JP2777126B2 - 細菌中で発現されるヒトアポリポタンパク質ａｉ及びその変異体、並びにそれらの製造方法 - Google Patents
細菌中で発現されるヒトアポリポタンパク質ａｉ及びその変異体、並びにそれらの製造方法Info
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Description
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は組換えDNA 技術を用
いたヒトアポリポタンパク質ＡＩ(apoAI) 及びその変異
体の産生に係る。 【０００２】 【従来の技術および発明が解決しようとする課題】アテ
ローム性動脈硬化症及びその合併症（例えば冠性心疾
患、 CHD）は恐らく健康上の最も危険な問題の１つであ
る。この病気の進行には多数の危険要因(risk factor)
が伴っており、最も重要な危険要因の１つは血漿コレス
テロール(CHL) レベルの上昇である。従って、ヒト体内
のCHL 代謝の研究が非常な注目を浴びている。 【０００３】ヒト体内の血漿CHL 及びトリグリセリド(T
G)のレベルを調節する遺伝子、治療食(diet)及びホルモ
ンの相互作用のメカニズムを理解する鍵はリポタンパク
質運搬系にある。血漿中のリポタンパク質の機能は主と
して脂質を１つの器官から別の器官に運搬することであ
る。これらのリポタンパク質は疎水性脂質を可溶化する
だけでなく各クラスの脂質を配給すべき身体部位を指令
することが最近明らかにされた。主として４つのクラス
のリポタンパク質、即ちキロミクロン(CM)、極低密度(V
LDL)、低密度(LDL) 及び高密度(HDL) リポタンパク質が
存在する。 【０００４】血漿中で運搬されるときTG及びコレステリ
ルエステル(CHLE)はリポタンパク質粒子にパッケージさ
れ極性リン脂質(PL)の表面単層によって包囲された疎水
性コアを形成する。表面皮膜はアポリポタンパク質(ap
o) と指称されるタンパク質と共に比較的少量の非エス
テル化CHL も含有する。少なくとも９種類のapo 、即ち
ＡＩ、ＡII、ＡIV、Ｂ(48-100)、ＣＩ、ＣII、ＣIII 、
Ｄ及びＥが同定されている。 【０００５】血漿リポタンパク質レベルとCHD の進行の
危険との関連を研究することは特に重要である。HDL 及
びLDL は双方ともCHL 及びCHLEの担体である。しかしな
がらLDL-CHL レベルはプラスの危険要因であるが（Kann
el等、Ann. Intern. Med. 、90:85-91、1979）、HDL レ
ベルは重要なマイナスの危険要因である（Yaari 等、La
ncet、i:1011-1015 、1981）ことが指摘されている。こ
れらのリポタンパク質の正確な機能及び作用モードはま
だ完全には解明されていないが、HDL は特に末梢組織か
らCHL を除去しCHL 逆輸送(RCT) と指称されるメカニズ
ムによって肝臓に逆輸送する機能を果たすと考えられ
る。 【０００６】HDL の主なアポリポタンパク質はapoAＩで
あり、いくつかの研究によれば血漿apoAＩレベルとCHD
との間にはHDL-CHL レベルとCHD との間で報告されたよ
うな（Ishikawa等、Eur. J. Clin. Invest. 、8:179-18
2 、1978）逆相関関係があることが判明した。更に、HD
L-CHL 及びapoAＩのレベルは血管造影法で診断される冠
性アテローム動脈硬化病巣の容態に対して逆の相関関係
をもつ（Pearson 等、Amer. J. Epidem.、109:285-295
、1979;Maciejko 等、New Eng. J. Med.、309:385-389
、1983）。従って、血漿中の高濃度HDL は粥腫の形成
を遅らせ及び／または既存病巣の退行を促進することに
よってCHD に影響を与えると考えられる。 【０００７】HDL アポリポタンパク質主としてapoAＩと
レシチンとの複合体は、培養された動脈平滑筋細胞のご
とき細胞からinvitro で遊離CHL の流出を促進する（St
ein等、Biochem.Bio-phys. Acta、380:106-118 、197
5）。実験的に誘発したアテロームをもつ動物に対する
リン脂質の静脈注入はこの流出に有利に作用し(Adams
等、J. Path. Bact.、94:77-87、1967）、apoAＩ／レシ
チン複合体は天然HDL 粒子と同様の速度で血漿から除去
される（Malmendier等、Clin. Chem. Acta、131:201-21
0 、1983）。 【０００８】CHL を与えたウサギにapoAＩを静脈注入す
ると病巣波及範囲が50％縮小する。これは、apoAＩがア
テローム性動脈硬化の病巣形成に対する防御効果をもつ
ことを示し、その理由は恐らく大動脈壁に吸収されてCH
L が減少するためである（Maclejko and Mao、Artherio
sclerosis 、2:407a、1982;Mao等、Fed. Proc. (USA)、4
2、no7 pABSTRACT 357 、1983;Badimon等、Cardiovascu
lar Disease '86、1986 ABS-TRACT 81）。 【０００９】Apo ＩはHDL の約70％を占める主要タンパ
ク質であり、血漿中に濃度 1.0〜1.2 mg／mlで比較的多
量に存在している（Schonfield等、J. Clin. Invest.、
69:1072 、1982）。血漿apoAＩは243 個のアミノ酸から
成るポリペプチド単鎖でありその一次配列は既知である
（Brewer等、Biochem. Bio-phys. Res. Commun. 、80:6
23-630、1978）。細胞内でapoAＩは267 個のアミノ酸か
