Przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywa¬ nia trójmetyloamoniowych soli nieorganicznych pochodnych makrolidów polienowych o wzorze ogólnym przedstawionym na rysunku, w którym R oznacza reszte makrolidu polienowego, n równa sie 0 lub 1, zas X oznacza anion soli nieorganicznej, jak metylosiarczan* siarczan, chlorek, fosforan: Antybiotyki z grupy makrolidów polienowych sa szeroko stosowane w leczeniu grzybic u ludzi i u zwierzat oraz w zwalczaniu wzglednie zapobie¬ ganiu zakazeniom grzybowym.Dotychczas znany jest szereg pochodnych makro¬ lidów polienowych o niektórych wlasnosciach fizy¬ kochemicznych • korzystniejszych od antybiotyków wyjsciowych. I tak znany jest kompleks amfote- rycyny B z dezoksycholanem sodu, pochodne N-acylowe — opis patentowy Stanów Zjednoczo¬ nych Ameryki 3.244.590, chlorowodorki estrów me¬ tylowych — Mechlinski W., Schaffner C. P., J. Antibiot., 25, 256, (1964), produkty kondensacji z formaldehydem — opis patentowy francuski Rhone-Poulenc 41.272, wzglednie utlenionymi poli¬ sacharydami — opis patentowy belgijski nr 620.619 oraz N-glikozylowe pochodne — opis patentowy belgijski nr 787.531.Niedogodnoscia opisanych wyzej pochodnych jest to, ze poprawa wlasnosci fizykochemicznych prze¬ waznie wplywa na pogorszenie sie innych wlas¬ nosci tych zwiazków, przy czym w przypadku N-acylowych pochodnych nastepuje istotne obni- 10 15 zenie aktywnosci przeciwgrzybowej, zas sole estrów sa bardzo nietrwale.Z opisu patentowego RFN nr 2706156 znana jest informacja o otrzymaniu N,N,N-trójmetylowych pochodnych amfoterycyny B, nystatyny i mykohep- tyny z niepodstawiona grupa karboksylowa, przy czym ich struktura chemiczna nie zostala udowod-. niona. Jednakze zwiazki te sa nierozpuszczalne w wodzie, co uniemozliwia bezposrednie stosowanie ich w roztworach.Sposób wedlug wynalazku polega na tym, ze na makrolid polienowy* który zawiera lub nie zawiera grupy karboksylowej, w rozpuszczalniku organicz¬ nym lub w ich mieszaninie, w temperaturze poko¬ jowej oraz przy ciaglym mieszaniu dziala sie siar¬ czanem dwumetylu w obecnosci wodoroweglanu sodu, calosc pozostawia do przereagowania, a nas¬ tepnie uzyskany produkt wydziela sie ze srodo¬ wiska reakcji eterem etylowym, rozpuszcza w bu¬ tanolu, przemywa woda, zageszcza pod zmniejszo¬ nym cisnieniem i eterem etylowym wytraca pro¬ dukt koncowy o wzorze ogólnym przedstawionym na rysunku, w którym X oznacza anion metylo- siarczanowy.Wytworzony metylosiarczan znanymi sposobami mozna przeprowadzic w inne sole nieorganiczne.¦W przypadku, gdy wychodzi sie z makrolidu za¬ wierajacego grupe karboksylowa siarczan dwume¬ tylu dziala nie tylko jako srodek metylujacy grupe aminowa makrolidu lecz takze estryfikuje jego 122 8843 122 884 .4 grupe karboksylowa i otrzymuje sie sól estru o wzorze przedstawionym na rysunku, w którym n = 1.Jako makrolidy polienowe stosuje sie nystatyne, polifungine, amfoterycyne B, kandycydyne, pima- rycyne, trychomycyne, leworyne, rimocydyne, pe- rimycyne. kandydyne, aureofacyne. Jako* rozpusz¬ czalniki organiczne stosuje sie dwumetyloacetamid, dwumetyloformamid; metanol.W przypadku, gdy czasteczka antybiotyku za¬ wiera aromatyczna grupe aminowa, to ulega ona podstawieniu' jednym lub dwoma alkilami. Do ta¬ kich antybiotyków nalezy leworyna, kandycydyna, trychomycyna i aureofacyna. Przeprowadzone ba- T*1" dauia—wytfooa^L ze proponowane przez nas wa- I A MjmAi^ alkifowailia sa wystarczajaco lagodne, aby I nie doiprowadlic dp degradacji antybiotyku. i ^ W^ogiaanych wj literaturze warunkach alkilowania, l -dzialanie; siarczanu dwumetylu spowodowaloby •**'%h^areie -pierscienia makrolidowego, odszczepienie reszty cukrowej i degradacje chromoforu polieno- wego, a w rezultacie utrate aktywnosci biologicz¬ nej. Aktywnosc przeciwgrzybowa oraz homolitycz- na in vitro DMS-pochodnych antybiotyków w po¬ równaniu do wyjsciowych substancji ilustruje za¬ laczona tabela.. Struktura otrzymanych pochodnych zostala udo¬ wodniona metodami spektroskopowymi. Dla przy- przykladu podajemy sposób identyfikacji pochod¬ nej kandycydyny, otrzymanej w wyniku alkilowa¬ nia siarczanem dwumetylu proponowanym sposo¬ bem, zwanej dalej DMS — kandycydyna. W wa¬ runkach kwasowej hydrolizy kandycydyny uwal¬ nia sie reszta mykozaminy. Otrzymana w wyniku rozszczepienia wiazania O-glikozydowego przez dzialanie rozcienczonych roztworów kwasów na DMS-kandycydyne substancje zidentyfikowano jako N,N,N-trójmetylomykozamine Struktura tego zwiazku okreslona na podstawie analizy widma . masowego, wykonanego technika desorpcji polem (jon podstawowy, bedacy zarazem jonem masowym przy m(e = 206 oraz widma protonowego rezonansu magnetycznego (sygnal przy d = 3»68 charakterys¬ tyczny dla grup metylowych zwiazanych z atomem azotu o intensywnosci trzykrotnie wyzszej od syg¬ nalu 8 = 1,68, charakterystycznym dla trzech pro¬ tonów grupy metylowej w pozycji 6 aminocukru).- Dowodem na obecnosc wiazania estrowego w czasteczce pochodnej antybiotyku jest obecnosc in¬ tensywnego pasma absorpcyjnego w widmie pod¬ czerwonym przy v = 1730 cm-1 przy równoczesnym braku pasma jonu karboksylowego, charakterys¬ tycznego dla wyjsciowego antybiotyku przy v = = 1590 cm-1. Widma absorpcyjne w zakresie swiatla widzialnego i ultrafioletu kandycydyny i jej pochodnej róznia sie jedynie nieznacznie in¬ tensywnoscia, natomiast polozenie maksimów ab¬ sorpcji i struktura oscylacyjna sa identyczne.Swiadczy to o niezmienionej strukturze chromoforu pollenowego w DMS-pochodnej.W widmie NMR persilowanej DMS-kandycydyny stwierdzono obecnosc pasm przy <5 = 3,65 oraz S = 3,03, charakterystycznych dla wodorów grup metoksylowej i N-podstawionej metylowej. W wod¬ nych roztworach zasad z kandycydyny uwalniany jest p-aminoacetofenon, natomiast z DMS-kandy¬ cydyny — N-dwumetylo-, N-metylo- i niepodsta- wiony p-aminoacetofenon, w stosunkach molowych 3:5:2. 