NO882763L - Humant apolipoprotein ai og variantform av samme uttrykt i escherichia coli. - Google Patents

Description

Humant apolipoprotein AI og variantform av samme uttrykt i Escherichia coli.

Den foreliggende oppfinnelse vedrører produksjonen av humant apolipoprotein AI (apoAI) og dets varianter ved hjelp av rekombinant DNA teknologi.

Aterosklerose og dets medfølgende komplikasjoner (dvs. koronær hjertesykdom, CHD), er et og kanskje det mest vesentlige helseproblem i verden. Et stort antall risikofaktorer er blitt assosiert med utviklingen av denne sykdom, i det en av de mest viktige av disse er forhøyede plasmakolesterol (CHL) nivåer. Således er mye oppmerksomhet blitt gitt til studiet av CHL metabolisme i mennesket.

Lipoproteintransportsystemet gir nøkkelen til forståelse

av mekanismene hvorved gener, diett og hormoner virker sammen for å regulere plasma CHL og triglyserid (TG) nivåer i mennesket. Funksjonen av lipoproteinene i plasma er hovedsakelig å transportere lipider fra et organ til et annet. Det er nylig blitt klart at de ikke bare løseliggjør hydrofobe lipider, men kan også diktere det stedet i kroppen som hver lipidklasse skal avleveres til. Det er fire hovedklasser av lipoproteiner: kylomikroner (CM), veldig lav tetthets (VLDL), lav tetthets (LDL) og høy tetthets (HDL) lipoproteiner.

For transport i plasma blir TG og kolesteryl estere (CHLE) sammenpakket til lipoproteinpartikler, hvor de danner en hydrofob kjerne omgitt av et overflatemonolag av polare fosfolipider (PL). Overflatedekket inneholder også uesterifisert CHL i relativt små mengder sammen med proteiner kalt apolipoproteiner (apo). Minst ni apoer er blitt identifisert: AI,

All, AIV, B (48-100), CI, CII, CIII, D og E.

Av spesiell interesse er undersøkelsen om relasjonene mellom plasma lipoproteinnivåer og risikoen for utvikling av CHD. Både HDL og LDL er bærere for CHL og CHLE; imidlertid er det indikasjoner på at, mens LDL-CHL nivåer er en positiv risikofaktor (Kannel et al., Ann. Intern. Med.. 90:85-91,

1979), er HDL en viktig negativ risikofaktor (Yaari et al., Lancet, i:1011-1015, 1981). Selv om den nøyaktige funksjon og virkningsmåte av disse lipoproteiner ikke ennå forstås full-

stendig, viser det seg at HDL spesielt tjener til å fjerne CHL fra perifere vev og transportere den tilbake til leveren, med en mekanisme kalt revers CHL transport (RCT).

Hovedapolipoproteinet i HDL er apoAI, og flere studier har vist en invers forbindelse mellom plasma apoAI nivåer og CHD

lik det som er blitt dokumentert for HDL-CHL nivåer og CHD (Ishikawa et al., Eur. J. Clin. Invest.. 8:179-182, 1978). I tillegg er både HDL-CHL og apoAI nivåer inverst korrelert til graden av angiografisk demonstrerbare koronære arteriosklerotiske lesjoner (Pearson et al., Amer. J. Epidem.. 109:285-295, 1979; Maciejko et al., New Eng. J. Med.. 309:385-389, 1983). Således kan det argumenteres med at høye konsentrasjoner av HDL i plasma influerer på CHD ved å forsinke aterogenese og/eller fremme tilbakegang av eksisterende lesjoner.

Komplekser av HDL apolipoproteiner, hovedsakelig apoAI, og lecitin fremmer utstrømningen av fri CHL fra celler in vitro. inkludert dyrkede arterielle glatte muskelceller (Stein et al., Biochem. Biophvs. Acta. 380:106-118, 1975). Intravenøs

infusjon av fosfolipider i dyr med eksperimentelt indusert aterom influerer på denne utstrømning på en fordelaktig måte (Adams et al., J. Path. Bact., 94:77-87, 1967), og apoAI/lecitin-komplekser blir klargjort fra plasma i en hastighet lik hastigheten til naturlige HDL partikler (Malmendier et al., Clin. Chem. Acta. 131:201-210, 1983).

Den intravenøse infusjon av apoAI i CHL forede kaniner reduserer områdene som er involvert i lesjonen med 50%. Dette indikerer at apoAI har en beskyttende virkning på dannelsen av aterosklerotisk lesjon og muligens ved å minke CHL opptak av aortaveggen (Maciejko og Mao, Artheriosclerosis. 2:407a, 1982; Mao et al., Fed. Proe. ( USA). 42, nr. 7 ABSTRACT 357, 1983; Badimon et al., Cardiovascular Disease ' 86. 1986 ABSTRACT 81).

ApoAI er hovedproteinet i HDL, omtrent 70%, og er relativt rikelig i plasma med en konsentrasjon på 1,0-1,2 mg/ml (Schon-field et al., J. Clin. Invest.. 69:1072, 1982). Plasma apoAI

er en enkel polypeptidkjede med 243 aminosyrer, hvis primære sekvens er kjent (Brewer et al., Biochem. Biophys. Res. Commun.. 80:623-630, 1978). I sin intracellulære form er apoAI tilstede som en 267 aminokjede lang forløper; de første 18 N-terminale

rester i dette lengere protein blir spaltet intracellulært ved hjelp av signalpeptidase i grovt (granulært) endoplasmatisk retikulum. Den nylige utskilte apoAI inneholder fortsatt en 6 aminosyre lang N-terminalforlenging; omdannelsen til dets modne form utføres ved hjelp av en plasma og/eller lymfespesifikk protease (Zannis og Breslow, i Advances in Human Genetics. Harris og Hirschhorn eds., Plenum, 125-215, 1985).

Den C-terminale del av apoAI molekylet er blitt vist og består av gjentatte enheter av 11 eller 22 aminosyrer (McLachlan, Nature. 267:465-466, 1979); de dobbelt arrangerte segmenter er imidlertid ikke nøyaktige duplikasjoner, men aminosyresub-stitusjoner har hovedsakelig konservert den kjemiske type av rester i tilsvarende stillinger i de gjentatte segmenter.

Disse gjentatte segmenter er antatt å eksistere i amfipatisk helisk konfigurasjon (Segrest et al., FEBS Lett.. 38:247-253, 1974), er trodd å være det hovedstrukturere krav for de hovedbiologiske aktiviteter i apoAI, dvs. lipidbinding og lecitin CHL acyltransferase (LCAT) aktivering. To andre funksjoner av apoAI, at det virker som ligand for gjenkjennelse av HDL partikler ved en reseptor, og at det fjerner CHL fra perifere vev, er ennå ikke blitt relatert til spesifikke sekvenser eller områder i apoAI molekylet.

Den første beskrevne molekylære variant av humant apoAI er Milano (apoAI-MI) mutante (Franceschini et al., J. Clin. Invest.. 66:892-900, 1980). Denne erkarakterisert vedArgl73-Cys substitusjon (Weisgraber et al., J. Biol. Chem.. 258:2508-2513, 1983) , og ble identifisert i 33 individer som hørte til samme slekt. Alle var heterozygote for det mutante apoprotein, som blir overført som et autosomalt dominant trekk. De viste markerte reduserte HDL-CHL konsentrasjoner og hypertriglyseridemi av variabel grad, negativt korrelert med HDL nivåene. Ingen forbindelse mellom de mutante og spesifikke patologiske tilstander kunne fastsettes; faktisk var de affiserte individene tilsynelatende beskyttet fra utvikling av tidlig aterosklerose (Gualandri et al., Am. J. Hum. Gen.. 1986, in press).

Aminosyresubstitusjonen i apoAI-MI modifiserer strukturen av det mutante apoprotein, hvilket fører til en reduksjon av ordnet alfa-helisk struktur og til en økt eksponering av hydrofobe rester (Franceschini et al., J. Biol. Chem.. 260:16321-16325, 1985). Gjenoppbyggingen av det mutante apoprotein forandrer på en signifikant måte molekylets lipidbindende egenskaper, som binder seg mere lett enn normalt apoAI med lipider.

Apoprotein/lipidkomplekser ligner de som dannes ved hjelp av normal apoAI, men blir lettere ødelagt ved denaturerende midler. Tilstedeværelse av en cysteinrest i variantformen tillater dannelse av komplekser med apoAII, så vel som apoAI dimerer; disse proteinkomplekser er sannsynligvis ansvarlige for dannelse av de avvikende HDL partikler, observert i de "affiserte" individer. Alle disse egenskaper til apoAI-MI kan bidra til dets akselererte nedbrytning, så vel som til en effektiv opptakskapasitet for lipidvev.

Flere andre genetiske varianter av apoAI er blitt beskrevet så langt (Breslow, Ann. Rev. Biochem.. 54:699-727, 1985), men ingen av disse er forbundet med noen patologiske tilstander eller, hovedsakelig, til signifikante forandringer av lipo-proteinmetabolisme i bærerne (Tabell 1 nedenfor).

ApoAI cDNA kloner er blitt oppnådd ved flere laboratorier (Breslow, Ann. Rev. Biochem.. 54:699-727, 1985; Sharpe et al., Nucl. Acids Res.. 12:3917-3932, 1984). mRNA er omtrent 890 basepar (bp) lang og presenterer en 5' utranslantert sekvens på 35bp, en kodesekvens på 801bp (267 aminosyrer), et translasjons-termineringskodon (TGA) og en 3' utranslatert sekvens på 54bp fulgt av en polyA hale. Den komplette cDNA nukleotidsekvens er vist i Figur 1 i de medfølgende tegninger.