ら成る前駆体の形態で存在する。この長いタンパク質の
最初の18個のN-末端残基は粗面小胞体のシグナルペプチ
ダーゼによって細胞内で開裂される。新しく分泌された
apoAＩは依然として6 個のアミノ酸から成るN-末端延長
部をもち、血漿及び／またはリンパ特異的プロテアーゼ
によって成熟形に変換される(Zannis and Bre-slow、Ad
vances in Human Genetics、Harris and Hirsch-horn e
ds. 、Plenum、125-215 、1985)。 【００１０】ApoAＩ分子のC-末端部は11または22個のア
ミノ酸の反復単位から成ることが判明した(McLachlan、
Nature、267:465-466、1979) 。縦列セグメントは正確な
重複ではないが、アミノ酸置換物は一般に反復セグメン
トの対応位置の残基の化学的タイプを保存していた。こ
れらの反復セグメントは、両親媒性螺旋コンホーメーシ
ョンで存在すると推定され(Segrest等、FEBS Lett.、3
8:247-253、1974) 、apoAＩの主要生物学的活性即ち脂
質結合及びレシチンCHL アシルトランスフェラーゼ(LCA
T)賦活を与える主な構造要件であると考えられる。apoA
Ｉのその他の２つの機能、即ちレセプターによってHDL
粒子を認識するリガンドの機能及び末梢組織からCHL を
除去する機能とapoAＩ分子の特異的配列またはドメイン
との関連はまだ解明されていない。 【００１１】最初に文献に発表されたヒトapoAＩの分子
変異体はMilano(apoＡＩ-MＩ) 変異体であった（France
schini等、J. Clin. Invest.、66:892-900、1980）。こ
の特徴は、Arg173-Cys置換にあり（Weisgraber等、J. B
iol. Chem.、258:2508-2513、1983）、同じ血縁に属する
33人の被験者において同定された。これらの被験者全員
が常染色体性優性形質として伝達される突然変異アポリ
ポタンパク質にヘテロ接合性であった。被験者において
はHDL-CHL 濃度が顕著に低下しており、HDLレベルに対
してマイナスの相関関係をもつ種々の程度のトリグリセ
リド過多を示した。突然変異と特異的病理状態との間の
関連は全く確認できなかった。実際、罹患被験者は早期
アテローム性動脈硬化の進行から明らかに保護されてい
た（Gualnadri 等、Am. J. Hum. Gen.、1986、印刷
中）。 【００１２】ApoAＩ-MＩ中のアミノ酸置換は突然変異ア
ポタンパク質の構造を修飾しα螺旋秩序構造を減少させ
疎水性残基の露出を増加させる（Franceschini等、J. B
iol.Chem.、260:16321-16325 、1985）。突然変異アポ
タンパク質の構造再生(remodelling) は、正常apoAＩよ
りも容易に脂質と会合する分子の脂質結合性を有意に変
化させる。アポタンパク質／脂質複合体は、正常apoAＩ
によって形成される複合体と同様であるが変性剤による
破壊が容易である。変異形の内部にシステイン残基が存
在するので、apoAIIとの複合体及びapoAＩ二量体の形成
が可能である。これらのタンパク質複合体が「罹患」被
験者で観察された異常HDL 粒子の形成の主因であると推
定される。ApoAＩ-MＩのこれらの特徴すべてがその異化
作用促進及び組織脂質の有効吸収能に寄与すると考えら
れる。 【００１３】apoAＩのその他のいくつかの遺伝変異体が
これまで文献に発表されたが(Breslow、Ann. Rev. Bioc
hem.、54:699- 727 、1985) 、これらのうちでキャリア
における何らかの病理状態またはリポタンパク質代謝作
用の有意な変化と関連づけられたものはない（表1 参
照）。 【００１４】ApoAＩ cDNA クローンはいくつかの研究室
で得られた（Breslow 、Ann. Rev.Biochem.、54:699-72
7、1985;Shar-pe等、Nucl. Acids Res.、12:3917-393
2、1984）。mRNAは約890 塩基対(bp)の長さをもち、35b
pの5'非翻訳配列と 801bp（267 個のアミノ酸）のコー
ド配列と翻訳終止コドン(TGA) とポリA テイルを付けた
54bpの3'非翻訳配列とをもつ。完全cDNAヌクレオチド配
列を添付の図１に示す。 【００１５】 【課題を解決するための手段】本出願人は、apoAＩまた
はその遺伝変異体を含むタンパク質を産生するために組
換えDNA 技術の使用が有効であることを知見した。変異
体としては、6-Ser がThr で置換されたapoAＩ(apoＡＩ
-T6)、apoAＩ-MＩ、または、apoAＩ-T6 とapoAＩ-MＩの
双方の突然変異を含む変異体(apoＡＩ- T6/MＩ) があ
る。タンパク質は、抗apoAＩ抗血清を用いる酵素結合免
疫吸着検定法(ELISA) によって検出できる。産生したタ
ンパク質はapoAＩまたはその遺伝変異体がN-末端で担体
ペプチドに融合した融合タンパク質の形態でもよい。 【００１６】本発明においては、抗ヒトapoAＩ抗血清を
用いるELISA によって検出可能な式(1) Ｍｅｔ−Ｘ−Ｙ （１） ［式中、X は結合、β- ガラクトシダーゼのN-末端アミ
ノ酸残基に由来の配列もしくはプロテインA の１つ以上
のIgG-結合ドメインを含む配列を含む担体ペプチド配列
またはヒトapoAＩのプロ配列を示し、Y はヒトapoAＩま
たはその遺伝変異体を示す］で示されるタンパク質を形
質転換宿主中で発現させ得る発現ベクターが該タンパク
質の製造のために使用される。 【００１７】Met 残基は、翻訳開始コドンの機能をもつ
と考えられる。かかる発現ベクターで形質転換され内部
