PL169984B1

PL169984B1 - Method of obtaining an agent inducing incubation of nematodes causing a potato disease

Info

Publication number: PL169984B1
Application number: PL92302047A
Authority: PL
Inventors: Johan G Mulder; Pieter Diepenhorst; Pieter Plieger; Ingrid E M Bruggemann-Rotgans
Original assignee: Bvchemische Pharmaceutische Industrie "Luxan"; Chemische Pharmaceutische Ind
Priority date: 1991-07-18
Filing date: 1992-07-10
Publication date: 1996-09-30
Also published as: LV10160A; EP0596033A1; LV10160B; WO1993002083A1; CA2113626C; IE922283A1; NL9101266A; LTIP113A; JPH07505118A; BR9206287A; EE03072B1; US5585505A; TR25995A; CA2113626A1

Abstract

1. Sposób wytwarzania srodka wywolujacego wyleganie sie nicieni powodujacych chorobe ziemniaka z ich cyst, znamienny tym, ze z krazacej wody zasilajacej hodowle pomidorów lub ziemniaków wyodrebnia sie substancje czynna stanowiaca zwiazek o wzorze strukturalnym jego sól lub ester jako co najmniej jedna z substancji czynnych i miesza sie ja ze stalym nosnikiem lub rozpuszcza w cieklym nosniku oraz ewentualnie dodaje substancje pomocnicze i inna substancje czynna PL PL PL

Description

Celem wynalazku jest opracowanie sposobu wytwarzania środka wywołującego wykluwanie się nicieni powodujących chorobę ziemniaka z ich cyst.

Według wynalazku sposób wytwarzania środka wywołującego wylęganie się nicieni powodujących chorobę ziemniaka z ich cyst polega na tym, że z krążącej wody zasilającej hodowlę pomidorów lub ziemniaków wyodrębnia się substancję czynną stanowiącą związek o

jego sól lub ester jako co najmniej jednąz substancji czynnych i miesza sięjąze stałym nośnikiem lub rozpuszcza w ciekłym nośniku oraz ewentualnie dodaje substancje pomocnicze i inną substancję czynną.

169 984

Korzystnie wyodrębnia się związek, jego sól lub ester o czystości co najmniej 99% wagowych.

Korzystnie substancję czynną wyodrębnia się z krążącej wody zasilającej przez jej adsorpcję w kolumnie chromatograficznej i następnie eluuje się ją z tej kolumny.

Korzystnie stosuje się kolumnę chromatograficzną złożoną z sefarozy. Korzystnie eluuje się substancję czynną z kolumny roztworem wodnym.

Do środka wytworzonego sposobem według wynalazku można dodawać inną substancję czynną, zwłaszcza będącą środkiem do dezynfekcji gleby, wybranym z grupy obejmującej sól sodową metamu i 1,3-dichloropropen.

Środek wytwarzany sposobem według wynalazku, wywołujący wylęganie się nicieni powodujących chorobę ziemniaka z ich cyst zawiera stały lub ciekły nośnik i ewentualnie substancje pomocnicze, a jako substancję czynną zawiera związek o wzorze sumarycznym C27H30O9, o wzorze strukturalnym przedstawionym wyżej, bądź jego sól lub ester, wyizolowany z krążącej wody zasilającej hodowlę sadzonek pomidorów i ziemniaków, i ewentualnie inną substancję czynną, zwłaszcza dezynfekująca glebę, takąjak sól sodowa metamu i/lub 1,3 -dichloropropen.

Po przeprowadzeniu obszernych i skomplikowanych badań stwierdzono, że opisany wyżej związek powoduje wykluwanie się nicienia cystowego ziemniaka. Zgodnie z nomenklaturą związek ten stanowi kwas trans-2-(2.13-dihydroksy-9-metoksy-7,7-16-trimetylo-5,10,20-triokso-19-oksaheksacyklo-[9.7.0.1³’⁶.0³’⁸.112 .0^12,16]ejkoza-1(11 ),8-dien- 15-ylo)cyklo-propanokarboksylowy.

Dane spektralne czystego związku podano w przykładzie.

