HU176811B - Process for the purification of heparin - Google Patents
Process for the purification of heparin Download PDFInfo
- Publication number
- HU176811B HU176811B HU77KA1485A HUKA001485A HU176811B HU 176811 B HU176811 B HU 176811B HU 77KA1485 A HU77KA1485 A HU 77KA1485A HU KA001485 A HUKA001485 A HU KA001485A HU 176811 B HU176811 B HU 176811B
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- heparin
- matrix
- purification
- specific activity
- bound
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
- C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
- C08B37/006—Heteroglycans, i.e. polysaccharides having more than one sugar residue in the main chain in either alternating or less regular sequence; Gellans; Succinoglycans; Arabinogalactans; Tragacanth or gum tragacanth or traganth from Astragalus; Gum Karaya from Sterculia urens; Gum Ghatti from Anogeissus latifolia; Derivatives thereof
- C08B37/0063—Glycosaminoglycans or mucopolysaccharides, e.g. keratan sulfate; Derivatives thereof, e.g. fucoidan
- C08B37/0075—Heparin; Heparan sulfate; Derivatives thereof, e.g. heparosan; Purification or extraction methods thereof
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Polymers & Plastics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Materials Engineering (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Treatment Of Liquids With Adsorbents In General (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Description
Aktiebolaget KABI, Stockholm, Svédország
Eljárás heparin tisztítására
2
A találmány tárgya eljárás heparin tisztítására. A találmány szerinti eljárással nagy fajlagos aktivitású, igen tiszta heparint állíthatunk elő.
A heparint a gyógyászatban már évtizedek óta alkalmazzák. A heparin a legismertebb antikoagulánsok egyike, és igen előnyösen használható fel többek között a trombózis megelőzésére. Miként ismert, a heparin egy szulfátéit poliszacharid, amely a megfelelő állati szervekből (tüdőből és bél-nyálkahártyából) viszonylag bonyolult módszerekkel különíthető el. A klinikai gyakorlatban jelenleg alkalmazott heparin-készitmények igen széles határok között változó, azaz körülbelül 5000-től 35 000-ig terjedő molekulasúlyú hatóanyagot tartalmaznak. A hatóanyagok fajlagos aktivitása rendszerint körülbelül 130 egység/mg. Megállapíthatjuk tehát, hogy a kereskedelmi forgalomban kapható ismert készítmények minősége igen változó. Heparin-kezelés esetén viszonylag ritkán lépnek fel mellékhatások; az esetlegesen jelentkező mellékhatások azonban rendszerint nehezen kezelhető elváltozásokhoz vezetnek. E mellékhatások egy részét feltehetőleg a heparin-készítményekben levő szennyező anyagok okozzák. Igen nagy szükség van tehát a jelenleg alkalmazottnál tisztább és specifikusabb hatású heparin-készitmények előállítására.
A heparin és különböző plazmafehérjék közötti kölcsönhatást már vizsgálták a heparint megkötő plazmafehérjék tisztítása kapcsán [American Journal of Physiology, 218,1500—5 (1970)]. Ebben a cikkben a szerzők heparint megkötő fehéijékként az alfa-2-globulin és az 30 alfa-l-albumin elektroforetikus szérum-fehérjefrakciókat jelölik meg.