で前記タンパク質を発現せしめる宿主が式(1) のタンパ
ク質の産生に使用できる。形質転換宿主を培養し、得ら
れた式(1) のタンパク質を回収する。 【００１８】従って、本発明は式(1) のタンパク質を提
供する。 【００１９】好ましい実施態様によれば本発明は、 (A) １．apoAＩ（図１参照）、 ２．apoAＩ-T6 、 ３．apoAＩ-MＩ、 ４．apoAＩ- T6/MＩ、 ５．N-末端延長部Thr-Met-Ile-Thr-Pro-Ser-Phe-Asp-Gl
y-Ser-Met-をもつapoAＩ(apoＡＩ-RP5) 、 ６．N-末端延長部Thr-Met-Ile-Thr-Asn-Ser-Arg-Gly-Se
r-Met-をもつapoAＩ(apoＡＩ-IP1) 、 ７．apoAＩ-T6 とapoAＩ-RP5とを結合したタンパク質(a
poＡＩ-RP5/T6)、 ８．apoAＩ-T6 とapoAＩ-IP1とを結合したタンパク質(a
poＡＩ-IP1/T6)、 ９．apoAＩ-MＩとapoAＩ-RP5とを結合したタンパク質(a
poＡＩ-RP5/MＩ) 、 10．apoAＩ-MＩとapoAＩ-IP1とを結合したタンパク質(a
poＡＩ-IP1/MＩ) 、 11．apoAＩ-T6/M ＩとapoAＩ-RP5とを結合したタンパク
質(apoＡＩ-RP5/T6/MＩ) 、 12．apoAＩ- T6/MＩとapoAＩ-IP1とを結合したタンパク
質(apoＡＩ-IP1/T6/MＩ) 、 13．N-末端延長部Arg-His-Phe-Trp-Gln-Gln をもつapoA
Ｉ(proapoAＩ) 、 14．proapoＡＩとapoAＩ-MＩを結合したタンパク質(pro
apoAＩ-MＩ) 、 15．ブドウ球菌プロテインA によって与えられたN-末端
延長部をもちN-末端から順に（λファージのCRO タンパ
ク質の最初の11個のアミノ酸）−（ブドウ球菌プロテイ
ンA の248 個のアミノ酸 (残基23〜270))-(Pro-Gly-Asp
-Ser-Thr)-（β- ガラクトシダーゼの最終17個のアミノ
酸)-（タンパク質分解酵素エンテロキナーゼの認識配列
を含みGly-Asp-Pro-Glu-Phe-Val-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys-
Ser-Ser-Arg-Gly-Ser-Met)で示される17個のアミノ酸)-
(apoＡＩ、apoAＩ-T6 、apoAＩ-MＩまたはapoAＩ-T6/M
Ｉ) の構造をもつ541 個のアミノ酸残基から成るタンパ
ク質をコードする遺伝子を担う組換えプラスミドの構
築、及び、 (B) 大腸菌（Escherichia coli、E.coli株）中での前記
遺伝子の発現に係る。これらの遺伝子の発現によって以
下のタンパク質が得られる。 【００２０】−Met-apoAＩ、Met-apoAＩ-T6 、Met-apoA
Ｉ-MＩ及びMet-apoAＩ- T6/MＩから選択されたアポリポ
タンパク質、 −アミノ酸配列Met-Thr-Met-Ile-Thr-Pro-Ser-Phe-Asp-
Gly-Ser-Met-がapoAＩ、apoAＩ-T6 、apoAＩ-MＩ及びap
oAＩ- T6/MＩから選択されたアポリポタンパク質に融合
した融合タンパク質、 −アミノ酸配列Met-Thr-Met-Ile-Thr-Asn-Ser-Arg-Gly-
Ser-Met がapoAＩ、apoAＩ-T6 、apoAＩ-MＩ及びapoAＩ
- T6/MＩから選択されたアポリポタンパク質に融合した
融合タンパク質、 −プロアポリポタンパク質proapoＡＩまたはproapoＡＩ
-MＩ、または、 −（λファージのCRO タンパク質の最初の11個のアミノ
酸)-（ブドウ球菌プロテインA の248 個のアミノ酸 (残
基23〜270))-(Pro-Gly-Asp-Ser-Thr)- (β- ガラクトシ
ダーゼの最終17個のアミノ酸)-（タンパク質分解酵素エ
ンテロキナーゼの認識配列を含みGly-Asp-Pro-Glu-Phe-
Val-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys-Ser-Ser-Arg-Gly-Ser-Met ）
で示される17個のアミノ酸)-(apoＡＩ、apoAＩ-T6 、ap
oAＩ-MＩまたはapoAＩ- T6/MＩ) から構成された融合タ
ンパク質。 【００２１】 【発明の実施の形態】本発明で使用される発現ベクター
は、該ベクターに含まれたDNA 配列、特に構造遺伝子の
配列を発現し得るベクターである。発現されるべきDNA
配列はそれらの発現を調節する上流配列に対して正しく
配置されている。発現されるべきタンパク質、宿主の性
質等を考慮して適当な任意のプロモーター系を使用する
とよい。従って、PL、lac 、tac 及びtrp プロモーター
から選択されたプロモーターを使用し得る。本発明の場
合、5'- 調節配列は発現されるべきapoAＩまたはその遺
伝変異体に対して非相同である。調節配列はlac または
trp オペロンの調節配列でもよい。言い替えると、本発
明の発現ベクターは、apoAＩまたはその遺伝変異体であ
る非相同タンパク質を発現し得る。好ましい遺伝変異体
はapoAＩ-T6 、apoAＩ-MＩ及びapoAＩ- T6/MＩである。 【００２２】式(1) のタンパク質をコードするDNA 配列
を含む本発明で使用可能な発現ベクターは典型的にはプ
ラスミドである。これらは単鎖でもよい。各ベクターは
複製起点を有しており複製可能である。好ましい発現ベ
クターは、apoAＩまたはその遺伝変異体を発現する場合
はプラスミドpFCE4+に由来し、担体配列がβ- ガラクト
シダーゼのN-末端アミノ酸残基に由来の配列を含む融合
タンパク質を発現する場合はpUC8またはpUC9に由来し、
