PL123797B1 - Process for preparing novel peptides - Google Patents

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania nowych peptydów i ich pochodnych. Zwiazki te znaj¬ duja zastosowanie w medycynie ludzkiej i weteryna¬ ryjnej. Wykazuja one aktywnosc agonistów morfi¬ ny.Jak to ogólnie przyjeto, takze i w niniejszym opisie, termin „agonista morfiny" oznacza zwiazek o aktyw¬ nosci biologicznej nasladujacej aktywnosc natural¬ nego alkaloidu.Wlasciwosci farmakologiczne i zastosowanie tera¬ peutyczne morfiny sa wyczerpujaco opisane w pismien¬ nictwie, np. „The Pharmacological Basis of Thera- peutics", red. L.S. Goodman i A. Gilman, wyd. przez The AfacMillan Company, New York, wydanie trzecie (1965), zwlaszcza rozdzial 15, str. 247—266, oraz „Martindale: The Extra Pharmacopceia", red. N.W.Blacow, wyd. przez The Pharmaceutical Press, Lon¬ don, wydanie dwudzieste szóste (1972), zwlaszcza str. 1100—1106, wlaczone jako odnosniki do niniej¬ szego opisu. Jednakze, jak dobrze Wiadomo (L.S.Goodman i wsp. loc. cit., rozdzial 16) powtarzanie podawania morfiny moze doprowadzic biorce do roz¬ winiecia sie nalogu w stosunku do leku i tolerancje na jego dzialanie, oraz pojawienie sie objawów absty¬ nencji po przerwaniu podawania teku. Totez w ciagu wielu lat prowadzono badania z zamiarem uzyskania zwiazku posiadajacego widmo aktywnosci morfiny, ale pozbawionego jej cech niekorzystnych.Obecnie otrzymano nowe peptydy <* ogólnym wzorze IMP^-Gly^-r-R* oraz ich sole i sole addycyj¬ ne z kwasami wykazujace aktywnosc agonistów mor¬ finy tak w testach in vitro jak in vivo. We wzorze tym R1 oznacza atom wodoru, rodnik alkilowy o 1—4 ato¬ mach wegla lub rodnik allilowy, X* oznacza rodnik 5 L-tyrozyJowy ewentualnie podstawiony przy atomie azotu Na rodnikiem alkilowym o 1—4 atomach wegla, X4 oznacza rodnik D-metionylowy, grupe sulfotlen- ku D-metionylu lub sulfonu D-metionylu, X6 oznacza rodnik L-fenyloalanylowy, L-4-chlorowcofenyloalany- 10 Iowy, L-4-trójilu0rometylorenyloalanylowy L-4-nitro- fenyloalanylowy, L-4-metylotiofenyloalanylowy, L-4- -metylosulfoksylofenyloalanylowy lub L-4-metylosul- fonylofenyloalanylowy, X7 oznacza rodnik L-proli- lowy, D-prolilowy, L-homoprolilowy, D-homoproli- 15 Iowy, L-pipekolinylowy, D-pipekolinylowy, cykloleucy- lowy, D-leiicylowy lub D-metionylowyy R3 oznacza grupe NH2 lub -OR5, gdzie R5 oznacza atom wodoru lub rodnik alkilowy o 1—4 atomach wegla lub R* oznacza grupe zastepujaca grupe 1-karboksylowa C- 20 koncowej reszty aminokwasowej, o wzorze -CH*OR8, gdzie R8 oznacza atom wodoru lub rodnik alkanoilowy o 1-^4 atomach wegla, przy czym R3 oznacza zawsze grupe —CH2OR8 gdy X4 ma wyzej podane znaczenie, a X* oznacza rodnik L-fenylo-alanylowy i X7 oznacza 25 rodnik L-prolilowy albo gdy X4 oznacza rodnik D- -metionylowy, X6 oznacza rodnik L-fenyloalanylowy i X7 oznacza rodnik D-leucylowy lub D-metionylowy.W niniejszym opisie uzyto konwencjonalnych skró¬ tów dla aminokwasów i ich rodników, podanych np. 30 w Biochemistry, 11, 1726 (1972). W powyzszej i po- 123 797123 797 nizszej czesci opisu odnosniki dotycza L-aminokwasów i ich rodników, z wyjatkiem glicyny i innych przypad¬ ków osobno zaznaczonych.Rodnik alkilowy oznaczony symbolem R1 oraz czesc alkilowa z*daika alkanoilowego oznaczonego symbo- 5 lem RB, zawieraja 1—4 atomów wegla, korzystnie 1—2 atomów wegla, to znaczy stanowia rodnik mety¬ lowy lub etylowy.Aktywnosc soli addycyjnych peptydów o wzorze R1-X3-X4-Gly-X6-X7-R2 z kwasami zwiazana jest z 10 zasada, a kwas ma mniejsze znaczenie, aczkolwiek dla celów terapeutycznych jest korzystne, jesli jest on farmakologicznie i farmaceutycznie dozwolony dla biorcy. Do takich korzystnych kwasów naleza: a)" lewasy nieorganiczne, takie jak kwas chlorowodo- 15 rowy, bromowodorowy, fosforowy, metafosforowy, azo¬ towy i siarkowy, b) kwasy organiczne, takie jak was winowy, octowy, cytrynowy, jablkowy, mlekowy, fumarowy, benzoeso¬ wy, glikolowy, glukonowy, gulonowy, bursztynowy 20 i arylósulfonowy, np. p-toluenosulfohowy.Farmaceutycznie i farmakologicznie dopuszczalne sole addycyjne z kwasami lacznie z takimi solami, które nie sa dopuszczalne (np. sole kwasu fluorowodo¬ rowego i nadchlorowego) znajduja zastosowanie przy 25 wyodrebnianiu i oczyszczaniu zasad, a poza tym, te niedopuszczalne sole sa cenne w przypadku otrzy¬ mywania dopuszczalnych soli znanymi metodami.Tego rodzaju peptydy zawierajace liczne wolne grupy aminowe mozna otrzymac w postaci mono- i polikwa- 30 sowych soli addycyjnych lub w postaci mieszanych soli z licznymi kwasami.Podobnie w przypadku soli peptydów zawieraja¬ cych anion kwasu karboksylowego polaczony z katio¬ nem, rodzaj kationu ma mniejsze znaczenie, pomimo 35 tego, ze dla celów terapeutycznych jest on ko¬ rzystny, jesli jest farmakologicznie i farmaceutycznie dozwolony dla biorcy. Przykladami takich odpowied¬ nich kationów sa kation sodowy i potasowy.Ponizej, podano jedynie dla zilustrowania wyna- 40 lazku. i nie ograniczajac jego zakresu, wlasciwosci nowych peptydów oraz ich soli i soli addycyjnych z kwasami; jako agonistów morfiny.A) In yitto;.I. Zaharnowahie skurczów mysiego nasieniowodu 45 wywolanych przez: pobudzenie nerwu w badaniu me¬ toda Kughesali wsp. [Brain Research, 88 (1975) 296] ^przy uzyciu impulsów 0,1 Hz), przy czym hamowanie to zostaje zniesione przez znanego antagoniste substan¬ cji narkotycznych, nalokson -14-hydróksynormbrfinon).II. Oslabienie skurczów izolowanego jelita swinki morskiej .indukowanych impulsami elektrycznymi, przy czym jelito przygotowuje sie do stymulacji w sposób podany przez Patona w Brit. J. Pharmacol., 12 (1957) 55 119—127. W kazdy odcinek jelita wprowadzono ano¬ de i zawieszono z 2—3 g obciazeniem. Parametry bodzca: czestotliwosc 0,1 Hz, czas trwania 0,4 ms, napiecie (nadmaksymalne) 30—-40V, skurcz izoto- niczny. 