FI60501C - Foerfarande foer selektiv separering av interferon fraon interferon-raopreparat - Google Patents

Description

© SUOMI—FINLAND patenttijulkaisu—patentskrift 60501 © Kv.lk?/lnt.CI? A 61 K 45/02, G 12 P 21/0^ (g) Patenttihakemus — Patentansökning 771621+ »Kar® (g) Hakemispäivä — Ansökningsdag 20.05*77 ® Alkupäivä — Giltighetsdag 20.05-77 @ Tullut julkiseksi — Blivit offentlig 22.11.77 ® Nähtäväksipanon ja kuul.julkaisun pvm.—

Ansökan utlagd och utl.skriften publicerad 30.10.81

Patentti- ja rekisterihallitus (g) Patentti myönnetty - Patent meddelat θβ. 06.83

Patent* och registerstyrelsen , ©©© Pyydetty etuoikeus—Begärd prioritet 21.05.7o

Ranska-Frankrike(FR) 7615^1^ (73) Agence Nationale de Valorisation de la Recherche (ANVAR), 13, rue Madeleine-Michelis, 92522 Neuilly-sur-Seine, Ranska-Frankrike(FR) (72) Edward De Maeyer, Orsay, Jaqueline De Maeyer-Guignard, Orsay,

Ranska-Frankrike(FR) (7M Forssen & Salomaa Oy (5U) Menetelmä interferonin selektiiviseksi erottamiseksi interferoniraaka-valmisteesta - Förfarande för selektiv separering av interferon fr&n interferon-rdpreparat Tämän keksinnön kohteena on menetelmä interferonin selektiiviseksi erottamiseksi affiniteettikromatografiaa käyttäen interferoniraakavalmisteesta, joka sisältää epäpuhtautena muita proteiineja, jossa menetelmässä interferoniraakavalmiste saatetaan kosketuksiin adsorboijan kanssa, joka koostuu kantaja-aineesta sekä siihen liitetystä interferonin ligandina toimivasta yhdisteestä, ja desorboidaan interferoni.

Tiedetään, että interferoni on hyvin arvokas terapeuttinen tuote varsinkin sen huomattavien antiviraalisten ja immunodepressiivisten ominaisuuksien johdosta.

Tavallisten synteesimenetelmien in vitro mukaan tätä tuotetta saadaan virusten tai kemiallisten aineiden vaikuttaessa kudosviljelmiin. Mutta saadut valmisteet sisältävät myöskin epäpuhtauksia. Varsinkin nämä valmisteet sisältävät proteiineja, joilla on pyrogeeninen vaikutus ja jotka lisäksi voivat aiheuttaa vastaanottajassa erikoisen herkistymisen.

Raakoja interferonivalmisteita ei voida tämän johdosta käyttää välittömästi terapeuttisesti, vaan ne on puhdistettava.

2 60501

On ehdotettu erilaisia puhdistusmenetelmiä, varsinkin geelisuodatusta ja ionin-vaihtimien käyttöä.

Käytettäessä näitä menetelmiä interferonivalmisteiden puhdistamiseen ovat saannot olleet huonoja.

On ehdotettu myös affiiniteettikromatografian käyttöä puhdistukseen. Tämä menetelmä perustuu sopivalla tavalla kantaja-aineeseen liitetyn ligandin muodostaman adsorboivan faasin ja ko. tuotteen väliseen selektiiviseen affiniteettiin. Tuotetta sisältävän valmisteen kulkeminen adsorboivassa faasissa mahdollistaa tuotteen pidättymisen selektiivisellä tavalla ligandiin ja näin sen erottamisen sitä sisältävästä valmisteesta. Kiinnitetyn tuotteen talteenotto voidaan sitten suorittaa sopivan eluointi-aineen avulla.

Affiniteettikromatografiamenetelmät, joissa käytetään interferonin puhdistamiseen erikoisia vasta-aineita, anti-interferonia, eivät ole suuremmassa mitassa vielä kehittyneet antiseerumien ja anti-interferonin valmistusvaikeuksien johdosta.