担体配列がプロテインA の１つ以上のIgG 結合ドメイン
を含む場合はpLM3に由来し、proapoＡＩまたはその遺伝
変異体を発現させる場合はpDS20 である。 【００２３】apoAＩまたはその遺伝変異体を含むタンパ
ク質を発現させるために適当な宿主を本発明の発現ベク
ターによって形質転換させる。細菌、酵母または哺乳類
細胞系のごとき原核細胞または真核細胞の宿主を使用し
得る。代表的な宿主は大腸菌株である。所望のタンパク
質が細胞プロテアーゼによって分解されないように宿主
を選択する必要がある。一般には、apoAＩまたはその遺
伝変異体を含むタンパク質は以下の手順で得られる。 【００２４】１．クローンapoAＩ cDNA を選択する。 【００２５】２．apoAＩ遺伝子を易動性にする制限部位
が両端に形成されるようにcDNAを裁断(tailor)する。こ
れに付随してシグナルペプチド及びプロペプチドをコー
ドする配列が除去される。 【００２６】３．apoAＩ遺伝子を発現ベクターに正しい
読取枠で挿入する。突然変異T6及び／または MＩを導入
してもよい。apoAＩ遺伝子またはその変異遺伝子はオペ
ロン内の唯一の構造遺伝子でもよい。または、apoAＩま
たはその遺伝変異体を融合タンパク質として発現させた
い場合にその5'端を担体ペプチドをコードするDNA 配列
に付着させてもよい。 【００２７】４．apoAＩまたはその遺伝変異体を内部で
発現させ得る宿主を発現ベクターで形質転換する。 【００２８】５．形質転換した宿主を培養し、得られた
所望タンパク質を回収する。 【００２９】apoAＩまたはその遺伝変異体をコードする
遺伝子が１つ以上のイントロンを含まずに入手できる場
合、この遺伝子はベクター内に存在するプロモーターの
転写調節下にベクターに枠内(in frame)挿入される。遺
伝子は担体ペプチド配列をコードするDNA 配列の直後に
挿入され得る。従って式(1) のタンパク質をコードする
DNA 配列は適当なプロモーターを備えたベクター内の転
写開始コドンと終了コドンとの間に挿入され得る。proa
poＡＩまたはその遺伝変異体をコードする遺伝子も同様
にベクター内に挿入され得る。得られた発現ベクターに
よって形質転換された宿主の培養によって所望のタンパ
ク質を産生し得る。 【００３０】融合タンパク質の担体ペプチド部分は、β
- ガラクトシダーゼのN-末端アミノ酸残基に由来しても
よい。例えば、β- ガラクトシダーゼの最初の15個以内
のN-末端アミノ酸残基に由来し得る。好ましくは残基5
〜15、より好ましくは残基8〜12に由来する。このよう
にして得られた好ましい担体ペプチドは配列、Thr-Met-
Ile-Thr-Pro-Ser-Phe-Asp-Gly-Ser-Met またはThr-Met-
Ile-Thr-Asn-Ser-Arg-Gly-Ser-Met を含む。 【００３１】かかる担体ペプチドを組み込んだ融合タン
パク質を発現させるとき、その前にMet が存在する。こ
れはプロテインA の１つ以上のIgG-結合ドメインを含む
別の担体ペプチドを使用する場合にも同じである。かか
る担体配列は、ブドウ球菌プロテインA の完全配列また
は該タンパク質の残基23〜270 を含み得る。エンテロキ
ナーゼ、X 因子またはコラゲナーゼのごときタンパク質
分解酵素の認識部位を含むアミノ酸配列が、apoAＩまた
はその変異体の配列の直前に存在してもよい。適当な配
列は、Gly-Asp-Pro-Glu-Phe-Val-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys-
Ser-Ser-Arg-Gly-Ser-Met である。 【００３２】これはエンテロキナーゼの認識配列であ
る。担体配列中に別のアミノ酸配列が存在してもよい。
例えばプロテインA 配列とタンパク質分解酵素認識部位
の配列との間に30個以内の残基から成る結合配列が存在
してもよい。担体配列のN-末端部分が発現ベクター中の
プロモーターによって天然にコントロールされる構造遺
伝子の第１残基例えば20個以内の残基を含んでいてもよ
い。プロテインA のIgG-結合ドメインを含む融合タンパ
ク質は水溶性であり、水性環境で適度に安定であり、例
えばIgG-結合Sepharose を用いたアフィニテイクロマト
グラフィーによって均質になるまで容易に精製できる。 【００３３】N-末端延長部が担体ペプチドによって準備
されたか否かにかかわりなく、式 (1)の組換えタンパク
質は典型的にはヒト起源のその他のタンパク質を実質的
に含まない。言い替えると、該タンパク質は実質的に純
粋な形態で形成され、通常なら該タンパク質と会合して
いるタンパク質が付随していない。 【００３４】apoAＩまたはその遺伝変異体を含むタンパ
ク質は治療効果をもつのでヒトまたは動物の体内治療に
使用され得る。より詳細には、血漿コレステロール及び
／またはトリグリセリドのレベルを低下させるために使
用され得る。従って、このタンパク質は、アテローム性
動脈硬化症及び冠性心疾患のごとき心血管疾患に対して
使用され得る。このタンパク質は予防のために投与され
てもよくまたは既往の病状の改善及び／または治療のた
めに投与されてもよい。 【００３５】従って本発明によって産生されるタンパク
質は、薬剤的に活性の担体または希釈剤を含む医薬組成
物として提供され得る。かかる組成物は公知の方法で処
方され得る。タンパク質は非経口投与例えば静注投与さ
れてもよい。 【００３６】以下に、本発明を要約する。 【００３７】１． 抗ヒトａｐｏＡＩ抗血清を用いたＥ
ＬＩＳＡによって検出可能であり、式（１） Ｍｅｔ−Ｘ−Ｙ （１） ［式中、Ｘはβ−ガラクトシダーゼの最初の15個以内の
Ｎ末端アミノ酸に由来する配列を有する担体ペプチド配
列又はヒトａｐｏＡＩのプロ配列であり、Ｙはヒトａｐ
