FI70415C - Foerfarande foer framstaellning av terapeutiskt anvaendbara petider - Google Patents

Description

\ν&Τ·] ΓΒ1 m KUULUTUSjULKAISU 7Π41 c LBJ (11) UTLÄGGNINGSSKRIFT ' υ H 1 3 c (45) p!:; (51) Kv.lk.*/lnt.CI.* C 07 K 7/06 SUOMI—FINLAND (21) Patenttihakemus — Patentansökning 783509 (22) Hakemispäivä — Ansöknlngsdag 23 · 1 1 - 78 (Fl) (23) Alkupäivä — Giltighetsdag 23-11.78 (41) Tullut julkiseksi — Blivlt offentllg 25-05-79

Patentti- ja rekisterihallitus /44) Nähtäväksipanon ja kuul.julkaisun pvm. — 27.03.86

Patent- och registerstyrelsen ' ' Ansökan utlagd och utl.skriften publicerad (86) Kv. hakemus — Int. ansökan (32)(33)(31) Pyydetty etuoikeus — Begärd prioritet 24.11.77 Englant i-England(GB) 48980/77 (71) The Wellcome Foundation Limited, 183-193 Euston Road, London N.W.1.,

Englanti-England(GB) (72) Samuel Wilkinson, Beckenham, Kent, Eng 1 anti-England(GB) (74) Oy Koister Ab (54) Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisten peptidien valmistamiseksi -Förfarande för framstäl1 ning av terapeutiskt användbara peptider Tämä keksintö kohdistuu menetelmään uusien, terapeuttisesti käyttökelpoisten peptidien valmistamiseksi.

Nämä peptidit omaavat morfiinia vastaavan vaikutuksen. Yleisesti hyväksytyn ja tässä käytetyn merkityksen mukaan morfiinia vastaava aine on yhdiste, jonka biologinen vaikutus muistuttaa luonnon alkaloidia.

Morfiinin farmakologiset ominaisuudet ja terapeuttinen käyttö on hyvin esitetty kirjallisuudessa, katso esimerkiksi "Pharmacological Basis of Therapeutics", Goodman, L.S. ja Gilman, A. (toimittajat), julkaissut The MacMillan Company, New York, kolmas painos (1965), erikoisesti luku 5 sivut 247-266 ja "Matindale: The Extra Pharmacopeia", Blacow, N.W. (toim.), julkaissut Pharmaceutical Press, London, 26, painos (1972), erikoisesti sivut 1100-1106, mitkä 2 70415 kaikki on liitetty tähän viitteeksi. Kuten kuitenkin hyvin tiedetään (Goodman, L.S. et ai., loc cit. luku 16) morfiinin toistuva annostus voi aiheuttaa vastaanottajassa tottumusta lääkkeeseen ja sen vaikutuksen heikkenemistä sekä vieroitusoireiden esiintymistä lopetettaessa annostus. Useita vuosia on siten suoritettu tutkimuksia yhdisteen löytämiseksi, jonka aktiivisuusspektri vastaa morfiinia, mutta joka ei omaa sen epäkohtia.

Keksinnön mukaisesti saadaan uusia kaavan (I): R1-Tyr-X4-Gly-X6-X7-R2 (I) mukaisia peptidejä yhdessä niiden suolojen ja happoadditiosuolojen kanssa, mitkä yhdisteet omaavat morfiinia vastaavan vaikutuksen sekä in vitro että in vivo kokeissa.

Kaavassa (I): R^ on vety tai C -C -alkyyli; X^ on D-metionyyli, D-metionyy- -L ^ g lisulfoksidi tai D-metionyylisulfoni; X on L-4-halogeenifenyyli- alanyyli, L-4-trifluorimetyylifenyylialanyyli tai L-4-nitrofenyy- lialanyyli; X7 on L-prolyyli, D-prolyyli tai D-metionyyli; R2 on 5 . 5 NH2 tai OR , jossa R on vety.

Tässä yhteydessä aminihapoille ja niiden radikaaleille käytetyt lyhenteet ovat alalla tavallisesti käytettyjä ja ne on esitetty esimerkiksi julkaisussa "Biochemistry", 11, 1726 (1972). Edellä ja kauttaaltaan seuraavassa kaikki lyhenteet ovat L-aminohappoi-hin ja niiden radikaaleihin liittyviä paitsi glysiinin tapauksessa ja ellei toisin ole mainittu.

1 2

Kaavassa (I) alkyyliryhminä R ja R on edullisesti metyyli tai etyyli.

Kaavan (I) mukaisten peptidien ja niiden suolojen sekä happoadditiosuolo jen alaluokkana voidaan mainita yhdisteet, joissa R^ on vety; 4 X on D-metionyyli, D-metionyylisulfoksidin tai D-metionyyli-sulfoni, edullisesti D-metionyyli tai D-metionyylisulfoksidi, ja edullisimmin D-metionyylisulfoksidi; X° on L-4-nitrofenyylialanyyli; 7 X on L-prolyyli tai D-prolyyli, edullisesti L-prolyyli; 2 5 5 R on ryhmä -OR , jossa R on vety.

7041 5

Kaavan (I) mukaisia peptidejä ja niiden suoloja sekä hap-poadditiosuoloja voidaan valmistaa jonkin alalla tunnetun menetelmän mukaan analogisen rakenteen omaavia yhdisteitä valmistettaessa. Täten niitä voidaan valmistaa kytkemällä peräkkäin asianmukaisia aminohappoja joko peptidisynteesin klassisia menetelmiä tai kiin-teäfaasimenettelyjä käyttäen tai peptidi-aliyksikköjen perusval-mistuksen ja sitä seuraavan kytkennän avulla.

Näitä reaktioita voidaan suorittaa esimerkiksi aktivoimalla liitettävän aminohapon karboksyylihapporyhmä ja suojaamalla ei-reagoivat amino- ja karboksyylihapporyhmät. Nämä menettelyt ovat standardeja peptidikemiassa. Yksityiskohtia sopivista aktivointina suojaryhmistä ja sopivista reaktio-olosuhteista (sekä kytkentä-reaktioita että suojaryhmien poistoa varten), jolloin rasemisoitu-minen on minimaalinen, voidaan löytää seuraavasta kirjallisuudesta, joka kokonaisuudessaan on liitetty mukaan viitteeksi pelkästään esittelytarkoituksia varten ja jota ei ole tarkoitettu täydelliseksi tai rajoittavaksi.

(a) GB-patenttijulkaisut 1 042 487, 1 048 086 ja 1 281 383.

(b) Schröder ja Liibke , "The Peptides" (Academic Press) (1965) .

(c) Bellean ja Malek, J. Am. Chem. Soc., 90, 165 (1968).

(d) Tilak, Tetrahedron Letters, 849 (1970).

(e) Beyerman, Helv. Chim. Acta., 56, 1729 (1973).

(f) Stewart ja Young, "Solid Phase Peptide Synthesis" (W.H. Freeman and Co.) (1969).

Reaktio-olosuhteista riippuen kaavan (I) mukaisia peptidejä saadaan vapaana emäksenä tai sen happoadditiosuolana tai suolana. Happoadditiosuolat voidaan muuttaa vapaiksi emäksiksi tai muitten happojen suoloiksi ja emäkset voidaan muuttaa happoadditiosuolaksi alalla tunnettujen menetelmien avulla. Samoin voidaan peptidit muuttaa suoloikseen ja suolat muuttaa peptideiksi tai toisiksi suoloiksi hyvin tunnettujen menettelyjen avulla.

Kaavan (I) mukaisia peptidejä ja niiden suoloja ja happoaddit iosuolo ja voidaan siis valmistaa siten, että 4 70415 (a) yhdiste, jonka kaava on R1-Y1-OH (II) jossa R1 merkitsee samaa kuin edellä ja Y1 kaavan (I) N-pää-teasemaryhmän osasekvenssin kanssa identtinen osasekvenssi, saatetaan reagoimaan yhdisteen kanssa, jonka kaava on H-Y2-R2 (III) 2 2 jossa R merkitsee samaa kuin edellä, ja Y on kaavan (I) mukaisen peptidin loppuosan kanssa identtinen osasekvenssi, jolloin reagenssit (II) ja (III) ovat mahdollisesti suojattuja ja/tai aktivoituja, ja tarvittaessa suojaryhmät poistetaan tuotteesta, tai 2 (b) kun kaavassa (I) R on NH , vastaava kaavan (I) 2 5 1 5 mukainen peptidi, jossa R on OR ja R on C^-C^-alkyyli, saatetaan reagoimaan ammoniakin kanssa, tai 4 (c) kun kaavassa (I) X on D-metionyylisulfoksidi, vas- 4 taavan kaavan (I) mukainen peptidi, jossa X on D-metionyyli, hapetetaan, ja haluttaessa saatu tuote muutetaan emäkseksi tai kationisuolaksi (jossa suolassa peptidi on karboksylaat-tianioni) tai happoadditiosuolaksi.