Vi har nå funnet at rekombinant DNA teknologi kan anvendes på en vellykket måte til å produsere proteiner som omfatter apoAI eller en genetisk variant av dette. Varianten kan være apoAI hvori 6-Ser er blitt erstattet av Thr (apoAI-T6), apoAI-MI eller en variant som kombinerer mutasjonene i begge apoAI-T6 og apoAI-MI (apoAI-T6/MI). Proteinene kan påvises ved hjelp av enzym-bundet immunoabsorbans måling (ELISA) med anti-apoAI anti-serum. Proteinene som produseres, kan være i form av fusjonsproteiner hvori apoAI eller genetisk variant av dette, blir sammenføyd, ved dets N-terminus, til et bærerpeptid.

Følgelig gir den foreliggende oppfinnelse en ekspressjonsvektor som i en transformert vert er i stand til å uttrykke et protein som er i stand til å bli påvist ved hjelp av ELISA med anti-humant apoAI antiserum og som har formelen (1):

Met-X-Y (1)

hvor X er en binding, en bærerpeptidsekvens som omfatter en sekvens dannet fra de N-terminale aminosyrerester fra beta-galaktosidase eller en sekvens som omfatter et eller flere IgG-bindende områder fra protein A, eller prosekvensen fra humant apoAI: og Y representerer sekvensen fra humant apoAI eller en genetisk variant av dette.

Metresten kan tillegges det translasjonene startkodon. Verter transformert med en slik ekspressjonsvektor og hvori et nevnt protein er i stand til å bli uttrykt, kan anvendes til å fremstille proteinet med formel (1). Den transformerte vert blir dyrket, og proteinet med formel (1), som således oppnås, blir utvunnet. Proteinene med formel (1) danner også en del av oppfinnelsen.

I foretrukne utførelsesformer vedrører oppfinnelsen

A) konstruksjon av rekombinante plasmider som bærer genene for: 1- apoAI (se Figur 1)

2- apoAI-T6

3- apoAI-MI

4- apoAI-T6/MI

5- apoAI med følgende N-terminale ekstensjon

Thr-Met-Ile-Thr-Pro-Ser-Phe-Asp-Gly-Ser-Met- (apoAI-RP5), 6- apoAI med følgende N-terminale ekstensjon

Thr-Met-Ile-Thr-Asn-Ser-Arg-Gly-Ser-Met- (apoAI-IPl), 7- proteinet som kombinerer apoAI-T6 og apoAI-RP5 (apoAI-RP5/T6),

8- proteinet som kombinerer apoAI-T6 og apoAI-IPl (apoAI-IPl/T6),

9- proteinet som kombinerer apoAI-MI og apoAI-RP5 (apoAI-RP5/MI),

10- proteinet som kombinerer apoAI-MI og apoAI-IPl (apoAI-IPl/MI),

11- proteinet som kombinerer apoAI-T6/MI og apoAI-RP5 (apoAI-RP5/T6/MI),

12- proteinet som kombinerer apoAI-T6/MI og apoAI-IPl (apoAI-IPl/T6/MI) og

13- apoAI med følgende N-terminale ekstensjon

Arg-His-Phe-Trp-Gln-Gln (proapoAI)

14- proteinet som kombinerer proapoAI og apoAI-MI

(roapoAI-MI)

15- proteinene fra 541 aminosyrerester med en N-terminal ekstensjon gitt ved hjelp av stafylokokkprotein A og som fra sin N-terminus er sammensatt av:

(de første 11 aminosyrer fra CRO proteinet fra fag lambda)-(248 aminosyrer fra stafylokokkprotein A (rester 23 til 270))-(Pro-Gly-Asp-Ser-Thr)-(de siste 17 aminosyrer fra beta-galaktosidase)-(de 17 aminosyrene som inneholder en gjenkjennelsessekvens for den proteolytiske enzymenterokinase og som er Gly-Asp-Pro-Glu-Phe-Val-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys-Ser-Ser-Arg-Gly-Ser-Met)-(apoAI, apoAI-T6, apoAI-MI eller apoAI-T6/MI); og B) ekspressjonen av disse gener i Escherichia coli ( E. coli) stammer. Ved ekspressjon av disse gener oppnås de følgende proteiner: - et apolipoprotein selektert fra Met-apoAI, Met-apoAI-T6, Met-apoAI-MI og Met-apoAI-T6/MI; - et fusjonsprotein hvor aminosyresekvensen

Met-Thr-Met-Ile-Thr-Pro-Ser-Phe-Asp-Gly-Ser-Met

blir sammmenføyd til et apolipoprotein selektert fra apoAI, apoAI-T6, apoAI-Mi og apoAI-T6/MI;

- et fusjonsprotein hvor aminosyresekvensen

Met-Thr-Met-Ile-Thr-Asn-Ser-Arg-Gly-Ser-Met

blir sammenføyd til et apolipoprotein selektert fra apoAI, apoAI-T6, apoAI-MI og apoAI-T6/MI;

- et proapolipoprotein proapoAI eller proapoAI-MI; og

- et fusjonsprotein sammensatt av (de første 11 aminosyrer av CRO proteinet av fag lamda)-(248 aminosyrer fra stafylokokkprotein A (rester 23 til 270))-(Pro-Gly-Asp-Ser-Thr)-(de siste 17 aminosyrer fra beta-galaktosidase)-(de 17 aminosyrer som inneholder en gjenkjennelsessekvens for den proteolytiske enzymenterokinase og som er Gly-Asp-Pro-Glu-Phe-Val-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys-Ser-Ser-Arg-Gly-Ser-Met)-(apoAI, apoAI-T6, apoAI-MI eller apoAI-T6/MI).

I de medfølgende tegninger:

Figur 1 viser den fullstendige nukleotidsekvens som tilsvarer den modne form av humant apoAI. Sekvensen er vist i mRNA forstand i 5' til 3' retning; den nedre linje viser aminosyresekvensen. Figur 2 viser rekonstruksjonen av 5' enden av genet som koder for modent humant apoAI. Et DNA fragment fra plasmid pAI/A, som starter ved det første Sau 3AI restriksjonssted, ble legert til en syntetisk oligonukleotidadaptor, ført sammen ved å varmebehandle og legere de enkeltstrengede forløpere 1-4.

Det resulterende 790 bp fragment, flankert av to Bam HI restriksjonssteder, koder for det modne apoAI molekyl. Figur 3 vedrører nukleotidsekvensen til pLS66 og pMLll-20. Sekvensene viser forbindelsesstedet mellom ATG startkodon i pFCE4<+>og begynnelsen av apoAI genet før (pLS66, A) og etter delesjon (pMLll-20, B). Figur 4 vedrører nukleotidsekvensen til pIL8-6 og pIL8-l. Sekvensene viser til tilstedeværelse av apoAI-MI mutasjon (C til T) i pIL8-l (A) og av apoAI-T6 mutasjon (G til C) i pIL8-6

(B) .

Figur 5 viser immunoblotanalyse av pMLll-20. Aliquotte

mengder av det eluerte materialet fra affinitets kolonnen og fra en standard human HDL fraksjon ble kokt og kjørt på elektroforese i duplikat på en 12,5% SDS-PAGE. Blotting på nitrocellulosefilter ble utført som beskrevet i teksten. Felt: 1- standard HDL; 2- eluat fra affinitets kolonnen; 3- Mr standarder. Figur 6 viser immunoblotanalyse av pRP5og pUC9. Aliquotte mengder av bakterielle kulturer, som bærer vildtype pUC9 eller de rekombinante pRP5 plasmider, indusert med IPTG, ble pelletert og resuspendert i den egnede buffer for gel elektroforese parallelt med en standard human HDL fraksjon; etter koking ble prøver kjørt på elektroforese på 12,5% SDS-PAGE. Blotting på nitrocellulosefilter ble utført som beskrevet i teksten. Felt: 1- Mr standarder; 2- standard HDL; 3- pUC9; 4- pRP5. Figur 7 viser konstruksjonen av plasmid pLM8, hvor boksene angir følgende: PROT A, AMP, LAC Z og APOAI: gener som koder for protein A, -laktamase, -galaktosidase og human moden apoAI;

CRO: sekvens som koder for de første 11 aminosyrer i lambda cro proteinet; T: protein A transkripsjons termineringssekvens; Fl: fag fl sammenpakkingsekvens; ORI: replikasjonsutgangspunkt; Ek.AD: proteolytisk stedsekvens gjenkjent av enterokinase. EcoRI og Clal steder i plasmid pLM8 er ikke unike. Figur 8 viser rekonstruksjonen av 5' proapoAI sekvensen. Figur 9 viser konstruksjonen av vektor pFC33 som er i stand til å uttrykke proapoAI. Figur 10 viser en gel elektroforese og immunoblotanalyse av proapoAI uttrykt ved hjelp av pFC33. Felt 1: HDL standard, Felt 2: Ikke-rekombinant stamme, Felt 3: proapoAI og Felt 4: Molekylvektstandard.