A trombin-antitrombin komplex képződésének tanulmányozásakor megállapították, hogy a heparin gyor5 sitja az említett komplex kialakulását [Thrombosis Research, 7, 305—313 (1975)]. A feltételezések szerint a heparin ezen hatását annak köszönheti, hogy hozzákötődik úgy az antitrombinhoz, mint a trombinokhoz, vagy a heparin az antitrombinnal reagálva aktiválja azt. 10 A mátrixhoz kötött antitrombin (a heparin egyik kofaktora) adszorpciós sajátságainak vizsgálata során meglepő módon azt tapasztaltuk, hogy a mátrixhoz kötött antitrombin specifikusan megköti a jelenlegi klinikai gyakorlatban használt heparinnak azt a molekula-frak15 cióját. amely a klinikailag értékes trombózis-ellenes hatást közvetíti. Az adszorpció és deszorpció körülményeinek megfelelő megválasztásával ily módon rendkívül tiszta heparin állítható elő. A fenti módszerrel előállított, tisztított heparin fajlagos aktivitása — a kiindulási 20 anyagként felhasznált heparin körülbelül 130 egység/ mg-os értékével szemben — 200—270 egység/mg, és a tisztított heparin molekulasúlya lényegesen szűkebb határok közé esik, mint a kiindulási anyagé. További kísérleteink során azt tapasztaltuk, hogy az adszorpciós25 -deszorpciós tisztítási eljárásban antitrombin helyett egyéb heparin-megkötő plazmafehérjéket is jó eredménnyel alkalmazhatunk. E további, heparin-megkötő fehétjék közül példaként a IX koagulációs faktor (B-faktor) elkülönítése során izolálható, körülbelül 150 000-es molekulasúlyú inter-a-tripszin-inhibitort em176811
Htjuk meg. A legtisztább (körülbelül 270 egység/mg fajlagos aktivitású) heparint akkor kapjuk, ha adszorbensként mátrixhoz kötött antitrombint használunk fel. A találmány szerinti eljárással tehát egyszerű, ipari méretekben is jól alkalmazható módon állíthatunk elő igen tiszta, a jelenleg alkalmazottnál lényegesen nagyobb fajlagos aktivitású heparin-készítményeket.
A találmány szerinti eljárást az oltalmi kör korlátozása nélkül az alábbi példákban részletesen ismertetjük. A heparin fajlagos aktivitását Denson és Bonnar módszerével határoztuk meg [Brit. J. Haematol. 30, 139 (1975)].
1. példa
Heparin tisztítása mátrixhoz kötött antitrombin felhasználásával
A tisztításhoz felhasznált adszorbenst a következőképpen állítjuk elő:
A mátrix aktiválása g brómciánt 30 ml desztillált vízben oldunk, és az oldathoz 50 ml ülepített agarózt [Sepharose 4B, a Pharmacia Fine Chemicals cég (Uppsala, Svédország) gyártmánya] adunk. Az elegyet jégfürdön keverjük, majd 4 mól nátriumhidroxid beadagolásával a rendszer pH-ját 11,2-re növeljük cs 10 percig ezen az értéken tartjuk. Ezután a gélt hideg desztillált vízzel és 0,2 mólos nátrium-hidrogénkarbonát-oldattal mossuk.
A fehérje felvitele a mátrixra
200 mg, Miller—Andersson és munkatársai módszerével [Thromb. Rés. 5, 439—452 (1974)] tisztított antitrombint 50 ml 0,2 mólos nátrium-hidrogénkarbonát oldatban oldunk, és az oldatot (pH=9,0) a fentiek szerint aktivált gélhez adjuk. A szuszpenziót éjszakán át szobahőmérsékleten enyhén keverjük, majd aagy ionerősségű pufferoldatokkal mossuk. A mosáshoz váltakozva használunk fel nagy és kis pH-értékű pufferoldatokat.
Heparin tisztítása
A fentiek szerint előállított, mátrixhoz kötött antitrombint oszlopba töltjük, és az oszlopot 0,05 mólos trisz-pufferoldat és 0,15 mólos nátriumklorid-oldat elegyével (pH=7,4) egyensúlyba hozzuk. 300 mg heparint (Vitrum; fajlagos aktivitás: 130 egység/mg) 20 ml, 0,05 mólos trisz-pufferoldat és 0,15 mólos nátriumklorid-oldat elegyében (pH=7,4) oldunk, és az oldatot keresztülszivattyúzzuk az oszlopon. Ezután a gélt a fentivel azonos összetételű pufferoldattal mossuk, majd a heparint 0,05 mólos trisz-pufferoldat és 1,0 mólos nátriumklorid-oldat elegyével (pH=7,4) leoldjuk. Az eluátumból desztillált víz jelenlétében végzett gélszűréssel eltávolítjuk a sót (a gélszűréshez Sephadex G—25 gyantaoszlopot használunk fel; gyártja a Pharmacia cég), majd az eluátumot fagyasztva szárítjuk. 270 egység/mg fajlagos aktivitású, tisztított heparint kapunk. A molekulasúlyeloszlás vizsgálata során megállapítottuk, hogy a tisztított termékben jelenlevő anyagok molekulasúlya lényegesen szúkebb határok között változik, mint a kiindulási anyag esetén- A szénhidrát-elemzést karbazol-kénsavas módszerrel végeztük.
