HU176811B - Process for the purification of heparin - Google Patents

Description

Aktiebolaget KABI, Stockholm, Svédország

Eljárás heparin tisztítására

2

A találmány tárgya eljárás heparin tisztítására. A találmány szerinti eljárással nagy fajlagos aktivitású, igen tiszta heparint állíthatunk elő.

A heparint a gyógyászatban már évtizedek óta alkalmazzák. A heparin a legismertebb antikoagulánsok egyike, és igen előnyösen használható fel többek között a trombózis megelőzésére. Miként ismert, a heparin egy szulfátéit poliszacharid, amely a megfelelő állati szervekből (tüdőből és bél-nyálkahártyából) viszonylag bonyolult módszerekkel különíthető el. A klinikai gyakorlatban jelenleg alkalmazott heparin-készitmények igen széles határok között változó, azaz körülbelül 5000-től 35 000-ig terjedő molekulasúlyú hatóanyagot tartalmaznak. A hatóanyagok fajlagos aktivitása rendszerint körülbelül 130 egység/mg. Megállapíthatjuk tehát, hogy a kereskedelmi forgalomban kapható ismert készítmények minősége igen változó. Heparin-kezelés esetén viszonylag ritkán lépnek fel mellékhatások; az esetlegesen jelentkező mellékhatások azonban rendszerint nehezen kezelhető elváltozásokhoz vezetnek. E mellékhatások egy részét feltehetőleg a heparin-készítményekben levő szennyező anyagok okozzák. Igen nagy szükség van tehát a jelenleg alkalmazottnál tisztább és specifikusabb hatású heparin-készitmények előállítására.

A heparin és különböző plazmafehérjék közötti kölcsönhatást már vizsgálták a heparint megkötő plazmafehérjék tisztítása kapcsán [American Journal of Physiology, 218,1500—5 (1970)]. Ebben a cikkben a szerzők heparint megkötő fehéijékként az alfa-2-globulin és az 30 alfa-l-albumin elektroforetikus szérum-fehérjefrakciókat jelölik meg.

A trombin-antitrombin komplex képződésének tanulmányozásakor megállapították, hogy a heparin gyor5 sitja az említett komplex kialakulását [Thrombosis Research, 7, 305—313 (1975)]. A feltételezések szerint a heparin ezen hatását annak köszönheti, hogy hozzákötődik úgy az antitrombinhoz, mint a trombinokhoz, vagy a heparin az antitrombinnal reagálva aktiválja azt. 10 A mátrixhoz kötött antitrombin (a heparin egyik kofaktora) adszorpciós sajátságainak vizsgálata során meglepő módon azt tapasztaltuk, hogy a mátrixhoz kötött antitrombin specifikusan megköti a jelenlegi klinikai gyakorlatban használt heparinnak azt a molekula-frak15 cióját. amely a klinikailag értékes trombózis-ellenes hatást közvetíti. Az adszorpció és deszorpció körülményeinek megfelelő megválasztásával ily módon rendkívül tiszta heparin állítható elő. A fenti módszerrel előállított, tisztított heparin fajlagos aktivitása — a kiindulási 20 anyagként felhasznált heparin körülbelül 130 egység/ mg-os értékével szemben — 200—270 egység/mg, és a tisztított heparin molekulasúlya lényegesen szűkebb határok közé esik, mint a kiindulási anyagé. További kísérleteink során azt tapasztaltuk, hogy az adszorpciós25 -deszorpciós tisztítási eljárásban antitrombin helyett egyéb heparin-megkötő plazmafehérjéket is jó eredménnyel alkalmazhatunk. E további, heparin-megkötő fehétjék közül példaként a IX koagulációs faktor (B-faktor) elkülönítése során izolálható, körülbelül 150 000-es molekulasúlyú inter-a-tripszin-inhibitort em176811

Htjuk meg. A legtisztább (körülbelül 270 egység/mg fajlagos aktivitású) heparint akkor kapjuk, ha adszorbensként mátrixhoz kötött antitrombint használunk fel. A találmány szerinti eljárással tehát egyszerű, ipari méretekben is jól alkalmazható módon állíthatunk elő igen tiszta, a jelenleg alkalmazottnál lényegesen nagyobb fajlagos aktivitású heparin-készítményeket.

A találmány szerinti eljárást az oltalmi kör korlátozása nélkül az alábbi példákban részletesen ismertetjük. A heparin fajlagos aktivitását Denson és Bonnar módszerével határoztuk meg [Brit. J. Haematol. 30, 139 (1975)].

1. példa

Heparin tisztítása mátrixhoz kötött antitrombin felhasználásával

A tisztításhoz felhasznált adszorbenst a következőképpen állítjuk elő:

A mátrix aktiválása g brómciánt 30 ml desztillált vízben oldunk, és az oldathoz 50 ml ülepített agarózt [Sepharose 4B, a Pharmacia Fine Chemicals cég (Uppsala, Svédország) gyártmánya] adunk. Az elegyet jégfürdön keverjük, majd 4 mól nátriumhidroxid beadagolásával a rendszer pH-ját 11,2-re növeljük cs 10 percig ezen az értéken tartjuk. Ezután a gélt hideg desztillált vízzel és 0,2 mólos nátrium-hidrogénkarbonát-oldattal mossuk.

A fehérje felvitele a mátrixra

200 mg, Miller—Andersson és munkatársai módszerével [Thromb. Rés. 5, 439—452 (1974)] tisztított antitrombint 50 ml 0,2 mólos nátrium-hidrogénkarbonát oldatban oldunk, és az oldatot (pH=9,0) a fentiek szerint aktivált gélhez adjuk. A szuszpenziót éjszakán át szobahőmérsékleten enyhén keverjük, majd aagy ionerősségű pufferoldatokkal mossuk. A mosáshoz váltakozva használunk fel nagy és kis pH-értékű pufferoldatokat.

