godzin bez aktywatora supresji (TBG), a drugą hoduje się z TBG. Następnie MNC odmywa się od pożywki hodowlanej i blokuje się proliferację traktując MNC mitomycynąC.

W następnym etapie świeżo wydzielone limfocyty od zwykłego dawcy (które były stymulowane fitohemaglutyniną(PHA), w celu stosowaniajako reagujące komórki testowe) dodaje się do każdej z części, limfocytów kontrolnych i stymulowanych TBG, w równych proporcjach w celu uzyskania hodowli testowych. Hodowle prowadzi się przez 72 godziny. Następnie ocenia się proliferację hodowli testowych stosując N³-tymidynę, a supresję ocenia się na podstawie spadku w niej proliferacji.

Wskaźnik supresji wylicza się z następującego wzoru:

liczba impulsów / minutę w testowej hodowli z TBG

SI = (1 - ------- ) X 100% liczba impulsów / minutę w testowej hodowli bez TBG

Wskaźnik supresji charakteryzuje składnik supresora ludzkiego układu odpornościowego. W zależności od danych uzyskanych w wyniku badania układu odpornościowego pacjenta określa się dalsze metody leczenia chorób autoimmumzacyjnych.

Wynalazek jest dalej zilustrowany następującymi przykładami.

Przykład I. Pacjent C., 29 lat. Diagnoza: stwardnienie rozsiane, (postać mózgowo-rdzeniowa, przedłużony okres powrotu do zdrowia); pacjent przeszedł kilka kuracji preparatami kortikosteroidowymi; badania immunologiczne prowadzone podczas stanu powrotu do zdrowia wykazały, że aktywność stymulacyjna limfocytów T w krwi obwodowej wynosiła 28%.

W obecnym stanie powinno się unikać leczenia za pomocą TBG.

Przykładu. Pacjent B., 28 lat, diagnoza: stwardnienie rozsiane, (postać mózgowo-rdzeniowa, przebieg zwalniający, stan ostry). Czas trwania choroby: 3 lata. Stan neurologiczny: oczopląs poziomy przy patrzeniu na wprost; żywe odruchy ścięgniste; stopy D>. Odruchy brzuszne: odruchy górno-dolne umiarkowane i dolne nie występują. Dwustronny objaw dużego palca (objaw Babińskiego). Stopotrząs jest bardziej wyraźny wprawo. Brakparezy członków, określono niezmienne napięcie mięśniowe. Chód ataktyczny. Niestabilny w pozycji Romberga. Ataksja podczas próby kolano-łokieć, opóźnione oddawanie moczu.

Płyn rdzieniowy:

białko - 0,76% reakcja Langa - 66644322.

Badanie okulistyczne: blade skroniowe odcinki tarcz nerwu wzrokowego.

Aktywność supresora T w krwi obwodowej podczas indukcji TBG - 17%.

W warunkach aseptycznych z żyły przedramienia pacjenta pobrano jedną próbkę krwi

110 ml. Wyodrębniono komórki jednojądrowe (MNC) w standardowy sposób w gradiencie gęstości fikol-urotrust. Wyizolowane MNC hodowano z TBG w stężeniu 60 pg/ml. Po przemyciu przez odwirowanie komórki wprowadzono dożylnie. Oznaki powrotu do zdrowia obserwowano 5 dnia. Chód i oddawanie moczu stało się normalne. Przywrócona został stabilność w pozycji Romberga. Próba kolano-łokieć przebiegała gładko. Ponowne badanie układu odpornościowego wykazało wzrost aktywności funkcjonalnej supresorów T w krwi obwodowej z indukcją TBG wynoszącą38%. Próby prowadzone w 7, 14 i 28 dniu nie ujawniły u pacjenta przeciwciał przeciw-TBG.

Przykład III. Pacjent H., lat 42 przybył do szpitala z diagnozą gośćca przewlekłego (zapalenie wielostawowe, seropozytywny A; stadium 2) niewystarczające funkcjonowanie stawów (TGF). Aktywność supresorów T w krwi obwodowej przy indukowaniu TBG wynosiła 22%.

Pacjent otrzymał zastrzyki TBG do stawów ze zmianami patologicznymi, przy czym każdy zastrzyk o objętości 0,5 ml miał stężenie 60 pg/ml. Powrót do zdrowia obserwowano 4 dnia. Objawy bólowe osłabły. Niedostateczne funkcjonowanie stawów cofnęło się. Ponowne badanie wykazało 47% wzrost aktywności funkcjonalnej surresorów T w krwi obwodowej pod wpływem

179 765 indukcji TBG. Próba Ouhterloniego prowadzona 7,14 i 28 dnia nie wykazała obecności u pacjenta przeciwciał przeciw TBG.

Badania 105 dawców i 154 pacjentów cierpiących na różne choroby autoimmumzacyjne wykazało, że zastosowanie TBG w dawce mniejszej niż 3 pg/ml krwi wywołuje niewystarczający efekt, podczas gdy stosowanie dawki powyżej 120 pg/ml krwi było niepożądane.

Normalna wartość aktywności supresorów wynosi 63,4% ± 4,7, przy stanie ostrym ta wartość wynosi 20,5% ± 9,8, podczas powrotu do zdrowia wynosi ona 47,7% ± 2,8; w początkowym stadium powrotu do zdrowia wartość ta wynosi 66,6% ±16,1 (działanie stymulujące).

Dlatego preparaty TBG okazały się wysoce aktywne jako środki do leczenia chorób autoimmunizacyjnych. Sposób leczenia chorób autoimmunizacyjnych według wynalazku zapewnia skuteczne leczenie różnych chorób autoimmunizacyjnych bez wywoływania niepożądanych efektów ubocznych.

Wynalazek można szeroko stosować jako środki do leczenia szerokiego zakresu chorób autoimmunizacyjnych jak również do diagnozowania składnika supresorowego ludzkiego układu odpornościowego.

Claims (3)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Sposób stymulowania aktywności supresorowej limfocytów, znamienny tym, że izoluje się krew pacjenta, bada się in vitro stan odpornościowy i w przypadku stwierdzenia deficytu supresorów prowadzi się hodowlę komórek autoimmunizacyjnych wyodrębnionych z krwi obwodowej w obecności trofoblastycznej β-I-glikoproteiny w stężeniu od 3 do 120 pg/ml krwi.
2. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że bada się poziom supresora T.
3. 3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że prowadzi się hodowlę komórek jednojądrowych wyodrębnionych z krwi obwodowej w obecności trofoblastycznej β-I-glikoproteiny w stężeniu 60 pg/ml krwi.