5 Zaleta pochodnych wedlug wynalazku jest ich - doskonala rozpuszczalnosc w wodzie, a przy tym wysoka aktywnosc przeciwgrzybowa i korzystniej¬ sza selektywna toksycznosc in vitro w stosunku do wyjsciowych, antybiotyków. ii Sposób otrzymywania trójmetyloamoniowych soli nieorganicznych makrolidów polienowych, zwlasz¬ cza soli nieorganicznych estrów "metylowych tych pochodnych ilustruja podane nizej przyklady.Przyklad I. 2,Q g polifunginy o E i%- = 800 1 cm *¦* 11 przy 304 nm rozpuszcza sie w 20 ml mieszaniny . dwumetyloformamidu z metanolem w stosunku 1:1, dodaje 2 g wodoroweglanu sodu i wjcrapla 2 ml siarczanu dwumetylu. Calosc miesza sie w tempe¬ raturze pokojowej przez 10 godzin. W tym czasie ,f praktycznie . calosc antybiotyku przereagowuje.Nastepnie pod zmniejszonym cisnieniem odparo¬ wuje sie metanol i dodatkiem eteru etylowego wy¬ traca osad, do którego dodaje sie 50 ml butanolu.Calosc odwirowuje od nierozpuszczonego wodoro- 25 weglanu sodu, zas .roztwór w butanolu przemywa dwukrotnie 20 ml wody. Frakcje butanolowa za¬ geszcza sie azeotropowo z woda pod zmniejszonym cisnieniem do objetosci okolo 15 ml i eterem ety¬ lowym wytraca ester metylowy soli trójmetyló- 30 amoniowej polifunginy. Po dwukrotnym przemyciu kolejno eterem etylowym i heksanem pochodna suszy sie w prózni, otrzymujac 1,6 g estru metylo¬ wego soli N»N,N-trójmetyloamoniowej polifunginy o Ei1cm = 700 przy 304 nm, co stanowi 80% wydaj- nosci teoretycznej.Przyklad II. 2,0 g nystatyny o E *°l°m = 860 przy 304 nm rozpuszcza sie w 50 ml metanolu, do¬ daje 2 g wodoroweglanu sodu i wkrapla 2 ml siar¬ czanu dwumetylu. Calosc miesza sie w tempera¬ turze 25°C w czasie 4 godzin. Dalszy tok postepo¬ wania jak w przykladzie I. Otrzymuje sie 1,5 g estru metylowego soli N,N,N—trójmetyloamoniowej nystatyny o E11(;{n.= 760 przy 304 nm, co stanowi 45 75°/o wydajnosci teoretycznej.Przyklad III. 1,0 g amfoterycyny B o E 11cm= 142° Przy 382 nm rozpuszcza sie w 20 ml mieszaniny dwumetyloformamidu z metanolem w stosunku 10 : 1, dodaje 1 g wodoroweglanu sodu 50 i wkrapla 1 ml siarczanu dwumetylu. Calosc mie¬ sza sie w temperaturze 15°C w ciagu doby. Dalszy tok postepowania jak w przykladzie I. Otrzymuje sie 0,9 g estru metylowego soli N,N,N-trójmetyloamo- niowej amfoterycyny B o E11°/°n = 900 przy 382 nm, 55 co stanowi 90% wydajnosci teoretycznej. Uzyskany * osad oczyszcza sie metoda rozdzialu przeciwprado- wego w ukladzie chloroform : metanol: woda (2:2:1).Otrzymano 0,3 g estru metylowego soli N,N»N- trójmetyloamoniowej amfoterycyny B o E ^°m = 80 . = 1400 przy 382 nm, Przyklad IV. Ig kandydyny o E11°/Jn=820 przy 383 nm* rozpuszcza sie w 20 ml mieszaniny dwumetyloacetamidu z metanolem w stosunku 65 10:1, dodaje 1 g wodoroweglanu sodu i wkrapla122 884 6 1 ml siarczanu dwumetylu. Calosc miesza sie w temperaturze 20°C w czasie 15 godzin. Dalszy tok postepowania jak w przykladzie I. Otrzymuje sie 0,8 g estru metylowego soli N,N,N-trójmetyloamo- niowej kandydyny o E 11c/Jn = 550 przy 383 nm, co stanowi 80% wydajnosci teoretycznej. Otrzymany produkt oczyszcza sie metoda