2. példa
Heparin tisztítása mátrixhoz kötött antitrombin felhasználásával (szakaszos eljárás)
A mátrixhoz kötött antitrombint az 1. példában ismertetett módon állítjuk elő. 300 ml így előállított, ülepített adszorbenst 0,05 mólos trisz-pufferoldat és 0,15 mólos nátriumklorid-oldat elegyével (pH=7,4) egyensúlyba hozunk, majd vákuumban leszűrjük és szárítjuk. A kapott adszorbenst 500 mg heparin (Vitrum; fajlagos aktivitás : 130 egység/mg) 300 ml, a fentiekkel azonos összetételű pufferoldattal készített oldatához adjuk, és az elegye; 1 órán át szobahőmérsékleten keverjük. Ezután a gélt zsugorított üvegszűrőn vákuumban leszűrjük, és 10 x 200 ml, a fentiekkel azonos összetételű pufferoldattal mossuk. Az adszorbeált heparint 3 x 200 ml, az 1. példában említettel azonos összetételű deszorbeáló pufferoldattal oldjuk le a gélről, majd az eluátumot fagyasztva szárítjuk. Sómentesítés céljából a kapott termék desztillált vízzel készített oldatát Spehadex G—25 gélen szűrjük, majd az eluátumot fagyasztva szárítjuk, 250 cgység/mg fajlagos aktivitású, tisztított heparint kapunk.
3. példa
Heparin tisztítása mátrixhoz kötött inter-a-tripszin-inhibitor felhasználásával
Az adszorbens előállítása
ÍX koagulációs faktort (B-faktort) Andersson és munkatársai módszerével [Thromb. Rés., 7, 451—459 (1975)] tisztítunk. A tisztítás során heparinmegkötő sajátságokkal rendelkező, körülbelül 150 000-es molekulasúlyú inter-a-tripszin-inhibitort különítünk el. 250 mg, így elkülönített fehérjét 200 ml 0,2 mólos nátrium-hidrogénkarbonát-oldatban oldunk, majd a kapott oldatot (pH=9,0) az 1. példában ismertetett módon brómciánnal aktivált 50 ml ülepített Sepharose 4B gélhez adjukA szuszpenziót éjszakán át szobahőmérsékleten enyhén keverjük, majd a gélt az 1. példában ismertetett módon mossuk.
Heparin tisztítása
A fentiek szerint előállított adszorbenst oszlopba töltjük. 300 mg heparint (Vitrum) 20 ml, 0,05 mólos trisz-pufferoldat és 0,15 mólos nátriumklorid-oldat eiegyében (pH=7,4) oldunk, és az oldatot az oszlopba szivattyúzzuk. A gélt a fenti összetételű pufferoldattal mossuk, majd az adszorbeált heparint az 1. példában ismertetett deszorbeáló pufferoldattal leoldjuk. A sót Sephadex G—25 gélen desztillált víz jelenlétében végzett gélszűréssel eltávolítjuk, és az effluenst fagyasztva szárítjuk. 230 egység/mg fajlagos aktivitású, tisztított heparint kapunk.
Claims (4)
1. Eljárás heparin fajlagos aktivitásának növeléséi» tisztítással, azzal jellemezve, hogy a legfeljebb 150 egység/mg, előnyösen 130 egység/mg fajlagos aktivitású heparint mátrixhoz kötött plazmafehérjéken adszorbeáltatjuk, majd a tisztított terméket leoldjuk.
2. Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatosítási mód- ja, azzal jellemezve, hogy adszorbensként mátrixhoz kötött antitrombint használunk fel. 5
3. Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatosítási mód ja, azzal jellemezve, hogy adszorbensként mátrixhoz kötött inter-a-tripszin-inhibitort használunk fel.
4. Az előző igénypontok bármelyike szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy mátrixként agarózt használunk fel.
