Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarza¬ nia fermentowanego produktu z mleka zawieraja¬ cego zdolne do zycia bifidobakterie przez hodowa¬ nie bifidobakterii w srodowisku mlecznym. Nowy produkt ma zastosowanie,jako produkt spozywczy i napój lub jako dodatek do tych produktów.Bifidobakterie sa dobrze znane jako bakterie dominujace znalezione we florze jelitowej nie¬ mowlat karmionych piersia. Bifidobakterie znane sa w celu otrzymywania nastepujacych róznorod¬ nych wlasciwosci fizycznych, a mianowicie: (a) tlumienia rozwoju bakterii gnilnych, (b) inhibitowania wytwarzania toksycznych amin, (c) promotorowania trawienia kazeiny mleka ko¬ biecego przez dzialanie fosfatazy fosforoproteiny oraz (d). inhibitowania wzrostu bakterii chorobotwór¬ czych w polaczeniu z obnizaniem wartosci pH w jelitach przez wytwarzanie kwasu mlekowego, kwasu octowego, kwasu mrówkowego i podobnych.Jednakze niemowle, które jest karmione butelka (lub „noworodek karmiony butelka"), ma bardzo malo bifidobakterii jelitowych wymienionych po¬ wyzej co ma bairdzo znaczacy wplyw na utrzy* manie zdrowych jelit. Jest to racjonalna przy¬ czyna tego, ze niemowleta karmione butelka sa szczególnie podatne na choroby jelit w porówna¬ niu z niemowletami karmionymi piersia. Z iego__ wzgledu w celu przeksztalcenia flory jelit niemo¬ wlat karmionych butelka na podobna do tej, któ- 15 25 80 ra wystepuje u niemowlat karmionych piersia wy¬ twarzano doswiadczalnie zmodyfikowane, mleko w proszku dla niemowlat, zawierajace bifidobakte¬ rie jako substytut mleka kobiecego.Jednakze zgodnie ze znanym sposobem hodowa¬ nia bifidobakterii w srodowisku takim jak mleko i podobne, napotyka na pewne trudnosci i z tego wzgledu sposób ten nie moze byc praktycznie przeprowadzany na skale przemyslowa. Trudnosci te stanowi (w porównaniu z procesem wytwarza¬ nia bakterii kwasu mlekowego, które sa bardzo szeroko stosowane w obróboe mleka) to, ze: (a) warunki hodowli musza byc scisle beztle¬ nowe; (b) wymaganie dotyczace .odzywek dla przepro¬ wadzania hodowli jest skomplikowane oraz scisle okreslone i dlatego bakterie nie rozmnazaja sie w srodowisku czystego mleka, które nie zawiera zadnych substancji promotorujacych wzrost, takich jak ekstrakt drozdzy i podobne; oraz to, ze (c) trudno jest utrzymac bakterie zdolne do zycia w ciagu dlugiego okresu czasu przy niskiej wartosci pH w konwencjonalnej fermentacji mle¬ ka, poniewaz odpornosc na dzialanie kwasu bifido¬ bakterii jest niska.Jezeli substancja promotorujaca wzrost bifido¬ bakterii jest dodawana do srodowiska mlecznego, wówczas bifidobakteria moze byc ewentualnie ho¬ dowana w srodowisku tlenowym. Jednakze pro- 107 561s 107561 4 dukty tej hodowli czesto wplywaja szkodliwie ha smak i zapach. Dodatkowa wada jest to, ze sub¬ stancje promotorujace wzrost sa ogólnie kosztow¬ ne i dlatego nie maja praktycznego zastosowania.Podczas badania kultury z zastosowaniem bifi¬ dobakterii, nieoczekiwanie wykryto nowy szczep bifidobakterii, który ma przedluzona aktywnosc rozwojowa w warunkach tlenowych w srodowisku czystego mleka, które nie zawiera zadnych sub¬ stancji promotorujacych wzrost lub srodków re¬ dukujacych.Odkrycie tego wariantu bifidobakterii jest pod¬ stawa, niniejszego wynalazku.