Związek wywołujący wykluwanie jest nielotnym związkiem dobrze rozpuszczającym się w wodzie, metanolu, eterze dietylowym, octanie etylu i innych podobnych polarnych rozpuszczalnikach, ale nie rozpuszczającym się w heksanie, dichlorometanie, chloroformie itp.

Jest on nietrwały przy pH poniżej 2 i powyżej 7, oraz w temperaturach powyżej około 35°C.

Związek wywołujący wykluwanie można wydzielić z hydrokultury albo z hodowli tkanek lub komórek części roślin wchodzących w skład rodziny psiankowatych (Solanaceas), w szczególności z korzeni ziemniaków i pomidorów, w obecności odpowiedniej pożywki.

Odpowiedni sposób wytwarzania związku wywołującego wykluwanie wymienionych nicieni polega na tym, że prowadzi się hydrokulturę roślin odpowiedniej odmiany Solanaceae albo hodowlę zawiesiny komórek z tkanek takich roślin.

Związek wywołujący wykluwanie, stanowiący substancję czynną środka wytworzonego sposobem według wynalazku można również uzyskać z krążącej wody zasilającej hodowlę sadzonek roślin z rodziny Solanaceae, w szczególności pomidorów. Nieoczekiwanie stwierdzono, że obiegowa woda zasilająca stosowana w uprawie w szklarniach sadzonek pomidorów, zazwyczaj na wełnie mineralnej, zawiera znaczne ilości środka wywołującego wykluwanie.

Związek wywołujący wykluwanie stanowiący substancję czynną środka wytworzonego sposobem według wynalazku uzyskać można również np. prowadząc hodowlę zawiesiny komórek z tkanek odpowiednich gatunków z grupy Solanaceae. Wykorzystując odpowiedni ośrodek hodowli, np. taki jak opisano niżej, z takiej zawiesiny komórek uzyskuje się roztwór związku wywołującego wykluwanie. Materiał wyjściowy stanowić może wydzielina komórkowa, z tym, że wykorzystać można także ekstrakt lub homogenizat odpowiednich komórek. Komórki pobiera się np. z tkanki odpowiednich roślin z rodziny psiankowatych zdolnych do wywoływania wykluwania się nicieni. Szczególne znaczenie mająuprawiane odmiany gatunków Solanum tuberosum L., np. odmiana Mentor. Można stosować komórki jako takie, albo komórki zmodyfikowane genetycznie, np. komórki, do których wprowadzono określoną informację genetyczną z wykorzystaniem Agrobacterium tumefaciens. Można także wykorzystywać uprawy pędów lub uprawy korzeni zamiast hodowli zawiesiny komórek. W takich przypadkach obowiązują takie same rozważania, które dotyczą hodowli zawiesiny komórek.

169 984

Pożywki, które można wykorzystać do wytwarzania tego związku wywołującego wykluwanie z hodowli komórek, zawierają zazwyczaj:

- składniki podstawowe (sole, elementy spory),

- źródło węglowodanów (często sacharozę, choć można stosować również jeden lub więcej innych węglowodanów);

- witaminy (pakiety witamin są dostępne w handlu w postaci standardowych preparatów i można je wykorzystać bezpośrednio);

- hormony (często stosowana jest kombinacja cytokininy z auksynami, z dodatkiem lub bez kwasu giberelinowego i kwasu abscysynowego; jednakże skład i stężenie można zmieniać w zależności od rodzaju komórek).

Odpowiednia kombinacja składników substratu zawiera:

- składniki podstawowe + witaminy:

według Murshige i Skoog (Physiol. Plant 15, 473-497 (1962)).

- źródło węglowodanów: roztwór sacharozy, np. 30 g/litr

- Hormony:

a. W przypadku hodowli zawiesinowej komórek nie modyfikowanych genetycznie dodawać można 5 mg/litr kwasu naftylooctowego.

b. W przypadku uprawy korzeniowej nie modyfikowanej genetycznie dodawać można 0,2 mg/litr kwasu giberelinowego i 0,05 mg/litr kwasu naftylooctowego.

c. W przypadku hodowli opartych na komórkach transformowanych genetycznie (zawiesina komórek, uprawa pędów i korzeni), hormony nie zawsze stosuje się.