Tämän keksinnön kohteena on poistaa nämä epäkohdat ja aikaansaada menetelmä, jolla voidaan erittäin yksinkertaisella tavalla ja lisäksi erinomaisin tuotoksin saada interferonivalmisteita, joiden interferoniaktiivisten tuotteiden, joista epäpuhtauksina olevat proteiinit on suurimmaksi osaksi poistettu, pitoisuus on suuri, ja joita voidaan tämän johdosta käyttää terapeuttisesti.

Keksinnön mukaiselle menetelmälle on pääasiallisesti tunnusomaista se, että ligandina käytetään yhdistettä, jolla on kaavan

0 NIL

Jl I SOjONa oör _χ·

il—q.—rC-O

SOjONa ""^OH

3 60501 mukainen sinisen kromoforin polysyklinen rakenne, jossa kaavassa R on H tai -S020Na.

Rakenne mahdollistaa interferonin selektiivisen pidättymisen, kun käytetyn adsor-boijan määrä on riittävä sekä ligandin ja puhdistettavan valmisteen välinen kosketus kestää riittävän kauan, niin että saavutetaan edellä mainittujen valmisteiden interferoniaktiivisuutta omaavien tuotteiden haluttu kiinnittyminen, ja näin kiinnitetyt tuotteet otetaan talteen desorboimalla nämä kiinnitetyt tuotteet puskurin avulla, jonka suolapitoisuus on hypermolaarinen veren suolapitoisuuteen nähden.

Näin on mahdollista erottaa huomattavan selektiivisesti interferoni sitä sisältävistä valmisteista, jotka voivat olla yhtä hyvin ihmis- kuin eläinalkuperää ja varsinkin kudosviljelmien pinnalta saatuja nesteitä, tuoreita viljelmiä (primäärisiä tai sekundäärisiä) tai jatkuvia solukolta, joiden solut on saatettu tuottamaan interferonia edullisesti seerumia sisältämättömässä viljelyväliaineessa virusten tai synteettisen nukleiinihapon kuten poly I.C avulla.

Interferoni voidaan ottaa talteen helposti ja käytännöllisesti katsoen melkein totaalisesti ja sen denaturoitumatta suorittamalla desorptio edellä mainituissa sopivissa olosuhteissa. Tämän menetelmän merkitystä lisää vielä se, että käytetyn adsorboijan adsorptiokyky pysyy käytännöllisesti katsoen ennallaan. Näin ollen tätä adsorboijaa voidaan käyttää useampia kertoja, mikä on erittäin edullista taloudelliselta kannalta.

Keksinnön erään sovellutusmuodon mukaan adsorboija sisältää geelin muodostavaa kiinteää kantaja-ainetta, joka on polysakkaridia kuten agaroosia tai sen johdannaista, varsinkin modifioitua agaroosia, jossa polysakkaridiketjut ovat verkkoutu-neet kolmiulotteiseksi verkoksi, erittäinkin tavaramerkillä SEPHAROSE (Pharmacia) myytyä, tai polyakryyliamidia tai akryyliamidihartsia.

Kantajaan liitetyn ligandin muodostaa edullisesti BLEU CIBACRON F3GA tai tavaramerkillä BLEU CIBACRON 3GA myyty tuote, joka eroaa edellisestä oleellisesti siten, että ketjun päässä olevan fenyyliradikaalin S020Na-ryhmän tilalla on vetyatomi.

Ligandina käytetty syklinen yhdiste voidaan vaikeuksitta kiinnittää polysakkaridiin, varsinkin molekyylipainoltaan suuruusluokkaa 2 miljoonaa olevaan polysakkaridiin nimeltään DEXTRAN 2000. Tämän jälkeen polysakkaridi liitetään kantaja-aineeseen.

Tällainen edullinen tuote, jonka siis muodostaa DEXTRAN 2000:aan liitetty sykli- 4 60501 nen yhdiste, on tavaramerkillä BLEU DEXTRAN 2000 saatava tuote, joka vastaa aikaisemmin mainittua DEXTRAN 2000:aan kiinnitettyä BLEU CIBACRON F3GA:a. Tämä tuote on edullisesti liitetty DEXTRAN 2000:n välityksellä agaroosin muodostamaan kantaja-aineeseen, joka on erityisesti SEPHAROSE'a, joka vastaa kaupallista tuotetta BLEU DEXTRAN SEPHAROSE (valmistaja Pharmacia, Uppsala, Ruotsi).

