NL9101266A - Wekstof voor het aardappelcyste-aaltje. - Google Patents

Description

Wékstof voor het aardarroelcvste-aalti e.

De onderhavige uitvinding heeft betrekking op een wekstof voor het aardappelcyste-aaltje, alsmede op een werkwijze voor het bereiden van een dergelijke wekstof en op een werkwijze voor het bestrijden van aardappelmoeheid.

Aardappelmoeheid, dat wil zeggen de aantasting van de aardappelplant door het aardappelcyste aaltje (ACA) is een groot probleem. Met name voor de productie van fabrieksaardappelen welke veelal geschiedt via intensieve aardappelteelt, treedt door deze aantasting een productieverlies op.

De aardappelplant treedt op als waardplant voor de veroorzaker van de aardappelmoeheids ziekte: nematoden, momenteel bekend onder de namen Globodera rostochiensis en Globodera pallida. waarvan diverse pathotypes bekend zijn. Deze nematoden overbruggen de tijd waarin geen aardappelen op het veld staan , d.w.z. van de herfst tot het voorjaar, in vrij in de grond voorkomende cysten. Deze cysten zijn in feite de met eieren gevulde verharde achterlijven van vrouwtjes nematoden van een vorige generatie. In het voorjaar, bij de groei van de aardappelplant, wordt door de plant een wekstof afgescheiden, die de larven van de nematoden in de cysten naar de plant toe lokt.

Preventieve maatregelen en eventuele bestrijding hebben tot op heden in hoofdzaak bestaan uit ruime vruchtwisseling (wisselbouw), bedrijfshygiënische maatregelen, gébruik van resistente rassen en grondontsmetting.

Doordat de opbrengst per hectare voor aardappels aanzienlijk gunstiger ligt dan voor andere vruchten, is ruime vruchtwisseling weinig aantrekkelijk en kiest men, zo mogelijk, liever voor andere maatregelen.

Van de andere maatregelen heeft echter alleen grondontsmetting ruime toepassing gevonden. Hiertoe gébruikt men hoofdzakelijk dichloorpropeen en metarn-natrium. Gezien de aanzienlijke hoeveelheden ontsmettingsmiddel die toegepast worden, en de chemische, fysische en toxicologische eigenschappen van deze middelen, bestaat er een tendens om het gebruik van deze middelen terug te dringen. De belangrijkste reden hiervoor is, dat deze middelen gezien worden als een bedreiging voor het milieu.

In het verleden is reeds gezocht naar middelen om het opwekken van de nematoden kunstmatig te bewerkstelligen. Als men namelijk in staat is een stof op het onbebouwde land te brengen, die het ACA opwekt, heeft men mogelijk een effectieve biologische bestrijdingsmethode. Omdat de aaltjes namelijk in een dergelijke situatie geen voedingsbron hebben, sterven deze af, en kan men daarna aardappels telen met minder kans op schade door aardappelmoeheid. Door een combinatie van een dergelijke stof met een geringe dosering van een chemisch bestrijdingsmiddel zou een goed effect verkregen kunnen worden.

Doordat in die tijd de chemische bestrijdingsmethode meer veelbelovend leek, is het onderzoek naar deze biologische bestrijdingsmethode gestaakt, zonder dat er resultaten geboekt waren. Een publicatie omtrent deze onderzoekingen is ondermeer gedaan in Nematologica, 31, No.2 (1985), pag 159-170. Hierin is de toepassing van aardappelwortel diffusaat voor het wékken van de cysten vermeld.

De uitvinding heeft betrekking op een stof voor het wekken van de soorten en pathotypen van de nematoden die de ziekte aardappelmoéheid veroorzaken, welke nematoden onder meer Globodera rostochiensis en Globodera oallida omvatten, uit de cysten ervan, welke stof gekenmerkt wordt, doordat deze verkrijgbaar is uit een weefsel- of celcultuur van plantedelen van nachtschade-achtigen (Solanaceae), meer in het bijzonder uit aardappelwortels, in aanwezigheid van een geschikte voedingsbron

Een bijzonder geschikte methode voor het verkrijgen van een wekstof voor de genoemde nematoden, is het kweken ervan met behulp van een celsuspensie cultuur.

De wekstof heeft in het algemeen een molecuulgewicht gelegen tussen 530 en 550, meer in het bijzonder 539 of 540 bepaald met behulp van een moleculaire zeef met oligomaltoses als referentie.

De wekstof volgens de uitvinding kan onder meer bereid worden onder toepassing van een celsuspensie culture van de weefsels van een geschikt ras van de Solanaceae. Onder toepassing van een geschikt kweekmedium, bij voorbeeld zoals verderop beschreven wordt, verkrijgt men uit een dergelijke celsuspensie een oplossing van de wekstof. Daarbij kan men uitgaan van het celexudaat, maar men kan ook gebruik maken van een extract van de cellen zelf. De cellen zijn bij voorbeeld afkomstig van weefsels van geschikte nachtschade-achtigen, die het vermogen hebben de onderhavige nematoden te wekken. Daarbij gaat het vooral om cultuurvariëteiten van de soort Solanum tüberosum. bij voorbeeld het ras Mentor. Men kan de cellen als zodanig toepassen, of genetisch gemodificeerde cellen, bij voorbeeld cellen, waarin onder toepassing van Aarobacterium tumefaciens specifieke genetische informatie is aangebracht. Het is ook mogelijk gébruik te maken van scheutcultures of van wortelcultures, in plaats van celsuspensiecultures. Ook daarbij gelden dezelfde overwegingen ten aanzien van raskeuze, als voor de celsuspensie cultures.

