Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarza¬ nia inkluzyjYiych kompleksów prostacykliny i jej estrów alkilowych o 1—4 atomach wegla z cyklo¬ dekstrynami.Prostacykliny i ich pochodne znajduja zasto¬ sowanie do hamowania skupiania sie plytek krwi, potencjalnie moga znalezc zastosowanie jako czyn¬ niki przeciw zakrzepicy. Dotychczas jednak zwiaz¬ ki te nie byly stosowane do celów klinicznych wskutek ich niestabilnosci w roztworach wod¬ nych.Sposobem wedlug wynalazku wytwarza sie nowe inkluzyjne kompleksy prostacykliny i jej pochodnych z cyklodekstrynami, które sa stabil¬ ne w roztworach wodnych i wykazuja przedlu¬ zone dzialanie.W pierwszym etapie biosyntezy prostaglandy- ny, poczynajac od kwasu arachidonowego, w pro¬ cesie enzymatycznym tworza sie endonadtlenki, oznaczane PGGa i 'PGiH2- 'Powyzsze endonadtlenki sa krancowo nietrwale, o czasie póltrwania okolo kilku sekund, Gdy plytki zderzaja sie ze sciana¬ mi naczyn, z plytek uwalniaja sie powyzsze endo¬ nadtlenki, które nastepnie przeksztalcaja sie w prostacykliny pod wplywem enzymu, wytwarza¬ nego przez sciany naczyn. Gdy naczynie jest u- szkodzone i nie wytwarza enzymu, który prze¬ ksztalca endonadtlenki w prostacykline, przeksztal¬ caja sie one w tromboksan, który przyspiesza sku¬ pianie sie plytek i prowadzi do zakrzepicy.Zakrzepica stanowi statystycznie najpowazniej¬ szy czynnik powodujacy smiertelnosc ludzi mlo¬ dych i w srednim wieku. Obecnie nie ma na¬ prawde skutecznego sposobu rozbijania juz u- 5 tworzonych zakrzepów i zapobiegania smiertel¬ nemu tworzeniu sie skrzepów. Skuteczny srodek, farmacetuczny rozbijajacy zakrzepy móglby rato¬ wac zycia w przypadkach ataków serca, zawalów oraz zakrzepicy serca, zapobiegajac dalszemu roz- io wojowi zakrzepów juz utworzonych i powodujac ich rozbicie. Srodek taki mozna by stosowac równiez np. do zapobiegania zakrzepicom przed- i pooperacyjnym.Prostacyklina (PGIj) pod wzgledem budowy i5 chemicznej stanowi (5Z)-9-dezoksy-6,9 a-epoksy- -A3-prostaglandyne-Fla. Zaobserwowano, ze zwia¬ zek ten ma niezwykle silne dzialanie hamujace skupianie sie plytek i usuwajace juz utworzone zakrzepy. iDotychczas jednak niemozliwe wydawa- 23 lo sie praktyczne jej zastosowanie z uwagi na bardzo krótki biologiczny czas póltrwania (okolo 2 minut). W wodnym roztworze zwiazek ten w znacznej mierze rozklada sie w ciagu okolo 4 mi¬ nut. Krancowa nietrwalosc tego zwiazku spowo- 25 dowana jest jego budowa chemiczna. Mozliwosc wytwarzania stabilizowanej, a wiec odpowiedniej do zastosowania w terapii prostacykliny lub jej pochodnych bylo wiec zagdnieniem o wielkim zna¬ czeniu praktycznym (Science, 20 grudnia 1976, s. 30 17). 121 664121664 Sposobem wedlug wynalazku wytwarza sie in¬ kluzyjne kompleksy prostacykliny lub jej pochod¬ nych z cyklodekstrynami.Cyklodekstryny stanowia pierscieniowe czastecz¬ ki, skladajace sie z 6, 7 lub 8 jednostek glikopi- ranbzy, tworzacych jednostki Struktura ich charakteryzuje sie specjalnym ukla¬ dem grup hydroksylowych. Wszystkie drugorzedo- we grupy hydroksylowe usytuowane sa . na jed¬ nej krawedzi pierscienia, a wszystkie pierwszo- zedowe grupy hydroksylowe znajduja sie na dru¬ giej krawedzi tego pierscienia. Wskutek tego ze¬ wnetrzna powierzchnia pierscienia jest zasadniczo hydrofilowa, co zapewnia rozpuszczalnosc cyklo- dekstryn w wodzie.Z drugiej strony, wewnetrzna