60 B) In vivo: I. Zwiazki wykazuja dzialanie znieczulajace, np. sa oce skuteczne w stosunku do myszy w standardowym tescie „goracej plytki" w modyfikacji. N.B. Eddy'ego i wsp.; podanej w J, Pharm. Exp. Therap., 107, 385 ^ (1953), przy czym wstrzykuje sie je do komory móz¬ gowej, a ich dzialanie znoszone jest przez nalokson.Dalszym przykladem skutecznosci zwiazków jest oslabienie wicia sie myszy indukowanego kwasem octo¬ wym w tescie bedacym modyfikacja metody podanej przez Hendershota i wsp. w J. Pharm. Exp. Therap., 125 (1959), 237, przy czym zwiazki podaje sie per os, a oslabienie wicia sie jest znoszone przez nalokson.II. Zwiazki wykazuja dzialanie przeciwkaszlowe, np. w badaniu na swinkach morskich metoda Boura i wsp. podana w Brit. J. Pharmacol., 39 (1970), 225.III. Zwiazki wykazuja dzialanie przeciwbiegunkowe, np. skutecznie oslabiaja biegunke spowodowana przez olej rycynowy u szczura.Peptydy o wzorze R1-X3-X4-Gly-X6-X7-R3 oraz ich sole i sole addycyjne z kwasami poddane ocenie w stan¬ dardowych farmakologicznych sposobach postepowa¬ nia, wykazuja zdolnosc zarówno indukowania, jak i utrzymywania znieczulenia u zwierzat laboratoryjnych, takich jak szczury h myszy. Zwiazki sa pod tym wzgle¬ dem skuteczne, przy podawanym róznymi drogami, w tym pozajelitowo, np. przez iniekcje dozylna lub do komory mózgowej.Dla zilustrowania znieczulajacego dzialania zwiazków przytoczono nastepujace, nie ograniczajace zakresu wynalazku, przypadki.I. Zniesienie odruchu korzystnej postawy. Jest to charakterystyczne dla znanych czynników znieczula¬ jacych, takich jak wodzian chloralu (2,2,2-trójchloro- etanodiol-1,1), uretan (karbaminian etylu) i barbi- rutany (pochodne kwasu barbiturowego). Zwierze nie wykazujace tego odruchu nie moze przewrócic sie lub odzyskac normalnej postawy po polozeniu go na grzbie¬ cie.II. Zniesienie odruchu malzowiny usznej. W tym sposobie postepowania drut lub podobna sonde wpro¬ wadza sie do malzowiny usznej. U normalnego (kon¬ trolnego) zwierzecia powoduje to odruch drgania dotknietej malzowiny lub potrzasanie nia.III. Zniesienie normalnego odruchu rogówkowego..W tym sposobie postepowania lekko dotyka sie ro¬ gówki drutem lub podobnym przedmiotem. Normal¬ ne (kontrolne) zwierze w wyniku odruchu rogówko¬ wego mruzy powieki. Odruch ten ma kliniczne zna¬ czenie dla czlowieka, poniewaz jest jednym z psiat- nich odruchów znoszonych podczas wywolywania ogólnego znieczulenia.Kazdy z powyzej wymienionych odruchów. (I), (II) i (III) mozna odwrócic przez podanie znanego antagonisty substancji narkotycznych naloksonu (1- -N-allilo-7,8-dwuwodoro-14-hydroksynormorfinon).Tym niemniej wiadomo, ze. sama morfina nie znost u zwierzat laboratoryjnych, takich jak myszy, odruchu korzystnej postawy, gdy podana jest w duzej ilosci, az do dawek smiertelnych, w szybkim wstrzyknieciu.Sposród peptydów o wzorze R1-X3-X4-Gly-X6- -X7-R2 oraz ich soli i soli addycyjnych z kwasami, mozna wyróznic, nastepujace podklasy zwiazków, o nastepujacym znaczeniu podstawników w kazdej pod- klasie: R1 oznacza atom wodoru, X3 oznacza rodnik L-tyryzylowy, X4 oznacza rodnik D-metionylowy, grupe sulfotlenku D-metionylu lub sulfonu D-metio- nylu, korzystnie rodnik D-metionylowy lub grupe sulfotlenku D-metionylu, a zwlaszcza grupe sulfo¬ tlenku D-metionylu, X6 oznacza rodnik L-fenyloala-123 797 3 nylowy lub L-4L-nitrofenyloalanylowy, korzystnie L- -4-nitrofenyloalanylowy, X7 oznacza rodnik L-proli- Iowy lub D-prolilowy, korzystnie- L-prolilowy, oraz Ra oznacza grupe -OR5, gdzie R5 korzystnie oznacza atom wodoru, grupe NH, lub grupe -CH,OR8, gdzie R* korzystnie oznacza atom wodoru.Jako nastepna podklase mozna wymienic te pepty- dy o wzorze H-Tyr-X4-Gly-X6-X7-Ra oraz ich sole i sole addycyjne z kwasami, w których X4 oznacza rodnik D-metionylowy, grupe sulfotlenku D-metio- nylu lab sulfonu D-metionylu, X* oznacza rodnik L-fenyloalanylowy, L-4-chlorofenyloalanylowy lub L- -4-nitrofenyloalanylowy, X7 oznacza rodnik D-pro- lilowy, L-prolilowy, D-leucylowy lub cykloleucylowy, a Ra me znaczenie jak we wzorze ogólnym.Jako nastepna podklase mozna wymienic te pepty- dy o wzorze H-Tyr-X4-Gry-Phe(4NOa)-X7-R3 oraz ich sole addycyjne z kwasami, w których X4 oznacza grupe sulfotlenku D-metionylu lub sulfonu D-metio¬ nylu, X7 oznacza rodnik L-prolilowj lub D-prolilowy a R2 oznacza grupe aminowa albo grupe -CHjOH.Peptydy o wzorze BhX*rXA~Glj-X*-lF-R2 oraz ich sole i sole addycyjne z kwasami mozna wytwarzac jakakolwiek metoda wytwarzania zwiazków o analo¬ giczne) budowie. Mozna je otrzymac na drodze ko¬ lejnego sprzegania wlasciwych aminokwasów albo klasycznymi metodami syntezy peptydów, albo przy uzyciu fazy stalej, albo tez na drodze wstepnego otrzy¬ mywania podjednostek peptydowych, z nastepujacym po tym ich sprzeganiem.Reakcje tego rodzaju mozna przeprowadzic np. aktywujac grupe karboksylowa przylaczanego amino¬ kwasu i zabezpieczajac nie reagujace grupy aminowe i karboksylowe. Sa to metody standardowe w chemii peptydów. Szczególy dotyczace odpowiednich grup aktywujacych i zabezpieczajacych (blokujacych), a takze wlasciwych warunków reakcji i to tak reakcji sprzegania jak i usuwania grup zabezpieczajacych, z minimalnym stopniem racemizacji, mozna znalezc w ponizszych zródlach literaturowych, wlaczonych do niniejszego opisu jako odnosniki. Pismiennictwo to podano tu jedynie przykladowo i w zadnym stopniu nie wyczerpuje ono zagadnienia: brytyjskie opisy pa¬ tentowe nr nr 1 042 487, 1 048 086 i 1 281 383; Schoe- der i Luebke, „The Peptides", Acedemic Press, 1965; Bellean i Malek, J. Am. Chem. Soc, 90, 165 (1968); Tilak, Tetrahedron Letters, 849 (1970); Beyerman, Helv.Chim. Acta, 56, 1729 (1973); Stewart i Young, „Solid Phase Peptide Synthesis", W.H. Freeman and Co. 1969.W zaleznosci od warunków reakcji peptydy otrzy¬ muje sie w postaci wolnej zasady, wzglednie w posta¬ ci soli addycyjnej z kwasem lub soli. Sole addycyjne z kwasami mozna przeksztalcic w wolne zasady lub sole innych kwasów, a zasady w sole addycyjne z kwa¬ sami, znanymi metodpmi. Podobnie, peptydy mozna przekszttetc w ich sole, a sole przeksztalcic w pepty¬ dy lub inne^oleananymi metodami.Sposób wytwarzania peptydów o ogólnym wzorze i^OPOF-Gly^^-R* oraz ich soli i soli addycyj¬ nych z kwasami polega wfeding wynalazku na tym, ze reagent o wzorze RMP-OH, w którym R1 ma wyzej podane znaczenie a Y1 oznacza rodnik X* o wyzej podanym znaczeniu lub czesciowa sekwencje rodników odpowiadajaca wzorowi produktu i posiadajaca rod- t nik X3 na N-koncu, poddaje sie reakcji z reagentem o wzorze X-Y2, w którym Y2 oznacza grupe niezbedna do utworzenia wyzej zdefiniowanego produktu, przy czym reagenty RMfL-OH i H-Y* ewentualnie zabez* 5 piecza sie i/lub aktywuje w odpowiednim miejscu i we wlasciwy sposób, a nastepnie, jesli jest to potrzeb¬ ne, we wlasciwy sposób przeprowadza sie jedno lub oba stadia usuwania grup zabezpieczajacych z otrzy¬ manego zwiazku i ewentualnie przeksztalca sie wolna 10 zasade w sól lub sól addycyjna z kwasem.Nalezy takze podkreslic, ze mozliwe sa i inne prze* ksztalcenia in situ peptydów. I tak, peptydy, w których R3 oznacza grupe NH, mozna wytwarzac np* podda¬ jac ester alkilowy peptydu (w którym Ra oznacza grupe 15 -OR5, gdzie R5 oznacza alkil), taki jak ester metylowy, reakcji z amoniakiem. Estry peptydów mozna wytwa¬ rzac z kwasów peptydowych (Ra oznacza grupe OR5, gdzie R5 oznacza atom wodoru) zwykla metoda estry- fikacji, a estry mozna przeksztalcic w kwasy peptydowe 20 przez zmydlenie. Peptydy, w których X4 oznacza gru¬ pe sulfotlenku D-metionylu lub sulfonu D-metionylu mozna wytwarzac selektywnie utleniajac odpowiedni zwiazek, w którym X4 oznacza rodnik D-metionylowy lub grupe sulfotlenku D-metionylu. 