Vielä selittämättömistä syistä on käytännössä käyttökelpoiseksi mainitulla BLEU CIBACRON F3GA tyyppisellä polysyklisellä yhdisteellä suuri affiinisuus interferoniin. Yksinkertaisella kosketuksella edellä esitetyissä iso- tai hypomolaarisissa olosuhteissa, jotka edullisesti on aikaansaatu noin 0,01-0,15 M molaarisuuden omaavan puskurin avulla, mainitut tuotteet adsorboituvat selektiivisesti, kun taas suurin osa valmisteissa olevista epäpuhtauksista jää adsorboitumatta.

On erittäin yksinkertaista saattaa adsorboija ja puhdistettava valmiste keskenään kosketukseen kromatografiakolonnissa saattamalla puhdistettava valmiste kulkemaan kolonnin läpi. Adsorboijalla täytetty kolonni tasapainotetaan mainitulla puskurilla, jonka pH on suuruusluokkaa 6-8, edullisesti neutraali.

Käytetään raakoja interferonivalmisteita, joiden interferonipitoisuus on noin 46 . ...

10 -10 kansainvälistä yksikköä 0,1-0,2 g:ssa proteiinia, mikä antaa ommaisaktii- visuuden (kansainvälisiä interferoniyksiköitä mg:aa proteiinia kohti), joka on 10 -10^ välillä. Nämä valmisteet voidaan johtaa sellaisinaan kolonnin läpi tai ne voidaan ennalta dialysoida puskurin avulla, jota on käytetty mainitun kolonnin tasapainotukseen. Työskenneltäessä kudosviljelyvällaineen kanssa isomolaarisissa olosuhteissa interferonisaanto on noin 80-90%, kun taas hypomolaarisissa olosuh-eissa se on 100 %. Viimeksi mainitussa tapauksessa erittäin sopivan puskurin muodostaa Tris-HCl 10 mM pH 7,5. Tris on lyhennys, joka tarkoittaa tris-(hydroksi-metyyliaminometaania).

Kiinnittyneet tuotteet voidaan ottaa talteen lisäämällä puskurin suolapitoisuutta, varsinkin lisäämällä asetaatteja, fosfaatteja, klorideja tai muita suoloja siten, että saadaan hypermolaarinen suolapitoisuus veren suolapitoisuuteen nähden ja ainakin 0,5 M, edullisesti 1 M.

Interferonin talteenotto suoritetaan edullisesti kolonnista eluoimalla.

Tämä talteenotto voidaan kokonaan suorittaa vesiliuoksessa. On todettu, että orgaanisia liuottimia käyttämättä on mahdollista ottaa talteen käytännöllisesti katsoen 5 60501 totaalisella tavalla ligandiin kiinnittyneet interferoniaktiiviset tuotteet käyttämällä edellä esitetyn kaltaista hypermolaarisen puskurin vesiliuosta.

Saadut tulokset ovat tyydyttäviä olkoonpa interferonin alkuperä mikä tahansa ja varsinkin, kun se on peräisin sidekudoksista tai valkosoluista.

Kokoamalla valitut fraktiot saadaan puhdistettuja interferonivalmisteita, joiden interferonipitoisuus on suuri ja jotka käytännöllisesti katsoen ovat kokonaan vapautetut epäpuhtauksina olevista muista proteiineista, ja ainakin 90 %:sti alkujaan läsnäolevista muista proteiineista.

Lisäksi eluointiolosuhteet mahdollistavat interferoniaktiivisten tuotteiden pääosan kokoamisen fraktioon, jonka tilavuus on pieni, jolloin etuna on, että saadaan valmisteita, joiden interferonipitoisuus on suuri raaoissa valmisteissa olevaan pitoisuuteen verraten.