powierzchnia pierscienia ma charakter hydrofobowy, poniewaz w tej czesci znajduja sie tylko atomy wodoru i glikozydowe mostk tlenowe. W rezultacie, jezeli do wodnego roztworu cyklodekstryn doda sie cza¬ steczki, które sa inniej polarne niz woda i o ta¬ kim ksztalcie i wymiarze, który umozliwia im penetracje do wneki wewnatrz cyklodekstryny, juz w roztworze wodnym tworza sie inkiuzyj ne kom¬ pleksy cyklodekstryny. Sposób ten znajduje za¬ stosowanie w stabilizacji wielu zwiazków.Sposób ten znajduje równiez zastosowanie do obnizenia napiecia niektórych zwiazków i do o- ohrony róznych substancji przed utlenieniem at¬ mosferycznym. Pierscien, zlozony z jednostek gliko- piranozy nazywany jest ia-cyklodekstryna, z 7 jed- nostek-J3-cyklodekstryna oraz pierscien z 8 jedno¬ stek glikopiranozy-y-cyklodekstryna.Kompleksy inkluzyjne wytwarzane sposobem wedlug wynalazku sa znacznie bardziej stabilne i maja znacznie bardziej przedluzone dzialanie niz prostacyklina i jej pochodne, mozna je stosowac jako substancje czynne srodków farmaceutycznych do celów Klinicznych. Srodki te moga byc po¬ dawane w postaci wstrzykiwan dozylnych albo w postaci tabletek podjezykowych itp., do leczenia i zapobiegania wytwarzania sie wyzej wymienio¬ nych zakrzepów. Poniewaz kompleksy te dziala¬ ja bardzo gwaltownie, zastosowanie ich mozna w wielu przypadkach uratowac zycie.Pochodne prostacykliny, stosowane do wytwa¬ rzania kompleksów sposobem wedlug wynalazku stanowia estry.Prostacykline i jej pochodna mozna wytwarzac sposobami opisanymi w nastepujacyoh publikac¬ jach: Tetr. Let. 30, 26—27 (1977); J. Am. Chem.Soc. 99, 2006, (1977).Sposób wedlug wynalazku polega na tym, ze do wodnego roztworu ny lub dowolnej ich mieszaniny, ewentualnie za¬ wierajacego równiez sole organiczne lub nieor¬ ganiczne wprowadza sie organiczny roztwór pro¬ stacykliny lub jej ester, korzystnie alkilowy o 1—4 atomach wegla, nastepnie z otrzymanej mie¬ szaniny usuwa rozpuszczalnik i utworzony kom¬ pleks inkluzyjny wyodrebnia sie z roztworu.Wodne roztwory cyklodekstryn moga zawierac równiez bufory fosforanowe. Inkluzyjne komplek¬ sy prostacykliny lub jej estry alkilowe z cyklo- dekstrynami wyodrebnia sie w niskiej tempera¬ turze przez liofilizacje lub krystalizacje.Tak wytworzone kompleksy inkluzyjne mozna przeksztalcac w konwencjonalne preparaty farma- 5 ceutyczne znanymi sposobami. Preparaty te za¬ wieraja powyzsze kompleksy inkluzyjne w po¬ laczeniu z konwencjonalnymi zarobkami, rozcien¬ czalnikami, regulatorami mocy jonowej iAub inny¬ mi dodatkami. Mozna je podawac w postaci roz- io tworów do wstrzykiwan i wlewek, tabletek do¬ ustnych lub podjezykowych, kapsulek, drazetek lub ampulek proszkowych.Jako cyklodekstryne mozna stosowac Y- cyklodekstryne albo .dowolne mieszaniny. 15 Pochodne prostacykliny, obejmujace tez prosta- cykline, mozna rozpuszczac w róznych mieszaja¬ cych sie z woda, niemieszajacych sie z woda lub innych rozpuszczalikach, które mieszaja sie z wo¬ da w sposób ograniczony. iMozna tu stosowac np. 20 etery jak eter dwuetylowy, czterowodorofuran lub dioksan, ketony np. aceton, sulfotlenki np. sul- fotlenek dwumetylu oraz amidy alkilowane przy atomie azotu, jak dwumetyloformamid. Mozna tez stosowac mieszaniny dwóch lub wiecej rozpusz- 25 czalników.Wodne roztwory cyklodekstryn korzystnie rów¬ niez zawieraja rózne sole