* Pierwszorzedne wlasciwosci typowego szczepu -bifidobakterii (Bifidobacterium bifidum YIT-4005) Stosowanego w sposobie wedlug wynalazku opisa¬ no ponizej. Ten nowy szczep wyizolowano z od¬ chodów zdrowego niemowlaka karmionego piersia p'r2sez 4tirkakrotn4 obróbke, roztworem buforowym o niskiej"wartosci pH. (1) Wlasciwosci taksonomiczne.Szczep ten jest gramo-dodatnia paleczka nie wytwarzajaca zarodników i ma postac komórko- watych granulek porównywalnych z blekitem me¬ tylenowym. Wedlug obserwacji mikroskopowych bakterie sa polimorfiezne z nacietymi koncami w ksztalcie litery Y lub wygieciem. Kolonie ufor¬ mowane przez metode plytkowa podwójnej war¬ stwy maja ksztalt cylindryczny, wypukly lub so- czewkowaty, a kolonie uformowane u dolu plytki maja rózne ksztalty. Podczas hodowania w srodo¬ wisku odtluszczonego mleka (o zawartosci sub¬ stancji stalej = 12%) w ciagu 72 godzin tworzy sie kwas octowy i kwas mlekowy w stosunku wynoszacym 1,7 ± 0,5 (kwas octowy/kwTas mle¬ kowy).Ponadto otrzymuje sie nastepujace wyniki prze¬ prowadzonych testów: aktywnosc katalazowa (—), aktywnosc koagulujaca mleko ( + ), hydroliza zela¬ tyny (—), aktywnosc redukowania azotanów (—), wytwarzanie indolu (—) i wytwarzanie siarkowo¬ doru (—).. Bakteria stosowana w sposobie wedlug wynalaz¬ lo 15 10 25 30 35 ku wykazuje dodatnia reakcje fermentacji w od¬ niesieniu do nastepujacych cukrów: glukozy, fruk¬ tozy, laktozy i galaktozy. Bakteria ta wykazuje negatywna reakcje fermentacji wobec cukrów,, takich jak arabinoza, ksyloza, salicyna, mannoza,. mannitol, melecytoza, cellobioza, sorbit, inulina,, trehaloza, ramnoza, maltoza, ryboza i sorboza.W odniesieniu do wyzej wymienionych wlasci¬ wosci ten szczep bakterii koresponduje z Bifido¬ bacterium bifidum wedlug Bargey'a Manual z 1974,. lecz bakteria ta jest sklasyfikowana jako wariant Bifidobacterium bifidum ze wzgledu na to, ze po¬ siada nowe wlasciwosci, których nie posiada zna¬ na bakteria i wariant ten nazwano „Bifidobacte¬ rium bifidum YIT-4005". (2) Warunki wzrostu.Temperatura: 25^5°C (optimum 36—38°C), Wartosc pH 5—7 (optimum pH 6—7). (3) Odpornosc na dzialanie kwasu.Szczep ten oraz szczep standardowy (Bifidobac¬ terium bifidum E319, który nazwano ponizej „szczepem standardowym"), hodowano odpowied¬ nio w warunkach beztlenowych w srodowisku cie¬ klym VL-G w ciagu 48 godzin i hodowana bak¬ terie zbierano aseptycznie przez odwirowanie.Przemyta zawiesine komórek (OD660 mji = 1,5) do¬ dawano do roztworów buforowych (pH 6,0 : 1) 100M kwas fosforowy; pH 5,0—4,0:1 (100M kwas octowy) o róznych wartosciach pH jak przedsta¬ wiono w tablicy I. . Wytworzone roztwory utrzy¬ mywano w temperaturze 5°C dla okreslania zy¬ wotnosci bakterii w danym czasie.Jak przedstawiono w tablicy I, w przypadku standardowego szczepu ilosc bakterii zdolnych do zycia szybko zmniejszala sie wraz z