Kaavan (I) mukaisten peptidien happoadditiosuolojen aktiivisuus perustuu emäkseen ja hapon merkitys on vähäisempi, vaikkakin terapeuttisista syistä se on edullisesti farmakologisesti ja farmaseuttisesti hyväksyttävä vastaanottajalle. Esimerkkeihin tällaisista sopivista hapoista kuuluvat (a) mineraali-hapot: suolahappo, bromivetyhappo, fosforihappo, metafosforihappo, typpihappo ja rikkihappo; (b) orgaaniset hapot: viinihappo, etikka-happo, sitruunahappo, omenahappo, maitohappo, fumaarihappo, bentsoehappo, glykolihappo, glukonihappo, gulonihappo, meri-pihkahappo, aryylisulfonihappo, esimerkiksi p-tolueenisulfoni-happo. Farmaseuttisesti ja farmakologisesti hyväksyttävät

II

5 70415 happoadditiosuolat yhdessä vähemmän hyväksyttävien suolojen kanssa (esimerkiksi fluorivetyhapon ja perkloorihapon suolat) ovat käyttökelpoisia emäksiä eristettäessä ja puhdistettaessa ja luonnollisesti ei-hyväksyttävät suolat ovat myös arvokkaita hyväksyttäviä suoloja valmistettaessa alalla tunnettujen menettelyjen avulla. Niitä peptidejä jotka sisältävät useita vapaita aminoryhmiä, voidaan saada mono- tai polyhappoadditiosuolojen muodossa tai useiden happojen sekasuoloina.

Vastaavasti peptidien suoloissa (muodostuen peptideistä karboksylaattianionina yhdessä kationin kanssa) kationin luonne on vähemmän tärkeä, vaikkakin terapeuttisia tarkoituksia varten on suositeltavaa, että vastaanottaja pystyy sen farmaseuttisesti ja farmakologisesti hyväksymään. Esimerkkeihin näistä sopivista kationeista kuuluvat natrium ja kalium.

Kaavan (I) mukaisten peptidien ja niiden suolojen ja happoadditiosuolojen morfiinia muistuttaviin ominaisuuksiin kuuluvat seuraavat, jotka on annettu pelkästään esittelysyistä ja joita ei ole pidettävä rajoittavina.

(A) In vitro: (i) Eristetyn hiiren vasdeferens'in neutraalisesti aiheutetun supistuman esto testattaessa menetelmän mukaan, jonka ovat esittäneet Hughes et ai (Brain Research, 88 (1975) 296) (käyttäen pulsseja kohdalla 0,1 Hz), jolloin esto poistetaan tunnetun narkoottisen antagonistin, naloksonin, (I-N-allyy-li-7,8-dihydro-14-hydroksinormorfinoni) avulla.

(ii) Eristetyn marsun ileum'in sähköisesti aiheutettujen supistumien vähentäminen valmistettuna stimulointia varten Paton'in esittämällä tavalla (Brit. J. Pharmacol., 12 (1957) 119-127). (Jokainen suolen osa kiinnitetään lävistämällä anodiin ja siihen ripustetaan 1-2 gramman paino. Stimulointiparametrit: taajuus 0,1 Hz; kesto 0,4 ms: jännite (supramaksimaalinen 30-40 V; supistumat aiheutettiin isotoonisesti).

(B) In vivo: 6 70415 (i) Yhdisteet omaavat analgeettisen vaikutuksen, esimerkiksi ne ovat tehokkaita hiirellä alalla standardina käytetyssä "kuuma levy" menettelyssä tutkittuna Eddy, N.B. et ai'ien esittämän menetelmän muunnoksen mukaan (J. Pharm. Exp. Therap. 107, 385 (1953), annosteltaessa yhdisteitä intraserebronventrikulaa-risen injektion avulla ja tämä vaikutus poistettiin naloksonin avulla.

(ii) Seuraavana esimerkkinä yhdisteet ovat tehokkaita vähennettäessä etikkahapolla aiheutettuja vääntelemisiä hiirellä tutkittuna Henderson'in et ai. J. Pharm. Exp. Therap. 125 (1959), 237 esittelemän menetelmän muunnoksen mukaan; yhdisteet annosteltiin oraalisesti ja tämä vähentyminen poistettiin naloksonin avulla.

(iii) Yhdisteet omaavat antitussiivisen vaikutuksen, esi merkiksi testattaessa marsuilla Boura'n et ai., Brit. J. Pharmacol., 39, (1970), 225 esittämän menetelmän mukaan.

(iv) Yhdisteet omaavat antidiarrettisen vaikutuksen, esimerkiksi ne ovat tehokkaita hoidettaessa risiiniöljyllä aiheutettua diarreaa rotissa.

Kaavan (I) mukaisten peptidien, niiden suolojen sekä hap-poadditiosuolojen on arvioituna lukuisten standardin mukaisten farmakologisten menettelyjen perusteella havaittu sekä aiheuttavan että ylläpitävän anesteettisen vaikutuksen laboratoriossa eläimillä mukaanluettuna rotat ja hiiret. Yhdisteet ovat tehokkaita tässä suhteessa annosteltuina lukuisten menetelmien avulla, mukaanluettuna parenteraalinen, esimerkiksi suonensisäinen tai intraserebroventrikulaarinen injektio. Esimerkkejä yhdisteiden anesteettisestä vaikutuksesta ovat seuraavat, joita ei ole pidettävä rajoittavina.

(i) Oikaisurefleksin esto. Tämä on tunnusomainen tunnetuille nukutusaineille, kuten kloraalihydraatille (2,2,2-trikloori-1,1-etaanidiolo, uretaanille (etyylikarbamaatti) ja barbituraateille (barbituurihapon johdannaisia). Eläimet, joilta puuttuu tämä refleksi, eivät pyri kääntymään ympäri tai saavuttamaan normaalia asentoaan sijoitettuna selälleen.

7 70415 (ii) Korvanlehtirefleksin esto. Tässä menettelyssä lanka tai vastaava tutkain työnnetään korvalehteen; normaalissa (vertailu) eläimessä aiheutuu refleksinomainen kosketetun korvalehden vääntely tai ravistelu.

(iii) Sarveiskalvorefleksin esto. Tässä menettelyssä sarveiskalvoa kosketetaan heikosti teräslangalla tai vastaavalla; normaalissa (vertailu) eläimessä esiintyy silmäluomen refleksinomainen räpäytys. Tämä refleksi on kliinisesti tärkeä ihmiselle, koska se on eräs viimeisistä poistettavista reflekseistä yleis-nukutuksessa.

Jokainen edellä mainituista vaikutuksista voidaan estää annostelemalla tunnettua narkoosia vastustavaa ainetta, nalok-sonia (l-N-allyyli-7,8-dihydro-14-hydroksinormorfinoni). On kuitenkin havaittu, että morfiini itse ei poista oikaisureflek-siä laboratorioeläimissä, kuten hiirissä, annosteltuna akuutin bolusinjektion avulla aina kuolettaviin annoksiin asti.

Kaavan (I) mukaisten peptidien morfiinia muistuttavan vaikutuksen vuoksi voidaan niitä sekä niiden farmakologisesti ja farmaseuttisesti hyväksyttäviä suoloja ja niiden farmakologisesti ja farmaseuttisesti hyväksyttäviä happoadditiosuoloja käyttää imettäväisten hoitoon sekä ihmisten että eläinten lääkinnässä tiloissa, joissa morfiinia muistuttava vaikutus on suotava. Esimerkkeinä mainittuihin käyttötapoihin kuuluvat seuraavat: (1) Kivunpoisto (analgesia), esimerkiksi sileän lihaksen kouristuksesta aiheutuva kipu renaalisessa taibiliaarisessa kollikissa, kuolemaan johtavasta taudista kuten syövästä aiheutuva kipu, leikkausjälkikivut ja synnytyskivut.

(2) Sedaatio, esimerkiksi nukutusta edeltävä lääkintä; rauhoitus; unen saanti, erikoisesti milloin unettomuus aiheutuu kivusta tai yskästä ja tuskatilan poisto yleensä.

(3) Yskimisen esto, (4) Hengenahdistuksen poisto, esimerkiksi akuutista vasemmanpuolisen sydänkammion vajaatoiminnasta tai pulmonaa-risesta ödeemasta aiheutuva.

3 70415 (5) Ummetuksen aiheuttaminen, esimerkiksi ileostomian tai kolostomian jälkeen ja diarrean ja dysentrian hoitoon.

(6) Euforian aiheuttaminen ja masennustilan hoito, esimerkiksi kuolemaan johtavaan tautiin kuten syöpään liittyen.