En ekspressjonsvektor i henhold til oppfinnelsen er en vektor i stand til å uttrykke DNA sekvenser, og spesielt, sekvensene til strukturelle gener som vektoren inneholder. DNA sekvensene som skal uttrykkes, er korrekt plassert i relasjon til oppstrømssekvensene som kontrollerer deres ekspressjon. Et hvilket som helst egnet promoter system kan anvendes ved å ta i betrakting proteinet som skal uttrykkes, naturen av verten, etc. Således kan en promoter selektert fra PL, lac, tac og trp promotere anvendes. I det foreliggende tilfelle er de 5'-regulatoriske sekvenser heterologe med henblikk på apoAI eller den genetiske variant av denne som skal uttrykkes. De regulatoriske sekvenser kan være de som er fra lac eller trp operon. Med andre ord er en ekspressjonsvektor av oppfinnelsen i stand til å uttrykke et heterologprotein hvor det heterologe protein er apoAI eller en genetisk variant av dette. Foretrukne genetiske varianter er apoAI-T6, apoAI-MI og apoAI-T6/MI.

Ekspressjonsvektorene av den foreliggende oppfinnelse, som inneholder en DNA sekvens som kode for et protein med formel (1), er typisk plasmider. De kan være enkeltstrenget. Hver vektor er repliserbar og inneholder replikasjonsutgangspunkt. Foretrukne ekspressjonsvektorer blir dannet fra plasmid pFCE4+ i tilfelle av ekspressjon av apoAI eller en genetisk varint av dette, pUC8 eller pUC9 i tilfelle av ekspressjon av et fusjonsprotein hvor bærersekvensen omfatter en sekvens dannet fra N-terminale aminosyrerester fra beta-galaktosidase, pLM3 der hvor bærersekvensen omfatter et eller flere IgG bindende områder fra protein A og PDS20 der hvor proapoAI eller en genetisk variant av dette, blir uttrykt.

For å uttrykke proteinet som omfatter apoAI eller en gentisk variant av dette, blir en egnet vert transformert med en ekspressjonsvektor i henhold til oppfinnelsen. En prokaryotisk eller eurkaryotisk vert kan anvendes slik som bakterer, gjærceller eller en pattedyrcellelinje. I de typiske tilfelle er verten en stammme av L. Coli. Det bør velges en vert hvor det ønskede protein ikke blir nedbrutt av cellulære proteaser.

I generelle termer kan derfor et protein som omfatter apoAI eller en genetisk variant av dette, oppnås i henhold til følgende fremgangsmåte:

1. Klonet apoAI cDNA blir selektert.

2. cDNA blir tilpasset slik at apoAI genet er gitt med restriksjonsteder i begge ender så det blir lett bevegbart. Dette kan involvere fjerning av sekvensene som koder for signalpeptide og propeptide. 3. apoAI genet blir innført i en ekspressjonsvektor i den korrekte avlesningsramme. Mutasjoner T6 og/eller MI kan innføres. apoAI genet eller et variantgen kan være det eneste strukturelle gen i et operon. Alternativt kan det være gitt festet ved sin 5'-ende til en DNA sekvens som kode for et bærerpeptid der hvor det er ønsket å uttrykke apoAI eller en genetisk variant av dette som et fusjonsprotein. 4. En vert hvor apoAI eller en genetisk variant av denne som er i stand til å blir uttrykt, blir transformert med ekspressj onsvektoren. 5. Den transformerte vert blir dyrket, og det ønskede protein som således oppnås, blir utvunnet.

Der hvor et gen som kode for apoAI eller en genetisk variant av dette er tilgjengelig uten et eller flere introner, kan dette gen innføres i ramme i en vektor under den transkrip-sjonene kontroll av en promoter gitt i vektoren. Genet kan innføres umiddelbart etter en DNA sekvens som koder for en bærerpeptidsekvens. En DNA sekvens som koder for et protein med formel (1) kan derfor gis mellom translasjonen start og stoppkodon i en vektor som gir en egnet promoter. På samme måte kan et gen som koder for proapoAI eller en genetisk variant av dette bli innført i en vektor. Dyrking av en vert transformert med den resulterende ekspressjonsvektor fører til produksjon av det ønskede protein.

Bærerpeptiddelen av et fusjonsprotein kan dannnes fra N-terminale aminosyrerester fra beta-galaktosidase. Den kan f.eks. dannes fra opptil de første femten N-terminale aminosyrerester fra beta-galaktosidase. Fortrinnsvis er restene rester 5 til 15, mere foretrukket rester 8 til 12. Foretrukne bærerpeptider oppnådd på denne måte, omfatter sekvensene: Thr-Met-Ile-Thr-Pro-Ser-Phe-Asp-Gly-Ser-Met

Thr-Met-Ile-Thr-Asn-Ser-Arg-Gly-Ser-Met.

Når fusjonsproteiner som inkorporerer slike bærerpeptider blir uttrykt, blir de forutgått av Met. Dette gjelder også der hvor det alternative bærerpeptid som omfatter et eller flere av de IgG-bindende områder fra protein A, blir anvendt. En slik bærersekvens kan omfatte hele sekvensen fra stafylokokkprotein A, eller rester 23 til 270 fra dette protein. En aminosyre-sekvens som inkluderer et gjenkjennelsessted for et proteolytisk enzym slik som enterokinase, faktor X eller kollagenase, kan umiddelbart gå forut for sekvensen for apoAI eller en variant av dette. En egnet sekvens er: Gly-Asp-Pro-Glu-Phe-Val-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys-Ser-Ser-Arg-Gly-Ser-Met.

Dette er en gjenkjennelsessekvens for enterokinase. Andre aminosyrer kan være tilstede i bærersekvensen. F.eks. kan det være en sammenbindingssekvens på opptil 30 rester mellom protein A sekvensen og sekvensen til det proteolytiske enzymgjen-kj ennelsessted. Den N-terminale del av bærersekvensen kan omfatte de første rester, f.eks. opp til 20 rester, av det strukturelle gen, naturlig kontrollert av promoteren, gitt i ekspressjonsvektoren. Fusjonsproteiner som omfatter et IgG-bindende område fra protein A, er vannløselige, i rimelig grad stabile i vandige omgivelser og blir lett renset til homogenitet ved affinitets kromatografering, f.eks. på IgG-bundet sefarose.

Med eller uten den N-terminale utvidelse gitt av et bærerpeptid, er rekombinante proteiner med formel (I) typisk gitt i det vesentlige fri for andre proteiner av human opprinn-else. Med andre ord er det gitt et protein som i det vesentlige er i ren form, som ikke er fulgt av protein hvormed det vanligvis er assosiert.

Proteinet som omfatter apoAI eller en genetisk variant av dette, kan anvendes i en fremgangsmåte for behandlig av menneskekroppen eller dyrekroppen ved terapi. Mer spesielt kan det anvendes til å senke plasmakolesterol og/eller triglyserid-nivåer. Således kan et protein anvendes til å bekjempe aterosklerose og kardio-vaskulære sykdommer slik som koronaer hjertesykdom. Proteinet kan administreres preventivt eller til forbedring/helbredelse av en eksisterende tilstand.

Et protein produsert i henhold til oppfinnelsen, kan derfor være gitt som en farmasøytisk sammensetning som også omfatter en farmasøytisk aktiv bærer eller et fortynningsmiddel. Slike sammensetninger kan være utformet på kjent måte. Proteinet kan administreres parenteralt, f.eks. intravenøst.

De følgende eksempler illustrerer oppfinnelsen.

Eksempel 1

MATERIALER OG FREMGANGSMÅTER.

Stammer og medier.

Stammer: E. Coli K12 JM101 (Messing et al., Nature. 314:309-321, 1981), MC 1061 (Casadaban og Cohen, J. Mol. Biol. 138:179-207, 1980), 71/18cl857 (Lorenzetti et al., Gene. 39:85-87, 1985), RL841 ( Kenkel. Proe. Nati. Acad. Sei. USA. 82:488-482, 1985), CAG629 ( rpoHl65. lon-: CA. Gross, Madison, Wisconsin).

Medier: Alle stammer blir dyrket i LB medium med 50 mg/ml ampicillin når det trengtes (LA medium). 1 mM IPTG ble tilsatt til mediet for på ny å undertrykke lac promoteren når det var hensiktsmessig.

Enzymer, enzymatiske reaksjoner og DNA rensing.

Lysozym var fra Sigma (St. Louis, MO, USA).

Restriksjonsendonukleaser var fra Boehringer (Mannheim, DE), BRL Inc. (Gaithesburg, MD, USA) eller New England Biolabs (Beverly, MA, USA); T4 ligase og alle andre enzymer var fra Boehringer. Alle enzymatiske reaksjoner ble utført i henhold til tilførerens instruksjoner med mindre annet var spesifisert. DNA fragmenter oppnådd ved restriksjonsendonuklease digestion, ble separert ved elektroforese i agarose horisontale geler eller polyakrylamid vertikale geler og ekstrahert fra gel-matriksen ved en modifisering av elektroelueringsmetoden, ved å anvende en ISCO Mod. 1750 konsentrator (ISCO Co., Lincoln, NE, USA) og videre rensing på Elutip-d kolonner (Schleicher og Schuell, Keene, NH, USA).

Ensym immunoassay for apoAI<g>jenkjennelse i bakterielle ekstrakter ( ELISA).

Pelleterte celler ble resuspendert i lysis buffer (50 mM Tris-Cl pH 7,0, 30 mM NaCl, 0,1% NaN3, 10 mg/l FenylMetyl Sulfonyl Fluorid). Løsningen ble laget 1 mg/ml med lysozym og ble rørt ved 4°C i 30 minutter. Etter 5 omganger med frysing og opptining ble ekstraktene underkastet enzymimmunoassay som følger.