obnizaniem wartosci pH (zwlaszcza ponizej 4,6). W przypadku nowego szczepu stosowanego wedlug wynalazku ilosc zdolnych do zycia bifidobakterii byla bardzo stabilna nawet przy wartosci pH bliskiej 4,0 i dla¬ tego nowe bakterie sa wysoce odporne na dziala¬ nie kwasu (liczba podana w tablicy I wskazuje ilosc zdolnych do zycia bakterii w mililitrze).Tablica I | PH 6,0 5,0 4,6 4,3 4,1 4,0 1 szczep* V s V s V s V s V s V s 1 Czas obserwacji (dni) 1 0 |*3 4,7 x 10* 4,5x10* 5,0 xl08 4,9 x 108 4,2 X 108 4,5 xl08 4,6 xl08 4,2 xl08 4,7 X IO8 4,5 x!08 5,0 x!08 4,9 xl08 3,8 x 108 3,1 xl08 3,8 x 10* 3,1x 10* 5,1 x 108 1,0 x 10^ 4,0 x 108 3,9 xl06 9,5 xl07 4,1 x 104 7,0,x 10* 1,2 x 10* 5 3,7 x 108 658xl07 2,4x10* 5,5x10* 4,2 x 103 3,6 xl02 2,1 x 108 2,1 x 104 3,4 xl07 1,0 xl03 &,0xl05* < 10* i 7 40,xl08 4,2 xl07 3f,0 x 10* 1,9 xl07 2,0 x 10' 4,0 xl03 6,9 x 107 < 102 5,6 xl06 < 102 ^~2y8xi05 < 109 10 | 3.0 xl08 2.1 x 107 | 3,3 xl08 2,1 x 10» | 9,3 xl07 < 102 | 3,0 xl07 < 102 * | 43x105 < 1Q2 [ 2,9 x 10* < 10* | *V, Bifidobacterium bifidum YIT-4005 S. Bifidobacterium bifidum E 319107 561 Te sama tandecje stwierdzono w kulturze mle¬ kowej. Rózne szczepy bifidobakterii przedstawione w tablicy II hodowano w srodowisku mleka od¬ tluszczonego (zawartosc substancji stalej = 10°/o) zawierajacego 0,3% ekstraktu drozdzy az pH kul¬ tur Uzyskala wartosc przedstawiona w tablicy.Nastepnie kultury szybko chlodzono i utrzymywa¬ no w temperaturze 5°C dla okreslenia zywotnosci bakterii w czasie. odpornosci na dzialanie kwasi1., oznaczona pod numerem depozytowym FERM-P nr 3371.Ogólnie szczepy, które rozmnazaja sie w warun¬ kach tlenowych do tych samych granic jak Bifido¬ bacterium bifidum YIT-400f5 stosowany w sposo¬ bie wedlug wynalazku sa korzystnie wykorzysty¬ wane do wytwarzania sfermentowanego mleka- Chociaz odpornosc na dzialanie kwasu nie zaw¬ sze jest zalezna od stosowanych produktów, to Tablica II pH 4,61 4,21 Szczep* V s A B C D V S A B C D Czas obserwacji (dni) l 0 ! 3 | 5 i 7 | 10 | 4,1 x 109 6,8 x 108 3,3 x 1C9 1,5 xl09 8,8 xl08 4,3 x 109 1.8 xl09 2,5 xl08 9.9 x 108 4,2 x 109 2,1 x 10n 7,7 xl08 f 3,1 x 10° 2,0 xl07 5.6 x 108 2.7 x 108 6,2 x 107 7,1 x 108 7,6 x 108 2.0 x 106 7,5 X 106 2,5 xl07 1,5 xl07 2.1 xl07 2,0 xl09 4,3x10" 1,5 xl07 5,3 xl07 2,5 x 10e 7,9 xl07 9,8 x 108 4,5 x 104 8.2 x 105 4,9x10* 8,7 x 104 6.3 x 105 7,6 x 108 5,3 xl05 4,3 x 106 _ 9,6 x 106 5,1 x 105 6,3 X 106 7,0 xl07 < 102 2.3 x 103 2.4 x 103 < 102 1.5 x 104 4,3 xl08 1,6 x 104 [ 2,1 x 105 7,7 x 108 2,9 x 104 4,4x10^ [ 2,4 xl O6 < 10* < 10- < 102 < 102 < 102 | *V: Bifidobacterium bifidum YIT-4005 S: Bifidobacterium bifidum E 319 A: Bifidobacterium bifidum B: Bifidobacterium bifidum YIT-4002 C: Bifido~bacterium longum szczep standardowy D: Bifidobacterium longum (4) Wzrost w srodowisku tlenowym.Srodowisko mleka odtluszczonego (zawartosc substancji stalej = 12%) sterylizowano przez ogrzewanie, a nastepnie chlodzono do temperatury 37°C, przy czym przez srodowisko przepuszczano powietrze. Nowy szczep i szczepy porównawcze przedstawione w