25 Wszystkie te metody sa powszechnie znane w chemii peptydów, a szczególy dotyczace warunków reakcji oraz odpowiednich sposobów zabezpieczania i usu¬ wania grup zabezpieczajacych mozna znalezc w pis¬ miennictwie przytoczonym w powyzszej czesci opisu. 30 Poniewaz, jak uprzednio wspomniano, peptydy o wzorze R1-Xa-X4-Gly-X^X7-R2 wykazuja aktyw¬ nosc agonistów morfiny, peptydy te, a takze ich far¬ makologicznie i farmaceutycznie dopuszczalne sole i sole addycyjne z kwasami, mozna stosowac w lecze- 35 niu ssaków, w ramach zarówno ludzkiej jak i wete¬ rynaryjnej medycyny, w kazdym staniej w którym wskazany jest czynnik wywolujacy skutki podobne do wywolywanych przez morfine.Mozna wymienic nastepujace przyklady specjalnej 40 uzytecznosci tych zwiazków: ulga w bólu (analgezja), np. bólu wynikajacego ze skurczu miesni gladkich w kolce nerkowej lub zólciowej, bóUt spowodowanego przez choroby, takie jak rak, w ich koncowym stadium, bólu w okresie pooperacyjnym, bólu ^spotykanego 45 w poloznictwie; uspokojenie np. w przygotowaniu do narkozy, dzialanie kojace, wywolywanie snu, szczegól¬ nie wtedy, kiedy bezsennosc spowodowana jest przez ból lub kaszel, oraz ogólnie -* ulga w niepokoju; stlu¬ mienie kaszlu; ulga w dusznosci, np. niedomodze le- 50 wej komory lub obrzeku pluc; wywolywanie zapar- cia np. po wytworzeniu sztucznego oóftytu na jelicie kretym lub na okreznicy i przy leczeniu biegunki i czerwonki; wywolywanie pobudzenia i leczenia de* presji np. przez wywolywanie ulgi w bólu spowodo- 55 wanym choroba, taka jak rak, w jej koncowym sta¬ dium.Peptydy o wzorze R1-X»-X4-Gly*X*-X7-R* oraz ich farmakologicznie i farmaceutycznie dopuszczalne sole i sole addycyjne z kwasami mozna takze stosowac do aa wywolywania i/lub utrzymywania znieczulenia u ssa¬ ków, w ramach zarówno ludzkiej jak i weterynaryj¬ nej medycyny.Peptyd, lub jego sól, mozna podawac zarówno sam jako jedyny srodek uutciulajacy, ~albo lacznie z jedna 65 lub wiecej substancjami dopelni*jacyini i/lob uzu-123 797 7 pelniajacymi jego aktywnosc. Te dodatkowe substan¬ cje mozna podawac przed padaniem* równoczesnie z podaniem lub po podaniu peptydu lub jego Soli.W przypadku jednoczesnego podawania, rózne srod¬ ki podawac mozna tak jako oddzielne dawki, jak i w pos¬ taci srodka skojarzonego.Jedna z mozliwosci jest podawanie peptydu lub tego soli po podaniu trankwilizatorów — pochodnych benzodwuaminy, takich jak chlordiazepoksyd (4-tle- nek 7-chloro-2-metyloamino- 5 -fenylo - 3H -1,4 - benzo- dwuazepiny), dwuazepan (7-chloro-l,3-dwuwodoro-l- -metylo-5-fenylo-2H-l,4-benzodwuazepinon-2) i oksa- zepam (7-chloro-l,3-dwuwodoró-3-hydroksy-5-fenylo- -2H-l,4-benzodwuazepinon-2).Inna mozliwoscia jest podawanie peptydu lub jego soli w celu utrzymania znieczulenia wstepnie wywo¬ lanego przez uprzednie podanie innego srodka znie¬ czulajacego, np. barbituranu, takiego jak sól sodowa tiopentalu (5-etylo-5-)l-metylobutylo (-2-tiobarbituran sodowy).Szczególna uzytecznosc peptydów o wzorze R1- -X3-X4-Gly-X*-X7-R3 i ich farmakologicznie i far¬ maceutycznie dopuszczalnych soli i soli addycyjnych z kwasami przejawia sie szczególnie przy stosowaniu ich w dziedzinie znieczulania okreslonej w niniejszym opisie jako „neuroleptoanalgezja", stanie charaktery¬ zujacym sie spokojem, psychiczna obojetnoscia na bodzce otoczenia i nieczulosc na ból (patrz np. Dorland's Ilustrated Medical Dictionary, wydanie 25, wyd.W.B. Saunders, 1974, str. 1041, oraz „The Pharmacolo- gical Basis of Therapeutics*', wydanie 5, red. L.S.Goodman i A. Gilman, wyd. MacMillan Publishing Co. Inc., 1975, a zwlaszcza rozdzial 8, str. 97—101, wlaczone do niniejszego opisu jako odnosniki). Stan ten klinicysci uwazaja za pozadany, aby umozliwic przeprowadzenie postepowania takiego jak bronchos- kopia, badanie promieniami X, opatrywanie oparzen i cystoskopia, w którym korzystny jest pewien stopien wspólpracy pacjenta. W tych okolicznosciach zaakcep¬ towane zostalo uzycie ustalonych dawek zlozonych z narkotycznego srodka znieczulajacego, cytrynianu fenantylu (cytrynian N-)l-fenetylo-4-piperydylo (-pro- pionanilidu) i srodka neuroleptycznego droperidolu (l-{l-[3-(p-fluorobenzoilo)propylo] -1,2,3,6-czterowo- doro-4-pirydylo}-2-benzimidazolinon.W medycynie weterynaryjnej, w okolicznosciach, w których wymagane jest powstanie neuroleptoanal- gezji, np. w nastawianiu zlaman, zszywaniu rany i kastracji, znalazlo uznanie stosowanie dwóch rodza¬ jów ustalonych dawek, a mianowicie zlozonych z nar¬ kotycznego srodka znieczulajacego chlorowodorku etor- finy ' (chlorowodorek 4,5-a-epoksy-3-hydroksy-6*me- toksy-a,17-dwumetylo-a-propylo-6,14 -etenomorfinano- -7a(R)-karbinolu} i/albo z acepromazyny (1-{10[3- - (dwumetyloamino)propylo] - lOH-fenotiezyno -2 -ylo}- -etenon) albo z metotrimeprazyny (2-metoksy-N,N,0- -trójmetylo-lOH-fenotiazyno-10-propanoamina).Jak dotychczas, stan neuroleptoanalgezji mozna bylo osiagnac tylko przez podanie tych polaczen leków, o których wspomniano w powyzszej czesci opisu.Tak wiec nowe peptydy oraz ich dopuszczalne sole i sole addycyjne z kwasami stanowia w zastosowaniu klinicznym wazny postep i wartosciowe uzupelnienie zbioru srodków stojacych do dyspozycji lekarza i le¬ karza weterynarii, gdy same umozliwiaja uzyskanie 8 takiego wyniku, nie wymagajac podawania zadnych, dodatkowych leków.W kazdym z cytowanych powyzej przypadków ko¬ rzystnego zastosowania nowych peptydów oraz ich 5 soli i soli addycyjnych z kwasami, tak w celu wywola¬ nia i/lub utrzymania znieczulenia, np. wywolania i/lub utrzymania neuroleptoanalgezji, jak i w warun¬ kach, w których wskazany jest srodek wywierajacy, wplyw podobny do moifiny, np. w przypadkach spe- 10 cjalnej uzytecznosci wyszczególnionych w powyzszej czesci opisu, wymagana ilosc peptydu, jego soli lub soli addycyjnej z kwasem jako substancji czynnej jest rózna w zaleznosci od drogi podawania i od charak¬ teru i wymaganego stopnia pozadanego efektu i osta- 15 tecznie zalezy od uznania lekarza czy lekarza wetery-; narii. Tym niemniej, ogólnie w kazdym z tych przy¬ padków korzystnego