ｏＡＩ配列か又は、ヒトａｐｏＡＩ配列中 173位のＡｒ
ｇがＣｙｓで置換された配列（ａｐｏＡＩ−ＭＩ）、６
位のＳｅｒがＴｈｒで置換された配列（ａｐｏＡＩ−Ｔ
６）もしくは上記２つの置換を有する配列（ａｐｏＡＩ
−Ｔ６／ＭＩ）を示す］で示されるタンパク質。 【００３８】２． 担体ペプチド配列が、-Thr-Met-Ile
-Thr-Pro-Ser-Phe-Asp-Gly-Ser-Met-又は-Thr-Met-Ile-
Thr-Asn-Ser-Arg-Gly-Ser-Metである、上記タンパク
質。 【００３９】３． アミノ酸配列Met-Thr-Met-Ile-Thr-
Pro-Ser-Phe-Asp-Gly-Ser-Met が、ａｐｏＡＩ、ａｐｏ
ＡＩ−Ｔ６、ａｐｏＡＩ−ＭＩ及びａｐｏＡＩ−Ｔ６／
ＭＩから選択されたアポリポタンパク質に融合してい
る、上記のタンパク質。 【００４０】４． アミノ酸配列 Met-Thr-Met-Ile-Thr
-Asn-Ser-Arg-Gly-Ser-Metが、ａｐｏＡＩ、ａｐｏＡＩ
−Ｔ６、ａｐｏＡＩ−ＭＩ及びａｐｏＡＩ−Ｔ６／ＭＩ
から選択されたアポリポタンパク質に融合している、上
記タンパク質。 【００４１】５． Met-プロ apoAIである、上記タンパ
ク質。 【００４２】６． 抗ヒトａｐｏＡＩ抗血清を用いたＥ
ＬＩＳＡによって検出可能であり、式（１） Ｍｅｔ−Ｘ−Ｙ （１） ［式中、Ｘはβ−ガラクトシダーゼの最初の15個以内の
Ｎ末端アミノ酸に由来する配列を有する担体ペプチド配
列又はヒトａｐｏＡＩのプロ配列であり、Ｙはヒトａｐ
ｏＡＩ配列か又は、ヒトａｐｏＡＩ配列中 173位のＡｒ
ｇがＣｙｓで置換された配列（ａｐｏＡＩ−ＭＩ）、６
位のＳｅｒがＴｈｒで置換された配列（ａｐｏＡＩ−Ｔ
６）もしくは上記２つの置換を有する配列（ａｐｏＡＩ
−Ｔ６／ＭＩ）を示す］で示されるタンパク質の製造方
法であって、（ｉ）前記タンパク質を発現させ得る発現
ベクターで形質転換した細菌宿主を培養し、（ii）得ら
れたタンパク質を回収する、ことを特徴とする方法。 【００４３】７． 担体ペプチド配列が、-Thr-Met-Ile
-Thr-Pro-Ser-Phe-Asp-Gly-Ser-Met又は-Thr-Met-Ile-T
hr-Asn-Ser-Arg-Gly-Ser-Met- である、上記方法。 【００４４】８． そのプラスミドのβ−ガラクトシダ
ーゼ遺伝子のα−ペプチドの９番目のアミノ酸のコドン
の直後のＢａｍＨＩ部位にａｐｏＡＩ、ａｐｏＡＩ−Ｔ
６、ａｐｏＡＩ−ＭＩ又はａｐｏＡＩ−Ｔ６／ＭＩをコ
ードする遺伝子をもつプラスミドｐＵＣ８で形質転換さ
れた宿主を培養することによって、式中のＸが -Thr-Me
t-Ile-Thr-Pro-Ser-Phe-Asp-Gly-Ser-Met-である式
（１）のタンパク質が得られる、上記方法。 【００４５】９． そのプラスミドの翻訳開始コドンの
直後の配列 -Thr-Met-Ile-Thr-Asn-Ser-Arg-Gly-Ser-Me
t-のコドンの直後にａｐｏＡＩ、ａｐｏＡＩ−Ｔ６、ａ
ｐｏＡＩ−ＭＩ又はａｐｏＡＩ−Ｔ６／ＭＩをコードす
る遺伝子をもつプラスミドｐＵＣ９で形質転換された宿
主を培養することによって、式中のＸが -Thr-Met-Ile-
Thr-Asn-Ser-Arg-Gly-Ser-Met-である式（１）のタンパ
ク質が得られる、上記方法。 【００４６】10． ＸがヒトａｐｏＡＩのプロ配列であ
る式（１）のタンパク質が、ｔｒｐプロモーターの調節
下でプラスミドから発現される、上記方法。 【００４７】 【実施例】本発明を以下の実施例でさらに具体的に説明
する。 【００４８】実施例１ 材料及び方法 菌株及び培地 菌株: 大腸菌K12JM101(Messing等、Nature、314:309-32
1 、1981) 、MC1061（Casadaban and Cohen 、J. Mol.
Biol. 138:179-207 、1980）、71/18cI857（Lorenzetti
等、Gene、39: 85-87 、1985) 、RL841(Kenkel、Proc.
Natl. Acad. Sci. USA、82:488-492、1985) 、CAG629
（rpoH165 、lon-;C. A. Gross、Madison、 Wisconsi
n）。 【００４９】培地: 全部の菌株を必要に応じて50mg／ml
のアンピシリンを加えたLB培地(LA培地) で増殖させ
た。適当な場合にはlac プロモーターを抑制解除するた
めに1mM のIPTGを培地に添加した。 【００５０】酵素、酵素反応及びDNA 精製 リゾチームはSigma(St. Louis 、MO、USA)から入手。制
限エンドヌクレアーゼはBoehringer(Mannheim 、DE) 、
BRL Inc. (Gaithersburg、MD、USA) またはNewEngland B
iolabs(Beverly 、MA、USA)から入手。T4リガーゼ及び
その他の全部の酵素はBoehringerから入手。特に注釈が
なければすべての酵素反応は酵素を製造業者の指示通り
に使用して行なった。制限エンドヌクレアーゼ分解によ
って得られたDNA フラグメントをアガロース水平ゲルま
たはポリアクリルアミド垂直ゲルを用いた電気泳動によ
って分離し、ISCO Mod. 1750濃縮器（ISCO CO.、Lincol
n、NE、 USA）を使用し電気溶出法の修正方法でゲルマ
トリクスから抽出し、更にElutip-dカラム（Schleicher
and Schuell、Keene 、NH、USA)で精製した。 【００５１】細菌抽出物中のapoAＩ認識のためのエンザ
イムイムノアッセイ(ELISA) ペレット化した細胞を溶菌緩衝液（50mMのTris-Cl pH7.