Kaavan (I) mukaisia peptidejä ja niiden farmakologisesti ja farmaseuttisesti hyväksyttäviä suoloja ja happoadditiosuoloja voidaan käyttää myös ihmisten ja eläinten lääkinnässä anestesiatilan muodostamiseen ja/tai ylläpitämiseen imettäväisessä.

Peptidiä tai sen suolaa voidaan annostella joko yksinään ainoana anesteettisena aineena tai yhdessä yhden tai useamman muun aineen kanssa, joka täydentää tai korvaa sen vaikutusta. Näitä lisäaineita voidaan annostella ennen, samanaikaisesti tai jälkeen peptidin tai sen suolan annostuksen ja samanaikaisesti annosteltaessa voidaan eri aineita annostella joko erillisinä annoksina tai yhdistettynä valmisteena.

Eräänä mahdollisuutena peptidiä tai sen suolaa voidaan annostella bentsodiatsepiinia olevan rauhoittavan lääkkeen kuten kloori-dia tsepoksidin (7-kloori-2-metyyliamino-5-fenyyli-3H-l,4-bentsodi-atsepiini-4-oksidi), diatsepamin (7-kloori-l,3-dihydro-l-metyyli-5-fenyyli-2H-l,4-bentsodiatsepiini-2-oni) ja oksatsepamin (7-kloori-l,3-dihydro-3-hydroksi-5-fenyy1Ϊ-2Η-1,4-bentsodiatsepiini-2-oni) annostuksen jälkeen.

Toisena mahdollisuutena peptidiä tai sen suolaa voidaan annostella anestesian ylläpitämiseksi sen muodostamisen jälkeen annostelemalla etukäteen toista anesteettista ainetta, esimerkiksi barbituraattia kuten tiopentalnatriumia (natrium-5-etyyli-5-(1-metyylibu-tyyli)-2-tiobartituraatti).

Erikoisen edullinen käyttötapa kaavan (I) mukaisille peptideille ja niiden farmakologisesti ja farmaseuttisesti hyväksyttäville suoloille ja happoadditiosuoloille anesteesiassa on "neuroleptanalge-siaksi" kutsutun tilan muodostaminen ja/tai ylläpitäminen, mille tilalle on tunnusomaista rauhallinen, psyykkinen piittaamattomuus ymparistöärsykkeistä ja analgesia (katso esimerkiksi Dorland's Illustrated Medical Dictionary, 25. painos, julkaissut W.B. Saunders, 1974, sivu 1041 ja "The Pharmacological Basis of Therapeutics", Goodman, L.S. ja Gilman, A. (toim.) 5, painos, julkaissut MacMillan Publishing Co. Inc., 1975, erikoisesti luku 8, sivut 97-101, jotka kaikki mainitaan tässä viitteenä). Tätä tilaa pitävät kliinikot edul-

II

9 70415 lisena, koska se sallii menettelyjen kuten bronkoskopian, röntgentutkimusten, palovammojen sitomisen ja systoskopian suorittamisen, jolloin jonkinlainen potilaan yhteistoiminta on edullista ja kiinteä annosyhdistelmä, joka sisältää narkoottista analgeettista ainetta, fentanyylisitraattia (N-(l-fenetyyli-4-piperidyyli)propionanili-disitraattia) ja neuroleptista ainetta, droperidolia (l-(l-/3-(p-f luoribentsoyyli) propyyli_/-l ,2,3,6-tetrahydro-4-pyridyyli) -2-bents-imidatsolinoni), on osoittautunut käyttökelpoiseksi näissä tapauksissa.

Eläinten lääkinnässä kaksi kiinteäannosyhdistelmää, jotka sisältävät narkoottista analgeettista ainetta etorfiinihydrokloridia (4,5 oo-epoksi-3-hydroksi-6-metoksi- OC , 17-dimetyy li- <"/-propyyli-6,14-etenomorfinaani-7 OMR)-metanolihydrokloridi) yhdessä joko asepromatsiinin (1-/10-/3-(dimetyyliamino)-propyyli/-10H-fenotiat-siini-2-yyli/-etanoni) tai metotrimepratsiinin kanssa (2-metoksi-Ν,Ν, β -trimetyyli-10H-fenotiatsiini-10-propanamiini), ovat osoittautuneet käyttökelpoisiksi tapauksissa, joissa halutaan neurolepto-analgeettinen vaikutus, esimerkiksi murtumia hoidettaessa, haavoja ommeltaessa ja kastraatiossa.

Tähän mennessä neuroleptoanalgeettinen vaikutus on saavutettu vain edellämainitun tapaisia lääkeyhdistelmiä käytettäessä. Kaavan (I) mukaisilla peptideillä ja niiden hyväksyttävillä suoloilla ja happoadditiosuoloilla on siten tärkeä kliininen merkitys ja muodostavat ne arvokkaan lisän lääketieteelliseen ja eläinlääketieteelliseen välineistöön salliessaan yksin tämän tuloksen ilman, että tarvitaan muuta lisälääkintää.

Jokaista edelläesitettyä kaavan (I) mukaisten peptidien ja niiden suolojen tai happoadditiosuolojen käyttöä varten, so. käytetäänkö niitä anestesian muodostamiseen ja/tai sen ylläpitämiseen (esimerkiksi neuroleptanalgesian muodostamiseen ja/tai ylläpitämiseen) tai tiloissa, joissa halutaan morfiinia muistuttava vaikutus (esimerkiksi edellä erikoisesti mainituissa tapauksissa (1), (2), (3), (4), (5) tai (6)), peptidin tai sen suolan tai happoadditiosuolan tarvittava määrä (joita tämän jälkeen kutsutaan vaikuttaviksi aineiksi) vaihtelee annostustavan ja halutun vaikutuksen luonteen ja voimakkuuden mukaan ja määräytyy se lopullisesti lääkärin tai eläinlääkärin arvostelun mukaan. Yleensä kuitenkin jokaista näitä käyttöä varten on annos alueella 0,0025 pg - 40 mg imettäväisen ruumiinpainon kilogrammaa kohti, edullisesti 0,025 ^ag - 10,0 mg/kg, vielä 10 7041 5 edullisemmin 0,01 ug/kg - 4,0 mg/kg ja optimaalisesti 0,25 - 400 pg/kg (kaikki annokset laskettuina peptidin mukaan). Anti-diarreettisena aineena käytettäessä tehokas oraalinen annos ihmiselle on 3 mg:n yksikköannos annettuna kaksi tai kolme kertaa päivässä; antitussii-visena aineena tehokas oraalinen annos on 30 mg:n yksikköannos annettuna kaksi tai kolme kertaa päivässä.

Aktiivista ainetta voidaan annostella jokaisella sopivalla tavalla halutun vaikutuksen saamiseksi, jolloin sopiviin tapoihin kuuluvat oraalinen rektaalinen, nasaalinen, topikaalinen (bukkaali-nen), vaginaalinen ja parenteraalinen annostus (mukaanluettuna sub-kutaaninen, intramuskulaarinen ja suonensisäinen annostus). On huomattava, että suositeltava tapa voi vaihdella halutun vaikutuksen mukaan ja siten synnytyskipujen poistamiseksi annostus suoraan sel-käytimeen voi olla edullista.

Vaikkakin on mahdollista annostella aktiivisia aineita raakana kemikaalina, on suositeltavaa käyttää niitä farmaseuttisten koostumusten valmistukseen.

Koostumukset, sekä eläinten että ihmisten lääkintään, sisältävät aktiivista ainetta, kuten edellä on määritelty, yhdessä yhden tai useamman hyväksyttävän kantajan kanssa ja mahdollisesti myös muita terapeuttisia aineosia. Kantajan (kantajien) täytyy olla hyväksyttäviä siinä mielessä, että ne ovat yhteensopivia muiden valmisteen aineosien kanssa eivätkä ole haitallisia vastaanottajalle.

On edullista, jos koostumukset eivät sisällä hapettavia aineita tai muita aineita, joiden kanssa peptidien tiedetään olevan yhteensopimattomia.

Koostumuksiin kuuluvat oraaliseen, rektaaliseen, nasaaliseen, topikaaliseen (bukkaaliseen), vaginaaliseen ja parenteraaliseen (mukaanluettuina subkutaaniset, intramuskulaariset ja suonensisäiset) annostukseen soveltuvat vaikkakin sopivin tapa kussakin tapauksessa riippuu esimerkiksi aktiivisesta aineesta ja käsiteltävästä tilasta. Valmisteita voidaan sopivasti annostella yksikköannoksina ja voidaan niitä valmistaa farmasiassa jonkin hyvin tunnetun menetelmän avulla. Kaikkiin menetelmiin kuuluu aktiivisen aineosan saattaminen yhteen kantajan kanssa, joka muodostuu yhdestä tai useammasta lisäaineosasta. Tavallisesti koostumukset valmistetaan sekoittamalla tasaisesti ja perusteellisesti aktiivinen aineosa nestemäisten kantajien ja hienojakoisten kiinteiden kantajien tai molempien kanssa ja muotoilemalla 11 7041 5 sitten tarvittaessa tuote halutuksi valmisteeksi.