En standard 96 brønn mikrotiterplate ble belagt med egnede fortynninger av anti-humant apoAI antiserum dannet i sau (Boehringer, Mannheim, DE) over natten ved 4°C. Etter 3 vaskinger med 10 mM Tris-Cl pH 8,0 som inneholdt 0,05% Tween-20 og 0,01% Mertiolat, 50 pl seriske fortynninger av apoAI

standard (TAGO Corp., Burlingame, CA, USA) eller av bakterielt ekstrakt ble tilsatt og inkubert i 1 time ved 37°C. Etter 3 vaskinger med den samme buffer, ble 50 pl tilsatt av en passende løsning av kanin anti-humant apoAI antiserum (Immuno Ltd., Dunton Green, Nr. Sevenoaks, Kent, GB), videre renset ved hjelp av ammoniumsulfat presipitering. Etter 1 time ved 37°C

og 3 flere vaskinger ble brønnene merket med protein et A-pepperrotperoksidasesett tilført av New England Nuclear,

(Boston, MA, USA) i henhold til fabrikantens instruksjoner.

Binding av anti- humant apoAI fra sau til Affigel 10.

Fremstilling av anti-apoAI antistoff fra sau (Boehringer, Manneheim, DE): 20 ml ufortynnet antistoffløsning ble dialysert mot 0,1 M fosfatbuffer pH 7, over natten ved 4"C ved kontinuerlig røring; så ble alle rester spunnet ned i det man beholdt supernatanten.

Fremstilling av Affigel 10 (Bio-Rad, Richmond, CA): 40 ml ble ekvilibrert ved romtemperatur før gjentatte (4-5 ganger) sykler med vasking med et halvt volum isopropylalkohol og så med dobbelt destillert vann; gelen ble tørket ned ved filtrering og overført til et 50 ml falkonrør i det man tilsatte det dialyserte antistoff. Røret ble så inkubert ved 4°C i 8 timer ved kontinuerlig røring og 1 ml av 1 M glycinetylester ble tilsatt; inkubering fortsatte over natten. Gelen ble så grundig vasket med de følgende løsninger:

- 100 ml PBS + 0,1% natriumazid

- " IM eddiksyre

- " " 0,1 fosfatbuffer pH 7 + 0,5 M NaCl

PBS + o,l% natriumazid;

pakket i en kolonne og ekvilibrert med påfyllingsbuffere (PBS + 10 mg/l PMSF + 10 mg/l Pepstatin A).

Immunoblotanalyse.

Prøver ble kjørt på polyakrylamidplate geler (ved den passende konsentrasjon) ved å anvende Laemmii metoden.

Så ble gelene overført på nitrocellulosefiltere ved å anvende et transblotapparat (Bio-Rad) ved 0,2 A i 4 timer ved 4°C i 25 mM Tris Base, 192 mM Glysin, 20% Metanol. Etter overføring ble filtrene vasket med destillert vann og så inkubert i 1 time med PBS + 3% BSA med svak rysting. Filtrene ble vasket igjen med destillert vann og inkubert med det første antistoff (det samme som ble anvendt i ELISA som annet antistoff) fortynnet 1:250 med PBS, og inkubert i 1 time ved romtemperatur. Etter 2 vaskinger med PBS og PBS + 0,05% Tween 20 ble filtrene inkubert med det andre antistoff (antikanin IgG dannet i geit konjugert med pepperrotperoksidase; Bio-Rad) fortynnet 1:7500 i 1 time ved romtemperatur. Etter 2 vaskinger til ble filtrene merket med 4-klor-l-naftol.

RESULTATER.

5' ende rekonstruksjon av apoAI genet.

En fullengde cDNA klon som koder for apoAI (pAI/A) ble oppnådd fra en human lever cDNA samling som hadde de kodende sekvenser for signalpeptide, propeptide og hele det modne apoAI protein (Sharpe et al., Nucl. Acids Res.. 12:3917-3932). Vi rekonstruerte 5' enden av genet slik at alle sekvenser i oppstrømsretning fra det første kodon i moden apoAI ble fjernet. For dette formål ble plasmid pAI/A digested med EcoRI og BamHI og et 890 bp fragment som inneholdt det cDNA innførte stykket, ble isolert og utvunnet fra en 1% agarosegel. Fragmentet ble kuttet med Sau3AI under delvis digestions-betingelser, og blandingen ble legert med en fosforylert syntetisk adaptor, som var blitt utformet til å rekonstruere den kodende sekvens for de første 9 aminosyrer i det modne protein, i det man optimaliserer sekvensen i henhold til kodonanvendelse i E. coli. Adaptoren ble fremstilt som følger: fire oligonukleotider ble syntetisert ved hjelp av fosfotriester-metoden (Crea og Horn, Nucl. Acids Res.. 8:2231-2348, 1980).

Alle fire oligonukleotider ble legert sammen i like molare mengder, legeringsblandingen ble behandlet med Sau3AI og adaptoren ble eluert og renset fra en polyakrylamid gel. Den resulterende sekvens av adaptoren er illustrert i Fig. 2.

Legeringsblandingen som inneholdt den rensede adaptor og det delvis Sau3AI-avskårne apoAI fragment ble digestert med BamHI. Et 790 bp fragment ble renset fra en polyakrylamid gel og legert til BamHI-avskårne pAT153-PvuII8 behandlet med kalvetarmfosfatase. Etter transformering av MC 1061 ble rekombinanter kartlagt ved hybridisering med fosforylert oligonukleotid 3 som prøve. Positive kolonier ble isolert og viderekarakterisert vedrestriksjonsenzymdigestion og sekvens-dannelse ved delvis kjemisk nedbryting i henhold til Maxam og Gilbert ( Methods Enzymol.. 65:499-560, 1980). Plasmidet som hadde adaptoren i den riktige orientering, ble betegnet pAI/12.

Således rekonstruert ble 5' enden av apoAI genet forutgått av et ATG startkodon og en BamHI kohesiv ende. Ved å anvende denne strategi kunne den modne apoAI kodende sekvens fjernes til en hvilken som helst ekspressjonsvektor som bar et BamHI sted etter Shine-Dalgarno sekvensene.

Konstruksjon av rekombinante vektorer ved å anvende pFCE4+.

BamHI fragmentet som inneholdt det modifiserte apoAI gen, ble renset og subklonet inn i BamHI stedet i pFCE4+ (Lorenzetti et al., 1985). Den resulterende konstruksjon med den riktige orientering av det innforte stykket ble verifisert ved hjelp av dideoksykjedetermineringssekvensdannelse (fig. 3A). Dette plasmid ble kalt pLS66.

Ved å anvende dette strategi ble apoAI genet innført utenfor rammen med henblikk på ATG startkodon som allerede var tilstede i vektoren. Således var det neste trinn å gjenopprette avlesningsrammen ved å plassere apoAI genet umiddelbart etter dette ATG kodon.

I- rammeplassering.

Ved å anvende pFCE4 systemet kan i-rammeplassering av et klonet gen utføres ved å anvende "bro" oligonukleotider som har sekvenser som er komplementære med strekkene av baser som flankerer området som skal deleteres på hver side (Sollazzo et al., Gene. 37:199-206, 1985).

For å gjøre dette syntetiserte vi ved hjelp av fosfotri-estermetoden et enkeltstrenget oligonukleotid som hadde følgende sekvens:

Dette oligonukleotid skulle varmebehandles med sin 5' ende til området umiddelbart forutgående for og som inkluderte ATG i vektoren (nukleotider 1 til 10), og med sin 3' ende til de første 8 nukleotider i apoAI genet, og således sløyfe ut de ekstra nukleotider tilstede i pLS66 (Fig. 2). ssDNA i pLS66 ble fremstilt som beskrevet ( Kunkel. Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 82:488-492, 1985) ved å anvende E. coli RL841 som vert. Denne baktrielle stamme er et derivat av E. coli RZ1032 som inneholder plasmid pCI857 (M. Zabeau) som produserer en temperaturfølsom repressor for PL promoteren tilstede i pFCE4.

Ved å anvende denne fremgangsmåte inneholdt ssDNA produsert fra denne stamme, flere urasilrester i stedet for tymin, og virket således som en normal, funksjonell template "in vitro", men var ikke biologisk aktiv ved transformering inn i en villtype (ung+) E. coli 71/18cI857 stamme som er den normale vert for disse plasmider.

0,1 pmol pLS66 ssDNA ble varmebehandlet med 2 pmol kinasert mutagent oligonukleotid (et 20 ganger overskudd) ved 56<*>C i 30 minutter i 15 mM Tris-Cl, pH 8,5, og 15 mM MgCl2. Etter avkjøling til romtemperatur ble forlengelses-legeringsblandingen tilsatt, og reaksjonen ble fortsatt ved 15°C over natten. Forlengelsesreaksjonsblandingen var som følger (sluttkonsentrasjoner): 10 mM Tris-Cl, pH 8,5; 10 mM MgCl2; 0,5 mM ATP; 0,05 mM dNTPs; 5 mM DTT; 1 enhet DNA polymerase, Klenow fragment og 1,5 enheter T4 DNA ligase.