zastosowania, dawkowanie mies¬ ci sie w zakresie 0,0025 ug — 40 mg/kg wagi ciala ssaka, korzystnie 0,025 ug — 10,0 mg/kg, bardziej 20 korzystnie 0,01 ug — 4,0 mg/kg, a najkorzystniej 0,25 —i 400 ug/kg, przy czym w kazdym przypadku dawkowanie odnosi sie do peptydu w postaci zasady.Skuteczna dawka doustna przeciw biegunce wynosi dla ludzi 3 mg w dawce pojedynczej, podawanej dwa 25 do trzech razy dziennie, a przeciw kaszlowi skuteczna dawka doustna wynosi 3(^ mg, w dawce pojedynczej podawanej dwa do trzech razy dziennie.Substancje czynna mozna podawac kazda droga odpowiednia do osiagniecia pozadanego wplywu. Do 30 odpowiednich dróg naleza: podawanie doustne, dood- bytnicze, donosowe, miejscowe (podpoliczkowe), do- pochwowe i pozajelitowe (w tym podskórne, domies¬ niowe i dozylne). Nalezy zdawac sobie sprawe z tego, ze korzystne drogi moga byc rózne w zaleznosci od 35 zamierzonego wplywu i tak np. moze okazac sie ko¬ rzystne podawanie bezposrednio do rdzenia kregowe¬ go w celu osiagniecia ulgi w bólu w przypadkach po¬ lozniczych.Aczkolwiek mozliwe jest podawanie substancji czyn- 40 nej jako po prostu substancji chemicznej nie poddanej dalszej obróbce, korzystnie jest przygotowac ja w pos¬ taci preparatu stanowiacego srodek farmaceutyczny.Srodki przeznaczone do leczenia tak ludzi jak i zwierzat zawieraja wyzej zdefiniowana substancje czyn- 45 na lacznie z jednym lub kilkoma dozwolonymi nos¬ nikami i ewentualnie innymi skladnikami leczniczymi.Nosnik musi byc dozwolony w tym sensie, ze musi on byc zgodny z innymi skladnikami srodka i nie moze byc szkodliwy dla biorcy. Jest pozadane, aby srodki 50 nie zawieraly czynników utleniajacych i innych subs¬ tancji, co do których wiadomo, ze peptydy sa z nimi niezgodne.Do odpowiednich srodków naleza srodki do poda¬ wania doustnego, doodbytniczego, donoaowego, miejsco- 55 wego (podpoliczkowego), dopochwowego lub poza¬ jelitowego (w tym podskórnego, domiesniowego i do¬ zylnego), aczkolwiek najodpowiedniejsza droga w kaz¬ dym przypadku zalezy od np. substancji czynnej i sta¬ nu chorobowego. 50 Srodki dogodnie mozna wytwarzac w postaci dawki jednostkowej kazda metoda znana w farmacjL Wszyst¬ kie te metody obejmuja stadium doprowadzania do polaczenia substancji czynnej z nosnikiem, stanowia¬ cym jeden lub wiecej dodatkowych skladników. Ogól- 65 nie, srodki przygotowuje sie doprowadzajac do równo-123 797 miernego, dokladnego polaczenia sie substancji czyn¬ nej z plynnym nosnikiem, albo z subtelnie rozdrob¬ nionym stalym nosnikiem, lub z oboma, a nastepnie, jesli jest to potrzebne, przez nadanie produktowi od¬ powiedniej formy.Srodki odpowiednie do podawania doustnego moga byc wytworzone w postaci odrebnych form jednostko¬ wych, takich jak kapsulki, oplatki lub tabletki, z których kazda zawiera przewidziana ilosc substancji czynnej, a takze jako proszek lub granulki, lub roztwór wzgled¬ nie zawiesine, jako plyn wodny lub niewodny, albo jako plynna emulsja olejowa w wodzie, lub plynna emulsja wodna w oleju. Substancje czynna mozna takze przygotowac w postaci duzej pigulki, powidelka lub pasty.Tabletki mozna wytwarzac przez wyciskanie lub prasowanie, dowolnie z jednym lub wieksza iloscia dodatkowych skladników. Tabletki wyciskane mozn? wytwarzac przez wyciskanie w odpowiednim urzadze¬ niu, stosujac substancje czynna swobodnie splywa¬ jaca jako proszek lub granulki, ewentualnie mieszaniny z lepiszczem, srodkiem smarnym* obojetnym rozcien¬ czalnikiem, srodkiem poslizgowym, powierzchniowo czynnym lub rozpraszajacym. Tabletki prasowane mozna formowac w odpowiednim urzadzeniu stosu¬ jac mieszanine sproszkowanego zwiazku zwilzonego obojetnym cieklym rozcienczeklikiem.Srodki do podawania doodbytniczego mozna wy¬ twarzac w postaci czopków ze zwyklymi nosnikami, takimi jak maslo kakaowe, a srodki do podawania -donosowego stanowia krople donosowe zawierajace substancje czynna w roztworze wodnym lub olejowym.Do srodków odpowiednich do podawania miejsco¬ wego w jamie ustnej naleza pastylki do ssania zawie¬ rajace substanqe czynna w podlozu smakowym, zaz- zwyczaj w sacharozie i gumie arabskiej lub tragakan- towej, oraz pastylki zawierajace substancje czynna w obojetnym podlozu, takim jak zelatyna i gliceryna, lub sacharoza i guma arabska.Srodki odpowiednie do podawania dopochwowego mozna wytwarzac jako czopki dopochwowe, kremy, pasty lub srodki do rozpylania zawierajace substancje czynna i nosniki uznane jako nadajace sie do tego celu.Srodki odpowiednie do podawania pozajelitowego dogodnie zawieraja wodne roztwory substancji czyn¬ nej, które to roztwory korzystnie sa izotoniczne z krwia biorcy. Srodki te mozna dogodnie wytwarzac przez rozpuszczenie stalej substancji czynnej w wodzie z wy¬ tworzeniem roztworu wodnego, a nastepnie wyjalo¬ wienie tego roztworu i uczynienie go izotonicznym z krwia biorcy. Srodki mozna wytwarzac w postaci pojemników zawierajacych jedna lub wiele dawek, np. jako zamkniete ampulki lub fiolki.Do srodków odpowiednich do podawania donoso¬ wego zawierajacych nosnik staly, nalezy gruboziar¬ nisty proszek o czastkach np. w zakresie 20—500 um, podawany w sposób stosowany przy zazywaniu ta¬ baki, to jest przez nagle wciagniecie przez nos proszku z pojemnika trzymanego w bezposrednim poblizu nosa.Nalezy rozumiec, ze poza wyzej wspomnianymi skladnikami srodki moga zawierac jeden lub kilka -dodatkowych skladników, takich Aak rozpuazczalatki, ibufory, srodki smakowe, lepiszcza, srodki' powierzch- 10 niowo czynne; zageszczajace, smarne, konserwujace (w tym przeciwutleniacze) i tym/podobne.W przypadku, gdy srodek przewidziany do leczenia tak ludzi jak i zwierzat wytworzony jest w postaci 5 dawek jednostkowych a zwlaszcza dawek wyzej wspom¬ nianych, kazda jego forma jednostkowa dogodnie za¬ wiera wyzej okreslona substancje czynna w ilosci 0,125 ug — 2 g, korzystnie 1,25 ug — 200 mg, najko¬ rzystniej 12,5 ug — 20 mg. Wszystkie ilosci wagowe io obliczono w odniesieniu do peptydu w postaci zasady.Wynalazek objasniaja nastepujace przyklady. Tem¬ perature podano w °C.Czesc eksperymentalna. Zastosowano nastepujace skróty: HOBT — 1-hydroksybenzotriazol DCCI — dwucykloheksylokarbodwuimid DCU — dwucykloheksylomocznik NMM — N-metylomorfolina DMF — dwumetyloformamid Pr — izopropanol Pr,O — eter dwuizopropylowy Pe — eter naftowy BtOAc — octan etylu Z — benzyloksykarbonyl Bu — m-rzed.butyl BOC — III-rzed.butyloksykarbonyl Bzl — benzyl Peptydy badano metoda chromatografii cienkowarst¬ wowej na plytkach pokrytych zelem krzemionkowym Mercka, stosujac nastepujace uklady