Oraaliseen annostukseen soveltuvat esiteltävän keksinnön mukaiset valmisteet voidaan annostella erillisinä yksikköinä kuten kapseleina tai tabletteina, joista jokainen sisältää etukäteen määrätyn määrän aktiivista ainetta; jauheina tai rakeina; tai liuoksina tai suspensioina vesipitoisessa tai vettä sisältämättömässä nesteessä; tai öljy-vedessä olevana nestemäisenä emulsiona tai vesi-öljyssä olevana nestemäisenä emulsiona . Aktiivinen aineosa voidaan annostella myös boluksena, nuolupuikkona tai tahnana.

Tabletti voidaan valmistaa puristamalla tai muottivalun avulla haluttaessa yhden tai useamman lisäaineosan kanssa. Puristetut tabletit voidaan valmistaa puristamalla sopivassa koneessa aktiivisen aineosan ollessa vapaasti valuvana kuten jauheena tai rakeina sekoitettuna haluttaessa sideaineen, liukastimen, inertin laimentimen, voiteluaineen, pinta-aktiivisen aineen tai dispergoivan aineen kanssa. Valettuja tabletteja voidaan valmistaa valamalla sopivassa koneessa jauhettua koostumusta oleva seos kostutettuna inertillä nestemäisellä laimentimella.

Valmisteet rektaalista annostusta varten voidaan antaa sup-positoreina tavanomaisen kantajan kuten kookosvoin kanssa, kun taas sopiva valmiste nasaalista annostusta varten muodostuu nenätipoista, jotka sisältävät aktiivista ainetta vesi- tai öljyliuoksena.

Topikaaliseen annostukseen suussa sopivat valmisteet käsittävät lääketabletit, jotka sisältävät aktiivista ainetta makuaineiden, tavallisesti sokerin ja akaasian tai tragantin kanssa sekä pastillit, jotka sisältävät aktiivista ainetta inertissä kantajassa, kuten gelatiinissa ja glyseriinissä tai sokerissa ja arabikumissa.

Vaginaaliseen annostukseen sopivat valmisteet voidaan antaa pessareina, voitena, tahnoina tai suihkeina, jotka aktiivisen aineosan lisäksi sisältävät sopivia alalla tunnettuja kantajia.

Parenteraaliseen annostukseen sopivat valmisteet muodostuvat sopivasti steriileistä aktiivisen aineosan vesiliuoksista, liuosten ollessa edullisesti isotonisia vastaanottajan veren kanssa. Näitä valmisteita voidaan valmistaa sopivasti liuottamalla veren kanssa. Näitä valmisteita voidaan valmistaa sopivasti liuottamalla kiinteää aktiivista ainetta veteen vesiliuoksen muodostamiseksi ja steriloimalla saatu liuos ja tekemällä se isotoniseksi vastaanottajan veren kanssa. Valmiste voidaan annostella yksi- tai moniannossäiliöstä, 12 7041 5 esimerkiksi suljetusta ampullista tai lääkepullosta.

Nasaaliseen annostukseen sopiviin valmisteisiin, joissa kantaja on kiinteä aine, kuuluu karkea jauhe, jonka osaskoko on alueella 20-500 mikrometriä ja joka annostellaan nuuskaamista muistuttavalla tavalla, so. hengittämällä nopeasti nenän kautta lähellä nenää pidetystä jauheastiästä.

On otettava huomioon, että edellä mainittujen aineosien lisäksi tämän keksinnön mukaisiin koostumuksiin voi sisältyä yksi tai useampia lisäaineosia, kuten laimentimia, puskureita, hajuai-neita, sideaineita, pinta-aktiivisia aineita, sakeuttajia, voiteluaineita, suoja-aineita (mukaanluettuina antioksidantit) ja vastaavia aineita.

Jos valmistetta käytetään ihmisen tai eläinten lääkinnässä yksikköannoksina, esimerkiksi edellä esitetyissä yksikköannosmuodois-sa, jokainen tällainen yksikkö sisältää sopivasti aktiivista aineosaa (kuten edellä on määritelty) alueella 0,125 ug-2 g, edullisesti 1,25 ,/ug-200 mg ja optimaalisesti 12,5 yug-20 mg olevan määrän (kaikki painot laskettu peptidiemäksen painon mukaan).

Edellä esitetyn perusteella keksinnön sovellutuksia ovat siten: (a) Kaavan (I) mukaiset peptidit, kuten edellä on määritelty, yhdessä niiden suolojen ja happoadditiosuolojen kanssa.

(b) Edellä esitetyt menetelmät kaavan (I) mukaisten peptidien ja niiden suolojen ja happoadditiosuolojen valmistamiseksi.

Seuraavion esimerkkien tarkoituksena on esitellä keksintöä lähemmin. Kaikki lämpötilat ovat Celsius-asteita.

Kokeellinen osa

Seuraavia lyhennyksiä käytetään kauttaaltaan.

HOBT 1-hydroksibentsotriatsoli DCCI disykloheksyylikarbodi-imidi DCU disykloheksyyliurea NMM N-dimetyylimorfoliini DMF dimetyyliformamidi

Pr isopropanoli

Pr^O di-isopropyylieetteri

Pe petrolieetteri ATOAc etyyliasetaatti Z bentsyylioksikarbonyyli

Bu tertiäärinen butyyli

II

13 7041 5 BOC tertiäärinen butyylioksikarbonyyll

Bzl bentsyyli THF tetrahydrofuraani

Peptidit tutkittiin ohutkerroskromatografiän avulla käyttäen Merck'in piigeelilevyjä seuraavien liuotinsysteeraien kanssa: 1 metyylietyyliketoni 2 n.-butanoli:etikkahappo:vesi (3:1:1) 3 kloroformi:metanoli:32-prosenttinen etikkahappo (120:90:40) 4 kloroformi:metanoli:32-prosenttinen ammoniakki (120:90:40) 5 n-butanoli:etikkahappo:etyyliasetaatti :vesi (1:1:1:1) 6 kloroformi:metanoli (8:1) 7 kloroformi:metanoli:32-prosenttinen etikkahappo (120:90:5) 8 kloroformi:metanoli:21-prosenttinen ammoniakki (120:90:5).

Optiset kiertymät määrättiin Bendix NPL automaattisen pola-rometrin avulla.

Peptidihydrolysaattien aminohappokoostumukset (6N.HC1, 110°, 24 h suljetuissa tyhjiöputkissa) määrättiin Beckman-Spinco MedeL 120°C aminohappoanalysaattorin tai Rank Chromostak aminohappoana-lysaattorin avulla.

Seuraavia yleisiä menettelyjä käytettiin kauttaaltaan peptidien synteesissä.

a) Kytkennät suoritettiin DMF:ssä ja välitettiin DCCI:n avulla.

b) Aminohappoesterihydrokloridit muutettiin vapaiksi estereiksi lisäämällä tertiääristä emästä, joko trietyyliamiinia tai N-metyylimorfoliinia.

c) HOBT lisättiin kytkentävaiheessa, kun osaskondensointi käsittää peptidin, jossa on optisesti aktiivinen karboksipäätteinen aminohappo.

d) Kytkentöjen annettiin edetä 24 tuntia kylmässä huoneessa +4°C:ssa.

e) Kytkennän jälkeen suoritettiin puhdistus pesemällä hapolla ja emäksellä muuttumattomien reaktanttien poistamiseksi.

f) Alkaalinen saippuointi suoritettiin vesipitoisessa metano-lissa autotitrauslaitteessa pH-arvossa 11,5 N.NaOH:n kanssa.

7041 5 14 g) Bentsyylioksikarbonyyli-suojausryhmät poistettiin hydro-genolyysin avulla metanoli/etikkahapossa käyttäen 10 % palladiumia hiilellä.

h) Edellä mainitusta hydrogenolyysistä saadut asetaattisuolat muutettiin vastaaviksi hydroklorideiksi lisäämällä metanolipitoista suolahappoa.

i) Bentsyyli-suojausryhmät poistettiin hydrogenolyysin avulla metanolissa käyttäen 10 % palladiumia hiilellä olevaa katalyyttiä.

j) Tertiääriset butyyli- ja tertiääriset butyylioksikarbonyy-li-suojaryhmät poistettiin N-vetykloridin kanssa etikkahapossa ani-solin läsnäollessa puhdistavana lisäaineena. Poiston annettiin edetä 60-90 minuuttia.

k) OBu-suojaryhmät threoniinin ja seriinin alkoholiosissa poistettiin 10 % vettä sisältävän trifluorietikkahapon avulla, jolloin erottumisen annettiin edetä 90 minuuttia.

l) Lopulliset peptidit eristettiin hydroklorideina ja lyofi-lisoitiin vesiliuoksesta.