Oczywiście powyższe składniki substratu stanowią jedynie przykłady składników, które można zastosować, ale bez wątpienia istotne znaczenie ma, jeśli zastosuje się właśnie takie składniki. Specjalista może opracować inne kombinacje i kompozycje zapewniające wydajne wytwarzanie środka wywołującego wykluwanie w oparciu o wiedzę ogólną.

W zależności od charakteru hodowli, różne sposoby obróbki wykorzystać można do wydzielania związku wywołującego wykluwanie z ośrodka hodowli lub z komórek. Odpowiedni sposób wydzielania związku wywołującego wykluwanie z komórek i ośrodka pozakomórkowego może obejmować następujące etapy:

1. homogenizację całej masy komórkowej;

2. ekstrakcję lub wytrącanie w celu usunięcia białek i szczątków komórek;

3. w razie potrzeby sączenie ciekłej fazy zawierającej środek wywołujący wykluwanie oraz rozcieńczanie lub zatężanie jej w celu uzyskania wymaganego stężenia;

4. oczyszczanie ciekłej fazy, z wykorzystaniem oczyszczania metodą preparatywnej chromatografii.

Odpowiednie chromatograficzne metody oczyszczania stosowane do wydzielania związku wywołującego wykluwanie mogąwykorzystywaćjednąlub więcej znastępującychjego właściwości:

- rozpuszczalność w metanolu

- różnice we współczynniku rozdziału między układami woda-metanol i woda/chloroform

- ładunek w preparalywnej/analitycz.nej chromatografii z wykorzystaniem sefarozy

- hydrofobowość w chromatografii z odwróceniem fazowym

- stosunek ładunku do hydrofobowości w chromatografii z wykluczeniem jonowym.

Jak wspomniano wyżej, związek wywołujący wykluwanie jest związkiem nielotnym. Z uwagi na jego małą lotność roztwory zawierające ten związek można skutecznie zatężać technikami próżniowymi takimi jak zastosowanie obrotowej wyparki cienkowarstwowej i/lub suszenie sublimacyjne.

Związek wywołujący wykluwanie uzyskać można i stosować w postaci czystej, to znaczy o czystości co najmniej 99% wag. Jednakże w przypadku stosowania czystość taka nie musi być konieczna, tak że można go wytwarzać i stosować 'w postaci częściowo oczyszczonej, np. uzyskanej w wyniku eluowania z adsorbentu, na którym związek wywołujący wykluwanie został zaadsorbowany. Jest to szczególnie przydatne wówczas gdy związek wywołujący wykluwanie

169 984 uzyskuje się z uprawy ziemniakówprzemysłowych napodłożu wszklarni. Stwierdzono, że wodazasilająca stosowana w takiej uprawie, cyrkUlowana przez szklarnie i uzupełniana w razie potrzeby świeżą wodą, zawiera znaczne ilości związku wywołującego wykluwanie. Można np. usuwać ten związek w sposób ciągły lub periodycznie z wody obiegowej, np. na drodze adsorpcji lub absorpcji. W wyniku eluowana, uzyskuje się zatężony środek wywołujący wykluwanie w roztworze w wodzie jako nośniku.

Środek wywołujący wykluwanie można stosować bezpośrednio, to znaczy w postaci kwasu, jako sól, np. sól sodową lub potasową, jako ester z odpowiednim związkiem lub jako pochodną podstawiony związek itp.

Środek wywołujący wykluwanie wprowadzać można do gleby bezpośrednio albo w postaci preparatu z odpowiednim nośnikiem takim jak woda lub roztwór wodny. Można także stosować stały nośnik.

W celu uzyskania przedłużonego działania korzystne mogą być preparaty o regulowanym uwalnianiu środka. Dobrze znane są odpowiednie preparaty z regulowanym uwalnianiem, np. takie, które można stosować jako składniki dodawane do gleby.