organiczne lub nieorga¬ niczne lub bufory, korzystnie fosforanowe które graja role w stabilizacji i nastawianiu pH i mocy 30 jonowej roztworu.Testy na dzialanie hamujace skupienie plytek Testy prowadzone na agregametrze Borna, na krwi ludzkiej. Skupianie indukowane bylo za po¬ moca 20 umoli ADP (trójfosforan adenozyny) lub 35 za -pomoca 1,2 mola kwasu arachidonowego. Kom¬ pleks inkluzyjny prostacykliny z j3-cyklodekstryna dodawano do zawiesiny plytek przed dodaniem srodka indukujacego. Teksty prowadzono w 20°C.Skupianie indukowane za pomoca kwasu ara- 40 chidowego Swiezy wodny roztwór kompleksu inkluzyjnego prostacykliny z |3-cyklodekstryna o stezeniu pro¬ stacykliny 40 fjig/ml nie wywolywal dzialania ha¬ mujacego na skupianie sie plytek, mujacego na skupienie sie plytek. Ten sam roz¬ twór, podawany .po 30 min. stania w temperatu¬ rze pokojowej, wywolywal 20 % hamowania.Roztwór, zawierajacy kompleks w ilosci odpo- 50 wiadajacej stezeniu prostacykliny 5 jig/ml wywo¬ lywal calkowite hamowanie skupiania sie plytek nawet po 30, 60 i 150 min. po przygotowaniu roz¬ tworu.Jezeli roztwór inkluzyjnego kompleksu prosta- 55 cykliny z 0-cyklodekstryna pozostawiano na 2 go¬ dziny w temperaturze pokojowej mozna bylo wy¬ wolac calkowite zahamowanie (100 %) nawet przy stezeniach 1 jAg/ml.Skupianie indukowane za pomoca ADP 60 Kompleks inkluzyjny prostacykliny z (3-cyklo- dekstryna rozpuszczono w wodzie i pozostawiono w temperaturze pokojowej na 4 godziny. (Nastepnie obserwowano hamowanie skupiania, indukowane przez ADP. Otrzymane wyniki zestawiono w Tab- 65 licy.121 664 6 Tabl 1 Stezenie prostacykliny 10 ng/ml 100 ng/ml 1 1 n,g/ml | 10 pig/ml ica Hamowanie 50i°/o | ioo% 1 100»/o I 100°/* | Przy roztworach, zawierajacych 20—400 ng/ml prostacykliny mozna spowodowac rozbijanie za¬ krzepów, wytworzonych pod wplywem ADP lub ristocetyny. Te same wyniki otrzymano w przy¬ padku pozostawiania roztworów w temperaturze pokojowej na 120 minut przed ich zastosowaniem.W swietle faktu, ze saima proistacyikMina irozklada sie w wodnych roztworach w ciagu 4 minut, po¬ wyzsze wyniki wykazuja, ze stabilnosc prostacy- kliny zostaje bardzo podwyzszona przez wytwa¬ rzanie jej kompleksu z cylklodekstryna. Zaobser¬ wowany fakt, ze swieze roztwory nie wykazuja dzialania hamujacego w stosunku do skupiania sie plytek spowodowany jest tym, ze dyisocjaoja kom¬ pleksów inkluzyjnych wymaga pewnego czasu.Z punktu widzenia farmakologicznego cecha ta jest bardzo korzystna, poniewaz w czasie podawa¬ nia stezenie PGI2 nie jest tak wysokie, aby moglo szkodzic, podczas gdy pózniej szybka dysocjacja inkluzyjnego kompleksu zapewnia, ze stezenie PGI2 utrzymuje biologicznie czynny poziom w cia¬ gu dlugiego czasu.Przy dodawaniu samej PGI2 do krwi ludzkiej, obserwuje sie czynnosc rozbijajaca w ciagu okolo 2 minut. W tym bardzo krótkim okresie czasu PGI2 calkowicie sie rozklada. W przeciwienstwie do powyzszego, kompleks inkluzyjny prostacykli¬ ny wykazuje czas trwania czynnosci 10 minut, czyli czynnosc jego jest pieciokrotnie przedluzona w stosunku do PGI2.Preparat tetnicy krezkowej traktowano wodnym roztworem inkluzyjnego kompleksu PGI2 z 0-cy- klodekstryna. Zaobserwowano tymczasowy efekt rozluzniajacy charakterystyczny dla prostacykliny.Przy traktowaniu kompleksem inkluzyjnym pre¬ paratu z macicy szczura zaobserwowano skurcz odpowiadajacy 