Etter inkubering ble reaksjonsblandingen fenolekstrahert, isopropanol og etanolpresipitert; 71/18cI1857 kompetente celler ble overført og flatet ut på selektivt medium, LA. For å identifisere kloner som inneholdt den ønskede delesjon, ble 150 kolonier plukket, dyrket på ordnede plater og overført på nitrocellulosefiltere. Hybridiseringen ble overført ved romtemperatur i 6x SSC og 10x Denhardfs ved å anvende det mutagene oligonukleotid som prøve. Filtrene ble så vasket i 6x SSC og 0,1% SDS ved to forskjellige temperaturer: første gang ved romtemperatur, for å sjekke hybridiseringseffektiviteten, og så ved 50<*>C, dvs. 4°C under den teoretiske smeltetemperatur. Dette ble beregnet i henhold til følgende formel, Tm = 4xGC + 2xAT, hvor GC og AT er antall par dannet av oligonukleotidet med den mutageniserte template (Norrander et al., Gene. 26:101-106, 1983). Etter hver vasking ble filtrene eksponert med røntgenstråle følsomme filmer. Mutante kolonikandidater som ga positive signaler også ved en streng temperatur, ble bekreftet ved hjelp av dideoksykjede-termineringssekvensdannelse (Fig. 3B). Effektiviteten av denne fremgangsmåte er nokså høy, omtrent 50%.

pFCE4+ med apoAI genet riktig plassert i ramme ble kalt pMLll-20.

Konstruksjon av apoAI varianter T6 og MI.

Både pLS66 og pMLll-20 ble anvendt som templates for konstruksjon av de to varianter apoAI-T6 og apoAI-MI. Vi besluttet å bruke begge templates for samtidig å oppnå de variante gener riktig plassert i ramme og i et transponerbart BamHI fragment.

For dette formål ble to enkle oligonukleotider syntetisert ved den vanlige fremgangsmåte:

1. 5' -CACCGCAGACTCCATGG-3' for T6 mutasjonen

2. 5' -GCGCCAGTGCTTGGC-3' for MI mutasjonen

I det vi indikerte med nummer 1 det første nukleotid i det første kodon i moden apoAI, skulle oligonukleotid 1 bli varmebehandlet fra rester 8 til 24, med en mistilpassning i posisjon 17 (G til C). Oligonukleotid 2 skulle bli varmebehandlet fra rest 510 til 524, med en mistilpassning i posisjon 517 (C til T).

Mutageneseeksperimentene ble utført ved å anvende den samme fremgangsmåte beskrevet for i-rammeplasseringen (Fig. 4A og B). For de dobbelte mutanter oppnådde vi først T6 mutasjonen og tilsatte så MI mutasjonen.

De resulterende plasmider ble kalt:

Konstruksjon av variantene apoAI- RP5 og IP1.

DNA fragmentene som inneholdt apoAI genet og dets varianter T6 og MI, ble avskåret fra plasmider pLS66, PIL5-6, PIL5-1 ogPIL5-6I ved Barn HI digestion og ble renset på en 1% agarosegel som beskrevet. Fragmentene ble så legert til pUC8 og pUC9 (Vieira og Messing, Gene. 19: 259-268, 1982), begge linearisert med Barn HI. Etter transformering av JM101 kompetente celler ble rekombinante plasmider identifisert ved den hurtige avbrytningsmetode og verifisert ved å avskjære isolater med Bam HI. To motsatte orienteringer av det innførte stykket ble adskilt ved å avskjære med Hind III og Xho I.

Konstruksjoner med pUC8 hadde apoAI genet allerede i ramme, umiddelbart forutgått av en metioninrest og de første 9 aminosyrer fra alfa-peptide fra det bakterielle beta-galaktosi dase gen; dette resulterte i en 10 aminosyreutvidelse i den N-terminale ende av apoAI molekylet i beta-galaktosidase.

Alle de rekombinante pUC9 derivater som inneholdt apoAI genene i den riktige orientering, krevde mer arbeid for å sette apoAI genet i ramme. De ble først avskåret med restriksjons-enzymene Hind III og Sal I mellom ATG translasjonsstart og apoAI genet. De kohesive ender dannet ved avskjæring, ble fylt igjen med DNA polymerase (Klenow fragment) og så religert med T4 DNA ligase. Dette resulterte i delesjon av 10 nukleotider ved det multiple kloningssted i pUC9, foran apoAI genet, og gjenopprettet således den korrekte avlesningsramme.

De rekombinante plasmider ble kalt:

a) pUC8 serier

Den logiske forklaring på å oppnå de utvidede varianter,

var at ekspressjonsnivåene ble økt ved tilstedeværelse av den N-terminale ende av bakteriell beta-galaktosidase, i det sekvensen naturlig forekommer etter de regulatoriske elementer tilstede i plasmidene.

Ekspressjon i E. coli stammer.

1) Alle rekombinante pFCE4 derivater ble transformert i den bakterielle vert CAG629 som bærer plasmid pCI856 (allerede beskrevet i "i-rammeplassering" avsnittet).

Over natten kulturer dyrket ved 32<*>C, ble fortynnet 1:10 i LA og dyrket i rystekolber til OD6500,5-0,6, så ble temperaturen forandret til 42"C og inkubering ble fortsatt i 1 til 2 timer. Etter induksjon ble cellene avkjølt på is i 10 minutter og pelletert ved sentrifugering. Pellet ble så behandlet som beskrevet i "ELISA" avsnittet for å bryte ned cellene. Celleekstraktene ble sentrifugert ved 16.000 rpm i 30 minutter ved 4'C, og supernatanten påført på affinitetskolonnen beskrevet i "Materialer og Fremgangsmåter". Etter grundig vasking ble de tilbakeholdte proteiner eluert med IM eddiksyre. De eluerte fraksjoner ble målt ved immunoblotanalyse (Fig. 5) og ved "ELISA"; foreløpige resultater oppnådd med pMLll-20 var gjennomsnittlig rundt 0,2 mg apoAI pr. liter kultur.

Lignende resultater ble oppnådd med alle andre konstruksjoner som bar mutasjoner apoAI-T6, apoAI-MI og apoAI-T6/MI. 2) Alle rekombinante pUC8/9 derivater ble transformert i den bakterielle vert MC1061.

Over natten kulturer dyrket ved 37 °C, ble fortynnet 1:100

i LA og dyrket i rystekolber i 1 time før tilsetning av 1 mM IPTG, så ble inkubering fortsatt i 4 til 6 timer til. Etter denne tiden ble cellene avkjølt på is i 10 minutter og pelletert ved sentrifugering. Fra dette trinn var ekstraksjonsprosedyrene de samme som beskrevet for pFCE4 derivatene. Råekstrakter av

celler som inneholdt pIPI og pRP5 ble målt ved immunoblotanalyse (Fig. 6) og ved "ELISA"; foreløpig resultater var gjennomsnittlig rundt 10 mg apoAI pr. liter kultur.

Lignende resultater ble oppnådd med alle andre konstruksjoner som bar mutasjoner apoAI-T6, apoAI-MI og apoAI-T6/MI i kombinasjon med både apoAI-RP5 og apoAI-IPl.

Eksempel 2.

Andre varianter ble konstruert ved å anvende vektoren pRIT2T (Pharmacia, Sweden) hvor et 949 bp fragment som bar apoAI genet, ble innført i Sma 1 stedet i denne vektoren. Proteinet uttrykt ved hjelp av dette plasmid var sammensatt av 541 aminosyrer. Disse er fra den N-terminale ende, de første 11 aminosyrer av CRO proteinet i phage lambda, fulgt av 248 aminosyrer fra sekvensen for stafylokokkprotein A (fra rester

23 til 270), 5 uvanlige aminosyrer (Pro-Gly-Asp-Ser-Thr) forårsaket av forbindelsen mellom de siste 17 aminosyrer fra beta-galaktosidase fra E. coli og 17 aminosyrer, som inneholdt gjenkjennelsessekvensen for det proteolytiske enzym enterokinase, Gly-Asp-Pro-Glu-Phe-Val-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys-Ser-Ser-Arg-Gly-Ser-Met, som umiddelbart forutgår sekvensen i det modne humane apoAI (kalt CPA-AI) eller dets varianter apoAI-T6, apoAI-MI, apoAI-T6/MI. Disse kimeriske proteiner er stabile og løselige i vandige løsninger.

Interaksjonen mellom CPA-AI med rottehepatosyter og med musemakrofager i kultur er blitt studert.Inkubering av<125>I-merket CPA-AI med de dyrkede celler ved 4°C viser at hybridproteinet binder seg til celleoverflaten med bindingsparameteret som ligner HDL. Hybridproteinet blir tatt opp av cellene ved 37'C og er vist å bli internalisert. Denne oppførsel ligner oppførselen til naturlig apoAI når det blir forbundet med lipider til å danne HDL partikler.

MATERIALER OG FREMGANGSMÅTER.

Materialer.

HDL (l,09<d<l,21 g/ml) ble fremstilt fra human plasma på en diskontinuerlig Kr gradient. HDL ble ekstensivt dialysert mot PBS, 1 mM EDTA for å fjerne KBr og lagret ved 4"C. Humant transferrin (Sigma) ble tilsatt jern i henhold til fremgangsmåten til Klausner et al., fJ. Biol. Chem.. 258, 4715-4724, 1983.

BSA var i det vesentlige IgG fri (Sigma, A 7638). Staphylo-coccus aureus protein A var fra Pharmacia. Hanks' balanserte saltløsning som inneholdt fenolrødt var fra Gibco.

Celler og cellekultur.

Fao celler, en rotte hepatomcellelinje dannet ogkarakterisertav Deschatrette og Weiss ( Biochemie 56, 1603-1611, 1974) , ble dyrket i monolag i Coon's modifiserte Ham's F12 medium (Seromed) tilsatt 5% fetalt kalveserum (FCS), 100 enheter/ml penicillin, 100 pg/ml streptomycin, 2 mM glutamin og 10 mM HÉPES buffer pH 7,4. J774 celler, en musemakrofagcellelinjé (Ralph et al, J. Immunolo<g>y 114, 898-905, 1975), ble opprettholdt i spinner suspensjonkultur i D-MEM medium som inneholdt 4,5% FCS, penicillin, streptomycin, glutamin og HEPES buffer pH 7,4 ved konsentrasjoner som nedenfor.