Esimerkki 1 H.Tyr.D-Met.Gly.Phe (4NC>2) .Pro.NH2 Tämä valmistettiin taulukossa I (s.18) esitetyn kaavion mukaan. Tuote eristettiin ensin hydrokloridi-additiosuolana ja puhdistettiin sitten karboksimetyyliselluloosalla (CMC 52) gradienttieluoinnin avulla ammoniumasetaattipuskureita käyttäen (0,001M - 0,5M). Lyofili-soinnin jälkeen vesiliuoksesta asetaatti-additiosuolan ominaisuudet olivat seuraavat:

Rf: 0,5 2 2; 0,833; 0,478 /-*725 : +8,1° ( c = 0,2 metanolissa)

D

Esimerkki 2 H.Tyr.D-Met(O).Gly.Phe(4N02).Pro.NH2 Tämä saatiin esimerkin 1 asetaatti-additiosuolasta hapettamalla vetyperoksidilla jääetikkahapossa. Tuotteen, asetaatti-addi-tiosuolana, ominaisuudet olivat seuraavat lyofilisoinnin jälkeen vesiliuoksesta:

Rf: 0,40 2; 0,684 25 /^/D : +6,1 ( c = 0,12 metanolissa) .

Il 15 7041 5

Valmistettiin seuraavat peptidit, joiden tunnusomaiset ominaisuudet on vastaavasti esitetty seuraavassa, peptidikemiassa käytettyjen mukaan edellä olevia esimerkkejä vastaten. C-päätteiset johdannaiset on esitetty tavanomaisesti, so.: -NH9 : amidi -NHEt : etyyliamidi -OMe : metyyliesteri DL-aminohapot valmistettiin Colescott et ai'ien menetelmän mukaan, J.A.C.S. 79 4232 (1957). Reaktiokaaviot on esitetty seuraavassa ja jokaiselle yhdisteelle annettu numero vastaa edellä mainitussa kirjoituksessa esitettyä.

- /7 Λ 2C2n5 Λ X\ C1CH.O.CH /J \\ ! CH Sv \\ ----CH . S —< ' V CH^Cl + HC.NH.COCH-,

Ln3,ö\ / 3 __^ 2 | 3 C02C2n3

V

CO C Hr /------ 2 2 b CH9 . S —(' CH-.C.NH.COCH-, 3 \—/ 2 \ v-------- co9c9h lila ^ >

N H

// N\ 1 2 CH S -JJ \\ CIio.CH.C0,H

\r=y 111 (DL) C. CO C NH9 ^ 1 /T\ 1 ^/-ch2.c.nh.coch3->ch3.so (' y- ch2.ch.co2h CO C.H, V__y

Va V (DL) ,---X CO C H ------ NH2

/Γ ^ I 2 5 // \\ ^ co H

llla^CH3S02-\ ^y-CH.2C.NH.C0CH3-^CH3.S02-(^_j CH2.CH.C02H

CO.C H

Via VI (DL) 16 7041 5

Jokainen DL-aminohappo asetyloitiin käyttäen sian munuais-asylaasia L-aminohapon ja D-asetyyliaminohapon saamiseksi. Biochm. Biophys. Acta 148, 414 (1967). Helv. Chim. Acta 59 2181 (1976).

NH Ac-O/etikkahappoa NH.COCH.

2 2 I 3 I -------- > r.ch.co2h r.ch.co2h

DL DL

asylaasi pH 7,5

NH. NH.COCH

2 I 3 R.CH.C02H + r.ch.co2h

L D

Seuraavassa on esitetty N-asetyyli-p-metyylisulfinyyli-DL-fenyylialaniinin entsymaattista hajottamista:

Asetyyli-DL-aminohappo (6,75 g, 25 millimoolia) liuotettiin 150 millilitraan vettä ja pH säädettiin arvoon 7,5 lisäämällä N ammoniumhydroksidiliuosta. Lisättiin asylaasia (50 mg) ja kobolttiasetaattia (200 mg) ja seosta sekoitettiin varovaisesti 38°C:ssa yön ylitse.

Lisäämällä etikkahappoa säädettiin pH arvoon 5,5 ja liuos johdettiin 4 x 50 pylvään lävitse, joka sisälsi Dowex AG 50 x 2 hartsia. Kun pylväs on pesty vedellä, eluoitiin L-aminohappo 0,5 m ammoniakilla.

L-aminohapot muutettiin t-butyylioksikarbonyyli-johdannai-sikseen ja liitettiin peptidiketjuun peptidikemiassa käytettyjen normaalimenettelyjen avulla. Yleinen menettely on esitetty seu-ravassa kaaviossa. Eri kytkentävaiheet voidaan joko välittää DCCI/HOBT:n avulla tai suorittaa seka-anhydridimenettelyn avulla.

Il 17 7041 5

X

Tyr D-Met Gly Phe Pro ! 1

I I

, BOC -f- OH H---OMe j I

I BOC---—2££1-----OMe j ! BOC ----4-· OH H__Ν_·_1Ι£ 1./HOAc 0Me BOC4 OH H —NH^ BOC--------} DCC1 -----OMe BOC -----QCCJ------------------ NII^ BOC _.... I_________j______Na.OII/McOU . OH H___iLJiClvIiDAc_____NH2 BOC-----j—— ---------!------------------JDCC1 __ L........ NH2 H----------L_. . _____________J_____________ _________ I N.HCl/HOAcj __ nh2

Taulukko I

H. Tyr —— ------ -~Met----GLy---Phe (4N02) ----- Pro.NH2 BOC.-D-Met.OH . H.Gly.OMe

HOBT/DCCI

BOC. D-Met---—---- Gly. OMe J N.HCl/HOAc

BOC.Tyr.OH H.D-Met --------------- Gly.OMe BOC.Phe(4N02).OH H.Pro.NH

! HOBT/DCCI ' HOBT/DCCI

BOC.Tyr--D-Met ---------—----Gly.OMe BOC . Phe (4N02) ------ Pro.NH

N.NaOH/MeOII N.HCl/HOAc BOC.Tyr - D-Met ----------^------- Gly.OH H.Phe(4N02) —---Pro.NH2

j HOBT/DCCI

BOC. Tyr---D-Met---£----Gly-----Phe/4N02) —-----Pro.NH2 ! N.HCl/HOAc H.Tyr----D-Met----Gly ----------- Phe(4N02)-------- Pro.NH2 7041 5 18 to .—. -—* -— CN CN CN -^T -—' tn CN — CN ------5+

tn - CN - OOOOO

H 0*0 O

rH O II II II II II

O II II II

c n υ υ α υ υ to υ υ '—— — ο -Ι-Ι ' u — 0) —' ο ο ο ο ο S O o o Ν' ο ο ο Ο — οοο-----ν*5— - - o «— in m r- - - <Ν Ο *- ι— Ο -+ τ— νο Ν’ m cn Ο I + + + + + + + + οο οο

-5+ ν· οο m CN

N· (N ·+ 0-5+ o oo in - - · - o o o o o — 00 ·- r- γιο en ro r— r- o m m tN l£> m m N* - vo oi n in ·. - O * - - o o o o o or-' ·-

·' — ·' ·· ••(NN (M

(N (N (N N- CN (N inmoo mj n* cn o> o ro o - ro +r

oil Ν’ Γ0 Ν' VD LO N< O

- 5 ΟΟ o o o o o o o <n ffi

K tn U

u K x U U O m o m u m x υ o o o cj cn a:

K K O K K

rH · E · 2 (N «H

CJ CN i—I (N CN CN · K CJ

kxukkko2K

2 cc s 2 2 m

K O · · · (¾ O CN

Or. CNO+JOI mk • "ΚΜΦΜΡΡ42 O , 2 0-i 2 Oi

M —· · I I ——-O

O (NO^QQ cn ro M

• O M m · · o Oi Oi

— 2 0< CJ ~ ~ 2 CJ

(N 5+ . N- (N (N N- N- r- 0 ' ' — O O ' ' '—' o 2d)rH <u 2 2 <u ω o u ’ ' Oi Ν’ Oi ' ’ '—’ Οι Οι Ν’ QJ . — . — (D Λ>ιΦ>ια)(1)>ι>ι<υ -P ΟΐΓ-Ιϋ^ΛχίηΗ,-ΙΚ: CO · O Oi O Oi Oi U U Oi •H >,........