tablicy 2 odpowiednio hodowano w wymienionym srodowisku w temperaturze 37°C.Zmiane w ilosci zdolnych do zycia bakterii oraz kwasowosc hodowli (mililitry 0,1N wodorotlenku sodu wymagane do zobojetnienia 10 ml hodowli) podczas hodowania przedstawiono na fig. 1. Ozna¬ czenia na wykresie dotycza tych samych danych jakie przedstawiono w tablicy 2.Jak wynika z tego wykresu, nowa bakteria stosowana w sposobie wedlug wynalazku rozmna¬ zala sie dajac 109 komórek zdolnych do zycia /ml lub wiecej. Z poczatkowej populacji 107—108/ml w ciagu 24 godzin przy czym szczep standardowy nie rozmnazal sie w tycti warunkach.Tendencja rozmnazania nowych bakterii jest zasadniczo taka sama jak w warunkach beztleno¬ wych.Nowy szczep stosowany w sposobie wedlug wy¬ nalazku, to jest Bifidobacterium bifidum YIT-4005 zdeponowano w Fermentation Research Institute, Ageney of Industrial Science and Technology nr 8-1, Inage Higashi-5- -ken, Japonia. Numer i oznaczono FERM-P nr 3372.Bifidobacterium bifidum YIT-4002 przedstawiono w tablicy 2 jako szczep porównawczy majacy wiekszosc takich samych wlasciwosci jak nowa Bifidobacterium bifidum YIT-4005 za wyjatkiem 35 45 50 55 60 65 odpornosc taka sama jak nowej bakterii jest po¬ zadana. Populacja bifidobakterii zdolnej do zycia powinna wynosic co najmniej 104/ml ro 7 dniach 'przechowywania w srodowisku o wartosci pH 4,0 stosowanym podczas otrzymywania danych przed¬ stawionych w tablicy I.Jak nadmieniono powyzej, korzysci zastosowa¬ nia nowego szczepu bifidobakterii wedlug wyna¬ lazku wymieniono ponizej: (a) latwa jest hodowla bez stosowania specjal¬ nych warunków hodowlanych. Tak, ze latwo roz¬ mnaza sie w warunkach tlenowych bez dodawa¬ nia jakichkolwiek substancji promotorujacych: wzrost, (b) problem znieksztalcania zapachu przez do¬ datki promotorujace wzrost jest rozwiazany i doj¬ rzewanie kulturowanego produktu jest proste, (c) poniewaz kulturowany produkt otrzymany sposobem wedlug wynalazku nie zawiera zadnych dodatków promotorujacych wzrost, korzystnie sto¬ suje sie go do wytwarzania pokarmu dla niemo¬ wlat lub dodatku do pokarmu dla niemowlat, (d) nowy szczep jest zasadniczo odporny na dzia¬ lanie tlenu, a warunki odzywiania wymagane dla jego hodowli sa proste. W konsekwencji kulturo¬ wany produkt (lub sposób obróbki kulturowanego produktu) utrzymuje wysoka zdolnosc do zycia bakterii podczas konserwowania, a proces jego przetworzenia na produkt spozywczy jest odpo¬ wiednio latwy zasadniczo bez strat zywotnosci bakterii. Wysoka odpornosc nowych bakterii na dzialanie kwasu jest szczególnie wazna w odniesie¬ niu do tego aspektu.107 561 8 W ten sposób, przez wykorzystanie nowego szczepu bifidobakterii staje sie mozliwe przepro¬ wadzenie efektywnej ^ hodowli, która umozliwia .zastosowanie znanej bakterii i wytworzenie pro¬ duktu spozywczego oraz napoju zawierajacego 5 zdolne do zycia bakterie.Podczas hodowania bifidobakterii mozliwe jest stosowanie warunków tlenowych odpowiednich do hodowli bakterii wytwarzajacych kwas mlekowy i zgodnie z tym mozliwe jest prowadzenie