Bakterielle stammer og plasmider.

De bakterielle verter var E. coli stammer HB101 (Boyer og Roulland-Dussoix, J. Mol. Biol. 41, 459-472, 1969) og RR1 M15

(Langley et al. Proe. Nati. Acad. Sei. USA 72, 1254-1257, 1975).

De anvendte plasmider var pNF 2690 (Nilsson et al, EMBO J.4, 1075-1080, 1985) og pLM3 (Monaco et al Atti Conveano conaiunto A.G.I.-S.I.B.B.M., 195-196, 1985); pRIT2T selges av Pharmacia, Sverige.

DNA konstruksjoner.

Restriksjonsenzymer, Klenow DNA polymerase og T4 DNA

ligase ble forhandlet fra Boehringer Mannheim og anvendt i henhold til tilførerens spesifikasjoner. Transformering av E. coli ble utført i henhold til Morrison ( Methods Enzymol. 68, 326-331, 1979) .

Ekspressjon av hybrid<g>enet.

Hybridgenet, under kontroll av lambda pR promoteren, ble uttrykt i det vesentlige i henhold til Zabeau og Stanley ( EMBO J. 1, 1217-1224, 1982). Bakterier ble dyrket ved 30°C til

ODgoo=°»9- Temperaturen ble raskt hevet til 42°C ved tilsetning av et likt volum buljong forvarmet ved 54°C. Kulturene ble inkubert ved 42"C i 90 minutter før innhøstning. Totalcellelysater ble tilsatt geler som beskrevet av Zabeau og Stanley (1982) .

Rensing av hybridproteinet.

Fremgangsmåten til Marston et al ( Biotechnology 2, 800-804, 1984) ble fulgt for rensing av hybridproteinet. Bakterielle pelleter ble resuspendert i 3 volumer (w/v) av buffer A (50 mM Tris/HCI ph 8,0, 50 mM NaCI, 1 mM EDTA) og lydbehandlet 5 x 20 sekunder på is. Etter sentrifugering (10,000 rpm, 10 minutter ved 4°C i en Sorvall SS34 rotor), ble pelleten resuspendert i 9 volumer (w/v) av buffer A som inneholdt 0,5% Triton X-100, 10

mM EDTA og etterlatt ved romtemperatur i 5 minutter. Suspensjonen ble sentrifugert som ovenfor, og pelleten ble resuspendert i 9 volumer (w/v) av buffer A som inneholdt 8 M urea og inkubert ved romtemperatur i 1 time.

Ureasuspensjonen ble tilsatt til 9 volumer (v/v) av 50 mM kaliumfosfatbuffer, pH 10,7, 50 mM NaCI, 1 mM EDTA og rørt i 30 minutter ved romtemperatur mens man holdt pH ved 10,7 ved tilsetning av KOH. Suspensjonen ble så nøytralisert og dialysert ved 4°C mot buffer A. Den dialyserte suspensjon ble sentrifugert som ovenfor; hybridproteinet i den klare supernatanten var allerede tilstrekkelig ren, i det gjennomsnitts-utbytte av hybridprotein ved dette stadium var 50-60 mg pr. liter bakteriell kultur. En videre rensing ble oppnådd ved affinitetskromatografering på IgG-Sefarose 6 FF (Pharmacia). Prøven ble avsatt på en kolonne, vasket sekvensielt med PBS som inneholdt 0,05% Tween 20, PBS og 5 mM AcONH4, pH 5 og eluert med IM AcOH/AcONH4, pH 2,8. Det rensede protein ble dialysert mot buffer A.

Kalibrering ved å anvende en Biogel 1. 5 A gelfiltrering-kolonne.

En Biogel 1,5 A kolonne fra Bio Rad (40 cm x 1 cm) ble ekvilibrert i 50 mM Tris/HCl pH 8,0, 50 mM NaCI, 1 mM EDTA. Prøven ble eluert ved en strømhastighet på 3 ml/t og 250 pg fraksjoner ble oppsamlet. Kolonnen ble kalibrert med dekstran-blått (2,000 kD) , tyroglobulin (699 kD) , ferritin (440 kD) , HDL (285 kD) og aldolase (158 kD). Mr av hybridproteinet ble bestemt ved å anvende 1,25 pg av [<125>I] eller 800 pg umerket

CPA-AI.

Jodering av proteiner.

Proteiner ble jodert ved å anvende Iodo-Gen reagent (Pierce Chemical Co.). Joderingsreaksjonsblandingen inneholdt 100 jjg Iodo-Gen, 1 mg protein i 200 \ iq PBS og 1 mCi bærerfri Na [125I] , 16,5 mCi/jig (Amersham International). Etter 10 minutter ved 4°C ble fri jod separert fra proteinet på en 10 ml Sephadex G50 kolonne. Kolonnen ble eluert med PBS (0,2% BSA) for HDL, transferrin og IgG og 50 mM Tris/HCl pH 8,0, 0,15 M NaCI, 1 mM EDTA, 0,2% BSA for hybridproteinet. Hybridproteinet, IgG og transferrin ble anvendt uten dialyse. Det var nødvendig ekstensivt å dialysere HDL mot PBS, 0,5 mM EDTA, inntil mindre enn 5% av markøren var løselig i 10% (w/v) trikloreddiksyre. Mindre enn 5% av markøren ble forbundet med lipid som bestemt etter lipidekstraksjonen med kloroform/metanol. Den spesifikke aktivitet som ble oppnådd, var 200-400 cpm/ng protein.

Bindingsmålinger.

Bindingsmålinger på suspensjonceller ble utført i 2 timer ved 4°C. For å oppnå en suspensjon av Fao celler, ble monolagene inkubert med PBS, 1 mM EDTA i 30 minutter ved 37°C. Disse celler eller suspensjonen av dyrkede J774 makrofager ble så vasket 3 ganger ved å pelletere ved 1000 g x 5 minutter ved 4°C og resuspendere i 3 ml Hanks/BSA. Hver bindingsmåling inneholdt 1 x IO<6>celler i 1 ml Hanks/BSA, og den angitte mengde av [<125>I]-apoA-l-PA eller [125I]-HDL. Etter 2 timer ved 4"C ble cellene vasket 4 ganger i Hanks/BSA, overført til Eppendorfrør og radioaktivitet talt i en gammateller. For konkurrerende eksperimenter ble 10 pg jodert ligand konkurrert med 10-800 jjg av enten umerket HDL, CPA-AI, protein A eller transferrin, i det hver av disse ble tilsatt til cellene ved 4°C, 30 minutter før tilsetningen av joderte ligander.

Liqandblot av HDL og CPA- AI.

J774 celler (2 x IO<8>) ble vasket 2 ganger i PBS og homogenisert i 10 mM Tris/HCl, pH 7,4, 0,1 mM EDTA. En postnukleær supernatant (PNS) ble fremstilt ved sentrifugering ved 2000 g i 10 minutter. PNS ble ekstrahert med 1% (v/v) Triton X-114 (Bordier, J. Biol. Chem. 256, 1604-1607, 1981). Vaskemiddelfasen ble blandet med et likt volum prøvebuffer som inneholdt ditiotreitol, kokt og så alkylert med jodacetamid. Omtrent 1 mg protein pr. felt ble påført til en 5-15% SDS polyakrylamidgel. Gelen ble blottet på nitrocellulose, og båndene visualisert ved hjelp av Ponceau S farging. Nitro-cellulosestrimlene ble herdet i 6 timer i Hanks som inneholdt 10% (w/v) lavfettmelkepulver. Ligander, enten [<125>I]-CPA-AI eller [<125>I]-HDL ved 12,5 pg/ml ble bundet i Hanks/melk i 16 timer. Strimlene ble så vasket 4 ganger med Hanks/melk og ligandene påvist med enten kaninantiserum mot: human HDL, CPA-AI eller protein A (ved 1/50 serumfortynning), vasket og inkubert i nærvær av antikanin IgG peroksidase som ble åpenbart med diaminobenzidinreaksjonen (Burnette, Anal. Biochem. 112, 195-203, 1981). Den tørkede blot ble så eksponert for røntgenstråle-f ilm.

Analytiske metoder.

Amino-terminalsekvensdannelse var ved automatisert Edman nedbrytning, utført i en gass-væskefasemikrosekvensdanner konstruert som beskrevet av Frank og Trosin (H. Tschesce (editor): Modem Methods in Protein Chemistry, Walter de Gruyter & Co., Berlin, 287-302, 1985) i henhold til Lottspeich ( Hoppe Seyler' s Z. Ph<y>siol. Chem. 361, 1829-1834, 1980). For å bestemme den karboksy-terminale sekvens av hybridproteinet, ble karboksypeptidase c, A og/eller B anvendt i henhold til Tadros et al ( Eur. J. Biochem. 138, 209-212, 1983). For aminosyre-analyse ble proteinet hydrolysert i henhold til Tadros et al ( Eur. J. Biochem. 127, 315-318, 1982), og aminosyresammen-setningen bestemt ved å anvende en automatisert aminosyre-analysator (Durrum D-500). Tryptofan og cystein ble ikke bestemt.

For mikroskopering ble prøver av HDL og CPA-AI negativt farget ved å anvende 2% fosforwolframsyre. Proteinkonsentrasjon ble målt ved fremgangsmåten til Bradford ( Anal. Biochem. 72, 248-254, 1976).