0,01—0,001 wielkosci wywolywanej przez PGR2. Skurcze wywolywane za pomoca szoków elektrycznych na arterii usznej królika hamowane byly inkluzyjnymi kompleksami o ste¬ zeniu substancji czynnej 10—&0 ng/ml. Ester ety¬ lowy PGI2 wykazywal ten sam efekt w stezeniu 0,2—0,4 ng/ml.Badano wplyw amylazy zawartej w slinie na cyklodekstryny i ich kompleksy. Ocena sposobu dzialania tej reakcji jest konieczna do zbadania, czy predkosc zwalniania PGI2 jest regulowana przez dysocjacje kompleksu czy tez przez enzyma¬ tyczna hydrolize cyklodekstryny.Zgodnie z naszymi doswiadczeniami w buforze fosforanowym o wartosci pH = 6 w 35°C naste¬ puje calkowicie rozklad skrobi rozpuszczalnej do cukru redukujacego (100%). Z drugiej strony, wy¬ mierny wzrost zdolnosci redukujacej 0-cyklode- kstryny pojawia sie dopiero po 5 godzinach. Mo¬ zna Wiec wyciagnac wniosek, ze |3-cyklodekstry*ia jest praktycznie odporna na sline. Z tego stwier¬ dzenia wynika, ze z tabletek podjezykowyeh pro- stacyklina moze wydzielac sie tylko wskutek dy- 5 socjacji inkluzyjnego kompleksu.Kompleks sporzadzony wedlug przykladu II przetrzymywano w zatopionej ampulce w ciagu 5 dni, w temperaturze pokojowej. Nastepnie ampulke otwierano, zawartosc wlewano do kolby 10 i dodawano 500-krotna objetosc eteru. Kolbe szcze¬ lnie zamykano i mieszanine mieszano w tempe¬ raturze pokojowej w ciagu 30 godz. Od czasu do czasu pobierano próbke mieszaniny reakcyjnej i,poddawano ja chromatografii cienkowarstwowej 15 (Kieselgel F254 produkcji Mertik'a przy uzyciu mieszaniny 1:1 octanu etylu i acetonu jako eluentu i kwasu chromosiarkowego do wywolywania. Na¬ wet po 30 godz. otrzymywano tylko plamke odpo¬ wiadajaca estrowi metylowemu prostacykliny 20 (Rf = 0,50). Nie obserwowano objawów rozkladu, mianowicie kompleks byl stabilny w rozpuszczal¬ niku ap-roitomowym przy obojetnej wartosci pH.Badajac stabilnosc kompleksów estrów etylo¬ wych prostacykliny z 0-cyklodekstryna, otrzyma- 25 nych zasadniczo wedlug przykladu II, otrzymano nastepujace wyniki: Czas póltrwania rozkladu inkluzyjnego komple¬ ksu wynosi 87 minut przy stezeniach 10 ng/ml, w wodnych roztworach (pH = 6,8—7). 30 W tych samych warunkach czas póltrwania sa¬ mego estru etylowego prostacykliny wynosi ii mi¬ nut.W przypadku podawania doustnego, cyklode¬ kstryny nie sa toksyczne. Podawano 500 mg 0-cy- 35 klodekstryny w postaci zawiesiny w 0,01°/o roztwo¬ rze metylocelulozy przez przewód pokarmowy sa¬ micom szczurów CFY o przecietnej wadze 250 g.Badane zwierzeta obserwowano w ciagu 34 dni.Stwierdzono, ze rozwijaly sie one w ten sam 40 sposób, co zwierzeta kontrolne, nie zauwazono zadnych sladów toksycznosci.Przy podawaniu dozylnym obserwowano: LD50 (Lv.) dla a-cykjodekstryny = 1 g/kg ciezaru ciala LD50 45 ciezaru ciala dla szczurów Spraaue-Dawley (Amer.J. Pathol. 83, 367 (107i6).Z wyników powyzszych doswiadczen widzimy, ze skuteczne stezenie inkluzyjnych kompleksów prostacykliny z cyklodekstryna jest zawarte w za- 50 kresie 0rl—1 (Jig/ml. Obliczajac na 5 litirów krwi, potrzebne jest wiec 0,1^5 mg PGI2, co oznacza 2—100 mg inkluzyjnego kompleksu PGI2 o steze¬ niu PGI2 5°/f. Preparty do wstrzykiwan dozylnych i tabletki podjezykowe powinny zawierac stezenie 55 substancji czynnej w powyzszych granicach.Wynalazek opisano bardziej szczególowo w na¬ stepujacych przykladach, nie ograniczajac jego za¬ kresu.Przyklad