rozpuszczalni¬ ków: 1. Metyloetyloketon 2. n-Butanol:kwas octowy:woda (3:1:1) 3. Chloroform :metanol:32% kwas octowy (120:90:40) 4. Chloroform.'metanol:32% amoniak (120:90:40) 5. n-Butanol :kwas octowy roctan etylu:woda (1:1:1:1) 6. Chloroform:metanol (8:1) 7. Chloroform:metanol:32% kwas octowy (120:90:5) 8. Chloroform:metanol:32% amoniak (120:90:5) Skrecalnosc optyczna mierzono w automatycznym polarymetrze Bendix NPL. Sklad aminokwasowy hy- drolizatorów peptydowyeh"(6 N HC1, w temperaturze 110°C w ciagu 24 godzin w odpowietrzonych zato- ^ pionych rurkach) oznaczono; w analizatorze amino¬ kwasów Beckman — Spico Model 120 C lub w anali¬ zatorze aminokwasów Rank Chromostak. W trakcie syntezy peptydów stosowano nastepujace metody ogólne: a) Sprzeganie prowadzono w srodowisku DMF 50 przy uczestnictwie DCCI b) Chlorowodorki estrów aminokwasów przeksztal¬ cano w wolne estry przez dodanie zasady czwartorzedo¬ wej albo w postaci trójetyloaminy albo N-metylo- morfoliny, 55 c) HOBT dodawano w stadium sprzegania, gdy w wyniku czesciowej kondensacji utworzyl sie peptyd o optycznie czynnym karboksylowym koncowym ami¬ nokwasie, d) Reakcje sprzegania prowadzono w ciagu, 24 go- 60 dzin w pokoju — chlodni w temperaturze 4°C . e) Po sprzezeniu otrzymanyzwiazekpoddawano oczysz¬ czaniu przez przemycie kwasem i zasada w celu usu¬ niecia nieprzereagowanych reaktantów, €J &ttydlenia alkalicznego dokoaywano w jsrodowis- 65 ku wodnego metanolu, przy uzyciu aparatu do auto- 15 20 25 30 35 40123 797 11 matycznego miareczkowania przy pH 11,5—12,0, stosujac 1 N NaOH, g) Benzyloktykarbonylewe grupy zabezpieczajace usuwano na drodze hydrogenolizy w srodowisku mie¬ szaniny metanolu i kwasu octowego przy uzyciu 10% katalizatora palladowego na weglu, h) Octany otrzymane w wyniku powyzsze) hydro¬ genolizy przeksztalcono w odpowiednie chlorowodorki za pomoca wprowadzenia roztworu chlorowodorku w metanolu, i) Benzylowe grupy zabezpieczajace usuwano na drodze hydrogenolizy w srodowisku metanolu przy uzyciu 10% katalizatora palladowego na weglu, j) Trzeciorzedowe butylowe i trzeciorzedowe bu¬ tyloksykarbonylowe grupy zabezpieczajace usuwano przy uzyciu 1 N roztworu chlorowodoru w kwasie oc¬ towym w obecnosci anizolu jako* zwiazku usuwajacego zanieczyszczenia. Rozszczepienie zachodzilo w ciagu 60—90 minut, k) Peptydy otrzymane jako produkt koncowy wyod¬ rebniano w formie chlorowodorków i liofilizowano z roztworów wodnych.Przyklad I. Wytwarzanie H.Tyt.D-Met. Gly, Phe (4 NOa).—ProNH,.Zwiazek ten wytwarza sie wedlug schematu 1. Otrzy¬ many zwiazek wpierw wyodrebnia sie jako sól addy¬ cyjna w postaci chlorowodorku, a nastepnie oczyszcza sie na karboksymetylocelulozie (CMC 52) przez gradien¬ towa elucje przy uzyciu buforów z octanu amonowego (0,001 M—0,5 M). Po liofilizacji z wodnego roztworu otrzymuje sie sól addycyjna w postaci octanu o nastepu¬ jacych wlasciwosciach: Rf 0,52*; 0,833; 0,47» Wd;+W° (C =0,2 w metanolu) Przyklad II. Wytwarzanie H.Tyr.D-Met(0).Gly.Phe-(4NOa).Pro.NHi.Zwiazek ten wytwarza sie z soli addycyjnej w posta¬ ci octanu, otrzymanego jak opisano w przykladzie I, przez utlenianie nadtlenkiem wodoru w lodowatym kwasie octowym. Otrzymany octan poddaje sie liofi¬ lizacji z roztworu wodnego, otrzymujac zwiazek o nas* tepujacych wlasnosciach: RfO,4(P;0,684 [o]d:+M° (C — 0,12 w metanolu) Wedlug standardowych metod stosowanych w chemii peptydów, analogicznych do przedstawionych w po¬ wyzszych przykladach, wytwarza sie nastepujace pep¬ tydy o wlasnosciach podanych w ponizszej czesci opisu. Pochodne przy C-koncu oznacza sie zgodnie z. przyjeta konwencja,.to znaczy: -NH, — amid- -NHEt — etylamid -OMe — eter metylowy W reszcie wystepujacej przy C-koncu (Pro.ol, to znaczy prolinol) zwiazków opisanych w przykladach V i VI, grupa 1-karboksylowa zwyklego rodnika pro- lilowego zastapiona jest grupa -CH2OH. Przy wytwa¬ rzaniu tych zwiazków grupe Pro.ol wprowadza tie podajac odpowiedni komplementarny reagent reakcji z H.Pro.ol, wytworzonym przez redukcje estru me¬ tylowego proliny (H.Pro.OMe) borowodorkiem so¬ dowym. W kazdym przypadku koncowym zwiazkiem posrednim jest odpowiedni BOOtyrozylopentapep- tyd, z którego grupe zabezpieczajaca usuw* sie sapo* 12 moca kwasu trójfluorooctowego w obecnosci anizolu.Nastepujaca metoda objasnia sposób wytwarzania analogów fenyloalaniny o wzorze R-fenyl-CHj. (NHj) CH.COjH podstawionych w pozycji para zawiera- 5 jacymi siarke resztami R takimi jak CH9.S-, CH9.SO- i CH3.S02, wystepujacych w peptydach opisanych w przykladach XVII, XVIII i XIX.D,L-aminokwasy wytwarza sie metoda podana przez Colescotfa i wsp. w J.A.C.S., 7d, 4232 (1957). Me¬ lo tode te ilustruja schematy 2 i 3, przy czym numery odpowiadajace poszczególnym zwiazkom odnosza sie do numerów zwiazków w powyzszej publikacji.Kazdy z D,L-aminokwasów poddaje sie acetylo- waniu i rozklada aie przy uzyciu acylazy z nerki swini, 13 otrzymujac L-aminokwas oraz D-acetyloaminokwas (schemat 4) [Biochem.Biophys.Acta, 148, 414 (1967), Helv.Chta.Aeta., 69, 21*1 (1976)].Przykladowo enzymatyczny rozklad N-acetylo-p- -metylosulfinylo-D,L-fenyIoalaniny przeprowadza sie 20 nastepujaco: 6,75 g (25 milimoli) acetylo-J,L-aminokwasu roz¬ puszcza sie w 150 ml wody i doprowadza pH do 7,5 dodajac IN roztwór wodorotlenku amonowego* Nas¬ tepnie dodaje sie 50 mg acylazy i 200 mg octanu ko- 26 baltu i otrzymana mieszanine miesza sie lagodnie w temperaturze 38 °C przez noc Nastepnie pH do¬ prowadza sie do 5,5 dodajac kwas octowy a otrzymany roztwór przepuszcza sie przez kolumne 4 x30 cm wypelniona zywica Dowex AG 50x2. Po przemyciu so kolumny woda L-aminokwas wymywa sie 0,5 M amo¬ niakiem.L-aminokwasy przeksztalca sie w pochodne III- -rzed.