PL103049B1 - Sposob oczyszczania heparyny - Google Patents

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób oczyszczania heparyny, pozwalajacy otrzymac heparyne o bar¬ dzo wysokiej czystosci i wysokiej specyficznej akty¬ wnosci.

Heparyna znajduje zastosowanie w medycynie od kilku dziesiecioleci. Jest ona jednym z najlepiej znanych antykoagulantów i stosuje sie ja po¬ wszechnie, na przyklad w celu zapobiegania zakrze- picy. Heparyne, bedaca sulfonowanym polisacha¬ rydem, mozna otrzymac stosunkowo skomplikowa¬ na metoda, ze zwierzecego sluzu jelitowego lub pluc. Obecnie stosowane w medycynie preparaty he¬ paryny zawieraja substancje o bardzo zróznicowa¬ nej wielkosci czastek — od okolo 5000 do 35000.

Specyficzna aktywnosc tych preparatów wynosi za¬ zwyczaj okolo 130 jednostek na mg. Dostepne obec¬ nie w sprzedazy preparaty sa calkiem róznorodne.

Uboczne dzialanie w trakcie leczenia heparyna zdarzaja sie raczej rzadko, ale przypadki pojawie¬ nia sie takiego ubocznego dzialania stwarzaja wiele trudnych problemów. Prawdopodobnie przyczyna niektórych z tych ubocznych dzialan sa zanieczy¬ szczenia preparatu heparyny.

Przytoczone fakty potwierdzaja potrzebe wytwa¬ rzania bardziej czystych preparatów heparyny i wy¬ kazujacych wyzsza specyficzna aktywnosc od pre¬ paratów, bedacych obecnie w uzyciu. W zwiazku z badaniami nad antytrombina, kofaktorem hepary¬ ny, zbadano mozliwosc wiazania bialka z nosnikiem.

Niespodziewanie stwierdzono, ze antytrombina, zwiazana z nosnikiem, moze specyficznie wiazac frakcje czasteczkowa heparyny, stosowanej w te¬ rapii, bedaca nosnikiem wlasinosci, odpowiadajacych za dzialanie zapobiegawcze heparyny przeciwko tworzeniu sie skrzepów. Okazalo sie, ze oprócz ko¬ lektora heparyny, antytrombiny, mozna stosowac inne wiazace heparyne bialka, takie jak inhibitor inter-a-trypsyny o ciezarze czasteczkowym okolo 150000, otrzymany podczas wyodrebniania koagula- cyjnego czynnika IX (czynnik B).

Sposób oczyszczania heparyny polega wedlug wy¬ nalazku na tym, ze heparyne poddaje sie adsorpcji na nierozpuszczalnym w wodzie nosniku zelowym, zawierajacym adsorpcyjnie z nim zwiazane bialko osocza wiazace heparyne, takie jak antytrombina lub inhibitor inter-a-trypsyny, a nastepnie oddziela sie zaadsorbowana heparyne.

Jako nierozpuszczalny w wodzie nosnik zelowy korzystnie stosuje sie zel agarozowy w postaci ku- lek.

Szczególnie korzystnym nosnikiem jest zel aga¬ rozowy aktywowany halogenkiem cyjanu.

Sposób wedlug wynalazku korzystnie realizuje sie tak, ze adsorpcje heparyny prowadzi sie, przepusz¬ czajac heparyne, rozpuszczona w wodnym roztwo¬ rze buforowym, przez kolumne wypelniona nosni¬ kiem zelowym.

Heparyne oddziela sie na drodze desorpcji, elu- u;ac 0,5% roztworem wodnym chlorku sodowego. 103 049103 049 Sposób wedlug wynalazku pozwala otrzymac nad¬ zwyczaj czysta heparyne. Oczyszczona heparyna charakteryzuje sie wysoka specyficzna aktywnoscia rzedu 200—270 jednostek na mg, w porównaniu z aktywnoscia substancji wyjsciowej, wynoszaca okolo 130 jednostek na mg. Rozklad ciezarów cza¬ steczkowych w oczyszczonej w ten specyficzny spo¬ sób heparynie charakteryzuje mniejszy rozrzut niz w wyjsciowej substancji. Heparyne najwyzszej ja¬ kosci, o specyficznej aktywnosci 270 jednostek na mg otrzymano, stosujac zwiazana z nosnikiem anty¬ trombine-. Tak wiec sposobem wedlug wynalazku mozna uzyskac heparyne o bardzo wysokim stopniu czystosci i bardzo wysokiej aktywnosci. Sposób ten jest prosty i dogodny do zastosowania na skale przemyslowa i' pozwala otrzymywac heparyne o wyzszej specyficznej .aktywnosci niz obecnie stoso¬ wanie preparaty.