Środki wywołujące wykluwanie w postaci oczyszczonej lub częściowo oczyszczonej są aktywne w roztworach wodnych lub w postaci stałej (ewentualnie w preparatach) w stężeniach w zakresie od 0,001 do 1000 mg/kg gleby, przy czym optymalne stężenie wynosi 1-100 mg/kg gleby.

W celu uzyskania najlepszych wyników roztwór lub środek stały, ewentualnie w postaci preparatu, powinno się wprowadzać lub wtryskiwać do gleby na głębokość korzystnie około 10 -20 cm. Na glebach podmokłych wykluwa się więcej larw CNZ niż na glebach innych, a ponadto znacznie więcej niż w przypadku wykluwania samorzutnego.

Nieoczekiwanie stwierdzono, że aktywność związku wywołującego wykluwanie zarówno w postaci czystej jak i w postaci zanieczyszczonego preparatu z hydrokultury, hodowli komórek ,lub hodowli tkanek, można znacznie zwiększyć stosując go w kwaśnej kompozycji, np. w kombinacji z kwasem askorbinowym.

Preparaty środka wywołującego wykluwanie można zbadać pod względem aktywności w wywoływaniu wykluwania się larw z jajeczek.

W tym celu cysty oczyszcza się fragmentów korzeni i/lub brudu, po czym przesiewa się przez sita 0,5 mm i 0,25 mm. Zebrano 32 mg frakcji > 0,25 i 22,5 mg frakcji 0,25 - 0,5 mm. Łącznie stanowiło to około 1200 cyst. Badany stały środek rozpuszczono w wodzie wodociągowej do uzyskania stężenia substancji wyjściowej 125 mg/litr. Z tego roztworu podstawowego wykonano rozcieńczenia 10- i 100-krotne.

Zawiesinę jajeczek wprowadzono w 70 ml wody wodociągowej przeniesiono do cylindra miarowego i napowietrzono za pomocą pompki akwaryjnej.

ml roztworu środka wywołującego wykluwanie i 0,5 ml zawiesiny jajeczek odpipetowano do probówek polistyrenowych, po czym odcięto dopływ powietrza. W próbie kontrolnej odpipetowano 0,5 ml zawiesiny jajeczek do 5 ml wody. Probówki przechowywano w 20°C mieszając ich zawartość przez obracanie.

Jajeczka i pozostałe gąsienice zliczano w dniu t = 0 dni, a gąsienice zliczano w dniach t = 4, 5 i i/lub 6 dni. W tym celu probówkę najpierw energicznie wytrząsano ręcznie przez 4 s, a następnie za pomocą mieszarki Vortex przez kolejne 10 s. Po uspokojeniu się zawiesiny z probówki odpipetowano 0,5 ml klarownego płynu z poziomu 1 cm poniżej powierzchni cieczy. Próbkę umieszczono na szalce do zliczania i rozcieńczono wodą wodociągową tak, aby warstewka wody przykryła całe dno. Jajeczka i gąsienice zliczano pod szkłem powiększającym.

Wyliczeń dokonuje się w następujący sposób:

Aktywność absolutna:

A I gąsienice _tsee-gąaeentce1₌₀ ⁿ [ jajeczka_t=0 x 100%

An = aktywność badanej próbki

169 984

Reakcję wolnych jajeczek w obecności środka wywołującego wykluwane opisać można wykorzystując kinetykę Monoda dla wzrostu drobnoustrojów z niekonkurującym inhibitowdiucln podłoża.

Przykład. Około 700 roślin ziemniaka (odmiany Mentor) uprawiano w hydrokuiturach stosując obiegowy roztwór zasilający zawierający azotan potasowy, azotan wapniowy, dwuwodorofosforan potasowy, siarczan amonowy, siarczan magnezowy, siarczan żelaza (II), siarczan manganu (II), siarczan cynku, siarczan miedzi (II) i boran sodowy. Zawartość fosforanu i azotanu w roztworze zasilającym oznaczano i w razie potrzeby odpowiednio nastawiano. Utrzymywano pH poniżej 4,2 dodając w razie potrzeby roztwór 6% kwasu azotowego i 4,25% kwasu fosforowego.