Ό ' I -- !>1 ' ' >1 ^>i -—- -—- >1

Si O CNi—I O»—I,—ICJO i—I

>< OCJ^OCJ'-^-'O

+J+J+J+J+J+J+J+J+J

<UO)<l><U<l)Q)<Ua)Q) SSSS2SSS2

1 I I I I I I I I

OI OI OI O | OI OI Q| Q| Q|

MMMMMMMMM

HE+E-iEhBEhEhBE-i

. HM M m k-M HM HM HM l-|-« HM

HM HM »—l—* HM HM M+ M-+ M hM

0 e (3 (ΟΝ’ΐηΟΓ-αΟσΝΟ-ι— -H T- Γ ΙΟ

W

'9 7041 5

Esimerkki 12 4N0o I 2

Tyr D-Met Gly Phe Pro BOC----j---OH H--OMe ! BOC -......- 1------------- -4 — OMe ! ; 1 BOC -1 OH H ---------; OMe 1 i 2 BOC---L ..................1----------- —r-- OMe BOC -—OH H--OMe

! 1 3 τ I

I ' 3 BOC--j----------------i-—- - OH BOC ------ ------ OMe ! j 4 i : /0 BOC--1--------------------OH HJ-------------- -—OMe ί 5 ! lv i : /° i BOC----r—-r-i----!---— .....- OMe ' Il i ; 8

O

I /

BOC— —-----------------------r------—-----------»---------- ---------------------------NH

1 ! 2 ! 9 1 I ! .0 i H--^-------1---------—........ NH2 10 BOC-D-Met.Gly.OMe (1) BOC-D-Met.DCHA-suola (28,38 g) suspendoitiin etyyliasetaattiin (150 ml) ja sekoitettiin KHSO^n (13,5 g) vesiliuoksen (75 ml vettä) kanssa. Kun liukeneminen oli täydellinen, orgaaninen faasi erotettiin, pestiin kahdesti vedellä (2 x 60 ml), kuivattiin vedettömällä MgSO^:llä ja väkevöitiin. Saatu öljy liuotettiin THF:ään (90 ml), jäähdytettiin -25°C:seen ja käsiteltiin NMM:llä (6,66 g) ja isobutyyliklooriformaatilla (8,60 g). Reaktioseosta 20 7 0 4 1 5 sekoitettiin -15°C:ssa 2 minuuttia ja käsiteltiin sitten esijäähdytetyllä (-25°C) liuoksella, jonka muodostivat Gly.OMe.HCl (7,53 g) ja NMM (6,06 g) DMFrssä (90 ml). Kun reaktioseosta oli pidetty 2 tuntia -15°C:ssa, se siirrettiin jäähauteeseen, käsiteltiin 2M KHCO^-liuoksella (72 ml) ja sekoitettiin 30 minuuttia. Liuottimet poistettiin tyhjiössä ja jäännös jakouutettiin etyyliasetaatilla (350 ml) ja vedellä (75 ml). Orgaaninen kerros pestiin sitten 5-prosenttisella sitruunahappoliuoksella (2 x 50 ml), 5-pro-senttisella NaHCO^-!iuoksella (2 x 50 ml) ja vedellä (2 x 50 ml). Uutteet kuivattiin vedettömällä MgS04:llä ja haihdutettiin, jolloin saatiin kiinteä aine, jota trituroitiin petrolieetterin kanssa .

Saanto 18,12 g, 94 %. TLC: yksi täplä liuotinsysteemeillä 2 , 7 ja 8.

H.D-met.Gly.OMe.HCl (2) BOC-D-Met.Gly.OMe (1) (18,1 g) suspendoitiin anisoliin (150 ml) ja käsiteltiin 1 M HCl/etikkahapolla (440 ml). Seosta sekoitettiin huoneenlämmössä 30 minuuttia. Tuote saostettiin lisäämällä kuivaa eetteriä, otettiin talteen suodattamalla ja pestiin huolellisesti kuivalla eetterillä. Raakatuote liuotettiin veteen (450 ml) ja liuos pestiin kahdesti eetterillä jäljellä olevan ani-solin poistamiseksi. Vesiliuos jäähdytyskuivattiin, jolloin saatiin 13,77 g tuotetta, saanto 95 %. TLC: puhdas (2, 7 ja 8).

BOC-Tyr.D-Met.Gly.OMe (3) BOC-Tyr (16,59 g) liuotettiin THF:ään (80 ml) ja jäähdytettiin -25°C:seen. Lisättiin NMM (5,96 g) ja sen jälkeen isobutyy-liklooriformaattia (7,69 g) nopeasti sekoittaen. Kun seosta oli pidetty 2 minuuttia -15°C:ssa, lisättiin esijäähdytetty liuos, jonka muodostivat D-Met.Gly.OMe.HCl (13,77 g) ja NMM (5,42 g) DMF:ssä (80 ml) ja sekoittamista jatkettiin -15°C:ssa 2,5 tuntia. Seos asetettiin jäähauteeseen ja käsiteltiin 2M KHCO^-liuoksella (65 ml) 30 minuuttia. Kun liuottimet oli poistettu haihduttamalla tyhjiössä, liuotettiin saatu jäännös etyyliasetaatin (360 ml) ja veden (70 ml) seokseen. Orgaaninen faasi erotettiin ja pestiin 5-prosenttisella sitruunahappoliuoksella (2 x 50 ml), 5-prosenttisella NaHCO^-liuoksella (2 x 50 ml) ja lopuksi vedellä (2 x 50 ml).

il 21 7041 5

Kuivaamisen (MgSO^) ja liuottimen poistamisen jälkeen jäljelle jäänyttä kiinteätä ainetta trituroitiin eetterin kanssa, jolloin saatiin 21,16 g (81,6 %) suojattua tripeptidiä. TLC:n (2, 7, 8) mukaan puhdas tuote.

BOC-Tyr.D-Met♦Gly (4)

Suojattu tripeptidi (3) (21,1 g) liuotettiin metanolin (350 ml) ja veden (150 ml) seokseen ja hydrolysoitiin käsittelemällä 2M NaOHrlla (55 ml). Reaktiota seurattiin TLC:llä (7) ja se todettiin täydelliseksi 45 minuutin kuluttua. Metanoli poistettiin tyhjiössä ja vesiliuos jäähdytettiin jäillä ja neutraloitiin 1 M HCl:llä (110 ml). Saostunut tuote suodatettiin, pestiin useita kertoja vedellä ja kuivattiin P^O^illä. Saanto 20,18 g, 98 %. TLC: yksi täplä 1iuotinsysteemeillä 2, 7 ja 8.

Laskettu yhdisteelle ^^H^N^O^S: C 53,73; H 6,61; N 8,96 %

Todettu: C 53,55; H 6,62; N 8,76 %.

BOC-Tyr.-D-met(0).Gly (5) BOC-tyr.D-Met.Gly:n (5,48 g) liuosta metanolissa (120 ml) käsiteltiin kahdella ekvivalentilla vetyperoksidia (2,7 ml 29,4-prosenttista liuosta). Reaktiota seurattiin HPLCillä. Kun seosta oli pidetty 20 tuntia huoneenlämmössä, se haihdutettiin kuiviin ja trituroitiin eetterillä. Saanto 5,46 g, 96,5 %. Sp. 186-188°C (haj.); C*.7p3,5 +lr0° (C - 1, DMF) , 5 1,^° (C = 1 , DMF) .

Laskettu yhdisteelle ^21^31^3^8^1 ^ ^ 6,39; N 8,66

Todettu: C 52,13; H 6,38; N 8,53.

BOC-Phe(N02).Pro.OMe (6) BOC-Phe(N02) (31,0 g) liuotettiin DMF:ään (150 ml), lisät tiin HOBT (27,0 g) ja seos jäähdytettiin -5°C:seen, minkä jälkeen lisättiin DCC1 (20,6 g). Lämpötila pidettiin -5°c:ssa 30 minuuttia; tämän ajan kuluttua lisättiin liuos, jonka muodostivat Pro-GMe.HCl (165,55 g) ja NMM (10,1 g) DMF:ssä (30 ml). Reaktioseosta sekoitettiin 5°C:ssa 20 tuntia ja se suodatettiin sitten DCU:n poistamiseksi. Haihdutettiin tyhjiössä, jolloin saatiin öljy, joka liuotettiin etyyliasetaattiin (1500 ml) ja pestiin 5-prosenttisella sit-ruunahappoliuoksella (2 x 250 ml). 5-prosenttisella NaHCO^-liuok-sella (2 x 250 ml) ja 1/2-kyllästetyllä NaCl:llä (2 x 250 ml). Or- 22 70415 gaaninen faasi kuivattiin ja väkevöitiin 500 ml:ksi. DCU poistettiin suodattamalla ja suodos haihdutettiin, jolloin saatiin kumimainen tuote, jota ei karakterisoitu.