-butoksykarbonylowe i wlacza w lancuch pep- tydowy zwyklymi metodami przyjetymi w chemii 35 peptydów. Metode ogólna przedstawiono na schema¬ cie 5. Poszczególne stadia sprzegania mozna przepro¬ wadzic albo przy uczestnictwie DCCI/HOBT, albo metoda mieszanych benzwodników.Ponizej opisano sposób wytwarzania analogów za- 40 wierajacych kwas L-(-)-pipekolinowy [kwas L-(-)- -szesciowodoropirydynokarboksylowy-2].W przypadku syntezy peptydu opisanego w przy¬ kladzie XII wymagany jest, jako zwiazek posredni, amid kwasu L- (-)-pipekolinowego. Zwiazek ten otrzy- 45 muje sie nastepujaco: Kwas pikolinowy (kwas pirydynokarboksylowy-2) poddaje sie redukcji wodorem w obecnosci kataliza¬ tora platynowego (H.C. Beyerman, Recueil, 78, 134 (1959). Otrzymany kwas pipekolinowy poddaje sie 90 rozkladowi przy uzyciu kwasu (-)-winowego do kwasu L-(-)-pipekolinowego; temperatura topnienia 268 °C.Me? 26,6° (C = 2,85 w H30) Zwiazek ten poddaje sie reakcji z BOC.N, (pH stat przy 10,0, uzycie 2 N NaOH), (ogólna metoda 55 E. Schnabela w Liebigs Ann.Chem., 702, 188 (1967)].Otrzymuje sie kwas BOC L-(-)-pipekolinowy; tem¬ peratura topnienia 122°C, [a]D ¦" 42'00 (C = 1 w metanolu) M Kwas ten poddaje sie reakcji z jCl.COOEt, NEt, i NH4C1, otrzymujac BOC. L-(-)-Pec.NH2, tempe¬ ratura topnienia 88 °C, [alt? = —344° (C == 1,0 w metanolu) Po reakcji tego zwiazku 2 N.HCl/HOAc otrzymuje sie es L-(-)-Pec.NH2.HCl13 123 797 Tabela I 14 1 Przyklad nr | 1 m IV V VI | VII | VIII 1 IX 1 X | XI J xir xm | XIV XV, | XVI XVII XVIII XIX 1 xx 1 xxi XXII XXIII XXIV xxv XXVI Zwiazek 2 H.Tyr.D-Met.Gly.Phe.D-Pro.OHHC1 H.Tyr.D-Met.GlyJhe(4NOa).Pro.0HHC1 TrójfluorooctanH.Tyr.D-MetGly.Phe (4N03).Pro.ol TrójfluorooctanH.Tyr.D-Met (O).Gly.Phe- -(4N02).Pro.ol H.Tyr.D-Met(02).Gly.Phe(4N02).Pro.NH2 [ H.Tyr.D-Met.Gly.Phe.D-Leu.OH H.Tyr.D-Met.Gly.Phe (4Cl).Pro.NH3 H-Tyr.Dr Mat(Q)J51yJ?hc.(4Cl).Pro.NH2 | H.Tyr,D-Met(0).Gly.Phe.D-Leu.OH H.TYr.P-Met.Gly.?he (4N03).Pec.NH2HCl H.T!yr.D-Met.GlyJlie(4N03).D-Metf NH3HOOGCH, H.Tyr.D-Mct.Gly.Ehe (4NO3).0-pro.NH3.HCl H.Tyr.D-Met(O).Gly.Phe (4N03).D- -Pro.NHjHOOCCH, H.Tyr.D-Met(O).Gly.Phe(4CF3).Pro.NH2.Ha H.Tyr.D-Met.Gly.Phe(4S02Me).Pro.NH2.HOOCCHj H.Tyr.D-Met.Gly.Phe(4SOMe).Pro.NH3 HOOCCH, H.Tyr.D-Met.Gly.Phe (4SMe).Pro.NH3HOÓCCH3 H.Tyr.D-Met.Gly.Phe (4CF3).Pro.NH2HCl H.Tyr.D-Met.Gly.Phe(4N03).homoPro.NH2 Octan H.Tyr.D-Met(O).Gly.Phe(4N03). homoPro.NH2 Octan N-alliloTyr.D-Met.Gly.Phe (4N02).Pro.NH3 Octan N-cyklopropylometyloTyr.D-Met.Gly.Phe(4N02)Pro.NH3 Octan H.Tyr.D-Met.Gly.Phe(4N03). cykloLeu.NH3 | Octan H.Tyr.D-Met.(O).Gly.Phe(4NO)3. cykloLeu-NH2 1 Rf 1 3 0,5l7;048» 0,44*5 0,46* 0,56*5 0,7575 0,718 0,40* 0,32*5 0,653; 0,644 0,61*5 0,5475 0,43* | 0,4935 0,92*5 0,83* | 0,60* | 0,40*5 0,407; 0,158 | 0,52*5 0,933 0,53*; 0,567 0,49*; 0,55*; 0,54» 0,527 0,33*; 0,507; 0,63» 0,30*5 %5V\ 0,248 0,27*5 0,5875 0,34° 0,27*5 0,5575 0,758 0,48*5 0,457 5 0,428 0*52*5 0,155 0,5335 0,137 0,37*5 0,6075 0,70« 0,42*5 0,637 5 0,788 0,617 | 0,407 1 M? 1 (w metanolu) | 4 +48,3° (C=0,2) | —2,8° (c=0^) | +22,9° (c=0,2) | +12,9° (c=0,22) | +6,3° (c=0,2) +7,1 (c=0,2) + 10,0 (c=0,2) | + 11*6° (c=0,l) +34,2° (c=0,2) +7,3° (c=0,2) +35,4° (c=0,2) +45,3° (c=0,2) + 17,3° (c=0,2) +6^3° (c=0,4) + 17,8° (c=l,0) +4,1° (c = 0,4) + 12,9° (c=0,2) Synteze peptydu opisanego w przykladzie III pro¬ wadzi sie w sposób podobny do syntezy amidu kwasu L- (-)-pipekolinowego. Obejmuje ona kondensacje frag- 5o mentów: BOC-Tyr-D-Met-Gly.OH i Phe (p-NOa)-L-(-)Pec.NH2 Totez przedostatnim peptydem jest COC.Tyr.- -D-Met-Gly-Phe(p-N02)-L-(-)-Pec.NH3, z którego grupe zabezpieczajaca usuwa sie przy uzyciu IN roz- 55 tworu chlorowodoru w kwasie octowym w obecnosci anizolu jako zwiazku usuwajacego zanieczyszczenia.Ponizej objasniono sposób wytwarzania analogów zawierajacych p-homoproline (kwas pirolidyno-2-oc- towy). 60 BOC-L-proline homologizuje sie w sposób opisany przez M.A. Ondetti'ego i S.L. Engela w J.Med.Chem., 18, 761 (1975).Nastepnie BOC.L-homoPro przeksztalca sie wyzej opisana metoda mieszanych bezwodników do BOC.L- 65 -homoPro.NH3, z którego otrzymuje sie L-homoPro.NH3HC1 przez usuniecie grup zabezpieczajacych przy uzyciu N.HCl/HOAc.Peptyd opisany w przykladzie XXI wytwarza sie zwykla metoda z fragmentów: BOC.Tyr-D-Met-Gly i Phe (p-N03)-homo.Pro.NH3.Nastepnie reszte Met pozyqi 2 mozna przew- ksztalcic w sulfotlenek dzialajac H3Oa.Przyklad VII. Aktywnosc farmakologiczna.Aktywnosc peptydów otrzymanych w powyzszych przykladach bada sie nastepujacymi standardowymi metodami farmakologicznymi.A) Nieczulosc na ból (analgezja) u myszy w tescie goracej plytki [modyfikacja metody N.B. Eddy'ego i wsp. opisanej w J.Pharm.Exp.Therap. (1953), 107 (385)], przy czym peptyd podaje sie przez wstrzyknie¬ cie do komory mózgowej.15 123 797 Tabele II 16 Peptyd z przykladu nr | 1 | I II III IV V VI VII VIII IX X XI — xn XIII XIV XV XVI XVII XVIII XIX XX XXI 1 xxii Wyniki wyrazone w wartosciach ED50 1 nieczulosc na ból mysz-goraca plytka g/mysz do komory mózgowej 2 0,007 0,005 0,005 0,07 0,05 0,0007 0,00008 0,07 0,005 0,0008 0,001 0,008 0,005 0,003 0,003 0,003 0,08 0,03 0,8 0,07 0,003 0,0008 aktywnosc przeciwbie¬ gunkowa mg/kg (szczur) podskórnie 3 0,05 0,02 2 0,2 0,03 0,05 0,05 5 0,2 0,02 0,7 0,3 1 0,02 0,02 0,03 Brak u 1 Brak u 1 8 0,1 0,03 NT per os 4 | 2 0,05 7 Braku 10 0,3 0,2 0,3 10 10 1 10 8 10 0,2 0,1 2 Brak u 10 Brak u 10 Brak u 10 8 2 NT aktywnosc prze- ciwkaszlowa mg/kg (swinka morska) 5 0,7 p.o. 0,7 p.o. 0,02 p.s.Brak u 10 p.o.NT 10p.o. 9 p.o. 3 p.o.NT NT 10 p.o.NT NT 10p.o. < 10 p.o. 10 p.o.Brak u 3 p.o.NT NT NT NT NT NT nieczulosc na ból — wicie sie mg/kg (mysz) 6 | 35 p.o. 2 p.o.NT NT NT | NT [ NT | NT | NT | NT | NT | NT | NT | NT [ 3 p.o.NT NT | NT 1 NT ] NT ] NT | NT 1 B) Aktywnosc przeciwbiegunkowa u szczurów. W metodzie tej szczury glodzi sie przez 24 godziny, a nastepnie podaje sie peptydy albo podskórnie, albo doustnie i po 15 minutach podaje sie im po 1 ml oleju rycynowego doustnie.C) W celu badania aktywnosci przeciwkaszlowej poddaje sie dzialaniu aerozolu zawierajacego 20% kwasu cytrynowego swinki morskie, którym 30 minut przed¬ tem podano badany zwiazek (doustnie lub podskór¬ nie). Podczas 5 minut ekspozycji liczy sie ilosc kaszlniec i oblicza srednia dla 6 zwierzat w jednym badaniu.Metoda jest opisana przez A.L.A. Boura, A.F. Greena i I.A. Saundersa w J.Pharmac. maj. 1970, t. 39, Nr 1, str. 225.D) Nieczulosc na ból u myszy w tescie wicia sie [modyfikacja metody Hendershota i wsp. opisanej w J.Pharm.Exp.Therap., 125 (1957)], 237, przy czym peptyd podaje sie doustnie.Na podstawie otrzymanych danych obliczono war¬ tosci ED50 (jest to dawka wymagana do wywolania wlasciwego efektu u 50 % zwierzat), przy czym skrót NT Oznacza: nie testowano, p.s. — oznacza podskór¬ nie, a p.o. — per os (doustnie). 