Niinpä lähtemällä edellä esitetyistä interferoniraakavalmisteista, joiden ominais-aktiivisuus jo on suuri, suuruusluokkaa 10^ kansainvälistä yksikköä proteiini mg kohti, voidaan tämän keksinnön mukaista menetelmää käyttämällä melkein totaalisin tuotoksin ja yhdessä ainoassa vaiheessa saada interferonivalmisteita, jotka ovat 30-40 kertaisesti puhdistettuja raakavalmisteisiin verraten, ja joiden ominais- g aktiivisuus on välillä 1-5 x 10 kansainvälistä yksikköä interferonia mg:aa proteiinia kohti. Tämä ominaisaktiivisuus on parhaita saatuja.

Puhdistetuilla valmisteilla on edulliset terapeuttiset ominaisuudet ja tarkemmin sanottuna hyvin tärkeä antiviraalinen vaikutus, kuten eri kokeet ovat osoittaneet.

Valmisteilla on vaikutusta varsinkin Hepatitis B virukseen, mikä on osoitettu keksinnön mukaisesti puhdistettujen ihmissidekudos- ja ihmisvalkosoluinterferonivalmis-teiden avulla kroonista Hepatitis B:tä sairastavissa potilaissa. Suoritetut kokeet on julkaissut Desmyter et ai julkaisussa The Lancet sivuilla 522-645, 1976 ja Greenberg et ai julkaisussa J. Med. 295 sivuilla 517-522, 1976. On voitu todeta näiden potilaiden maksan toiminnan huomattava paraneminen, jota on edistänyt infektoituneiden solujen korvautuminen interferonin suojaamilla infektoitumattomilla soluilla.

Keksinnön mukaiset interferonivalmisteet ovat osoittautuneet samoin tehokkaiksi Herpes simplex'iin nähden ja varsinkin Hepatitiksen aiheuttaman sarveiskalvon tulehduksen uusiutumisten estämisessä. Keksinnön mukaisten ihmisinterferonivalmisteiden avulla Kaufman'in et ai julkaisussa J. Infect. Dis. 133 (suppt) A 165-168, 1976 60501 6 esittämien menetelmien mukaan suoritetut kokeet ovat osoittaneet näiden valmisteiden suojaavan vaikutuksen viruksen aiheuttamaan infektioon nähden ja niiden estävän vaikutuksen Hepatitiksen aiheuttaman sarveiskalvon tulehduksen uusiutumisiin.

Lisäksi valmisteet vähentävät viruskomplikaatioiden, varsinkin Herpes Zoster'ista johtuvien uusiutumista ja kestoa, kuten on ilmennyt Jordan et al:n julkaisussa J. Infect. Dis. 130, 56-62, 1974 esittämistä kokeista. Valmisteet näyttävät toisaalta pidentävän kasvannaista vastustavien ominaisuuksiensa johdosta luusarkoomaa sairastavien potilaiden eloonjäämisaikaa. Nämä ominaisuudet voidaan osoittaa Strander'in et ai Acta Orthop. Scand:ssa 45, sivut 958-959, 1974 esittämällä menetelmällä.

Mainitut kokeet ovat osoittaneet keksinnön mukaisten interferonivalmisteiden vaarattomuuden ja niiden käytöstä johtuvien turmiollisten sivuvaikutusten puuttumisen.

Keksinnön mukaisten puhdistettujen valmisteiden huomattavan puhtauden johdosta niitä käytetään edullisesti sellaisinaan lääkkeen aktiivisena aineosana.

Keksintöä selvittävät seuraavat esimerkit.