mie- M .szanej kultury bifidobakterii z bakteriami wytwa¬ rzajacymi kwas mlekowy. Srodki redukujace oraz substancje promotorujacev rozwój niezbedne dla kultur Konwencjonalnej bifidobakterii nie sa ko¬ nieczne dla hodowania nowego szczepu bifidobak- 15 terii. Jednakze srodki promotorujace rozwój moga byc stosowane w sposobie wedlug wynalazku dla Stymulowania wzrostu w zakresie nie wplywaja¬ cym na fermentowany j rodukt.Srodowisko kultury mlekowej stosowane w spo- 20 sobie wedlug wynalazku stanowi zawierajacy lak¬ toze skladnik, taki jak rekonstytuowane mleko, serwatka mleka, mleko pelne, mleko odtluszczone i podobne produkty otrzymane z tych skladników.W szczególnych warunkach hodowania, popula- 25 • cja zdolnych do zycia bakterii osiaga maksimum w ciagu 18—24 godzin, a wartosc pfl kultury, ob¬ niza sie odpowiednio do ilosci wytwarzanego kwa¬ su. Wytwarzanie kwasu octowego rozpoczyna sie w poczatkowym etapie hodowania. Stosunek mo- 30 Iowy kwasu octowego i kwasu mlekowego pod¬ czas hodowania pozostaje zasadniczo staly i wy¬ nosi * 1,7 . ± 0,5 (kwas octowy/kwas mlekowy).Jezeli hodowanie postepuje nadal, por. ulacja zdolnych do zycia bifidobakterii zaczyna sie obni- 35 zac, lecz wytwarzanie kwasu postepuje nadal az srodowisko staje sie nasycone. Konsekwentnie, hodowanie zostaje zatrzymane w odpowiednim etapie w zaleznosci od zastosowania kulturowane- go produktu. Tak dlugo, jak bifidobakterie zdolne 40 do zycia sa wykorzystywane, populacja bakterii, i zdolnych do zycia wynosi korzystnie co najmniej 10Vml.Sposobem wedlug wynalazku populacje bifido¬ bakterii zdolnych do zycia otrzymuje sie latwo 45 w ilosci co.najmniej 109/ml.Produkt wytwarzany sposobem wedlug wynalaz¬ ku zawiera duza ilosc zdolnych do zycia bifido¬ bakterii o doskonalej zywotnosci, a ich metabolizm mleka, zwlaszcza mieszaniny kwasu organicznego 50 obejmujacej glównie kwas octowy i kwas mleko¬ wy moze byc wykorzystany sam jako produkt spozywczy lub jako dodatek do produktu spozyw¬ czego lub napoju. Alternatywnie, produkt otrzy¬ many sposobem wedlug wynalazku moze byc mie- 55 szany z przyprawami, takimi jak substancje slo¬ dzace, soki owocowe, substancje smakowe z woda itp. w celu wytworzenia. nowego sfermentowanego napoju mlecznego. Ostroznie wynirozony —'¦ wysu¬ szony lub wysuszony metoda rozpylona produkt 60 otrzymany z kultury sposobem wedlug wynalazku zawiera 10* lub wiecej zdolnych do zycia bifido¬ bakterii na g wysuszonego produktu. Sproszkowa¬ ny produkt osuszony w ten sposób jesl; latwy do j?i i echowywania i dlatego moze' byc szeroko sto- «5 sowany w odniesieniu do wyzej wymienionych za¬ stosowan. Na przyklad produkt i jego wyrób osu¬ szony moze byc stosowany w polaczeniu z pro^ duktami spozywczymi i napojami majacymi war¬ tosc pH 4—7, których nie ogrzewa sie do* tempe¬ ratury, w której gina bifidobakterie, takimi jak mleko, mleko skondensowane, mleko' sproszkowa-' ne, surowa smietana, mleko sfermentowane bakte¬ riami kwasu mlekowego, lody, maslo, ser, sok warzywny, sok owocowy, mleko sojowe, sfermen¬ towane