H.Phe(N02).Pro.OMe.HCl (7)

Suojattu dipeptidi (21,41 g) liuotettiin etyyliasetaattiin (300 ml) ja liuos jäähdytettiin 0°C: seen. Kuivaa HCl-kaasua johdettiin liuokseen 45 minuuttia samalla kun lämpötila pidettiin 0°C:ssa. Liuos väkevöitiin 50 ml:ksi ja laimennettiin kuivalla eetterillä (300 ml). Jäähdytettiin jääkaapissa ja tuote suodatettiin , pestiin huolellisesti kuivalla eetterillä ja kuivattiin P_Oc/NaOH:11a.

^ ^ O

Saanto 15,64 g, 85 %, sulamispiste 145-148 C.

f&jl5'5 -15,7° (C = 1, MeOH); -17,6° (C = 1, MeOH).

Laskettu yhdisteelle C1cH N OcCl: C 50,35; H 5,59; N 11,75 % 15 2U 3 5

Todettu: C 50,03; H 5,81; N 11,45 %.

BOC-Tyr.D-Met(0).Gly.Phe(N02).Pro.OMe (8)

Liuos, jonka muodostivat BOC-Tyr.D-Met(O).Gly (1,0 g) DMF:ssä (30 ml) jäähdytettiin -5°C:seen ja käsiteltiin HOBT:llä (0,56 g) ja DCClrllä (0,42 g). SEosta sekoitettiin -5°C:ssa 40 minuuttia ja sitten lisättiin liuos, jonka muodostivat Phe(N02).Pro.OMe.HCl (0,74 g) ja NMM (0,21 g) DMF:ssä (5 ml) ja liittymisreaktion annettiin tapahtua 5°C:ssa 20 tuntia. DCU poistettiin suodattamalla ja suodos väkevöitiin tyhjiössä. Raakatuote jakouutettiin etyyliasetaattiin (100 ml) ja veteen (20 ml). Orgaaninen kerros pestiin 5-prosenttisella sitruunahappoliuoksella (2 x 20 ml), 5-prosenttisella NaHCO^-liuoksella (2 x 20 ml) ja lopuksi vedellä. Kuivattiin vedettömällä MgSO^:llä ja haihdutettiin, jolloin saatiin amorfinen kiinteä aine, joka eetteritritu-roinnin jälkeen painoi 1,0 g (62 %). TLCillä (2) todettiin, että tuotteessa oli jonkin verran DCU:ta, sitä ei puhdistettu edelleen.

BOC-Tyr.D-Met(O).Gly.Phe(N02).Pro.NH2 (9) Täysin suojattu pentapetidi (1,0 g) liuotettiin metanoliin (150 ml) ja liuos jäähdytettiin jää/suola-seoksessa ja kyllästettiin ammoniakilla. Pullo suljettiin ja seoksen annettiin seistä huoneenlämmössä 6 vuorokautta. Kun ammoniakki ja metanoli oli

II

23 7041 5 poistettu huolellisesti, saatiin tuote etyyliasetaatti/eetteri-seoksesta, 0,81 g, 83 %. TLC:n (2, 7, 8) mukaan tuote sisälsi DCU:ta ja pienen määrän lähtöainetta. Tätä tuotetta käytettiin seuraavassa vaiheessa ilman lisäpuhdistusta.

H.Tyr.D-Met(O).Gly.Phe(N02).Pro.NH2 (10) BOC-Tyr.D-Met(O).Gly.Phe(N02).Pro.NH2 (0,81 g) suspendoitiin anisoliin (14 ml) ja käsiteltiin 1 M HC1/etikkahapolla (80 ml). Reaktioseosta pidettiin 45 minuuttia huoneenlämmössä ja haihdutettiin sitten kuiviin ja jäännöstä trituroitiin eetterillä. Raaka-tuote puhdistettiin ioninvaihtokromatografiällä käyttäen 2,5 x 25 cm:n karboksimetyyliselluloosakolonnia. Eluointi suoritettiin ammonium-asetaatin lineaarisella gradientilla 0,005 M:sta 0,2 M:ään pH:ssa 5,1.

Saanto 0,33 g. TLC:n ja HPLC:n mukaan puhdas tuote.

Laskettu yhdisteelle C3oH39N7°9S*CH3C02H'H2°: C 51,13; H 6,00; N 13,05 %

Todettu: C 50,83; H 6,06; N 12,91 %.

4NO_ f 2

Tyr D-Met Gly Phe Pro BOC ---------- -........ - ----- OMe 6

BOC--------------- NH

i 2 i 11 /0 1

BOC-----------OH H---1----------------------------- NH

! 12 2 o ! / ' BOC----'------------------- NH2

13 O

H---------------- ..... ^ ..............L“ - ----------NH2 14 24 7041 5 BOC-Phe(N02).Pro.NH2 (11) BOC-Phe(NO^).Pro.OMe (6) (22,9 g) liuotettiin metanoliin (250 ml) ja liuos jäähdytettiin jäillä. Liuoksen läpi kuplitet-tiin ammoniakkia, kunnes saatiin kyllästetty liuos, sen jälkeen pullo suljettiin ja sen annettiin seistä huoneenlämmössä 7 vuorokautta. Reaktioseos haihdutettiin tyhjiössä ja raakatuote kiteytettiin etyyliasetaatista. TLC:n ja HPLC:n mukaan puhdas tuote.

Sulamispiste 176-178,5°C. "29,4° (C - 1, MeOH) ^^546 "35'7° (C = lr Me0H> ·

Laskettu yhdisteelle ^gH^N^Og: ^ ^ 6,40; n 13,79 %

Todettu: C 55,60; H 6,33; N 14,04 S.

H.Phe(N02).Pro.NH2.HCl (12)

BOC-Phe(N02).Pro.NH2 (8,0 g) liuotettiin metanoliin (20 ml), isopropanolin (40 ml) ja etyyliasetaatin (375 ml) seokseen. Liuos jäähdytettiin jäissä ja lämpötila pidettiin 15°C:ssa samalla kun seokseen kuplitettiin kuivaa HCl-kaasua tunnin ajan. Sen jälkeen reaktioseoksen läpi johdettiin typpeä 5 minuutin ajan ja laimennettiin sitten kuivalla eetterillä (450 ml). Tuote suodatettiin, pestiin huolellisesti etterillä ja kuivattiin tyhjiössä P20^/NaOH:11a. Saanto 6,28 g, 93 %. Sulamispiste 156-159°C. C-13,5 (C = 1, MeOH), C&.754g5 -15,3° (C - 1, MeOH). D

BOC-Tyr.D-Met(O).Gly.Phe(N02).Pro.NH2 (13) BOC-Tyr.D-Met(O).Gly (5) (1,0 g) liuotettiin DMFtään (20 ml) ja jäähdytettiin -25°C:seen. NMM (0,21 g) ja isobutyylikloorifor-maattia (0,28 g) lisättiin voimakkaasti sekoittaen samalla kun lämpötila pidettiin -15°C:ssa 2 minuuttia. Sitten lisättiin esi-jäähdytetty (-25°C) Phe(N02> .Pro.NH2.HC1:n (0,71 g) ja NMM:n (0,33 g) liuos ja seosta sekoitettiin -15°C:ssa 2,5 tuntia. Reaktioseos siirrettiin jäähauteeseen ja käsiteltiin 2M KHCO^rlla (2,5 ml) 30 minuuttia. Liuottimet poistettiin tyhjiössä ja jäännös jakouutettiin etyyliasetaattiin (270 ml) ja veteen (40 ml). Orgaaninen faasi erotettiin ja pestiin 5-prosenttisella sitruunahapolla (2 x 40 ml), 5-prosenttisella NaHCO^illa (2 x 40 ml) ja vedellä (2 x 40 ml). Uute kuivattiin ja haihdutettiin kuiviin. Trituroi-taessa eetterillä saatiin 0,56 g tuotetta , 35 %. Tätä tuotetta käytettiin seuraavassa vaiheessa ilman 1isäpuhdistusta.