Oznaczenie specyjisznej aktywnosci heparyny wy¬ konano metoda, opisana przez Densona i Bonnara (Brit.J. Haematol. 30. 1975, str. 139).

Wynalazek ilustruja nastepujace przyklady.

W ponizszych przykladach skrót „trtis" oznacza trój-(hydroksymetylo)-aminometan; SepharoseR 4 B jest to nazwa handlowa agarozy, a SephadexR G 25 — nazwa mosnika zelowego w postaci kulek, sta¬ nowiacego dekstran, sieciowany epichlorohydr^na.

Przyklad I. Oczyszczanie heparyny za pomo¬ ca zwiazanej z nosnikiem antytrombiny. Sposób z zastosowanej kolumny. Adsorbent zelowy przygo¬ towuje sie w nastepujacy sposób: \ftittywowanie. 3 g bromku cyjanu rozpuszcza sie w Sl ml destylowanej wody. Dó tego roztworu do¬ daje sie 50 ml straconej agarozy (SepharoseR 4 B, Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Szwecja). Mie¬ szajac, schladza sie mieszanine na lazni lodowej.

Dodajac 4 m roztwór wodorotlenku sodowego pod¬ nosi sie pH mieszaniny do wartosci 11,2 i utrzymuje przez 10 minut. Nastepnie zel przemywa sie zimna destylowana woda i 0,2 m roztworem kwasnego weglanu sodowego.

Laczenie. Do zelu dodaje sie 200 mg antytrombiny oczyszczonej metoda, podana przez Millera, An¬ derssona i wspólpr. (Thromb. Res. 5, 1974, str. 439—452) i rozpuszczonej w 50 ml 0,2 m roztworu kwasnego weglanu sodowego o pH = 9,0. Zawiesine bialkowo-zelowa miesza sie lagodnie w temperatu¬ rze pokojowej przez noc, a nastepnie przemywa sie lagodnie roztworami buforowymi o. wysokiej sile jonowej, kolejno roztworem buforowym o wysokiej i miskiej wartosci pH.

Oczyszczanie heparyny. Adsorbent zelowy, zawie¬ rajacy zwiazana z nosnikiem antytrombine, umiesz¬ cza sie w kolumnie i doprowadza do równowagi roztworem buforowym o pH = 7,4, zawierajacym 0,05 mola tris i 0,15 mola chlorku sodowego w 1 li¬ trze. 300 mg heparyny (Vitrum, specyficzna aktyw¬ nosc 130 jednostek ma mg) rozpuszcza sie w 20 ml roztworu buforowego o pH = 7,4, zawierajacego 0,05 mola tris i 0,15 mola chlorku sodowego w 1 litrze i przepompowuje przez kolumne.

Nastepnie zel przemywa sie podanym wyzej roz¬ tworem buforowym o pH = 7,4, a zaadsorbowana heparyne desorbuje sie roztworem buforowym o pH = 7,4, zawierajacym 0,05 mola tris i 1,0 mola chlorku sodowego w 1 litrze. Z wyeluowanej hepa¬ ryny usuwa sie sól, saczac przez zel w destylowa¬ nej wodzie w kolumnie, wypelnionej zelem Sep- hadexR G 25 (Pharmacia), a nastepnie wydzielona heparyne liofilizuje siie. Oczyszczona heparyna po¬ siada specyficzna aktywnosc 270 jednostek na mg.

Badania nad rozkladem ciezaru czasteczkowego wy¬ kazuja, ze substancje te charakteryzuje znacznie mniejszy rozrzut ciezaru czasteczkowego niz wyj- io sciowa heparyne. Analize weglowodanów przepro¬ wadza sie, stosujac metode karbazol-kwas siarko¬ wy Przyklad II. Oczyszczanie heparyny za po¬ moca zwiazanej z nosnikiem antytrombiny. Sposób nieciagly. Nosnik, zawierajacy antytrombine, przy¬ gotowuje sie w sposób podany w przykladzie I.