mleko sojowe, majonez, sos, ketchup, pasta, dzem, maczka rybna i.inne specyfiki, takie jak odzywki dla niemowlat oraz odzywki diete¬ tyczne. Produkt zawierajacy zdolne do cycia bifi¬ dobakterie miesza sie z wymienionymi produktami spozywczymi i napojami, otrzymane w ten sposób wyroby spozywcze i napoje zawieraja zdolne do zycia bifidobakterie i maja doskonaly smak. Osu¬ szone wyroby moga byc mieszane z drozdzami w proszku, proszkiem Chlorella, cukrem itp. lub ich mieszaninami w postaci tabletek. Mozna je rów¬ niez mieszac z lekami. < Przedmiot wynalazku ilustruja bardziej szczegó¬ lowo ponizsze przyklady. Termin „wariant" sto¬ sowany w przykladach oznacza nowy szczep, tj.„Bifidobacterium bifidum YIT-4005 FERM-P nr 3372", stosowany w sposobie wedlug wynalazku.Przyklad I. Dziesiecioprocentowa kulture wyjsciowa wariantu inokulowano w 10 1 steryli¬ zowanego na goraco mleka odtluszczonego i hodo¬ wano w temperaturze 37°C w ciagu 3 godzin. W celu otrzymania skrzepu do hodowanego produktu dodaje sie 0,05% sproszkowanej podpuszczki.Skrzep ten oddziela sie, przemywa woda, przy czym wydziela sie serwatka. Przez dodanie 12% smietanki zawartosc tluszczu doprowadza sie do 30%, a sól, zaprawy smakowe i stabilizatory mie¬ sza sie ze .skrzepem, otrzymujac ser zawierajacy bifidobakterie. Otrzymany w ten sposób ser za¬ wiera w 1 g 7,6 X 107 zdolnych do zycia bifido¬ bakterii w tym etapie procesu natychmiast po wy¬ tworzeniu. Po 10 dniach przechowywania zawar¬ tosc zdolnych do zycia bifidobakterii wynosi 2,6 X 107 w 1 g produktu.Przyklad II. Sterylizowane cieplem, rekon¬ stytuowane mleko odtluszczone (zawartosc sub¬ stancji stalej — 16%) chlodzono, podczas miesza¬ nia przez wprowadzenie sterylnego powietrza i za¬ szczepiono 2% wyjsciowa kultura wariantu.Po iinkubowaniu w temperaturze 37°C w czasie 48 godzin 525 ml ^kultury mieszano z 475 ml sy¬ ropu zawierajacego 80 g cukru i do mieszaniny dodaje sie substancje smakowa. Otrzymana mie¬ szanine homogenizuje sie, otrzymujac sfermento¬ wane mleko zawierajace zdolne do zycia bifido¬ bakterie.' Otrzymane sfermentowane mleko mialo wartosc pH 4,30 i zawieralo w ml 36 X 10* zdol¬ nych do zycia bifidobakterii. Po dziewieciu dniach przechowywana ilosc zdolnych do zycia bifidobak¬ terii wynosila 4,9 X 107.Przyklad III. zawartosc substancji stalych mleka doprowadzano przez dodawanie odtluszczo¬ nego mleka-w proszku do wartoscL 16%. Po ste¬ rylizacji srodowisko zaszczepiano 5% kultura wyj¬ sciowa Lactobaciilus acidophillus i 1% kultura 7* 107 501 10 wyjsciowa wariantu i mieszanine przetrzymywano w temperaturze 37°C w ciagu 20 godzin. Do 525 ml roztworu kultUfy dodano 200 ml soku owocowego (sok bananowy/sok mandarynkowy = 3/1), 475 ml syropu zawierajacego 60 g cukru i substancje 5 smakowe. Nastepnie mieszanine homogenizuje sie.Otrzymane w tein sposób sfermentowane mleko zawiera bifidobakterie zdolne do zycia oraz soki Owocowe i ma wartosc pH 4,40 i zawiera w ml 2,6 X 109 zdolnych do zycia bifidobakterii oraz itf 4,8 X 108 L. acidophillus. Po siedmiu dniach prze¬ chowywania ilosc zdolnych do zycia bifidobakterii oraz zdolnych do zycia L. acidophillus w 1 ml zmalala odpowiednio do 6,8 X 107 i 2,0 X 10°.Przyklad IV. W celu wytworzenia 1 litra 19 srodowiska do wody dodano 70 g odtluszczonego proszku sojowego, 30 g proszku serwatki mlecz¬ nej i 10 g laktozy. Po sterylizowaniu srodowisko zaszczepiano 5% kultura wyjsciowa wariantu i in- kuboWano w temperaturze 37°C w ciagu 72 go- 2d dzin. Do 500 ml kultury dodano 500 ml syropu zawierajacego 60 g cukru i 60 g sorbitolu oraz substancje smakowe. Wytworzona mieszanine ho¬ mogenizowano. Otrzymane sfermentowane mleko sojowe mialo wartosc pil 4,3 i zawieralo w 1 ml ii 1,6 X 10* zdolnych do zycia bifidobakterii. Po sze¬ sciu dniach przechowywania ilosc zdolnych do zycia, bakterii W 1 ml zmalala do 3,8 X 107.Przyklad V. W 900 ml Wody rozpuszczono 100 g proszku z odtluszczonego mleka, otrzymujac W srodowisko. Po sterylizacji srodowisko zaszczepiono 2% kultura wyjsciowa wariantu i inkubowano - w temperaturze 37°C w ciagu 24 godzin. Otrzy¬ mane srodowisko zawieralo w 1 ml 2,8 X 109 zdol¬ nych do zycia bifidobakterii, mialo kwasowosc ^ 10,5, a stosunek molowy kwasu octowego do kwa¬ su mlekowego wynosil 1,7.Kulture wymrazamo i suszono w ciagu okolo 7 godzin pod zmniejszonym cisnieniem wynosza¬ cym co najmniej 2 mm Hg. Otrzymano 105 g su- 40 chego produktu zawierajacego wig 5,9 X 109 zdolnych do zycia bifidobakterii.Przyklad VI. Rekonstytuowane mleko (za¬ wartosc substancji stalych = 16%) szczepiono 2% kultura wyjsciowa wariantu. Rekonstytuowane mleko zawieralo "nastepujace srodki promotorujace wzrost: (a) pepton, (b) CSL (ciekly wyciag z ku¬ kurydzy) oraz (c) ekstrakt drozdzy.Imkubowanie prowadzono w temperaturze 37°C w ciagu 15 godzin. W sposób analogiczny do opi¬ sanego w przykladzie II z zastosowaniem otrzy¬ manego produktu wytworzono sfermentowane mle¬ ko. Wlasciwosci otrzymanego w ton sposób sfer¬ mentowanego mleka przedstawiono w tablicy III- Tablica III Substancja prorriotorujaca wzrost Brak Pepton 0,5% CSL 1,0% Ekstrakt drozdzy 0,3% Kwaso¬ wosc 7,0 8.0 7,2 7,0 Wartosc pH 4,75 4,55 4,60 4,75 Ilosc zdolnych I do zycia bifido- 1 bakterii/ml [ 1,5 xlÓ9 | 2,0 x 10* | 1,6x10* | 23 x 109 Próba. Wykazanie innych róznic miedzy ta gru¬ pa organizmu wykazano metoda porównawcza Scheffe'fa przeprowadzona dla 12 kombinacji zro¬ bionych z 4 róznych par prób. Badaniom poddano 36 osób.Przyklad VII. 3% kultura wyjsciowa wa¬ riantu szczepu szczepiono srodowisko, o wartosci pH 6,8, zawierajace 3% proszku ekstraktu drozdzy, 5% cieklego wyciagu z kukurydzy, 0,5% kwasu cytrynowego, 0,5% siarczanu amonu, 1% laktozy i 0,03% chlorowodorku cysteiny i inkubowano w temperaturze 37°C w ciagu 72 godzin. Kulture odwirowywano i zebrane bakterie suspendowana w wodzie zawierajacej 5% hydrolizatu mleka od¬ tluszczonego otrzymanego z zastosowaniem protea- zy, 5% cukru-i 1% witaminy C. Zawiesine wy- mrazano i suszono.Tablica IV 1 Substancja promotorujaca wzrost | Ocena* 1 Brak Pepton CSL Ekstrakt drozdzy +0,3-1,3 —1 ~ 0 —0,5~+0,4 —1 ~+0,l | Wykazane róznice 1 Efekt Efekt glówny Efekt polaczony Efekt kolejny Blad Suma kwadratów 46,042 0,291 32,000 37,667 Stopien latwosci 3 . ..