7041 5 25 H.Tyr.D-Met(0).Gly.Phe(N02).Pro.NH2 (14) BOC-Tyr.D-Met(0).Gly.Phe(N02).Pro.NH2:sta (0,56 g) poistettiin suojaus 1 M HC1/etikkahapossa (56 ml) anisolin (20 ml) läsnäollessa. Kun seosta oli pidetty 30 minuuttia huoneenlämmössä, liuottimet poistettiin tyhjiössä ja saatua raakatuotetta trituroi-tiin eetterillä. Tämä tuote kromatografoitiin 2,5 x 25 cm:n kar-boksimetyyliselluloosakolonnissa, eluointi ammoniumasetaatin lineaarisella gradientilla 0,005 M - 0,2 M pH 5,1. Osittain puhdistunut peptidi kierrätettiin uudelleen 2,5 x 50 cm:n karboksimetyy-liselluloosakolonnin läpi käyttäen ammoniumasetaatin lineaarista gradienttia 0,005-0,1 M, pH 5,1. Kun haihtuva puskuri oli poistettu toistetulla jäähdytyskuivauksella, saatiin puhdas peptidi. Saanto 50 mg. TLC:n (2, 7, 8) ja HPLC:n mukaan tuote oli puhdas. Yhdisteelle c30H39N7O9s ,CH3C02H, 1,5 H20 laskettu: C 50,52; H 6,05; N 12,89 % todettu: C 50,59; H 5,59; N 12,97 %.

Edellä mainitut kaasukromatografiset kokeet (HPLC) suoritettiin systeemillä: kolonni Zorbax C-8, 4,6 mm x 25 cm, liikkuva faasi asetonitriili/0,1 M ammoniumasetaatti, pH 4,0, virtausnopeus 2 ml/min, ilmaisu 254 nm:ssä.

Farmakologinen vaikutus

Edellä olevien esimerkkien mukaisten peptidien seuraavat vaikutukset testattiin normaalien farmakologisten menettelyjen mukaan.

(A) Analgesia hiiressä kuumalevytestin mukaan (muunnelma Eddy, N.B. et ai., J. Pharm. Exp. Therap. (1953)· 107, 385 menetelmästä, jolloin peptidiä annostellaan intraserebroventrikulaari-sen injektion avulla).

(B) Antidiarreettinen vaikutus rotassa. Tässä menettelyssä annettiin rottien olla ilman ravintoa 24 tuntia, minkä jälkeen peptidiä annosteltiin joko subkutaanisesti tai oraalisesti ja sitten 15 minuutin kuluttua 1 ml risiiniöljyä rottaa kohden oraalisesti .

(C) Yskimistä estävässä kokeessa kohdistettiin marsuihin aerosoli, joka sisälsi 20 % sitruunahappoa, 30 minuutin kuluttua ydhisteen annostuksesta (oraalisesti tai subkutaanisesti). Yski- 26 7 041 5 misten lukumäärä viiden minuutin altistusaikana laskettiin ja määrättiin keskiarvo kuudelle eläimelle koetta kohti. Menetelmän ovat esittäneet Boura, A.L.A., Green, A.F. ja Saunders, I.A. Br., J. Pharmac,. May 1970, osa 39, no. 1, sivu 225.

(D) Analgesia hiiressä vääntelykokeessa (muunnelma menetelmästä jonka ovat esittäneet Hendershot et ai. (J. Pharm. Exp. Therap., 125 (1959), 237), jolloin peptidiä annosteltiin oraalisesti.

Saaduista arvoista laskettiin vastaavat ED^-arvot (so. annos, joka tarvitaan aiheuttamaan asianmukainen vaikutus eläimissä) . N.T: = ei testattu.

Il 27 7 0 4 1 5

Tulokset ilmaistuna ED,_0:nä:

Peptidiä Analgesia: Antidiarrea Antitussiivi Analgesia: esim. no. hiiri-kuuma mg/kg (rotta) mg/kg vääntö levy s.c. p.o. (marsu) mg/kg ug/hiiri (hiiri) i. c . v.

1 0.007 0.05 2 0.7 p.o. 35 p.o.

2 0.005 0.02 0.05 0.7 p.o. 2 p.o.

0.02 s.c.

3 0.07 0.2 - NT NT

10

4 0.00008 0.05 0.3 3 p.o. NT

5 0.005 0.2 10 NT NT

6 0.0008 0.02 1 >10 p.o. NT

7 0.005 1 >10 >10 p.o. NT

8 0.003 0.02 0.2 <10 p.o. NT

9 0.003 0.02 0.1 10 p.o. 3 p.o.

10 0.003 0.03 2 - 3 p.o. NT

11 0.07 0.1 8 NT NT

Claims (3)

1. 28 7041 5 1. iMenetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisen peptidin valmistamiseksi, jonka kaava on R1_Tyr-X4-Gly-X6-X7-R2 (I) tai sen kationisuolan tai happoadditiosuolan valmistamiseksi, 1 4 jossa kaavassa R on vety tai C^-C^-alkyyli; X on D-metionyyli, D-metionyylisulfoksidi tai D-metionyylisulfoni; X^ on L-4-ha-logeenifenyylialanyyli, L-4-trifluorimetyylifenyylialanyyli 7 tai L-4-nitrofenyylialanyyli; X on L-prolyyli, D-prolyyli 2 5 5 tai D-metionyyli; R on Nl·^ tai OR i ]Ossa R on vety, tunnettu siitä, että (a) yhdiste, jonka kaava on R1-Y1-OH (II) jossa R*· merkitsee samaa kuin edellä ja kaavan (I) N-pääte-asemaryhmän osasekvenssin kanssa identtinen osasekvenssi, saatetaan reagoimaan yhdisteen kanssa, jonka kaava on H-Y2-R2 (III) 2. jossa R merkitsee samaa kuin edellä, ja Y on kaavan (I) mukaisen peptidin loppuosan kanssa identtinen osasekvenssi, jolloin reagenssit (II) ja (III) ovat mahdollisesti suojattuja ja/tai aktivoituja, ja tarvittaessa suojaryhmät poistetaan tuotteesta, tai 2 (b) kun kaavassa (I) R on NH2/ vastaava kaavan (I) mu- 2 5 5 kainen peptidi, jossa R on OR ja R on C^-C^-alkyyli, saatetaan reagoimaan ammoniakin kanssa, tai 4 (c) kun kaavassa (I) X on D-metionyylisulfoksidi, vastaava A kaavan (I) mukainen peptidi, jossa X* on D-metionyyli, hapetetaan, ja haluttaessa saatu tuote muutetaan emäkseksi tai kationisuolaksi (jos sa suolassa peptidi on karboksylaattianioni) tai happoadditiosuolak- si. 29 7041 5
2. 2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä peptidin valmistamiseksi, jonka kaava on H-Tyr-D-Met (O) -Gly-Phe (4N02) -Pro-NH2 tai sen happoadditiosuolan valmistamiseksi, tunnettu siitä, että (a) yhdiste, jonka kaava on H-Y1-OH (II) jossa Y on -Tyr- tai sellaisen ryhmän osasekvenssi, jonka N-pääte-asemassa on -Tyr- ja joka siitä lähtien on identtinen mainitun peptidin kanssa, saatetaan reagoimaan yhdisteen kanssa, jonka kaava on h-y2-nh2 (III) 2 jossa Y on ryhmän osasekvenssi, joka on identtinen mainitun peptidin loppuosan kanssa, jolloin reagenssit (II) ja (III) ovat mahdollisesti suojattuja ja/tai aktivoituja, ja tarvittaessa suojaryhmät poistetaan tuotteesta, tai (b) peptidi, jonka kaava on H-Tyr-D-Met (O) -Gly-Phe ( 4NC>2) -Pro-OR^ jossa on -C^-alkyyli, saatetaan reagoimaan ammoniakin kanssa, tai (c) peptidi, jonka kaava on H-Tyr-D-Met-Gly-Phe(4N02)-Pro-NH2; hapetetaan selektiivisesti, ja sen jälkeen saatu tuote haluttaessa muutetaan vapaaksi emäkseksi tai happoadditiosuolaksi.
3. 3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä peptidin valmistamiseksi, jonka kaava on H-Tyr-D-Met-Gly-Phe (4NC>2) -Pro-NH2 tai sen happoadditiosuolan valmistamiseksi, tunnettu siitä, että 7041 5 30 (a) yhdiste, jonka kaava on H-Y1-OH (II) jossa Y"*· on Tyr- tai sellaisen ryhmän osasekvenssi, jonka N-pää-teasemassa on -Tyr- ja joka siitä lähtien on identtinen mainitun peptidin kanssa, saatetaan reagoimaan yhdisteen kanssa, jonka kaava on h-y2-nh2 (III) 2 jossa Y on ryhmän osasekvenssi, joka on identtinen mainitun peptidin loppuosan kanssa, jolloin reagenssit (II) ja (III) ovat mahdollisesti suojattuja ja/tai aktivoituja, ja tarvittaessa suojaryhmät poistetaan tuotteesta, tai (b) peptidi, jonka kaava on H-Tyr-D-Met-Gly-Phe(4N02)-Pro-OR5 jossa R5 on C^-C^-alkyyli, saatetaan reagoimaan ammoniakin kanssa, ja sen jälkeen saatu tuote haluttaessa muutetaan vapaaksi emäkseksi tai happoadditiosuolaksi. II 7041 5 31