Przepuszczając obiegowy roztwór zasilający przez kolumnę zawierającą Amberlite XAD2 zaabsorbowano w kolumnie związek wywołujący wykluwanie.

Przy wymianie roztworu zasilającego kolumnę z XAD-2 odłączono i przemyto wodą destylowaną aż do uzyskania przewodnictwa poniżej 7 x 10⁶ S. Zaadsorbowany materiał zdesorbowano z XAD-2 stosując kolejno eluowanie 60% metanolem w wodzie i metanolem. Eluat ztężono, wysuszono w próżniowej wyparce rotacyjnej i suszono sublimacyjnie.

Uzyskany preparat środka wywołującego wykluwanie oczyszczano w kilku etapach opartych na:

- różnicy w rozpuszczalności w metanolu i wodzie;

- współczynniku rozdziału w ekstrakcji przeciwprądowej;

- ładunku w preparatywnej /analitycznej chromatografii z wykorzystaniem sefarozy

- hydrofobowości w chromatografii z odwróceniem fazowym

- stosunku ładunku do hydrofobowości w chromatografii z wykluczeniem jonowym.

W tym celu preparat rozpuszczono w metanolu i wytrząsano aż do uzyskania jednorodnej mieszaniny. Po odwirowaniu klarowną ciecz znad osadu usunięto za pomocą pipety, po czym zatężono i wysuszono w próżniowej wyparce rotacyjnej i suszono sublimacyjnie.

Układ przewodów kroplowego chromatografu przeciwprądowego (DCCC) wypełniono górną warstwę mieszaniny chloroformu, metanolu i wody (35 : 65 : 50). Preparat środka wywołującego wykluwanie rozpuszczono w górnej warstwie mieszaniny i wprowadzono do kolumny. Środek wywołujący wykluwanie eluowano z dna kolumny podaną mieszaninązbierając frakcje. Aktywność zebranych frakcji fazy ruchomej i fazy stacjonarnej oznaczano odrębnie.

Następnie frakcje rozfrakcjonowano na wymieniaczu anionowym, takim jak Q Sepharose HP. W tym celu środek wywołujący wykluwanie rozpuszczono i wprowadzono do kolumny w buforze (np. 5 mM piperazynie/kwasie octowym o pH 6,0), po czym przeprowadzono gradientowe eluowanie innym buforem (np. 5 mM piperazyny +lM octan sodowy, pH 6,0), po pozostawieniu nie związanego materiału w kolumnie. Eluat zebrano w postaci frakcji, które zbadano.

Połączone frakcje aktywne z wymieniacza anionowego rozfrakcjonowano w preparatywej kolumnie Rsil Cl 8 (250 x 25 mm) stosując gradientowe eluowanie. Aktywne frakcje połączono, zatężono i suszono sublimacyjnie. Materiał ten rozpuszczono w 1 mM HCl i frakcjonowano w kolumnie HPX-87H. Frakcje aktywne połączono i eluowano z dwóch kolumn Bakerbond C18 połączonych szeregowo. Uzyskano w ten sposób 245 ąg czystego środka wywołującego wykluwanie, który wykrystalizował z przesyconego roztworu. Uzyskany związek wywołujący wykluwanie poddano różnym analizom w celu ustalenia jego budowy chemicznej. Na ich podstawie ustalono następującą budowę związku wywołującego wykluwanie.

OCH

O

COOH

169 984

Związek wywołujący wykluwanie wykazuje wielkość Km określoną zgodnie z kinetyką Monoda około 10⁸ g/litr. W oparciu o tą wielkość zawartość środka wywołującego wykluwanie w nieoczyszczonych roztworach można wyliczyć z równania:

10'⁸

Zawartość środka wywołującego wykluwanie = 1— ^x 100% gdzie Km oznacza stężenie, przy którym zaobserwowano połowę maksymalnego wykluwania pod wpływem środka.