Esimerkki 1 BLEU DEXTRAN SEPHAROSE affiniteettikromatografiakolonnin valmistus eläin- ja ihmis-alkuperää olevan interferonin puhdistamista varten 1. BLEU DEXTRAN SEPHAROSE - geelin valmistus BLEU DEXTRAN SEPHAROSE-geelien valmistusmenetelmän ovat esittäneet L.D. Ryan ja C.S. Vestling (Arch. Biochem. Biophys., 160, 279-284, 1974). Tästä julkaisusta alkaen ei enää tarvitse aktivoida SEPHAROSE'a bromisyaanilla kuten Cuatrecasas on aikanaan esittänyt (Cuatrecasas P., J. Biol. Chem., 3059-3065, 1970), koska kaupasta on saatavissa lyofilisoituja käyttövalmiita jo aktivoituja SEPHAROSE-valmistei-ta, kuten bromisyaanilla aktivoitua SEPHAROSE'a ja BLEU DEXTRAN 2000, joita myy esim. Pharmacia (Uppsala, Ruotsi).

a) SEPHAROSE (CNBr-SEPHAROSE 4B)-geelin valmistus

Geelin paisuttamiseksi ja lyofilisoidussa valmisteessa olevien bakterisidien 7 60501 poistamiseksi pestään lasisuodattimella 1 mM HCl-liuoksella noin neljännestunnin ajan haluttua määrää CNBr-SEPHAROSE:a, jolloin grammasta kuivatuotetta saadaan noin 3,5 ml geeliä. Tätä tarkoitusta varten käytetään 200 ml 1 mM HCl:ää CNBr-SEPHAROSE'n kuivapainogrammaa kohti. Muodostettu geeli kiinnitetään heti BLEU DEXTRAN 2000:een.

b) SEPHAROSE-geelin kiinnittäminen BLEU DEXTRAN 2000:aan Määrätään kiinnittyvä BLEU DEXTRAN määrä ottamalla huomioon, että gramma kuivaa SEPHAROSE'a pystyy kiinnittämään 80-100 mg BLEU DEXTRAN'ia. Tämä määrä liuotetaan alkaliseeen puskuriin, jonka pH on suuruusluokkaa 8-10, edullisesti 0,4 M karbo-naattipuskuriin, jonka pH on 10 (20 mg BLEU DEXTRAN'ia liukenee helposti yhteen ml karbonaattipuskuria).

BLEU DEXTRAN liuos kaadetaan geelille, joka on ennalta huuhdeltu 3 tai 4 kertaisel-la tilavuudellaan karbonaattipuskuria (0,4 M pH 10). Geelin ja BLEU DEXTRAN’in seos kaadetaan tummalasiseen pulloon ja sitä sekoitetaan kevyesti esimerkiksi pyörivän pyörän avulla noin 18-24 tunnin ajan lähellä +4°C olevassa lämpötilassa kiinnittymisen edistämiseksi.

Kiinnittämisvaiheen jälkeen saatua BLEU DEXTRAN SEPHAROSE tuotetta huuhdellaan lasisuodattimella karbonaattipuskurin ylimäärällä kiinnittymättömän BLEU DEXTRAN'in poistamiseksi, kunnes puskuri jää värittömäksi (optinen tiheys pienempi tai yhtäsuuri kuin 0,02).

BLEU DEXTRAN'iin kiinnittymättornien aktiivisten kohtien poistamiseksi tuote saatetaan sitten kosketukseen alkanoliamiini-, varsinkin etanoliamiiniliuoksen (1 M, pH 8) kanssa noin kahden tunnin ajaksi lämpötilassa +4°C. Tätä vaihetta varten tuote kaadetaan edullisesti pullosta toiseen astiaan.

Geelin tekemiseksi kestäväksi pH:n, molaarisuuden tai muita muutoksia vastaan se huuhdellaan sitten kolmasti, vuorotellen sekä happamalla liuoksella, jonka muodostaa asetaattipuskuri (0,1 M pH 4,0), johon on lisätty 1 M NaCl:a, että alkalisel-la liuoksella, jonka muodostaa 0,1 M boraattipuskuri (pH 8,5), johon on lisätty 1 M NaCl:a.

Näiden huuhtelujaksojen jälkeen geeli tasapainotetaan 10 mM Tris-HCl-puskurilla (pH 7,5), johon on lisätty bakterisidista ja antiseptistä ainetta, varsinkin 0,02 % natriumatsidia.

β 60501 2. Affiniteettikromatografiakolonnin valmistus BLEU DEXTRAN SEPHAROSE kaadetaan mitoiltaan sopivaan kromatografiakolonniin (yksi ml geeliä pystyy kiinnittämään noin 8 miljoonaa kansainvälistä yksikköä interferonia).