chromatografii ko¬ lumnowej na zelu krzemionkowym wstepnie nasy¬ conym woda, w ukladzie chloroform : metanol : wo¬ da (20 : 10 : 1). Otrzymano 0,2 g pochodnej kandy¬ dyny o. E^^ = 850 przy 378 nm.Przyklad V. Ig trychomycyny o E' *°-.0m = = 450 przy 378 nm rozpuszcza sie w 20 ml miesza¬ niny dwumetyloacetamidu i metanolu w stosunku 10:1, dodaje 1 g wodoroweglanu sodu i wkrapla 1 ml siarczanu dwumetylu. Calosc miesza sie w temperaturze 20°C w czasie 15 godzin. Dalszy tok postepowania jak w przykladzie I. Otrzymano 0,6 g DMS-trychomycyny o Ex i% _ 560 przy 378 nm.Przyklad VI. 1 g pimarycyny o E i% _ = 960 przy 304 nm rozpuszcza sie w 2 ml metanolu, do¬ daje 1 g wodoroweglanu sodu i wkrapla 1 ml siar¬ czanu dwumetylu. Calosc miesza sie w tempera¬ turze 25°C w czasie 15 godzin. Dalszy tok postepo¬ wania jak w. przykladzie I. Otrzymano 0,85 g estru metylowego soli N,N,N-trójmetyloamoniowej pima¬ rycyny o E i°l°m = 700 przy 304 nm, co stanowi 80% wydajnosci teoretycznej.Przyklad VII. 1 g leworyny o E 11*/Jn = 800 przy 378 nm rozpuszcza sie w 20 ml mieszaniny dwumetyloformamidu z metanolem w stosunku 10 : 1, dodaje 1 g wodoroweglanu sodu i wkrapla 1 ml siarczanu dwumetylu. Calosc miesza sie w 20°C w czasie 15 godzin. Dalszy tok postepowania jak w przykladzie I. Otrzymano 0,7 g DMS-lewory- ny o E11°^0m = 600 przy 304 nm, co stanowi 70% wydajnosci teoretycznej.Przyklad VIII. 1 g rimocydyny o E ^n = = 600 przy 304 nm rozpuszcza sie w 20 ml miesza¬ niny dwumetyloformamidu z metanolem w sto¬ sunku 10 : 1, dodaje 1 g wodoroweglanu sodu i wkrapla 1 ml siarczanu dwumetylu. Calosc mie¬ sza sie w 20°C w czasie 15 godzin. Dalszy tok pos¬ tepowania jak w przykladzie I. Otrzymano 0,8 g estru metylowego soli N,N,N-trójmetyloamoniowej rimocydyny o E11^Jn= 560 przy 304 nm, co stanowi E °/o1 - ^1 cm - 35 80% wydajnosci teoretycznej.Przyklad IX. 0,1 g perimycyny o = 650 przy 380 nm rozpuszcza sie w 2 ml miesza¬ niny dwumetyloacetamidu z metanolem- w stosun¬ ku 10 : 1, dodaje 0,1 g wodoroweglanu sodowego i wkrapla 0,1 ml siarczanu dwumetylu. Calosc mie¬ sza sie w 20°C w czasie 10 godzin i dalej postepuje sie tak, jak w przykladzie I. Otrzymano 0,05 g soli N,N,N-trójmetyloamoniowej perimycyny o E11^}n = = 600 przy 380 nm, co stanowi 50% wydajnosci teoretycznej.Przyklad X. 1 g aureofacyny o £^^ = 800 przy 378 nm rozpuszcza sie w 20 ml mieszaniny dwumetyloformamidu i metanolu w stosunku 10:1, dodaje 1 g wodoroweglanu sodu i wkrapla 1 ml siarczanu dwumetylu. Calosc miesza sie w 20°C 10 15 20 25 w czasie 20 godzin i dalej postepuje jak w przy¬ kladzie I. Otrzymano 0,7 g DMS-aureofacyny o E i*cm= 760 przy 378 nm, co stanowi 65% wydaj¬ nosci teoretycznej.Przyklad XI. 0,1 g kandycydyny o E11°^°m = =- 400 przy 378 nm rozpuszcza sie w 5 ml miesza¬ niny dwumetyloformamidu ,i matanolu w stosunku 10 : 1» dodaje 0,1 g wodoroweglanu sodu i wkrapla 0,1 ml siarczanu dwumetylu. Calosc miesza sie w 20°C w ciagu 15 godzin i dalej postepuje jak w przykladzie