De media, die geschikt kunnen zijn voor de kweek van de wékstof zijn in het algemeen opgébouwd uit: basale componenten (zouten, sporenelementen) koolhydraatbron (vaak sucrose, maar het is ook mogelijk één of meer andere koolhydraten te gebruiken) vitaminen (vitaminenpakketen zijn standaard in de handel verkrijgbaar en kunnen als zodanig toegepast worden) hormonen (vaak toegepast wordt een combinatie cytokinine/auxines, al dan niet in combinatie met gibberellinezuur en abscisinezuur; samenstelling en concentratie kan echter gevarieerd worden in afhankelijkheid van het type cel)

Een mogelijke combinatie van voedingsbodem componenten bestaat uit:

Basale componenten + vitaminen

Volgens Murishige en Skoog (Physiol. Plant. 15, 473-497 (1962)).

Koolhvdraatbron sucrose oplossing, bij voorbeeld 30 g/1 Hormonen a. Bij niet genetisch gemodificeerde celsuspensiecultures kan men 5 mg/1 naftylazijnzuur toevoegen.

b. Bij niet genetisch gemodificeerde wortelcultures kan men 0,2 mg/1 gibberelinezuur en 0,05 mg/1 naftylazij nzuur toevoegen.

c. Bij cultures op basis van genetisch getransformeerde cellen (celsuspensie-, wortel-, of scheutcultures) behoeven niet altijd hormonen toegepast te worden.

Uiteraard zijn de hierboven genoemde voedingsbodem-componenten slechts voorbeelden van componenten, die men kan toepassen, maar is het geenszins essentieel, dat men juist deze toepast. De deskundige kan op basis van hetgeen bekend is hieromtrent ook andere combinaties en samenstellingen ontwikkelen, welke een goede wekstofproductie leveren.

Afhankelijk van de aard van de culture kan men verschillende opwerkingsprocedures toepassen voor het winnen van de wékstof uit de kweekvloeistof, c.q. uit de cellen. Uitgaande van het winnen van de wekstof uit de cellen en de extracellullaire media kan men 1. de totale celmassa homogeniseren, 2. een extractie of precipitatie uitvoeren om eiwitten en celdébris te verwijderen, 3. de vloeibare fase waarin zich de wekstof bevindt desgewenst filtreren, en tot de gewenste concentratie verdunnen of concentreren, en 4. deze vloeibare fase onder toepassing van een preparatieve chromatografische reinigingsmethode zuiveren.

De wekstof volgens de uitvinding is een niet-vluchtige verbinding en is goed oplosbaar in polaire oplosmiddelen, zoals water, methanol, diethylether, ethylacetaat en dergelijke. Door de geringe vluchtigheid zijn oplossingen ervan met behulp van vacuümtechnieken, zoals een roterende filmverdamper en/of vriesdrogen, goed te concentreren.

Wekstofpreparaten zijn in waterige oplossingen, of als vaste stof {al dan niet geformuleerd) aktief in een concentratie-range van 0,01 tot 1000 mg/1 oplossing of grond, waarbij het optimum ligt tussen 1 en 500 mg/1.

De oplossing c.q. vaste stof, al dan niet geformuleerd, dient door de grond te worden gemengd voor het beste resultaat. Op veengronden wordt ca. 75% en meer van de larven van het a.c.a. gewekt, wat significant verschillend is van de spontane wékking.

Wekstofpreparaten kunnen worden getoetst op aktiviteit aan de hand van wekking van larven uit eieren.

Hiertoe worden cysten geschoond van worteldelen en/of vuil en gezeefd over 0,5 mm en 0,25 mm zeven. 32 mg van de fraktie >0,5 en 22,5 mg van de fraktie 0,25 - 0,5 zijn afgewogen: Dit is samen ca. 1200 eieren. De te toetsen vaste stof wordt in kraanwater opgelost tot een concentratie die equivalent is aan 125 mg/1 oorspronkelijk uitgangsmateriaal. Van deze stock-oplossing wordt een 10- en 100-voudige verdunning gemaakt. Een standaard wekstof-oplossing van bekende herkomst (wekstof-G) wordt op dezelfde wijze bereid.

De ei suspensie wordt opgenomen in 70 ml leidingwater, overgébracht in een maatcilinder en doorborreld met lucht met behulp van een aquariumpompje.

In polystyreenbuizen wordt 5 ml wékstofoplossing gepipetteerd. Na afsluiten van de lucht wordt hieraan 0,5 ml eisuspensie toegevoegd (in drievoud). Dezelfde procedure wordt gevolgd voor de standaardoplossingen van wékstof-G. Als blanco wordt 0,5 ml eisuspensie bij 5 ml leidingwater gepipetteerd.