Ennen käyttöä kolonni huuhdellaan 20 kertaisella kuolleen tilavuuden määrällä 10 mM Tris HCl-puskuria (pH 7,5), johon on lisätty 0,02 % natriumatsidia.

Helposti irtoavien BLEU DEXTRAN-molekyylien poistamiseksi johdetaan läpi eluointi-liuosta, joka sisältää Tris-HCl (10 mM, pH 7,5), johon on lisätty 1 M NaCl niin kauan, että optinen tiheys 254 nimissä pysyy arvossa 0.

(Suurikokoisten kolonnien ollessa kysymyksessä suositellaan suoritettavaksi useita peräkkäisiä huuhtelujaksoja Tris-puskurilla, johon on mahdollisesti lisätty NaCl, kolonnien sopeuttamiseksi pH:n, molaarisuuden tai muiden olosuhteiden vaihteluihin) .

BLEU DEXTRAN SEPHAROSE kolonnia voidaan käyttää useita kuukausia interferonin useita puhdistusjaksoja varten edellyttäen, että kontaminoitumista ei tapahdu. Sen suojaaminen natriumatsidilla ja pitäminen kylmässä, noin +4°C:ssa, on riittävä varastointitoimenpide.

Natriumatsidin ollessa myrkyllistä soluille, on johdettava ainakin kolme kuollutta tilavuutta puskuria Tris-HCl kolonniin ilman atsidia kaikkien antiseptisten aineiden jäämien poistamiseksi.

Esimerkki 2

Ihmisinterferonivalmisteen puhdistaminen kromatografoimalla esimerkin 1 mukaisessa kolonnissa.

Puhdistettavan interferonivalmisteen muodostaa 32 ml vasta siirrostetun ihmis-fibroblastiviljelmän, joka on saatettu tuottamaan interferonia poly I.C.illä, pinnalta saatua nestettä. Pitoisuus on 6250 kansainvälistä yksikköä interferonia ml:a kohti, kun proteiinia on 1 mg ml kohti (tämän valmisteen suuri proteiinipitoisuus johtuu siitä, että se on rikastettu ihmisalbumiinilla säilyttämistä varten). Maini-. . 4 tun tuotteen ominaisaktiivisuus on 6,2 x 10 kansainvälistä yksikköä interferonia proteiini-mg kohti.

Valmistetta dialysoidaan voin +4°C lämpötilassa viidentoista tunnin ajan kolonnin 5 60501 tasapainotuspuskuria vastaan, tässä tapauksessa Tris-HCl (0,01 M, pH 7,5) vastaan.

32 ml valmistetta saatetaan kulkemaan nopeudella 1 ml minuutissa kolonnissa, jonka läpimitta on 1,6 cm ja jossa on 10,5 cm korkeuteen esimerkin 1 mukaista BLEU DEXTRAN SEPHAROSE geeliä. Kolonni huuhdellaan ennalta ainakin sen kuolleen tilavuuden kolminkertaisella määrällä atsiditonta puskuria. Sorptiovaihetta tarkkaillaan aallonpituudella 280 nm rekisteröimällä optinen tiheys (OD).

Kun kaikki valmiste on tunkeutunut geeliin, suoritetaan kolonnin pesu saattamalla kolonnin läpi kulkemaan viidestä kahdeksaan kuollutta tilavuutta puskuria Tris-HCl (10 mM, pH 7,5) adsorboitumattomien epäpuhtauksien poistamisen varmistamiseksi.

Optinen tiheys alenee arvoon 0 ja jää sitten tähän arvoon.

Interferonin talteenottamiseksi saatetaan kolonnin läpi kulkemaan 0,5-0,7 ml/min Tris-HCl (10 mM, pH 7,5) vesiliuos, johon on lisätty tällä kerralla 1 M NaCl.