RESULTATER.

Konstruksjon av plasmid pLM8 som bærer<g>enet som koder for hvbridprotein CPA- AI.

Vektoren pRIT2T er et derivat av pRIT2 (Nilsson et al, 1985), utformet for temperatur-induserbar ekspressjon av intrasellulære hybridproteiner i E. coli. Konstruksjonen inneholder de IgG-bindende områder fra stafylokokkprotein A som er under kontroll av lambda Pr promoteren. Et multippelt kloningssted forenkler innføringen av fremmede gener i 3' enden av protein A. Protein A transkripsjonstermineringssekvensen blir innført umiddelbart i nedstrømsretning fra det multiple kloningssted. Plasmid pLM3 inneholder E. coli lacZ genet sammenføyd i ramme til det modne gen for human apoAI (Monaco et al, 1985).

Plasmid pLM8, som bærer sammenføyningen mellom PA og apoAI, ble konstruert som beskrevet i Fig. 7. 949 bp fragmentet flankert av restriksjonsstedene EcoRI og Clal ble isolert fra pLM3, og de fremstikkende ender ble fylt igjen ved hjelp av Klenow DNA polymerase. Fragmentet ble legert til det Smal lineariserte pRIT2T. Det resulterende plasmid pLM8 bærer en åpen avlesningsramme, som koder for et fusjonsprotein på 541 aminosyrer, sammensatt at genet for protein A i 5' enden, og det fullstendige humane apoAI gen i 3' enden adskilt av en spesifikk sekvens for proteolytisk spaltning.

Ekspressjon, isolasjon og qrensinq av hybridproteinet. E. coli celler som bærer pLM8 i nærvær av pNF2690, et forenelig plasmid som koder for den temperaturfølsomme Cl 857 lambdarepressormutant, var i stand til å uttrykke store mengder hybridprotein. Når den blir dyrket ved 42°C, representerer mengden av den induserte CPA-AI omtrent 20% av det totale. Den synlige Mr i hybridproteinet er som forventet, 62 kD på SDS-PAGE. Standardmetoder for ekstrahering (lydbehandling, frysing-smelting, lysozym-Triton-X-100) viste seg å ikke fungere. En denatureringsprosedyre, som innvolverer inkubering av de lydbehandlede bakterier i 8M urea fulgt av tilsetning av en alkalibuffer, er blitt anvendt. Etter renaturering ved nøytralisering og dialyse, ble suspensjonen sentrifugert, og den klare supernatant inneholdt fusjonsproteinet i mer enn 90% renhet. Videre rensing ble oppnådd ved affinitetskromatografering ved hjelp av IgG Sepharose.

Karakteriserin<g>av hybridproteinet.

Identiteten av hybridproteinet ble bekreftet ved gjenkjennelse av et spesifikt apoAI antistoff fremstilt i sau. Protein A gjenkjenner ikke saueantistoff.

Den amino-terminale sekvens for de første åtte aminosyrer og den karboksy-terminale sekvens for de siste tre aminosyrer var i samsvar med de kjente sekvenser for apoAI og protein A. Også aminosyresammensetningsanalysen var i samsvar med den forventede sammensetning.

For å kvantifisere bindingen av hybridproteinet til celleoverflaten (se nedenfor) var det nødvendig å bestemme dets naturlige Mr. Dette ble utført ved gelfiltrering ved å anvende Biogel 1,5 A. Toppfraksjonen fra kolonneelueringen ga en Mr på 316 kD, som tilsvarer 5 ganger den monomere Mr på 62 kD. Den brede profil av hybridproteinelueringen indikerte at andre multimerer også var tilstede, så vel som en liten mengde oppsamlet materiale i tomvolumet. Gjennomsnittstørrelsen på

316 kD ble anvendt som en naturlig Mr for alle eksperimenter. Dette blir sammenlignet med 285 kD for HDL anvendt som standard på samme kolonne. Elueringsprofilen av det joderte hybridprotein var lik den som ble oppnådd for umerket hybridprotein.

HDL og hybridproteinpartikler ble undersøkt etter negativ farging med elektronmikroskop. Mikrografene viste en homogen populasjon av partikler med diametere som varierte fra 9-12 nm. Hybridproteinpartiklene har en svakt større størrelse enn HDL, hvilket bekrefter resultatene oppnådd ved gelfiltrering.

Sammenligning av den biologiske aktivitet av hybridproteinet og HDL.

Hybridproteinet renset fra E. coli og HDL renset fra human plasma ble anvendt i paralell for å studere deres kapasitet til å binde celleoverflatereseptorer. Flere celletyper ble undersøkt; en musemakrofag (J774) og en rottehepatocyt (Fao) cellelinje. Det er ting som tyder på at disse to celletyper prosesserer HDL på forskjellig måte. Kolesterolutveksling forekommer i makrofager og nedbrytning i hepatocyter.

Bindingsdata ved 4°C.

Joderte legander ble tillatt å binde seg til cellene ved 4°C i 2 timer. Et platå i den bundne mengde var blitt nådd ved 30 minutter. Konkurranse med 500 jjg umerket ligand ble anvendt for å evaluere mengden som var ikke-spesifikk, og denne verdi ble substrahert fra den totale bindingskurve for å gi verdien for spesifikk binding. De spesifikke bindingsverdier ble anvendt for å beregne affiniteten ved Scatchard analyser (Scatchard, Ann. N. Y. Acad. Sei. 51, 660-672, 1949). Med både HDL og hybridproteinet var bindingen spesifikk og av høy affinitet. Høyaffinitetsbindingen har en Kd på 2,8-3,0 x 10~<8>M for HDL og 3,5-4,9 x 10~<8>M for hybridproteinet med enten J774 eller Fao cellene. Resultatene er vist i Tabell 2 nedenfor. I tillegg er det en lavaffinitetskomponent som ikke er fullstendig utkonkurrert av umerket ligand med både HDL og hybridproteinet.

Høyaffinitetsbindingskomponenten i begge celletyper gir en maksimal binding på 90-155 ng/1 x IO<6>celler: dette representerer 1,9-3,6 x IO<5>steder pr. celle. Antall binndingssteder pr. celle og bindingsaffinitetene var på en bemerkelsesverdig måte lik for både HDL og hybridproteinet. Dette antyder at en enkelt reseptor er involvert og at apoAI komponenten alene kan forklare den reseptorformidlede binding av HDL.

Konkurransestudier.

Tilleggsbevis for den spesifikke binding av apoAI kommer fra konkurransestudier. Både HDL og hybridproteinet konkurrerte effektivt med hverandre for binding til J774 og Fao celler. Konkurransen var effektiv inntil den ikke-spesifikke komponent ble nådd. Protein A var ute av stand til å konkurrere for hybridprotein eller HDL binding. Som en uavhengig kontroll, ble transferrin anvendt i konkurransestudier. Selvom transferrin binder seg via transferrinreseptoren til celleoverflaten, kunne den ikke konkurrere med bindingen av HDL eller hybridproteinet.

Protein A og IgG bindingsaktiviteter.

Siden hybridproteinet også inneholder protein A, var det viktig å bestemme om protein A selv kunne binde seg til cellene. Protein A ble jodert til en lignende spesifikk aktivitet og målt for binding til både J774 og Fao celler. Selve høye konsentrasjoner av protein A (100 jjg/ml) ble spesifikk binding ikke påvist. Mengden av celle-assosiert radioaktivitet var mindre enn den ikke-spesifikke binding av hybridproteinet.

En forsiktighetsregel var nødvendig i utførelse av disse eksperimenter med hybridproteinet fordi J774 celler uttrykker Fc reseptorer for IgG. Derfor binder [<125>I]-kanin IgG seg til celleoverflaten Fc reseptorer med høy affinitet (Kd = 1 x 10~<8>M). Når [<125>I] CPA-AI var bundet i nærvær av kanin IgG, økte mengden av bundet hybridprotein med 2,7 ganger. Omvendt, når[<125>I]-kaninIgGble bundet i nærvær av hybridprotein, økte bindingen også (1,6 ganger). Tilsynelatende kan komplekset mellom IgG og CPA-AI binde seg til enten Fc reseptoren eller til HDL reseptoren. For å studere bare HDL reseptoren, ble alle bindingseksperimentene utført i IgG fritt medium. Cellene ble vasket 3 ganger i Hanks buffer tilsatt BSA (i det vesentlige IgG fritt) for å fjerne IgG tilstede i kulturmediet.

Karakterisering av HDL reseptoren.

J774 celler ble behandlet med trypsin ved 4°C før måling for binding av HDL, hybridprotein eller transferrin. Trypsin-behandlingen minsket ikke HDL eller hybridproteinbinding. Imidlertid ble bindingen av [<125>I]-transferrin redusert til 38% av kontrollen. HDL reseptoren er relativt trypsinresistent sammenlignet med transferrinreseptoren.

For å identifisere reseptoren involvert i bindingen av HDL og hybridproteinet, ble en ligandblot utført. Et Triton X-114 ekstrakt av en PNS fra J774 celler ble underkastet SDS-PAGE under reduserende betingelser og overført til nitrocellulose. Hver av[12<5>I]-HDL og[12<5>I]-CPA-AI bandt seg til et bånd på omtrent 110 kD. Dette bånd ble identifisert enten direkte ved visualisering av de[<125>I]-merkede ligander på en autoradiograf av filteret eller indirekte ved antistoffpåvisning ved å anvende et kaninantiserum mot HDL og visualisering med saueanti-kanin IgG peroksidase. For HDL var det en veldig høy bakgrunn av jodert markør på nitrocellulosen som gjorde påvisningen av et spesifikt bånd på autoradiografen uklar.