Hierna worden de buizen onder wentelen weggezet bij 20°C.

Eieren en overgebleven alen worden geteld op t=0 dagen en alen worden geteld op t=4, 5 en 6 dagen. Hiertoe wordt de buis eerst gedurende 4 sec. krachtig met de hand geschud en daarna gedurende 10 sec. met een Vortex mixer. Nadat de suspensie tot stilstand is gekomen, wordt op een hoogte van l cm onder het vloeistofniveau 0,5 ml uit de buis gepipetteerd. Dit monster wordt op een telschaaltje gebracht en met vers kraanwater verdund tot de waterfilm de gehele bodem bedekt. De eieren en alen worden onder een bionculair geteld.

De berekeningen worden als volgt uitgevoerd:

Absolute lokking:

A = absolute aktiviteit van het onderzochte monster, m

Relatieve lokking:

A = relatieve aktiviteit van het onderzochte monster, m, r

Α^ = absolute aktiviteit van wekstof G

Ajj Q = absolute aktiviteit van water blanco.

2

Voorbeeld

Uit wortels van aardappelplanten (van het ras mentor) in hydrocultures werd wekstof geïsoleerd door de voedingsoplossing door een kolom met XAD-2 te leiden waardoor wekstof aan XAD-2 absorbeerde. De wekstof werd van XAD-2 gedesorbeerd door achtereenvolgens te elueren met methanol. Het verkregen methanol extract werd in tegenstroom geëxtraheerd met chlorof orm/methanol/wat er.

Door extractie met methanol werd een oplossing van de wékstof verkregen. Het eluaat werd gezuiverd met behulp van Droplet Counter Current Chromatografie onder toepassing van achtereenvolgens Q-sepharose HP bij 18°C en pH 5,2, ten minste één RP-18 kolom met methanol/HCl bij pH 3, een HPX-87H kolom bij 18°C en pH 3 en ten minste één behandeling met een mini RP-18 cartridge met methanol/HCl bij pH 4. Aldus werd een fractie van de wekstof verkregen met een zuiveringsfactor ten opzichte van de ruwe wékstof van ca. 170.000 (op gewichtsbasis).

De aldus verkregen wekstof werd vervolgens geanalyseerd met behulp van massaspectrometrie, proton NMR en IR. Hieruit kon men een molecuulgewicht van 539 afleiden, evenals de aanwezigheid van de vijf op het formuleblad als formules 1-5 opgenomen structuurfragmenten.

Van deze wekstof werd de activiteit bepaald bij die concentratie van de wekstof, waarbij de helft van het maximale weksignaal verkregen wordt (gelijkenis met de Monod-kinetiék) . uit het quotiënt van de Km-waarden van de ruwe en de gezuiverde wekstof kon een zuiveringsfactor van ca. 100.000 bepaald worden.

Claims (9)

1. Wékstof voor het wékken van de soorten en pathotypen van de nematoden die de ziekte aardappelmoeheid veroorzaken, welke nematoden onder meer Globodera rostochiensis en Globodera oallida omvatten, uit de cysten ervan, welke stof verkrijgbaar is uit een weefsel- of celcultuur van plantedelen van nachtschade-achtigen (Solanaceae), meer in het bijzonder uit aardappelwortels, in aanwezigheid van een geschikte voedingsbron

2. Wekstof volgens conclusie 1, welke verkrijgbaar is door het kweken van een celsuspensie cultuur in aanwezigheid van een voedingsmedium.

3. wekstof volgens conclusie 1 of 2, waarbij de door het kweken verkregen ruwe oplossing gezuiverd wordt.

4. Wekstof volgens conclusie 1-3, waarin het molecuul-gewicht ca. 539 bedraagt.

5. Wekstof volgens conclusie 1-4, welke ten minste één van de structuurelementen van de figuren 1-5 bezit.

6. Wekstof volgens conclusie l, zoals beschreven en toegelicht in het voorbeeld en de figuren.

7. Werkwij ze voor het bereiden van een wekstof voor het wekken van de soorten en pathotypen van de nematoden die de ziekte aardappelmoeheid veroorzaken, welke nematoden onder meer Globodera rostochiensis en Globodera oallida omvatten, uit de cysten ervan, waarbij men een weefsel- of celcultuur van nachtschade-achtigen (Solanaceae) kweekt in aanwezigheid van een geschikt voedingsmedium en uit de verkregen vloeistof een wekstof wint.

8. Werkwijze volgens conclusie 7, waarbij men de verkregen wekstof zuivert.

9. Werkwijze voor het bestrijden van de soorten en pathotypen van de nematoden die de ziekte aardappelmoeheid veroorzaken, welke nematoden onder meer Globodera rostochiensis en Globodera pallida omvatten, waarbij men een wekstof volgens conclusie 1-6 op een met aardappels te bebouwen perceel brengt, eventueel in combinatie met grondontsmettingsmiddelen zoals zoals dichloorpropeen en metamnatrium.