I. Otrzymano 0,04 g DMS-kandycydy¬ ny o E 11g/Jn = 560 przy 378 nm, co stanowi 45% wydajnosci teoretycznej.Przyklad XII. 1 g mykoheptyny o E ^^ = = 700 przy 378 nm rozpuszcza sie w 20 ml miesza¬ niny dwumetyloacetamidu i metanolu w stosunku 10 : 1, dodaje 1 g wodoroweglanu sodu i wkrapla 1 ml siarczanu dwumetylu. Calosc miesza sie w 20°C w ciagu 15 godzin i dalej postepuje jak w przykladzie I. Otrzymano 0,8 g estru metylowego soli N,N,N-trójmetyloamoniowej mykoheptyny o i% 1 cm = 680 przy 378 nm, co stanowi 83% wydaj¬ nosci teoretycznej.Tabela aktywnosci przeciwgrzybowej i hemolitycz- nej makrolidów polienowych i ich DMS-pochodnych 45 50 Antybiotyk timarycyna DMS Polifungina DMS Nystatyno DMS Rimocydyna DMS Amfoterycyna B DMS Mykoheptyna DMS Kandydyna DMS Kandycydyna DMS Aureofacyna DMS Leworyna DMS Trychomycyna DMS Perimycyna DMS ' „ ICso (mcg/ml) i 1,7 0,08 0,15 0,1 0,25 ,5 2,5 0.03 0,08 0,05 0,2 0,054 0,15 0,005 0,005 0,005 0,003 0,007 0,009 0,005 0,01 0,002 0,002 EH50 (mcg/ml) 100 400 20 "l20 50 100 ¦ 30 50 5 5 15 65 20 70 2,5 - 15 0,35 15 2,5 . 20 3 10 5: 12. ¦ gdzie: 60 65 DMS — oznacza sól trójmetyloamoniowa estru; . metylowego antybiotyku lub sól trójme-. tyloamoniowa antybiotyku ICSo — oznacza stezenie substancji powodujace, zahamowanie wzrostu komórek Sacchya- romyces cerevisiae w pozywce plynnej; oznaczone spektrofotometrycznie przy, X = 660 nm po 24 godzinnej inkubacji w temperaturze 28°C EH50 — stezenie substancji powodujace w warun¬ kach standardowych 50% uwolnienie he¬ moglobiny oznaczone spektrofotomet¬ rycznie przy X = 550 nm.122 884 Zastrzezenia patentowe 1. Sposób otrzymywania trójmetyloamohiowych soli nieorganicznych pochodnych makrolidów poli- enowych, zwlaszcza soli nieorganicznych estrów metylowych o wzorze ogólnym przedstawionym na rysunku w którym R oznacza reszte makrolidu polienowego, n równa sie 0 lub 1, zas X oznacza anion soli nieorganicznej jak metylosiarczan, siar¬ czan, chlorek, fosforan, znamienny tym, ze na makrolid polienowy w rozpuszczalniku organicz¬ nym lub ich mieszaninie, w temperaturze pokojo¬ wej oraz przy ciaglym mieszaniu dziala sie siar¬ czanem dwumetylu w obecnosci wodoroweglanu sodu, calosc pozostawia do przereagowania, a nas- 10 15 S tapnie uzyskany produkt wydziela sie ze srodo¬ wiska reakcji eterem etylowym, rozpuszcza w bu¬ tanolu, przemywa woda, zageszcza pod zmniejszo¬ nym cisnieniem i wytraca eterem etylowym i wy¬ tworzony metylosiarczan trójmetyloamoniowy prze¬ prowadza sie znanymi sposobami w inne sole nie¬ organiczne. 2. Sposób wedlug zastrz. 1 znamienny tym, ze jako makrolidy polienowe stosuje sie nystatyne, polifungine, amfoterycyne B, kandycydyne, pima- rycyne, trychomycyne, leworyne, rimocydyne, peri- mycyne, kandydyne, i aureofacyne. 3. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze jako rozpuszczalniki organiczne stosuje sie dwu- metyloacetamid, dwumetyloformamid, metanol.R-N/CHJS 3/17 X • OZGraf. Z.P. Dz-wo, z. 896 (90+15) 4.84 Cena 100 il PL