Oczyszczanie heparyny. 500 mg heparyny (Vitrum, specyficzna aktywnosc 130 jednostek/mg) rozpuszcza siie w 300 ml roztworu buforowego o pH = 7,4, za¬ wierajacego 0,05 mola tris i 9,15 mola chlorku sodo¬ wego w 1 litrze. 300 ml osadzonej i zwiazanej z nos¬ nikiem antytrombiny doprowadza sie do stanu rów¬ nowagi wyzej podanym roztworem buforowym i suszy, stosujac podcisnienie. Adsorbent dodaje sie do roztworu heparyny i miesza przez godzine w temperaturze pokojowej. Zel suszy sde na szkla¬ nym filtrze, stosujac podcisnienie i przemywa 10- krotnie 200 ml roztworu buforowego o pH = 7,4, zawierajacego 0,05 mola tris i 0,15 mola chlorku so¬ dowego w 1 litrze.

Zaadsorbowana heparyne desorbuje sie z zelu, przemywajac 3-krotnie 209 ml roztworu buforowego o pH = 7,4, zawierajacego 0,05 m roztworu tris i 1,0 mola chlorku sodowego w 1 litrze. Eluat, za¬ wierajacy heparyne, zateza sie przez liofilizacje. Po¬ zostala sól usuwa sie, saczac przez zel SephadexR G 25 w destylowanej wodzie, a nastepnie heparyne liofilizuje sie. Oczyszczona heparyna posiada specy¬ ficzna aktywnosc 250 jednostek/mg.

Przyklad III. Oczyszczanie heparyny na ad¬ sorbencie zelowym, zawierajacym zwiazany z no¬ snikiem inhibitor inter-a-trypsyny.

Przygotowanie zelowego adsorbentu. Podczas 45 oczyszczania koagulacyjnego czynnika IX (czynnik B) (L.O. Andersson i wspólpr. Thromb. Res. 7, 1975, str. 451—459) otrzymuje sie wiazace heparyne bial¬ ko, inhibitor inter-a-trypsyny, o ciezarze czastecz¬ kowym okolo 150 000. 250 mg tego bialka rozpuszcza 50 sie w 200 ml 0,2 m roztworu kwasnego weglanu so¬ dowego, stanowiacego roztwór buforowy o pH = 9,0, a nastepnie dodaje sie do 50 ml straconego zelu SepharoseR 4 B, aktywowanego bromkiem cyjanu w sposób, opisany w przykladzie I. Zawiesine ze- 55 lowo-bialkowa miesza sie lagodnie przez noc w tem¬ peraturze pokojowej, a nastepnie przemywa tak, jak w przykladzie I.

Oczyszczanie heparyny. Kolumne wypelnia sie ad¬ sorbentem zelowym, zawierajacym zwiazane z no- «o snikiem bialko i przetlacza przez tak przygotowana kolumne roztwór 300 mg heparyny w 20 ml roz¬ tworu buforowego o pH = 7,4, zawierajacego 0,05 mola tris i 0,15 mola chlorku sodowego w 1 litrze.

Zel przemywa sie wyzej podanym roztworem bu- 65 forowym, a nastepnie desorbuje sie heparyne roz- 35i tworem buforowym o pH = 7,4, zawierajacym 0,05 mola tris i 1,0 mola chlorku sodowego w 1 litrze.

Z heparyny usuwa sie sól, saczac na zelu Sephadex G 25. w destylowanej wodzie, a nastepnie heparyne liofilizuje sie. Specyficzna aktywnosc oczyszczonej heparyny wynosi 230 jednostek na mg.

Claims (5)

Zastrzezenia patentowe

1. Sposób oczyszczania heparyny, znamienny tym, ze heparyne poddaje sie adsorpcji na nierozpusz¬ czalnym w wodzie nosniku zelowym, zawierajacym adsorpcyjnie z nim zwiazane bialko osocza wiazace heparyne, takie jak antytrombina lub inhibitor inter-a-trypsyny, a nastepnie oddziela sie zaadsor- bowana heparyne. 049 6

2. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze jako nierozpuszczalny w wodzie nosnik zelowy sto¬ suje sie zel agarozowy w postaci kulek.

3. Sposób wedlug zastrz. 2, znamienny tym, ze stosuje sie zel agarozowy, aktywowany halogenkiem cyjanu. ;

4. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze adsorpcje heparyny prowadzi sie, przepuszczajac he- io paryne rozpuszczona w wodnym roztworze buforo¬ wym przez kolumne wypelniona nosnikiem zelo¬ wym.

5. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze heparyne oddziela sie na drodze desorpcji, eluujac 0,5% roztworem wodnym chlorku sodowego.