0 、30mMのNaCl、 0.1％の NaN3 、10mg／l のフェニル
メチルスルホニルフルオリド) に再懸濁させた。溶液を
リゾチームで1 mg／mlにし、 4℃で30分間攪拌した。5
回の凍結乾燥サイクル後に抽出物を以下のごときエンザ
イムイムノアッセイで試験した。 【００５２】標準96ウェルのマイクロタイタープレート
を、ヒツジで感作した適当な希釈度の抗ヒトapoAＩ抗血
清で 4℃で1 晩被覆した（Boehringer、Mannheim、D
E）。0.05％のTween-20と0.01％のMerthiolate とを含
む10mMのTris-Cl pH8.0 で3 回洗浄後、50μl の系列希
釈度の標準apoAＩ（TAGO Corp.、Bur-lingame、CA、 US
A）または細菌抽出物を添加し、37℃で1 時間インキュ
ベートした。同じ緩衝液で3回洗浄後、50μl の適当な
希釈度のウサギ抗ヒトapoAＩ抗血清(Immuno Ltd.、Dunt
on Green、Nr. Sevenoaks 、Kent、GB) を添加し、硫酸
アンモニウム沈殿によって更に精製した。37℃で1 時間
維持し、更に3 回洗浄後に、New England Nuclear(Bost
on、MA、USA)から提供されるプロテインA-西洋ワサビペ
ルオキシダーゼキットを製造業者の指示通りに用いてウ
ェルを染色した。 【００５３】Affigel 10に対するヒツジ抗ヒトapoAＩの
結合 ヒツジ抗apoAＩ抗体（Boehringer、Manneheim 、DE）の
調製:20 mlの非希釈抗体溶液を不断に攪拌しながら0.1M
リン酸緩衝液pH7 に 4℃で1 晩透析した。次に遠心して
破片と上清とを分離した。 【００５４】Affigel 10(Bio-Rad、Richmond、CA) の調
製:1/2容のイソプロピルアルコールと倍容の蒸留水とを
順次用いた洗浄サイクルの繰り返し(4〜5 回) を行なう
前に40mlを室温で平衡させた。濾過によってゲルを乾燥
させ、50mlのfalcon管に移し透析抗体を加えた。次に管
を絶えず攪拌しながら 4℃で8 時間インキュベートし、
1 mlの1Mのグリシンエチルエステルを添加し、インキュ
ベーションを1 晩継続した。次に以下の溶液でゲルをお
おまかに洗浄した。 【００５５】−100 mlのPBS ＋ 0.1％ナトリウムアジド −100 mlの1M酢酸 −100 mlの0.1Mリン酸緩衝液 pH7＋0.5MのNaCl −100 mlのPBS ＋ 0.1％ナトリウムアジド ゲルをカラムに詰めローディングバッファ(PBS＋10mg／
l のPMSF＋10mg／l のPepstatin A)で平衡させた。 【００５６】イムノブロット分析 Laemmli 法を使用し標本を（適当な濃度で）ポリアクリ
ルアミド平板ゲルに流した。次にtransblot 装置(Bio-R
ad) を25mMのTris塩基、192mM のグリシン、20％のメタ
ノール中で0.2Aで 4℃で4 時間使用しゲルをニトロセル
ロースフィルターに移した。ゲルを受容したフィルター
を蒸留水で洗浄し、次に PBS＋ 3％BSAと共に穏やかに
攪拌しながら1 時間インキュベートした。フィルターを
蒸留水で再度洗浄し、PBS で1:250 に希釈した第１抗体
（ELISA で第２抗体として使用されるものと同じ）と共
に室温で1 時間インキュベートした。PBS 及び PBS＋0.
05％Tween20 で2 回洗浄後、1:7500に希釈した第２抗体
（西洋ワサビペルオキシダーゼと結合したヤギで感作し
た抗ウサギ IgG;Bio-Rad）と共にフィルターを室温で1
時間インキュベートした。更に２回洗浄後、フィルター
を4-クロロ-1- ナフトールで染色した。 【００５７】結果 apoAＩ遺伝子の5'端復元 apoAＩをコードする完全cDNAクローン(pＡＩ/A) は、シ
グナルペプチドとプロペプチドと完全成熟apoAＩタンパ
ク質とのコード配列をもつヒト肝臓cDNAライブラリイか
ら得られた（Sharpe等、Nucl. Acids Res.、12:3917-39
32）。成熟apoAＩの最初のコドンの上流配列全部が除去
されるように遺伝子の5'端を復元した。このために、プ
ラスミドpAＩ/AをEcoRＩ及びBamHＩで分解し、cDNAイン
サートを含む890bp のフラグメントを単離し、 1％アガ
ロースゲルから回収した。フラグメントを部分分解条件
下にSau3ＡＩで制限し、混合物を成熟タンパク質の最初
の9 個のアミノ酸のコード配列を復元するように設計さ
れたリン酸化合成アダプターに結合し、大腸菌における
コドン使用に従って最適な配列を得た。アダプターは以
下の手順で調製した。ホスホトリエステル法(Crea and
Horn、Nucl. AcidsRes.、8:2231- 2348、1980) によっ
て４つのオリゴヌクレオチドを合成した。 【００５８】１．5'-GATCCATGGACGAGCC-3' 2.5'-ACCGCAGAGTCCATGG-3' ３．5'-CGGTGGCTCGTCCATG-3' ４．5'-GATCCCATGGACTCTG-3' 等モル量の４つのオリゴヌクレオチド全部を一緒に結合
し、結合混合物をSau3ＡＩで処理し、アダプターを溶出
し、ポリアクリルアミドゲルから精製した。得られたア
ダプターの配列を図２に示す。 【００５９】精製アダプターと部分Sau3ＡＩ切断apoAＩ
フラグメントとを含む結合混合物をBamHＩで分解した。
790bp のフラグメントをポリアクリルアミドゲルから精
製し、仔ウシ腸ホスファターゼで処理したBamHＩ切断pA
T153-PvuII8 に結合した。MC1061の形質転換後、リン酸
化したオリゴヌクレオチド３をプローブとしたハイブリ
ダイゼーションによって組換え体をスクリーニングし
た。陽性コロニーを単離し、更に制限酵素分解によって
特性決定し、 Maxam and Gilbert（Methods Enzymol.、
65:499-560、1980）に従って部分化学分解した。正しい
方向付けのアダプターを含むプラスミドをpAＩ/12 と命
名した。 【００６０】このような復元後にはATG 開始コドンとBa
mHＩ付着端とがapoAＩ遺伝子の5'端の前に存在してい
た。この戦略を用い、成熟apoAＩコード配列をShine-Da
lgarno配列の後にBamHＩ部位を担う任意の発現ベクター
に移動させ得る。 【００６１】pFCE4+を使用した組換えベクターの構築 修飾apoAＩ遺伝子を含むBamHＩフラグメントを精製し、