Putkiin kootaan 6 ml fraktiot, joiden OD mitataan sorptiovaiheen tarkistamiseksi. Alla esitetään numeroitujen putkien fraktioilla 8-11 saadut tulokset niiden inter-feronipitoisuuksien ja proteiinipitoisuuksien avulla.

Putken n:o Kansainvälistä yksikköä Proteiineja Ominaisuus- interferoni a/ml (pg/ml) aktiivisuus 8 6 250 250 9 61 900 278 2,2 x 105 10 830 160 11 460 80 Hävitään, että interferoniaktiiviset tuotteet ovat pääasiallisesti kerääntyneet putkeen n:o 9. Interferonipitoisuus (kansainväl. yksikköä/ml) on kymmenen kertaa niin suuri kuin alussa havaittu, kun taas proteiinipitoisuus on noin 25 % raaka-valmisteiden proteiinipitoisuudesta, ja ominaisaktiivisuus on lisääntynyt 36-kertaiseksi, toisin sanoen BLEU DEXTRAN SEPHAROSE kolonnista poistuva valmiste on puhdistettu 36 kertaisesti raakatuotteisiin verrattuna.

Havaitaan, että vesiliuoksena kromatografoidun interferonin talteensaanti on totaalista. Putkeen n:o 9 on koottu 6 ml interferonia, jonka pitoisuus on 61900 yksikköä ml kohti, siis yhteensä 371400 yksikköä interferonia. Alussa oli 32 ml valmistetta, jossa oli 6250 yksikköä ml kohti, siis yhteensä 200 000 yksikköä.

10 60501

Interferoniaktiivisten tuotteiden desorptiovaiheen jälkeen kolonni regeneroidaan saattamalla noin kymmenkertainen kuollut tilavuus puskuria Tris-HCl (10 mM, pH 7,5), johon on lisätty 0,02 % natriumatsidia, kulkemaan sen läpi. Näin kolonni on valmis uuteen käyttöön ja se voidaan käyttöjen välisenä aikana säilyttää matalassa lämpötilassa.

Usean käyttöjakson jälkeen geeli voidaan regeneroida kiinnittyneiden proteiini-jäämien poistamiseksi. Tätä varten kolonni huuhdellaan viisinkertaisella kuolleella tilavuudellaan 3 M KCl:a.

Interferonin puhdistamisen tehokkuutta BLEU DEXTRAN SEPHAROSE geelissä esittää esimerkki 3, jossa kromatografoidaan hiiri-interferonivalmistetta, jota ei ole etukäteen keinotekoisesti rikastettu vierailla proteiineilla.

Esimerkki 3

Hiiri-interferonivalmisteen puhdistaminen kromatografisesti esimerkin 1 mukaisessa kolonnissa.

Puhdistettava interferonivalmiste on hiiren kudosviljelmän (sveitsiläisen hiiren fibroblasteja, soluja C 243), joka on saatettu tuottamaan interferonia Newcastle-taudin viruksella, pinnalta saatua nestettä. Viruksen inaktivoinnin jälkeen pH:ssa 2 pinnalta saatua nestettä dialysoidaan Tris-HCl-puskuria (0,01 M, pH 7,5) vastaan noin 14 tunnin ajan noin +°4C lämpötilassa.

Valmisteen alkuperäinen interferonipitoisuus on 1,5 x 10^ kansainvälistä yksikköä interferonia ml kohti, proteiinipitoisuus on 0,1 mg/ml ja ominaisaktiivisuus on 1,5 x 10^ interferoniyksikköä/mg proteiinia.

100 ml interferonia sisältävää valmistetta saatetaan kulkemaan esimerkin 1 mukaisessa BLEU DEXTRAN SEPHAROSE kolonnissa, jonka läpimitta on 1,6 cm ja joka sisältää geeliä 10,5 cm korkeuteen, työskennellen kuten esimerkissä 1. Valmisteen kulkemisen ja kolonnin huuhtelun jälkeen suoritetaan desorptio 1 M NaCl sisältävällä Tris-HCl-puskurin (0,01 M) vesiliuoksella kooten 6 ml:n fraktioita. Interferoni on rikastunut pääasiallisesti putkiin 15 ja 16, kuten allaolevassa taulukossa esitetyt tulokset osoittavat: 11 60501