EKSEMPEL 3.

Human apoAI ble syntetisert som et forløperprotein, preproapoAI på 2 67 aminosyrer. Det 18 aminosyrer lange prepeptid blir spaltet i løpet av sekresjon, og etterlater et proprotein kalt proapoAI. ProapoAI består derfor av en N-terminal ekstensjon på seks aninosyrer Arg-His-Phe-Trp-Gln-Gln, fulgt av det modne protein.

For å uttrykke proapoAI, ble 5' av apoAI genet syntetisert rekonstruert som vist i Fig. 8. Et Nde I-Bam HI oligonukleotid som koder for de første 15 aminosyrer i proapoAI, inkludert de 6 aminosyrer propeptid ble syntetisert. Det syntetiske DNA inkluderte et Nco I sted umiddelbart før Barn HI stedet. Et Eco RI-Sal I fragment som bar trp promoteren fra plasmid pDR720 (Pharmacia, Sverige; Russel og Bennet, Gene 20, 321, 1982), ble legert til et syntetisk Sal I-Nde I fragment som kodet for lambda ell Shine-Dalgarno sekvensen for å få Eco RI-Nde I 107 bp fragmentet illustrert i figuren. Dette DNA stykket ble legert til fragmentet som koder for proapoAI 5' sekvensen og subklonet inn i M13mp8 (Messing et al, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 74, 3642, 1977) som skulle sekvensdannes.

For å uttrykke det rekombinante proapoAI, ble en ekspressjonsvektor konstruert som illustrert i Fig. 9. Et Eco RI-Nco I fragment som inneholdt ekspressjonssignalene fulgt av 5' enden i proapoAI genet, ble avskåret fra den rekombinante M13mp8 (se Fig. 8) og legert til de to følgende fragmenter: a) det store fragment fra plasmid pDS20 (Duester et al, Cell 30, 855, 1982) avskåret med Eco RI-Bam HI b) et Nco I-Bam HI fragment fra pMLll-20 som inneholdt resten av apoAI sekvensen.

De resulterende plasmid pFC33 var i stand til å uttrykke et proapoAI protein, eller mere spesifikt Met-proapoAI, under trp promoteren i en E. coli B stamme (Delbruck, 1946, Bacterial vimses or bacteriophages Biol. Rev. 21:30-40). For induksjon ble celler dyrket over natten i et LB medium med ampicillin. Neste dag ble cellene fortynnet i M9 medium uten tryptofan og høstet etter 6 timer ved 37°C.

Fig. 10 viser en gelelektroforese og en immunoblotanalyse av proapoAI. Alilquotte mengder av bakterielle kulturer ble pelletert og resuspendert med gelelektroforesebuffer parallelt med en standard human fraksjon. Etter koking ble prøver kjørt på elektroforese på 12,5% SDS-PAGE. Blotting på nitrocellulosefilter ble utført som beskrevet i Eksempel 1.

Claims (25)

1. Ekspresjonsvektor i stand til å uttrykke, i en transformert vert, et protein som er i stand til å bli påvist ved hjelp av ELISA med anti-humant apoAI antiserum og som har formelen (1) Met-X-Y (1) karakterisert vedat X er en binding, en bærerpeptidsekvens som omfatter en sekvens dannet fra de N-terminale aminosyrerester fra beta-galaktosidase eller en sekvens som omfatter et eller flere IgG-bindende områder fra protein A, eller prosekvensen fra human apoAI; og Y representerer sekvensen fra human apoAI eller en genetisk variant av denne.

2. Ekspresjonsvektor i henhold til krav 1,karakterisert vedat nevnte protein er Met-apoAI, Met-apoAI-T6, Met-apoAI-MI eller Met-apoAI-T6/MI.

3. Ekspresjonsvektor i henhold til krav 2,karakterisert vedat den er dannet fra plasmid pFCE4+.

4. Ekspresjonsvektor i henhold til krav 3,karakterisert vedat den er plasmid pMll-20, pIL8-6, pIL8-l eller pIL8-6I.

5. Ekspresjonsvektor i henhold til krav 1,karakterisert vedat bærerpeptidsekvensen omfatter en sekvens dannet fra opp til de første femten N-terminale aminosyrerester i beta-galaktosidase.

6. Ekspresjonsvektor i henhold til krav 5,karakterisert vedat bærerpeptidet omfatter sekvensen Thr-Met-Ile-Thr-Pro-Ser-Phe-Asp-Gly-Ser-Met eller Thr-Met-Ile-Thr-Asn-Ser-Arg-Gly-Ser-Met.

7. Ekspresjonsvektor i henhold til krav 6, som er dannet fra plasmid pUC8 eller pUC9.

8. Ekspresjonsvektor i henhold til krav 7, som er plasmid pIPI, pIPI-6, pIPI-I, pIPI-61, pRP5, pRP5-6, pRP5-I eller pRP5-61.

9. Ekspresjonsvektor i henhold til krav 1,karakterisert vedat bærerpeptidet omfatter stafylokokkprotein A eller rester 23 til 270 av dette.

10. Ekspresjonsvektor i henhold til krav 1,karakterisert vedat bærersekvensen som omfatter et eller flere IgG-bindende områder fra protein A, blir sammenføyd til sekvensen fra human apoAI eller en genetisk variant av denne via en gjenkjennelsessekvens for et proteolytisk enzym.

11. Ekspresjonsvektor i henhold til krav 10,karakterisert vedat bærerpeptidsekvensen er sammensatt av (de første 11 aminosyrer fra CRO proteinet fra fag lamda)-(248 aminosyrer fra stafylokokkprotein A (rester 23 til 270))-(Pro-Gly-Asp-Ser-Thr)-(de siste 17 aminosyrer fra beta-galaktosidase)-(de 17 aminosyrer som inneholder en gjenkjennelsessekvens for det proteolytiske enzym enterokinase, og som er Gly-Asp-Pro-Glu-Phe-Val-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys-Ser-Ser-Arg-Gly-Ser-Met).

12. Ekspresjonsvektor i henhold til krav 1,karakterisert vedat bærerpeptidsekvensen omfatter et eller flere IgG-bindende områder fra protein A og som er dannet fra plasmid pLM3.

13. Ekspresjonsvektor i henhold til krav 12, som er plasmid pLM8.

14. Ekspresjonsvektor i henhold til krav 1,karakterisert vedat prosekvensen fra human apoAI blir føyd sammen med sekvensen fra human apoAI eller en genetisk variant av denne og som er dannet fra plasmid pDS20.

15. Ekspresjonsvektor i henhold til krav 14, som er plasmid pFC33.

16. En vert som er blitt transformert med en ekspresjonsvektor som definert i krav 1 og hvori derved et protein med formelen (1) som definert i krav 1 er i stand til å bli uttrykt.

17. Vert i henhold til krav 16, karakterisert vedat verten er en stamme av E. coli.

18. Fremgangsmåte for produksjon av et protein som er i stand til å bli påvist ved hjelp av ELISA med et anti-humant apoAI anitiserum, i det fremgangsmåten omfatter dyrking av en transformert vert som definert i krav 16 og utvinning av nevnte protein som oppnås på denne måte.

19. Protein som er i stand til å bli påvist ved hjelp av ELISA med anti-human apoAI og som har formel (1) Met-X-Y (1) karakterisert vedat X er en binding, en bærerpeptidsekvens som omfatter en sekvens dannet fra de N-terminale aminosyrerester fra beta-galaktosidase eller en sekvens som omfatter ett eller flere IgG-bindende områder fra protein A eller prosekvensen fra human apoAI; og Y representerer sekvensen fra human apoAI eller en genetisk variant av denne.

20. Protein i henhold til krav 19, karakterisert vedat det er valgt fra Met-apoAI- Met-apoAI-T6, Met-apoAI-MI og Met-apoAI-T6/MI.

21. Protein i henhold til krav 19, karakterisert vedat aminosyresekvensen Met-Thr-Met-Ile-Thr-Pro-Ser-Phe-Asp-Gly-Ser-Met er sammenføyd med et apolipoprotein valgt fra apoAI, apoAI-T6, apoAI-MI og apoAI-T6/MI.

22. Protein i henhold til krav 19, karakterisert vedat aminosyresekvensen Met-Thr-Met-Ile-Thr-Asn-Ser-Arg-Gly-Ser-Met er sammenføyd med et apolipoprotein valgt fra apoAI, apoAI-T6, apoAI-MI og apoAI-T6/MI.

23. Protein i henhold til krav 19, karakterisert vedat det er sammensatt av (de første 11 aminosyrer fra CRO proteinet fra phage lambda)-(248 aminosyrer fra stafylokokkprotein A (rester 23 til 270))-(Pro-Gly-Asp-Ser-Thr)-(de siste 17 aminosyrer fra beta-galaktosidase)-(de 17 aminosyrer som inneholder en gjenkjennelsessekvens for det proteolytiske enzym enterokinase og som er Gly-Asp-Pro-Glu-Phe-Val-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys-Ser-Ser-Arg-Gly-Ser-Met)-(apoAI, apoAI-T6, apoAI-MI eller apoAI-T6/MI).

24. Protein i henhold til krav 19, karakterisert vedat det er Met-proapoAI.

25. Farmasøytisk sammensetning som omfatter et protein som definert i krav 19 som aktiv ingrediens og en farmasøytisk akseptabel bærer eller fortynningsmiddel.