45 50 55 60 65 Zastrzezenia patentowe 1. Sposób wytwarzania nowych peptydów o ogól¬ nym wzorze R1-X3-X4-Gly-X6-X7-R2, w którym R1 oznacza atom wodoru lub rodnik alkilowy o 1—4 ato¬ mach wegla, X3 oznacza rodnik L-tyrozylowy ewen¬ tualnie podstawiony przy atomie azotu N2 rodnikiem alkilowym o 1—4 atomach wegla, X4 oznacza rodnik D-metionylowy, grupe sulfotlenku D-metionylu lub sulfonu D-metionylu, X6 oznacza rodnik L-fenyloala- nylowy, L-4-chlorowco-fenyloalanylowy, L-4-trójfluo- rometylofenylo-alanylowy lub L-4-nitrofenyloalanylo- wy, X7 oznacza rodnik L-prolilowy, D-prolilowy, D- leucylowy lub D-m;tionylowy, R2 oznacza grupe -NH2 lub -OR5, gdzie R5 oznacza atom wodoru lub rodnik alkilowy o 1—4 atomach wegla, lub R2 oznacza grupe, zastepujaca grupe 1-karboksylowa C-koncowej reszty aminokwasowej, o wzorze -CH2OR8, gdzie R8 oznacza atom wodoru lub rodnik alkanoilowy o 1—4 atomach wegla w czesci alkilowej, przy czym R2 ozna¬ cza zawsze grupe o wzorze -CH2OR8 gdy X4 ma wyzej podane znaczenie a X6 oznacza rodnik L-fenyloalany- lowy i X7 oznacza rodnik L-prolilowy albo gdy X4 oznacza rodnik D-metionylowy, X6 oznacza rodnik L-fenyloalanylowy i X7 oznacza rodnik D-leucylowy123 737 17 18 lub D-metionylowy, lub ich soli lub soli addycyjnych z kwasami, znamienny tym, ze reagent o wzorze ri-Y^OH, w którym R1 ma wyzej podane znaczenie a Y1 oznacza rodnik X3 o wyzej podanym znaczeniu 5 lub czesciowa sekwencje rodników odpowiadajaca wzorowi produktu i posiadajaca rodnik RX3 na N-koncu, poddaje sie reakcji z reagentem o wzorze H-Y2, w któ¬ rym Y2 oznacza grupe niezbedna do utworzenia wyzej zdefiniowanego produktu, przy czym reagenty R1-Y1- 10 -OH i H-Y2 ewentualnie zabezpiecza sie i/lub aktywuje w odpowiednim miejscu i we wlasciwy sposób a nas¬ tepnie odpowiednio usuwa sie grupe lub grupy zabez¬ pieczajace i ewentualnie przeksztalca sie wolna zasade w sól lub sól addycyjna z kwasem. 15 2. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze w przypadku wytwarzania peptydu o wzorze H-L- -Tyr-D-Met(0)-Gly-L-Phe(4N02)-L-Pro-NH2lub je¬ go soli addycyjnej z kwasem, reagent o wzorze H-Y^OH, w którym Y1 oznacza L-Tyr-lub czesciowa sekwencje 20 rodników odpowiadajaca wyzej wspomnianemu pep- tydowi i posiadajaca -L-Tyr na N-koncu poddaje sie reakcji z reagentem H-Y3, w którym Y3 oznacza grupe niezbedna do utworzenia wspomnianego peptydu, przy czym reagenty ewentualnie zabezpiecza sie i/lub 25 aktywuje w odpowiednim miejscu i we wlasciwy spo¬ sób, a nastepnie usuwa sie grupe lub grupy zabezpie¬ czajace i ewentualnie przeksztalca sie wolna zasade w sól addycyjna z kwasem. 3. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze 30 w przypadku wytwarzania peptydu o wzorze H-L-Tyr- -D-Met-Gly-L-Phe(4N02)-L-Pro-NH2 lub jego soli addycyjnej z kwasem, reagent o wzorze H-Y1-OH, w którym Y1 oznacza -L-Tyr-lub czesciowa sekwencje rodników odpowiadajaca wyzej wspomnianemu pep- 35 tydowi i posiadajaca -L-Tyr-na N-koncu, poddaje sie reakcji z reagentem o wzorze H-Y3, w którym Y2 ozna¬ cza grupe niezbedna do utworzenia wspomnianego peptydu, przy czym reagenty ewentualnie zabezpie¬ cza sie w odpowiednim miejscu i we wlasciwy sposób ^ a nastepnie usuwa sie grupe lub grupy zabezpieczajace i ewentualnie przeksztalca sie wolna zasade w sól addycyjna z kwasem. 4. Sposób wytwarzania nowych peptydów o ogól¬ nym wzorze R^MP-Gly^-TT-R2, w którym R1 45 oznacza atom wodoru, rodnik alkilowy o 1—4 atomach wegla lub rodnik allilowy, X3 oznacza rodnik L-ty- rozylowy ewentualnie podstawiony przy atomie azo¬ tu N3 rodnikiem alkilowym o 1—4 atomach wegla, X4 oznacza rodnik D-metionylowy, grupe sulfotlenku D-metionylu lub sulfonu D-metionylu, X6 oznacza rodnik L-fenyloalanylowy, L-4-chlorowcofenyloalanylo- wy, L-4-trójfluorometylofenyloalanylowyj L-4-nitrofe- nyloalanylowy, L-4-metylotiofenyloalanyIowy, L-4-me- tylosulfoksylofenyloalanylowy lub 4-metylosulfbnylofe- nyloalanylowy, X7 oznacza rodnik L-prolilowy, D- -prolilowy, L-homoprolilowy, D-homoprolilowy, L- -pipekolinylowy, D-pipekolinylowy, cykloleucylowy, D- -leucylowy lub D-metionylowy, R2 oznacza grupe -NH2, -OR5, gdzie R5 oznacza atom wodoru lub rod¬ nik alkilowy o 1—4 atomach wegla, lub R2 oznacza grupe zastepujaca grupe 1-karboksylowa C-konco- wej reszty aminokwasowej, o wzorze -CH2OR8, gdzie R8 oznacza atom wodoru lub rodnik alkanoilowy o 1—4 atomach wegla w czesci alkilowej, przy czym R2 oznacza zawsze grupe o wzorze -CH2OR8 gdy X4 ma wyzej podane znaczenie a X6 oznacza rodnik L- -fenyloalanylowy i X7 oznacza rodnik L-prolilowy albo gdy X4 oznacza rodnik D-metionylowy, X6 ozna¬ cza rodnik L-fenyloalanylowy i X7 oznacza rodnik D-leucylowy lub D-metionylowy, z wyjatkiem przy¬ padku gdy R1 oznacza atom wodoru lub rodnik alki¬ lowy o 1—4 atomach wegla, X6 oznacza rodnik L- -fenyloalanylowy, L-4-chlorowcofenyloalanylowy, L-4- -trójfluorometylofenyloalanylowy lub L-4-nitrofenylo- alanylowy i X7 oznacza rodnik L-prolilowy, D-proli- lowy, D-leucylowy lub D-metionylowy, lub ich soli lub soli addycyjnych z kwasami, znamienny tym, ze reagent o wzorze R1-Y1-OH3 w którym R1 ma wy¬ zej podane znaczenie a Y1 oznacza rodnik X3 o wyzej podanym znaczeniu lub czesciowa sekwencje rodników odpowiadajaca wzorowi produktu, posiadajaca rod¬ nik X3 na N-koncu, poddaje sie reakcji z reagentem o wzorze H-Y2, w którym Y2 oznacza grupe niezbed¬ na do utworzenia wyzej zdefiniowanego produktu, przy czym reagenty R1-Y1-OH i X-Y3 ewentualnie zabezpiecza sie i/lub aktywuje w odpowiednim miejscu i we wlasciwy sposób a nastepnie odpowiednio usuwa sie grupe lub grupy zabezpieczajace i ewentual¬ nie przeksztalca sie wolna zasade w sól lub sól addy¬ cyjna z kwasem.123 797 HJy_r— D-Met -Gjy_ BOC.D-Met.OH, H.Gly-OMe J HOBT/DCCI BOC.D-Met — Gly.OMe Phe(ANQ2)- PraNH, N.HCI/HOAC BOC^rOH. H.D-Met— Gly.OMe B0C.Phe(4N02)OH H.Pro.NH2 | H.OBT/DCCI | HOBT/DCCI BOCTyr— D-Met- BOCTyr— D-Met BOCTyr— D-Met - Gly.OMe BOCPhe (4N02)— Pro.NH2 N.NaOH/MeOH | N.HCl/tó\c Gly^H H. Phe (ANO2)— Pro.NH2 H.OBt/dCCI -Gl^ , --, , Phe (4N02)—Pno.NH2 ^m* N.HCI/HOAc ; H.Tyr— Q-Met—L_Gly 7 phe (4Nq2) — Pro.NH2 Schemat i C02C2H5 CH,S^ CICH2,O.CH, CH,.S-QOtfW.mC0CH.I / C02C2H5 C02C2H5 CH3.S^ycH2.c"NH.C0CH ma C02C2H; NH2 CH3. S^CH2 CH.C02H Schemat 2 W ( DL.)123 797 C02C2H5 NH; ma —CH3.S0^CHz. C NH. C0CH3- CH.SO^CIi.CH.COzH Va CO2C2H5 V (DL) C02C2H5 NH2 1lla -CH3.S02-{C H.2 C. NH. COC H3—CH3.S02-^CH2£H.C02H Via C02C2H5 VI (DL ) Schemct 3 NH2 NH.C0CH3 r.Ch.co.h AC2°/kwasoctotvy r,Ch,cq2h DL DL acylaza |pH7,5 NH2 NH.COCH3 I I R.CH.C02H + R.CH.C02H L fi Schemat 4123 797 Tyr D-Met BOC-LoH H DCCI BOC+OH BOC- H- BOC- BOC- DCCI BOC- Gly N.HCl/HOAc NaOH/MeOH -OMe -OMe -OMe -OMe -OH X Phe BOC- BOC- H- DCCI N.HCl/HOAc ¦OH H- DCCI N.HCl/HQAc -NH2 -NH2 NH2 NH2 NHz Schemat 5 LDD Z-d 2, z. 224/14Q0/84, n. 85+20 egz.Cena 100 zl PL PL PL PL

Claims (2)