Analiza spektralna związku wywołującego wykluwanie

Spektroskopia masowa

Analizę oczyszczonego związku wywołującego wykluwanie wykonano w spektrometrach masowych Finnegan MAT-95Q, Finnegan MAT TSQ 700 MS/MS i Finnegan MAT Laser TOF.

Widmo masowe materiału w formie kwasowej wykazuje jon cząsteczkowy o ciężarze cząsteczkowym 498 oraz szereg fragmentów o stosunku masy do ładunku 480, 470 i 450 Daltonów. W widmie masowym soli sodowej z natryskiem elektronów i desorpcją laserową uzyskano stosunek masy do ładunku 521 Daltonów

Protonowe NMR

Związek wywołujący wykluwanie rozpuszczono w 0,5 ml D2O i umieszczono w spektrometrze Varian-400. Czas przeszukiwania wynosił około 15 godzin (4720 przejść). Wykonano również widmo porównawczej próbki kontrolnej.

W protonowym widmie NMR w D2O w 5°C zaobserwowano następujące przesunięcia i sprzężenia, stosując spektrometr Varian-Unity 400 MHz oraz jako zewnętrzny wzorzec sól sodową kwasu 3-(metylosililo)propionowego-c4, 0,0 ppm. Próbkę zastosowano w postaci soli sodowej.

Położenie węgla	Przesunięcie (ppm)	Sprzężenie (Hz)
2	4,09
4	2,61	17,90(4')
4'	2,61
6	4,04	-
7 (Me)	1,20	-
	1,21	-
9 (OME)	3,26	-
13	4,32	7,68(14), 2,7^4(14')
14	2,18	7,74(13), 1^,,^-7(14')
14'	2,04	12,60(14), 3,02(13)
16 (Me)	1,34	-
17	1,95	4,94(18'), 14,47(17')
17'	1,43	5,21 (18), 13,57(17') + ? (18')
18	2,48	5,21 (17'), 20,43(18')
18'	2,58	widmo niejasne
Pierścień cyklopropanu
1	1,78	multiplet
2	1,50	multiplet
3	0,85	dublet
3'	0,84	dublet dubletów

Analiza w podczerwieni

Czysty środek wywołujący wykluwanie rozpuszczono w metanolu i przeniesiono do mikrokubka wypełnionego KBr. Po ostrożnym odparowaniu wykonano widmo. Jako ślepąpróbę wykonano w taki sam sposób widmo czystego metanolu. Widma wykonano w spektrometrze Bruker IFS-85 FTIR z detektorem DTGS, rozdzielczość optyczna 4 cm’¹, ilość przebiegów

169 984

128/256. Widmo przekształcono z wykorzystaniem transformacji Kubelli-Munka. Pasma absorpcji można zidentyfikować następująco:

Liczba falowa (cm’¹)

3379

2949/1470

2838

1765

1660

Złożone pasma przy 1200-1100

Grupa funkcyjna

OH, w tym woda

-CH?, i/lub CH₂ w pierścieniu 5 -OCII3 >CO w erścieni u 4

C=C

Różne alifatyczne eterowe atomy tlenu

UV

Widmo UV związku wywołującego wykluwanie charakteryzuje się maksimum absorpcji przy 267 nm oraz przy około 200 nm. Stosunek ekstynkcji dla czystego środka wywołującego wykluwanie przy 225 nm i 267 nm wynosi około 1,5. Współczynnik ekstynkcji przy 267 nm wynosi 4550 ± 1250 litr.mol’1.cm’1. Taka absorpcja sugeruje obecność sprzężonego układu wiązań C=C i/lub O=O, co odpowiada budowie środka wywołującego wykluwanie według wynalazku.