Heparin tisztítása

A fentiek szerint előállított, mátrixhoz kötött antitrombint oszlopba töltjük, és az oszlopot 0,05 mólos trisz-pufferoldat és 0,15 mólos nátriumklorid-oldat elegyével (pH=7,4) egyensúlyba hozzuk. 300 mg heparint (Vitrum; fajlagos aktivitás: 130 egység/mg) 20 ml, 0,05 mólos trisz-pufferoldat és 0,15 mólos nátriumklorid-oldat elegyében (pH=7,4) oldunk, és az oldatot keresztülszivattyúzzuk az oszlopon. Ezután a gélt a fentivel azonos összetételű pufferoldattal mossuk, majd a heparint 0,05 mólos trisz-pufferoldat és 1,0 mólos nátriumklorid-oldat elegyével (pH=7,4) leoldjuk. Az eluátumból desztillált víz jelenlétében végzett gélszűréssel eltávolítjuk a sót (a gélszűréshez Sephadex G—25 gyantaoszlopot használunk fel; gyártja a Pharmacia cég), majd az eluátumot fagyasztva szárítjuk. 270 egység/mg fajlagos aktivitású, tisztított heparint kapunk. A molekulasúlyeloszlás vizsgálata során megállapítottuk, hogy a tisztított termékben jelenlevő anyagok molekulasúlya lényegesen szúkebb határok között változik, mint a kiindulási anyag esetén- A szénhidrát-elemzést karbazol-kénsavas módszerrel végeztük.

2. példa

Heparin tisztítása mátrixhoz kötött antitrombin felhasználásával (szakaszos eljárás)

A mátrixhoz kötött antitrombint az 1. példában ismertetett módon állítjuk elő. 300 ml így előállított, ülepített adszorbenst 0,05 mólos trisz-pufferoldat és 0,15 mólos nátriumklorid-oldat elegyével (pH=7,4) egyensúlyba hozunk, majd vákuumban leszűrjük és szárítjuk. A kapott adszorbenst 500 mg heparin (Vitrum; fajlagos aktivitás : 130 egység/mg) 300 ml, a fentiekkel azonos összetételű pufferoldattal készített oldatához adjuk, és az elegye; 1 órán át szobahőmérsékleten keverjük. Ezután a gélt zsugorított üvegszűrőn vákuumban leszűrjük, és 10 x 200 ml, a fentiekkel azonos összetételű pufferoldattal mossuk. Az adszorbeált heparint 3 x 200 ml, az 1. példában említettel azonos összetételű deszorbeáló pufferoldattal oldjuk le a gélről, majd az eluátumot fagyasztva szárítjuk. Sómentesítés céljából a kapott termék desztillált vízzel készített oldatát Spehadex G—25 gélen szűrjük, majd az eluátumot fagyasztva szárítjuk, 250 cgység/mg fajlagos aktivitású, tisztított heparint kapunk.

3. példa

Heparin tisztítása mátrixhoz kötött inter-a-tripszin-inhibitor felhasználásával

Az adszorbens előállítása

ÍX koagulációs faktort (B-faktort) Andersson és munkatársai módszerével [Thromb. Rés., 7, 451—459 (1975)] tisztítunk. A tisztítás során heparinmegkötő sajátságokkal rendelkező, körülbelül 150 000-es molekulasúlyú inter-a-tripszin-inhibitort különítünk el. 250 mg, így elkülönített fehérjét 200 ml 0,2 mólos nátrium-hidrogénkarbonát-oldatban oldunk, majd a kapott oldatot (pH=9,0) az 1. példában ismertetett módon brómciánnal aktivált 50 ml ülepített Sepharose 4B gélhez adjukA szuszpenziót éjszakán át szobahőmérsékleten enyhén keverjük, majd a gélt az 1. példában ismertetett módon mossuk.

Heparin tisztítása

A fentiek szerint előállított adszorbenst oszlopba töltjük. 300 mg heparint (Vitrum) 20 ml, 0,05 mólos trisz-pufferoldat és 0,15 mólos nátriumklorid-oldat eiegyében (pH=7,4) oldunk, és az oldatot az oszlopba szivattyúzzuk. A gélt a fenti összetételű pufferoldattal mossuk, majd az adszorbeált heparint az 1. példában ismertetett deszorbeáló pufferoldattal leoldjuk. A sót Sephadex G—25 gélen desztillált víz jelenlétében végzett gélszűréssel eltávolítjuk, és az effluenst fagyasztva szárítjuk. 230 egység/mg fajlagos aktivitású, tisztított heparint kapunk.

Claims (4)

1. Eljárás heparin fajlagos aktivitásának növeléséi» tisztítással, azzal jellemezve, hogy a legfeljebb 150 egység/mg, előnyösen 130 egység/mg fajlagos aktivitású heparint mátrixhoz kötött plazmafehérjéken adszorbeáltatjuk, majd a tisztított terméket leoldjuk.

2. Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatosítási mód- ja, azzal jellemezve, hogy adszorbensként mátrixhoz kötött antitrombint használunk fel. 5

3. Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatosítási mód ja, azzal jellemezve, hogy adszorbensként mátrixhoz kötött inter-a-tripszin-inhibitort használunk fel.

4. Az előző igénypontok bármelyike szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy mátrixként agarózt használunk fel.