1. Zastrzezenia patentowe 1. Sposób wytwarzania nowych peptydów o ogól¬ nym wzorze R1-X3-X4-Gly-X6-X7-R2, w którym R1 oznacza atom wodoru lub rodnik alkilowy o 1—4 ato¬ mach wegla, X3 oznacza rodnik L-tyrozylowy ewen¬ tualnie podstawiony przy atomie azotu N2 rodnikiem alkilowym o 1—4 atomach wegla, X4 oznacza rodnik D-metionylowy, grupe sulfotlenku D-metionylu lub sulfonu D-metionylu, X6 oznacza rodnik L-fenyloala- nylowy, L-4-chlorowco-fenyloalanylowy, L-4-trójfluo- rometylofenylo-alanylowy lub L-4-nitrofenyloalanylo- wy, X7 oznacza rodnik L-prolilowy, D-prolilowy, D- leucylowy lub D-m;tionylowy, R2 oznacza grupe -NH2 lub -OR5, gdzie R5 oznacza atom wodoru lub rodnik alkilowy o 1—4 atomach wegla, lub R2 oznacza grupe, zastepujaca grupe 1-karboksylowa C-koncowej reszty aminokwasowej, o wzorze -CH2OR8, gdzie R8 oznacza atom wodoru lub rodnik alkanoilowy o 1—4 atomach wegla w czesci alkilowej, przy czym R2 ozna¬ cza zawsze grupe o wzorze -CH2OR8 gdy X4 ma wyzej podane znaczenie a X6 oznacza rodnik L-fenyloalany- lowy i X7 oznacza rodnik L-prolilowy albo gdy X4 oznacza rodnik D-metionylowy, X6 oznacza rodnik L-fenyloalanylowy i X7 oznacza rodnik D-leucylowy123 737 17 18 lub D-metionylowy, lub ich soli lub soli addycyjnych z kwasami, znamienny tym, ze reagent o wzorze ri-Y^OH, w którym R1 ma wyzej podane znaczenie a Y1 oznacza rodnik X3 o wyzej podanym znaczeniu 5 lub czesciowa sekwencje rodników odpowiadajaca wzorowi produktu i posiadajaca rodnik RX3 na N-koncu, poddaje sie reakcji z reagentem o wzorze H-Y2, w któ¬ rym Y2 oznacza grupe niezbedna do utworzenia wyzej zdefiniowanego produktu, przy czym reagenty R1-Y1- 10 -OH i H-Y2 ewentualnie zabezpiecza sie i/lub aktywuje w odpowiednim miejscu i we wlasciwy sposób a nas¬ tepnie odpowiednio usuwa sie grupe lub grupy zabez¬ pieczajace i ewentualnie przeksztalca sie wolna zasade w sól lub sól addycyjna z kwasem. 152. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze w przypadku wytwarzania peptydu o wzorze H-L- -Tyr-D-Met(0)-Gly-L-Phe(4N02)-L-Pro-NH2lub je¬ go soli addycyjnej z kwasem, reagent o wzorze H-Y^OH, w którym Y1 oznacza L-Tyr-lub czesciowa sekwencje 20 rodników odpowiadajaca wyzej wspomnianemu pep- tydowi i posiadajaca -L-Tyr na N-koncu poddaje sie reakcji z reagentem H-Y3, w którym Y3 oznacza grupe niezbedna do utworzenia wspomnianego peptydu, przy czym reagenty ewentualnie zabezpiecza sie i/lub 25 aktywuje w odpowiednim miejscu i we wlasciwy spo¬ sób, a nastepnie usuwa sie grupe lub grupy zabezpie¬ czajace i ewentualnie przeksztalca sie wolna zasade w sól addycyjna z kwasem.3. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze 30 w przypadku wytwarzania peptydu o wzorze H-L-Tyr- -D-Met-Gly-L-Phe(4N02)-L-Pro-NH2 lub jego soli addycyjnej z kwasem, reagent o wzorze H-Y1-OH, w którym Y1 oznacza -L-Tyr-lub czesciowa sekwencje rodników odpowiadajaca wyzej wspomnianemu pep- 35 tydowi i posiadajaca -L-Tyr-na N-koncu, poddaje sie reakcji z reagentem o wzorze H-Y3, w którym Y2 ozna¬ cza grupe niezbedna do utworzenia wspomnianego peptydu, przy czym reagenty ewentualnie zabezpie¬ cza sie w odpowiednim miejscu i we wlasciwy sposób ^ a nastepnie usuwa sie grupe lub grupy zabezpieczajace i ewentualnie przeksztalca sie wolna zasade w sól addycyjna z kwasem.4. Sposób wytwarzania nowych peptydów o ogól¬ nym wzorze R^MP-Gly^-TT-R2, w którym R1 45 oznacza atom wodoru, rodnik alkilowy o 1—4 atomach wegla lub rodnik allilowy, X3 oznacza rodnik L-ty- rozylowy ewentualnie podstawiony przy atomie azo¬ tu N3 rodnikiem alkilowym o 1—4 atomach wegla, X4 oznacza rodnik D-metionylowy, grupe sulfotlenku D-metionylu lub sulfonu D-metionylu, X6 oznacza rodnik L-fenyloalanylowy, L-4-chlorowcofenyloalanylo- wy, L-4-trójfluorometylofenyloalanylowyj L-4-nitrofe- nyloalanylowy, L-4-metylotiofenyloalanyIowy, L-4-me- tylosulfoksylofenyloalanylowy lub 4-metylosulfbnylofe- nyloalanylowy, X7 oznacza rodnik L-prolilowy, D- -prolilowy, L-homoprolilowy, D-homoprolilowy, L- -pipekolinylowy, D-pipekolinylowy, cykloleucylowy, D- -leucylowy lub D-metionylowy, R2 oznacza grupe -NH2, -OR5, gdzie R5 oznacza atom wodoru lub rod¬ nik alkilowy o 1—4 atomach wegla, lub R2 oznacza grupe zastepujaca grupe 1-karboksylowa C-konco- wej reszty aminokwasowej, o wzorze -CH2OR8, gdzie R8 oznacza atom wodoru lub rodnik alkanoilowy o 1—4 atomach wegla w czesci alkilowej, przy czym R2 oznacza zawsze grupe o wzorze -CH2OR8 gdy X4 ma wyzej podane znaczenie a X6 oznacza rodnik L- -fenyloalanylowy i X7 oznacza rodnik L-prolilowy albo gdy X4 oznacza rodnik D-metionylowy, X6 ozna¬ cza rodnik L-fenyloalanylowy i X7 oznacza rodnik D-leucylowy lub D-metionylowy, z wyjatkiem przy¬ padku gdy R1 oznacza atom wodoru lub rodnik alki¬ lowy o 1—4 atomach wegla, X6 oznacza rodnik L- -fenyloalanylowy, L-4-chlorowcofenyloalanylowy, L-4- -trójfluorometylofenyloalanylowy lub L-4-nitrofenylo- alanylowy i X7 oznacza rodnik L-prolilowy, D-proli- lowy, D-leucylowy lub D-metionylowy, lub ich soli lub soli addycyjnych z kwasami, znamienny tym, ze reagent o wzorze R1-Y1-OH3 w którym R1 ma wy¬ zej podane znaczenie a Y1 oznacza rodnik X3 o wyzej podanym znaczeniu lub czesciowa sekwencje rodników odpowiadajaca wzorowi produktu, posiadajaca rod¬ nik X3 na N-koncu, poddaje sie reakcji z reagentem o wzorze H-Y2, w którym Y2 oznacza grupe niezbed¬ na do utworzenia wyzej zdefiniowanego produktu, przy czym reagenty R1-Y1-OH i X-Y3 ewentualnie zabezpiecza sie i/lub aktywuje w odpowiednim miejscu i we wlasciwy sposób a nastepnie odpowiednio usuwa sie grupe lub grupy zabezpieczajace i ewentual¬ nie przeksztalca sie wolna zasade w sól lub sól addy¬ cyjna z kwasem.123 797 HJy_r— D-Met -Gjy_ BOC.D-Met.OH, H.Gly-OMe J HOBT/DCCI BOC.D-Met — Gly.OMe Phe(ANQ2)- PraNH, N.HCI/HOAC BOC^rOH. H.D-Met— Gly.OMe B0C.Phe(4N02)OH H.Pro.NH2 | H.OBT/DCCI | HOBT/DCCI BOCTyr— D-Met- BOCTyr— D-Met BOCTyr— D-Met - Gly.OMe BOCPhe (4N02)— Pro.NH2 N.NaOH/MeOH | N.HCl/tó\c Gly^H H. Phe (ANO2)— Pro.NH2 H.OBt/dCCI -Gl^ , --, , Phe (4N02)—Pno.NH2 ^m* N.HCI/HOAc ; H.Tyr— Q-Met—L_Gly 7 phe (4Nq2) — Pro.NH2 Schemat i C02C2H5 CH,S^ CICH2,O.CH, CH,.S-QOtfW.mC0CH. I / C02C2H5 C02C2H5 CH3.S^ycH2.c"NH.C0CH ma C02C2H; NH2 CH3. S^CH2 CH.C02H Schemat 2 W ( DL.)123 797 C02C2H5 NH; ma —CH3.S0^CHz. C NH. C0CH3- CH.SO^CIi.CH.COzH Va CO2C2H5 V (DL) C02C2H5 NH2 1lla -CH3.S02-{C H.2.C. NH. COC H3—CH3.S02-^CH2£H.C02H Via C02C2H5 VI (DL ) Schemct 3 NH2 NH.C0CH3 r.Ch.co.h AC2°/kwasoctotvy r,Ch,cq2h DL DL acylaza |pH7,5 NH2 NH.COCH3 I I R.CH.C02H + R.CH.C02H L fi Schemat 4123 797 Tyr D-Met BOC-LoH H DCCI BOC+OH BOC- H- BOC- BOC- DCCI BOC- Gly N.HCl/HOAc NaOH/MeOH -OMe -OMe -OMe -OMe -OH X Phe BOC- BOC- H- DCCI N.HCl/HOAc ¦OH H- DCCI N.HCl/HQAc -NH2 -NH2 NH2 NH

2 NHz Schemat 5 LDD Z-d 2, z. 224/14Q0/84, n. 85+20 egz. Cena 100 zl PL PL PL PL