I. Do 1 ml roztworu buforu fo- 60 sforanowego o wartosci pH = 8 dodaje sie 6 ml destylowanej wody. Roztwór ogrzewa sie do 30°C i dodaje 190 mg j3-cyklodekstryny (o zawartosci wody 14°/o). Po zakonczeniu rozpuszczania dodaje sie 8 mg PGI2 w 31 ml eteru w ciagu 1 godziny, 65 mieszajac. Pary eteru usuwa sie mieszajac pod121664 nieco zmniejszonym cisnieniem. Po calkowitym usunieciu par eteru roztwór pozostawia sie do ostygniecia do temperatury pokojowej, stale mie¬ szajac, w ciagu 1 godziny. Roztwór nastepnie za¬ mraza sie i liofilizuje w konwencjonalny sposób.Otrzymuje sie 18-2 mg suchego kompleksu prosta- cykliny z p-cyklodekstryna w postaci bialego roz¬ puszczalnego w wodzie proszku, który przy ogrze¬ waniu rozpada sie bez stopienia.Przyklad II. 10 mg estru metylowego pro¬ stacykliny rozpuszcza sie w 2 ml eteru etylowego.Oddzielnie rozpuszcza se 200 img bezwodnej fi- -cylkiodelksitryny tw miesizanioie 1 ml buforu o war¬ tosci pH = 8 d 5,5 iml wody destylowanej w <30^p; dodaje sie do roztworu wyzej opisany roztwór estru metylowego prostacykliny. Mieszanine mie¬ sza sie w ciagu 1 godziny pod lekko zmniejszo¬ nym cisnieniem, a nastepnie wytrzasa na wytrza¬ sarce w ciagu dalszych dwóch godzin w tempera¬ turze pokojowej. Roztwór zamraza sie i liofilizuje.Otrzymuje sie 198 mg kompleksu estru metylowego prostacykliny z p^yklodekstryna w postaci bez¬ postaciowego, rozpuszczalnego w wodzie proszku, rozkladajacego sie przy ogrzewaniu bez stapiania.Zastrzezenia patentowe 1. Sposób wytwarzania inkluzyjnych komplek¬ sów prostacykliny i jej estrów alkilowych o 1—4 atomach wegla z cykiodekstrynami, znamienny tym, ze do wodnego roztworu a-, 0- lub y-cyklo- dekstryny lub dowolnej ich mieszaniny, ewentu- 10 15 20 25 alnie zawierajacego równiez sole organiczne luo nieorganiczne, wprowadza sie roztwór prostacy¬ kliny lub jej estru w rozpuszczalniku organicz¬ nym, nastepnie z otrzymanej mieszaniny usuwa sie rozpuszczalnik organiczny i wyodrebnia sie z pozostalego roztworu inkluzyjny kompleks prosta¬ cykliny lub jej ester alkilowy z cyklodekstryna. 2. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze w przypadku wytwarzania inkluzyjnych komplek¬ sów estru metylowego prostacykliny z cyklode¬ kstrynami poddaje sie reakcji roztwór estru me¬ tylowego prostacykliny w rozpuszczalniku orga¬ nicznym z wodnym roztworem cyklodekstryn, ewentualnie zawierajacym równiez sole nieorga¬ niczne lub organiczne. 3. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze wprowadza sie roztwór eterowy prostacykliy lub jej estrów alkilowych do wodnych oroizltiwoirów cy¬ klodekstryn, ewentualnie zawierajacych równiez sole nieorganiczne i organiczne. 4. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze wprowadza sie roztwór prostacykliy lub jej estrów alkilowych w rozpuszczalnikach organicznych do wodnych roztworów cyklodekstryn, zawierajacych równiez bufory fosforanowe. 5. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze inkluzyjne kompleksy prostacykliny luib jej estrów alkilowych z cyklodekstrynami wyodrebnia sie w niskiej temperaturze przez krystalizacje. 6. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze inkluzyjne kompleksy prostacykliny lub jej estrów alkilowych z cyklodekstrynami wyodrebnia sie przez liofilizacje.Drukarnia Narodowa, Zaklad Nr 6, 330/83 Cena 100 zl / PL PL PL PL PL PL PL