- ¦ 3 . 6 60 Pozbawiony zmian' 15,347 - 0,097 5,333 0,628 F, 24,444 0,155 8,494 Poziom oznacza-l nia 1 do 1 % do 1 % I * —1: ubogi +1: dobry 0: sredni +2: lepszy107 561 li 12 Otrzymany osuszony proszek zawierajacy bak¬ terie dodawano do sterylizowanego mleka w ilosci lVo. Nastepnie mieszanine homogenizowano i wpro¬ wadzano do pojemnika. Otrzymane mleko zawie¬ ralo w 1 ml 4,6 X 108 zdolnych do zycia bifidobak¬ terii. Po szesciu dniach przechowywania ilosc ta wzrosla do. 2,2 X 106/ml.Przyklad VIII. W celu wytworzenia 150 litrów wyjsciowego wyrobu do produkcji lodów rozpuszczono w wodzie 7 kg surowej smietanki o zawartosci tluszczu 40%, 20 kg slodzonego, skon¬ densowanego mleka pelnego, 64 litry mleka, 2 kg odtluszczonego mleka w proszku, 6 kg cukru i 0,3 kg stabilizatorów. Nastepnie mieszanke steryli¬ zowano cieplem, homogenizowano i chlodzono do temperatury 40°C lub nizszej. Suchy proszek za¬ wierajacy bakterie wytworzono sposobem analo¬ gicznym do opisanego w przykladzie VII i dodano go do mieszaniny w ilosci 1%. Mieszanine rozle¬ wano do kubków i zamrazano w temperaturze —20°C, otrzymujac lody zawierajace w 1 ml 3,0 X X 108 zdolnych do zycia bifidobakterii. Po trzech miesiacach przechowywania wartosc ta wzrosla do 2,2 X 106/ml.Przyklad IX. Warzywa obejmujace 130 g marchewki, 100 g pomidorów, 3 g selerów i 100 g ogórków zagotowano w 500 ml wody. Zagotowane warzywa mieszano w mikserze i saczono przez ba¬ welne, otrzymujac sok jarzynowy. Do 100 ml soku warzywnego dodawano 10 g proszku Chlorella, 0,5 g soli w tabletkach, 0,1 kazein oraz 1 g suchego proszku zawierajacego bakterie, wytwo¬ rzonego sposobem opisanym w przykladzie VII, otrzymujac sok warzywny zawierajacy w 1 ml 2,8 X 108 zdolnych do zycia biiidobakterii. Po dzie- 5 sieoiu dniach przechowywania ilosc ta obnizyla sie do 6,5 X 107/ml.Przyklad X. Suchy proszek bakteryjny wy¬ tworzony sposobem opisanym w przykladzie VII miesza sie z mlekiem pelnym w proszku w ilosci 10 5 g na 100 g proszku mleka pelnego. Nastepnie do mieszaniny wprowadza sie gazowy azot dla otrzymania mleka w proszku dla niemowlat zawie¬ rajacego w 1 g 1,0 X 109 zdolnych do zycia bifido- bakterii. Po 3 miesiacach przechowywania ilosc 15 ta obnizyla sie do 5,1 X 107/g..Zastrzezenia patentowe 1. Sposób wytwarzania fermentowanego produk- 20 tu z mleka zawierajacego zdolne do zycia bifido- bakterie przez hodowanie wariantu biiidobakterii w srodowisku. mleka, znamienny tym, ze stosuje sie wariant bifidobakterii, który jest odporny na dzialanie kwasu i rozmnaza sie w warunkach tle- 25 nowych w czystym srodowisku mlekowym, które nie zawiera zadnych substancji promotorujacych wzrost. 2. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze jako wariant bifidobakterii stosuje sie Bifidobacte- 30 rium bifidum YIT-4005 zdeponowany pod nume¬ rem FERM-P 3372. 20 40 60 30 100 ° CZAS iNKUBOWANiA WZGraf. Z-d 2 — 749/80 — 90 Cena 45 zl PL PL