Dyfrakcyjna analiza rentgenowska

Kryształ analizowano w dyfraktometrze Enraf-Nonius CAD-4 z promieniowaniem CuKa monochromatyzowanym za pomocą grafitu i przeszukiwaniu przy ω - 2θ. Łącznie zmierzono 10551 odbić w zakresie-13 <h< 13,-25 <k <0, -14 < 1 < 14,pzzyzzymeedoos (Łowy zestaw obejmował 5257 odbić. Spośród nich 3721 wykazywało poziom ufności 2,5 σ(Ι). Maksymalna wartość (sin^k wynosiła 0,61 A’1 Dwa odbicia odniesienia (0,21,200) mierzono co godzinę stwierdzając, że w czasie zbierania pomiarów trwających 116 godzin nastąpił ich spadek o 9%, tak że wprowadzono odpowiednią korektę. Parametry celki elementarnej wyznaczono z wykorzystaniem procedury dopasowywania metodą najmniej szych kwadratów, wykorzystując 23 odbicia przy 74 < 20 < 84°. Dokonano korekty uwzględniając efekt Lorentza i polaryzację. Strukturę wyznaczano za pomocą programu CRUNCH wykorzystującego matryce Karle'a Hauptmanado wyznaczania faz. W przeprowadzonej następnie syntezie AF stwierdzono obecność cząsteczek wody. W wyniku anizotropowego blokowo-diagonalnego dopasowywania względem F metodą najmniejszych kwadratów uzyskano R = 0,126, R_w = 0,171, (Δ/σ)_ηκιχ = 0,85. Dokładność pasowania S = 0,548. Wykorzystano schemat ważony w = (3,0 + Fobs + 0,111 *F0b_S ⁵)’¹. Dokonano empirycznej korekty absorpcji (DIFABS, Walker i Stuart, 1983), ze współczynnikami w zakresie 0,23 - 1,43. Współczynniki rozproszenia wzięto z pracy Cromera i Manna (1968); International Tables for X-ray Crystallography (1974). Wszystkie wyliczenia przeprowadzano w oparciu o XTAL (Hall i Stewart, 1990), o ile nie zaznaczono tego inaczej. Schemat numerowania atomów przedstawiono na rysunku.

Claims

1. Sposób wytwarzania środka wywołującego wylęganie się nicieni powodujących chorobę ziemniaka z ich cyst, znamienny tym, że z krążącej wody zasilającej hodowlę pomidorów lub ziemniaków wyodrębnia się substancję czynną stanowiącą związek o wzorze strukturalnym

PL 169984 Β1 jego sól lub ester jako co najmniej jedną z substancji czynnych i miesza się ją ze stałym nośnikiem lub rozpuszcza w ciekłym nośniku oraz ewentualnie dodaje substancje pomocnicze i inną substancję czynną

Sposób wytwarzania środka wywołującego wylęganie się nicieni powodujących chorobę ziemniaka z ich cyst

Zastrzeżenia patentowe

1. SposóbwyóbEwytWaśradkawywoWjącego wylęgwie gia nicienijcwo dującychchorobę ziemniaka z irO cyst, znamienny tym, że z krcżcrej wody zasilającej hodowlę pomidorów lob ziemniaków wyodrębnia się substancję czynną stanowiącą związek o wzorze strukturalnym jego sól lob ester jako co najmniej jedną/ substancji czynnych i miesza się jąze stałym nośnikiem lob rozpuszcza w ciekłom nośniku oraz ewentoalnie dodaj e sobstancj e pomocnicze i innąsobstancj ę czynną.

2. Sposób wedłog zastrz. 1, znamienny tym, że woodrębnia się związek o wzorze jego sól lob ester o czostości co najmniej 99% wagowocO.

'

3. Sposób wedłog zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że sobstancję czynną 'woodrębnia się z krążącej wodo zasilającej przez jej adsorpcję w kolomnie chromatograficznej i następnie elooje się ją z tej kolomno.

4. Sposób wedłog zastrz. 3, znamienny tym, że stosoje się kolomnę chromatograficzną złożoną z sefarozo.

5. Sposób wedłog zastrz. 4, znamienny tym, że sobstancję czynną elooje się z kolomno roztworem wodnom.

6. Sposób wyCłhg zastrz. 1 albo 2, albo 4, albo 5, znamienny tym, że dodaje się innąsobstancję czynną, zwłaszcza będącą środkiem do dezynfekcji glebo wobranom z grupo obejmojącej metyloditiokarbaminian sodowo (sól sodowa metamo) i 1,3 dicOlyropropyn.