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
SE7603040A SE431218B (sv) | 1976-03-05 | 1976-03-05 | Forfarande for rening av heparin |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
HU176811B true HU176811B (en) | 1981-05-28 |
Family
ID=20327240
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
HU77KA1485A HU176811B (en) | 1976-03-05 | 1977-03-04 | Process for the purification of heparin |
Country Status (21)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPS52108012A (hu) |
AT (1) | AT356818B (hu) |
AU (1) | AU508430B2 (hu) |
CA (1) | CA1079272A (hu) |
CS (1) | CS196349B2 (hu) |
DE (1) | DE2709500C2 (hu) |
DK (1) | DK155606C (hu) |
ES (1) | ES456196A1 (hu) |
FI (1) | FI62103C (hu) |
FR (1) | FR2342991A1 (hu) |
GB (1) | GB1539332A (hu) |
HU (1) | HU176811B (hu) |
IE (1) | IE44907B1 (hu) |
IL (1) | IL51346A (hu) |
NL (1) | NL186385C (hu) |
NO (1) | NO144388C (hu) |
NZ (1) | NZ183480A (hu) |
PL (1) | PL103049B1 (hu) |
SE (1) | SE431218B (hu) |
SU (1) | SU736860A3 (hu) |
ZA (1) | ZA771267B (hu) |
Families Citing this family (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
SE449753B (sv) * | 1978-11-06 | 1987-05-18 | Choay Sa | Mukopolysackaridkomposition med reglerande verkan pa koagulation, lekemedel innehallande densamma samt forfarande for framstellning derav |
GB2164346B (en) * | 1984-08-31 | 1988-03-30 | Nicolas Huberto Behrens | A non-thrombogenic heparin and a process for its obtention |
WO2015112121A1 (en) | 2014-01-21 | 2015-07-30 | The Board Of Trustees Of The University Of Arkansas | Heparin affinity tag for use in protein purification |
Family Cites Families (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US2623001A (en) * | 1949-04-07 | 1952-12-23 | Bengt E G V Sylven | Preparing heparin |
DE1195010B (de) * | 1962-05-12 | 1965-06-16 | Ormonoterapia Richter S P A | Verfahren zur Reinigung von Heparin nach der Chromatographischen Methode |
-
1976
- 1976-03-05 SE SE7603040A patent/SE431218B/xx not_active IP Right Cessation
-
1977
- 1977-01-27 IL IL51346A patent/IL51346A/xx unknown
- 1977-02-14 CA CA271,731A patent/CA1079272A/en not_active Expired
- 1977-02-15 FI FI770491A patent/FI62103C/fi not_active IP Right Cessation
- 1977-02-22 NL NLAANVRAGE7701882,A patent/NL186385C/xx not_active IP Right Cessation
- 1977-02-23 ES ES456196A patent/ES456196A1/es not_active Expired
- 1977-02-25 JP JP2016477A patent/JPS52108012A/ja active Pending
- 1977-03-02 NZ NZ183480A patent/NZ183480A/xx unknown
- 1977-03-03 ZA ZA00771267A patent/ZA771267B/xx unknown
- 1977-03-03 IE IE469/77A patent/IE44907B1/en not_active IP Right Cessation
- 1977-03-04 FR FR7706469A patent/FR2342991A1/fr active Granted
- 1977-03-04 NO NO770764A patent/NO144388C/no unknown
- 1977-03-04 PL PL1977196438A patent/PL103049B1/pl unknown
- 1977-03-04 DE DE2709500A patent/DE2709500C2/de not_active Expired
- 1977-03-04 AT AT144577A patent/AT356818B/de not_active IP Right Cessation
- 1977-03-04 GB GB9275/77A patent/GB1539332A/en not_active Expired
- 1977-03-04 DK DK096077A patent/DK155606C/da not_active IP Right Cessation
- 1977-03-04 HU HU77KA1485A patent/HU176811B/hu unknown
- 1977-03-04 AU AU22953/77A patent/AU508430B2/en not_active Expired
- 1977-03-04 SU SU772457090A patent/SU736860A3/ru active
- 1977-03-07 CS CS771523A patent/CS196349B2/cs unknown