Putken n:o Kansainvälistä inter- Proteiineja Ominaisuusaktiivisuus feroniyksikköä/ml (pg/ml) (interferoniyksiköitä mg proteiinia kohti) 14 2,4 x 105 70 15 2,3 x 107 111 2,1 x 108 16 5,8 x 106 12 4,8 x 108 17 2,4 x 105 11 18 1,2 x 105 10

Raakaan valmisteeseen nähden ominaisaktiivisuuden lisääntyminen, toisin sanoen puh-distusaste, on 15 kertainen putkeen n:o 15 nähden ja 35 kertainen putkeen n:o 16 nähden.

(Lisäksi raakavalmisteessa olevan interferonin talteenotto on totaalista).

6 8 100 ml:ssa lähtövalmistetta oli kaikkiaan 1,5 x 10 x 100 eli 1,5 x 10 yksikköä interferonia.

Kokoamalla kaikki interferoniaktiiviset tuotteet kahteen 6 ml putkeen, eli putkeen n:o 15 : 2,3 x 107 x 6 kaikkiaan 13,8 x 107 yksikköä putkeen n:o 16 : 5,8 x 108 x 6 kaikkiaan 3,4 x 107 yksikköä ja laskemalla yhteen putkissa 15 ja 16 havaitut interferonin aktiivisuusarvot g saadaan kokonaismääräksi 1,8 x 10 yksikköä interferonia.

Edellä esitetty osoittaa keksinnön mukaisen menetelmän huomattavan selektiivisyy" den. Menetelmän käyttö mahdollistaa interferoniaktiivisuuden lisäämisen, jolloin samalla poistuu suurin osa proteiiniepäpuhtauksista.

Claims (8)

12 60501

1. Menetelmä interferonin selektiiviseksi erottamiseksi affiniteettikromato-grafiaa käyttäen interferoniraakavalmisteesta, joka sisältää epäpuhtautena muita proteiineja, jossa menetelmässä interferoniraakavalmiste saatetaan kosketuksiin adsorboijan kanssa, joka koostuu kantaja-aineesta sekä siihen liitetystä interferonin ligandina toimivasta yhdisteestä, ja desorboidaan interferoni, tunnettu siitä, että ligandina käytetään yhdistettä, jolla on kaavan 0 n»2 II I SOjONa R ' 0 SOjONa ^OH mukainen sinisen kromoforin polysyklinen rakenne, jossa kaavassa R on H tai -S020Na.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että sininen kromofori kiinnitetään geelin muodostavaan kiinteään kantaja-aineeseen, jonka osaskoko on sellainen, että se päästää läpi raakavalmisteen muut makromolekyylit paitsi interferonin.

3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kantaja-aineeseen kiinnitetty sininen kromofori on tasapainotettu puskurin avulla, jonka suolapitoisuus on isomolaarinen tai hypomolaarinen veren suolapitoisuuteen nähden, s.o. vähemmän tai yhtä suuri kuin 0,15 M ja että interferonin desorptio suoritetaan puskurin avulla, jonka suolapitoisuus on hypermolaarinen verrattuna veren suolapitoisuuteen, s.o. vähintään 0,5 M.

4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kantaja-aine sisältää polysakkaridia kuten agaroosia, varsinkin modifioitua agaroosia, jonka polysakkaridiketjut ovat verkkoutuneet kolmiulotteiseksi verkoksi, tai vaihtoehtoisesti polyakryyliamidia tai akryylihartsia. 13 60501

5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että ligandi on kiinnitetty dekstraaniin, jonka molekyylipaino on noin 2 miljoonaa.

6. Jonkin patenttivaatimuksista 1-5 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että käytetään adsorboijaa, joka sisältää agaroosia, johon mainittu ligandi on kiinnittynyt dekstraanin avulla.

7. Jonkin patenttivaatimuksista 1-6 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että raakavalmiste sisältää fibroblasti-interferonia.

8. Jonkin patenttivaatimuksista 1-6 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että raakavalmiste sisältää valkosoluinterferonia.