* * *

Przedmiotem wonalazko jest sposób wytwarzania środka wywołującego wolęganie się nicieni powoCojącoch chorobę ziemniaka i ich cyst.

Choroba ziemniaka, to znaczy atakowania roślin ziemniaka przez cystowy nicień ziemniaka (CNZ) stanowi poważno problem. W szczególności przo prodokcji ziemniaków przemysłowych, która często obejmoje intensywną. oprawę, atak ten powodowe znaczne strato prodhkcojne. Atak taki może również wystąpić przy oprawie sadzeniaków' i ziemniaków konshmpryjnoch.

Roślina ziemniaka stanowi roślinę-gospodarza dla organizmów wywołujących chorobę ziemniaka, będących nicieniami obecnie określanymi nazwami Globodera rostochiensis i Glo169 984 bodera pallida, przy czym znane są ich różne patologiczne typy. Nicienie te przebywają na polu w czasie, gdy nie ma na nim ziemniaków, to znaczy od jesieni do wiosny, albo dłużej, jeśli brak jest rosnących zieinhiaków lub in^iyhj. LOŚHii-oupoddrzyy'₃

W pOSac-Ci Cyst SWObodle© SpOCy/wających w ziemi. Cysty te stanowią w rzeczywistości wypełnione jajeczkami utwardzone odwłoki żeńskich nicieni z poprzedniej generacji. Na wiosnę, gdy ziemniak rośnie, roślina wydziela czynniki wywołujące wzrost, które wywabiają larwy nicieni zjajeczek poprzez ściankę cysty do rośliny.

Dotychczas środki zaradcze i ewentualne zwalczanie nicieni obejmowało stosowanie intensywnego jdodozmianu, odpowiednia, higienę rolną, zastosowanie odpornych odmian oraz dezynfekcję gleby.

W związku z tym, że zyski z hektara w uprawie ziemniaków są korzystniejsze niż w przypadku innych upraw, intensywny płodozmian jest mało atrakcyjny i jeśli jest to możliwe, wykorzystuje się inne środki.

Spośród takich innych środków powszechnie wykorzystywano dotychczas jedynie dezynfekcję gleby. Jako podstawowe środki dezynfekujące stosowano dotychczas 1 ,3-dichloropronen i metyloditiokarbaminian sodowy (sól sodowąmetamu). Z uwagi na znaczne ilości stosowanych środków dezynfekujących oraz ich właściwości chemiczne, fizyczne i toksykologiczne, istnieje tendencja do ograniczania zakresu ich stosowania. Jako najważniejszy powód takiego ograniczania wymienia się zagrożenie dla środowiska.

W przeszłości prowadzono obszerne prace nad środkami, które mogłyby sztucznie wywołać wykluwanie się nicieni, bowiem gdyby można było wprowadzić do gleby, po okresie uprawy środek, który wywołuje wykluwanie się CNZ, stanowiłoby to skuteczny sposób biologicznego zwalczania tych organizmów. W związku z tym, że w takiej sytuacji nicienie nie miałyby źródła pożywienia, padłyby one, tak że można by było uprawiać następnie ziemniaki przy mniejszym prawdopodobieństwie uszkodzeń spowodowanych chorobą ziemniaka. Jeszcze lepszy efekt można by osiągnąć przy połączeniu takiego środka z niewielką dawką chemicznego środka przeciw szkodnikom.

W związku z tym, że w przeszłości zwalczanie chemiczne okazało się skuteczne, badania nad lnetodąbiologicznąprzerwdnp bez osiągnięciajakichkolwiek rezultatów. Badania te opisano w różnych publikacj ach, między innymi w Nematologica 31,nr2(1985), 159-170. W pracy tej wspomniano o zastosowaniu dyfuzatu z korzeni ziemniaka do wykluwania cyst.

W opisie europejskiego zgłoszenia patentowego nr 434417 opisano sposób wytwarzania substancji zdolnej do stymulowania wykluwania się jajeczek cystowych nicieni powodujących chorobę ziemniaka z komórek korzeni roślin z grupy Solanaceae.