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
ATA144577A (de) | 1979-10-15 |
DE2709500C2 (de) | 1986-09-18 |
NO144388B (no) | 1981-05-11 |
DK96077A (da) | 1977-09-06 |
AU2295377A (en) | 1978-09-07 |
FI62103B (fi) | 1982-07-30 |
SE7603040L (sv) | 1977-09-06 |
GB1539332A (en) | 1979-01-31 |
NO770764L (no) | 1977-09-06 |
CS196349B2 (en) | 1980-03-31 |
NL7701882A (nl) | 1977-09-07 |
NL186385B (nl) | 1990-06-18 |
CA1079272A (en) | 1980-06-10 |
NL186385C (nl) | 1990-11-16 |
FR2342991A1 (fr) | 1977-09-30 |
FI770491A (hu) | 1977-09-06 |
FR2342991B1 (hu) | 1981-10-30 |
IE44907L (en) | 1977-09-05 |
SU736860A3 (ru) | 1980-05-25 |
NO144388C (no) | 1981-08-19 |
NZ183480A (en) | 1979-08-31 |
PL103049B1 (pl) | 1979-05-31 |
FI62103C (fi) | 1982-11-10 |
AU508430B2 (en) | 1980-03-20 |
IL51346A (en) | 1979-11-30 |
IL51346A0 (en) | 1977-03-31 |
JPS52108012A (en) | 1977-09-10 |
DK155606C (da) | 1989-09-11 |
DK155606B (da) | 1989-04-24 |
ES456196A1 (es) | 1978-07-01 |
SE431218B (sv) | 1984-01-23 |
ZA771267B (en) | 1978-01-25 |
AT356818B (de) | 1980-05-27 |
DE2709500A1 (de) | 1977-09-08 |
IE44907B1 (en) | 1982-05-19 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
KR0161667B1 (ko) | 헤파린 유도체 및 그 제조방법과 그를 함유하는 의약품 | |
Silvestri et al. | The C1q inhibitor in serum is a chondroitin 4-sulfate proteoglycan. | |
US4022758A (en) | Isolation of coagulation factors I and VIII from biological material | |
FI95136B (fi) | Menetelmä anneksiinien puhdistamiseksi | |
Yamagishi et al. | Purification and biological property of heparin cofactor II: Activation of heparin cofactor II and antithrombin III by dextran sulfate and various glycosaminoglycans | |
US4119774A (en) | Heparin purification method | |
JPH0625202B2 (ja) | デキストラン誘導体 | |
US5760177A (en) | Lipopolysaccharide binding protein and process for producing the same | |
US5777081A (en) | Process for producing an inter-alpha-trypsin inhibitor concentrate for therapeutic use and concentrate thus obtained | |
US4446126A (en) | Antithrombin-heparin complex and method for its production | |
US4689323A (en) | Covalently bound heparin--antithrombin-III complex | |
JPH0424360B2 (hu) | ||
EP0245813B1 (en) | EDTA-free heparins, heparin fractions and fragments, processes for their preparation and pharmaceutical compositions containing them | |
JPH07116235B2 (ja) | 抗トロンビンiii濃縮物の製造法 | |
JP2004506651A (ja) | 抗ヘパリンペプチド | |
JP2511500B2 (ja) | 胎盤組織タンパク質pp▲下4▼の精製法 | |
US4446314A (en) | Fractionation of heparin | |
HU176811B (en) | Process for the purification of heparin | |
JPH04298501A (ja) | ヘパリノイド活性を有する多糖類組成物或いは多糖類、それらの製造方法及びそれらを有効成分とする抗血液凝固剤 | |
EP0048898B1 (en) | Method for the production of an antithrombin-heparin complex and pharmaceutical compositions containing the complex | |
US4450104A (en) | Water insoluble gel matrix containing lectin bound to antithrombin | |
US4386025A (en) | Method of preparing antithrombin | |
US5470965A (en) | Complexable heterogenous oligosaccharides and alpha-hydosanes having therapeutical activity, process for their preparation and related pharmaceutical compositions | |
JPH01226900A (ja) | プロテインcの精製方法 | |
JPS59167519A (ja) | 不活化トロンビンゲルにより血漿タンパク質混合液からフイブリノ−ゲンを除去する方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
HU90 | Patent valid on 900628 |