pFCE4+(Lorenzetti 等、1985) のBamHＩ部位にサブクロ
ーニングした。得られた構築物が正しい方向付けのイン
サートを含むことをジデオキシチェーンターミネーショ
ン配列決定（図３のＡ）によって確認した。このプラス
ミドをpLS66 と命名した。 【００６２】この戦略を用い、ベクター中に既に存在す
るATG 開始コドンに対して枠外(outof frame)にapoAＩ
遺伝子を挿入した。従って次の段階ではapoAＩ遺伝子を
このATG 開始コドンの直後に配置することによって読取
枠を復元する。 【００６３】枠内配置 pFCE4 系を使用し、欠失させるべき領域の両端の塩基延
長部に相補的な配列をもつ「ブリッジ」オリゴヌクレオ
チドを使用してクローン遺伝子の枠内配置を行なうこと
が可能である（Sollazzo等、Gene、37:199-206、198
5）。 【００６４】このために、ホスホトリエステル法を使用
し以下の配列をもつ単鎖オリゴヌクレオチドを合成し
た。 【００６５】5'-CTTACATATGGACGAGCC-3' このオリゴヌクレオチドはその5'端でベクターの ATG
（ヌクレオチド 1〜10）を含む直前領域にアニーリング
し、その3'端でapoAＩ遺伝子の最初の8 個のヌクレオチ
ドにアニーリングし、その結果pLS66 に存在する余分な
8 つのヌクレオチドを鎖から除外する(loop out)。pLS6
6 のssDNA は大腸菌RL841 を宿主として（Kunkel、Pro
c. Natl. Acad. Sci. USA、82:488-492に記載のごと
く）調製した。この細菌株はpFCE4 中に存在するPLプロ
モーターの温度感受性リプレッサーを産生するプラスミ
ドpCI857(M. Zabeau) を含む大腸菌RZ1032の誘導体であ
る。 【００６６】このプロトコルを使用してこの菌株から産
生されたssDNA はチミンに置換したウラシル残基を数個
含み、従って「in vitro」で正常な機能鋳型として作用
するが、これらのプラスミドの正常宿主である野性型(u
ng+)大腸菌71/18cI857の形質転換に使用されたときは生
物学的に活性でない。 【００６７】15mMのTris-Cl pH8.5 及び15mMのMgCl2 中
で0.1 ピコモルのpLS66 ssDNA を2ピコモルのキナーゼ
化した突然変異オリゴヌクレオチド（20倍過剰）と56℃
で30分間アニーリングした。室温に冷却後、延長−結合
混合物を添加し反応を15℃で1 晩継続させた。延長反応
混合物は以下のごとく調製した（最終濃度）。10mMのTr
is-Cl pH8.5;10mMのMgCl2 ；0.5mM のATP;0.05mMのdNTP
s;5mM のDTT;1 単位のDNA ポリメラーゼ、Klenowフラグ
メント及び1.5 単位のT4 DNAリガーゼ。 【００６８】インキュベーション後に反応混合物をフェ
ノール抽出し、イソプロパノール及びエタノールで沈殿
させた。71/18cI857コンピテント細胞を形質転換し、選
択培地LAにプレートした。所望の欠失を含むクローンを
同定するために150 のコロニーを採取し、定序プレート
で増殖させニトロセルロースフィルターに移した。突然
変異オリゴヌクレオチドをプローブとして使用し 6×SS
C 及び10×Denhardt's中で室温でハイブリダイゼーショ
ンを行なった。次に 6×SSC 及び 0.1％SDS 中で異なる
2 つの温度でフィルターを洗浄した。最初の温度はハイ
ブリダイゼーション効率を検査するために室温であり、
次の温度は理論的融解温度より 4℃低い50℃である。こ
れは式Tm＝4 ×GC＋2 ×AT［式中、Gc及びATは突然変異
鋳型とオリゴヌクレオチドとによって形成された対合の
数である(Norrander等、Gene、26:101-106、1983) によ
って計算した。毎回の洗浄後にフィルターをX 線感受性
フィルムに露光した。ストリンジェントな温度でも陽性
シグナルを生じる有望な突然変異コロニーをジデオキシ
チェーンターミネーション配列決定（図３のＢ）によっ
て確認した。このプロトコルの効率はかなり高く約50％
である。apoAＩ遺伝子が正しく枠内配置されたpFCE4+を
pML11-20と命名した。 【００６９】apoAＩ変異体T6及び MＩの構築 ２つの変異体apoAＩ-T6 及びapoAＩ-MＩを構築するため
にpLS66 及びpML11-20を鋳型として使用した。転移BamH
Ｉフラグメント内に正しく枠内配置された変異体遺伝子
を同時に得るために双方の鋳型を使用したのである。 【００７０】このために、常用のプロトコルによって２
つの単鎖オリゴヌクレオチドを合成した。 【００７１】１． T6 突然変異のために 5'-CACCGCAGAC
TCCATGG-3' ２． MＩ突然変異のために 5'-GCGCCAGTGCTTGGC-3' オリゴヌクレオチド１は成熟apoAＩの第1 コドンの第1
ヌクレオチドを示す。オリゴヌクレオチド１は17位に不
適正(G対C)を伴って残基 8〜24にアニーリングする。オ
リゴヌクレオチド２は517 位に不適正(C対T)を伴って残
基 510〜524 にアニーリングする。 【００７２】枠内配置と同じプロトコルで突然変異誘発
実験を行なった（図４のＡ及びＢ）。重複突然変異体(d
ouble mutant) を得るためにまずT6突然変異を誘発し次
にMＩ突然変異を追加した。 【００７３】得られたプラスミドを以下のごとく命名し
た。 【００７４】pIL-5 ＝2 つのBamHＩ部位間のapoAＩ-T6
； pIL-5 Ｉ＝2 つのBamHＩ部位間のapoAＩ-MＩ； pIL5-6Ｉ＝2 つのBamHＩ部位間のapoAＩ- T6/MＩ； pIL8-6＝枠内のapoAＩ-T6 ； pIL8- Ｉ＝枠内のapoAＩ-MＩ； pIL8-6Ｉ＝枠内のapoAＩ-T6/M Ｉ。 【００７５】変異体apoAＩ-RP5及び IP1の構築 apoAＩ遺伝子及びその変異体T6及び MＩを含むDNA フラ
グメントをBamHＩ分解によってプラスミドpLS66 、pIL5
-6、 pIL5-Ｉ及びpIL5-6から切除し、記載のごとく 1％
アガロースゲルで精製した。次にフラグメントをpUC8及
びpUC9(Vi-eiraand Messing、Gene、19:259-268、1982)
に結合し、双方をBamHＩで直線化した。JM101 コンピ
テント細胞の形質転換後、組換えプラスミドを高速破壊
法で同定し、単離物をBamHＩで切断することによって確
認した。HindIII 及びXho Ｉで切断することによってイ
ンサートの対向する２つの方向(orientation) を識別し
た。 【００７６】pUC8を用いた構築物は、メチオニン残基と
細菌β- ガラクトシダーゼ遺伝子に由来のα- ペプチド
の最初の9 個のアミノ酸とがその直前に存在する既に枠
内配置されたapoAＩ遺伝子を含んでいた。その結果、β
- ガラクトシダーゼのapoAＩ分子のN-末端に10個のアミ
ノ酸から成る延長部が存在した。 【００７７】apoAＩ遺伝子を正しい方向付けで含むすべ
ての組換えpUC9誘導体では、更にapoAＩ遺伝子を枠内配
置する操作が必要であった。まずATG 翻訳開始とapoAＩ
遺伝子との間を制限酵素HindIII 及び SalＩで切断し
た。切断によって生じた付着端をDNA ポリメラーゼ（Kl
enowフラグメント）で埋め戻し、T4 DNAリガーゼで再結
合した。この結果、apoAＩ遺伝子の前方のpUC9の多重(m
ultiple)クローニング部位で10個のヌクレオチドが欠失
し、正しい読取枠が復元された。 【００７８】組換えプラスミドを以下のごとく命名し
た。 【００７９】(a) pUC8 系列 pIPI ＝apoAＩ-IPI； pIPI-6＝apoAＩ-IPI/T6 ； pIPI- Ｉ＝apoAＩ-IPI/MＩ； pIPI-6Ｉ＝apoAＩ-IPI/T6/M Ｉ。 【００８０】(b) pUC9 系列 pRP5 ＝apoAＩ-RP5； pRP5-6＝apoAＩ-RP5/T6 ； pRP5- Ｉ＝apoAＩ-RP5/MＩ； pRP-6 Ｉ＝apoAＩ- RP5/T6/MＩ。 【００８１】延長変異体を形成した理由は、プラスミド
中に存在する調節要素の後に天然の配列たる細菌β- ガ
ラクトシダーゼのN-末端が存在することによって発現レ
ベルが向上するからである。 【００８２】大腸菌株における発現 (1) （「枠内配置」の項で既に説明した）プラスミドpC
I856を担う細菌宿主CAG629をすべての組換えpFCE4 誘導
体で形質転換させた。 【００８３】32℃で1 晩増殖させた培養物をLAで1:10に
希釈し、震盪フラスコ中でOD650 0.5〜0.6 まで増殖さ
せ、次に温度を42℃に上昇させてインキュベーションを
1〜2 時間継続した。誘発後、細胞を10分間氷冷し遠心
によってペレット化した。次にペレットを「ELISA 」の
項で記載のごとく処理して細胞を破壊した。細胞抽出物
を16,000rpm で 4℃で30分間遠心し、上清を「材料及び
方法」の項に記載のごとくアフィニティカラムに通し
た。保持されたタンパク質をおおまかに洗浄し、1Mの酢
酸で溶出させた。溶出分画をイムノブロット分析（図
５）及び「ELISA 」によって検定した。pML11-20で得ら
れた予備結果を平均すると培養物1l当たり約0.2 mgのap
oAＩが存在した。 【００８４】突然変異体apoAＩ-T6 、apoAＩ-MＩ及びap
oAＩ- T6/MＩを担う他のすべての構築物に関しても同様
の結果が得られた。 【００８５】(2) すべての組換えpUC8/9誘導体で細菌宿
主MC1061を形質転換させた。 【００８６】37℃で1 晩増殖させた培養物をLAで1:100
に希釈し、震盪フラスコで1 時間増殖させてから1mM の
IPTGを添加し、次に更に 4〜6 時間インキュベーション
を継続した。このインキュベーション後、細胞を10分間
氷冷し遠心によってペレット化した。この段階以後はpF
CE4 誘導体で記載した手順と同じ抽出手順で処理した。
pIPI及びpRP5を含む細胞の粗抽出物をイムノブロット分
析（図６）及び「ELISA 」によって検定した。予備結果
を平均すると培養物1l当たり10mgのapoAＩが得られた。 【００８７】apoAＩ-PR5及びapoAＩ-IPIに組み込まれた
突然変異体apoAＩ-T6 、apoAＩ-MＩ及びapoAＩ- T6/MＩ
を担う他のすべての構築物に関しても同様の結果が得ら
れた。 【００８８】実施例２ apoAＩ遺伝子を担う949bp のフラグメントが SmaＩ部位
に挿入されているベクターpRIT2T(Pharmacia、Sweden)
を使用して別の変異体を構築した。このプラスミドによ
って発現されたタンパク質は541 個のアミノ酸から構成
されていた。これらはN-末端から順にλファージのCRO
タンパク質の最初の11個のアミノ酸とブドウ球菌プロテ
インA の配列の248 個のアミノ酸（残基23〜270 ）と5
つの異常なアミノ酸(Pro-Gly-Asp-Ser-Thr) と大腸菌の
β- ガラクトシダーゼの最終17個のアミノ酸とタンパク
質分解酵素エンテロキナーゼの認識配列を含む17個のア
ミノ酸Gly-Asp-Pro-Glu-Phe-Val-Asp-Asp-Asp-Asp--Lys
-Ser-Ser-Arg-Gly-Ser-Metとを含み、これらは成熟ヒト
apoAＩ(CPA-AＩと命名) またはその変異体apoAＩ-T6 、
apoAＩ-MＩ、apoAＩ- T6/MＩの配列の直前に存在した。
これらのキメラタンパク質は安定でありまた水溶液に可
溶である。 【００８９】CPA-A Ｉとラット肝細胞及び培養マウスマ
クロファージとの相互作用を試験した。 125Ｉ標識CPA-
A Ｉを培養細胞と共に 4℃でインキュベートするとハイ
ブリッドタンパク質がHDL に対する場合と同様の結合パ
ラメータで細胞表面に結合することが判明した。ハイブ
リッドタンパク質は37℃で細胞に吸収され内在化(inter
nalize) することが判明した。この挙動は脂質と会合し
てHDL 粒子を形成するときの天然apoAＩの挙動に類似す
る。 【００９０】材料及び方法 材料 ヒト血漿から不連続KBr 勾配の上でHDL(1.09＜d ＜1.21
g/ml) を調製した。HDL をPBS 、1mM のEDTAにおおまか
に透析しKBr を除去して 4℃で保存した。Klausner等
（J. Biol. Chem.、258 、4715-4724 、1983）の方法で
ヒトトランスフェリン(Sigma) に鉄を充填した。BSA は
実質的にIgG 非含有であった(Sigma、A 7638) 。Staphy
lococcus aureus プロテインA はPharmacia から入手し
た。フェノールレッドを含有するHank's平衡塩溶液はGi
bco から入手した。 【００９１】細胞及び細胞培養物 Fao 細胞としては、Deschatrette and Weiss（Biochemi
e 56、1603-1611 、1974）によって樹立され特性決定さ
れたラット肝癌細胞系を、 5％ウシ胎児血清(FCS) と10
0 単位／mlのペニシリンと100 μg/mlのストレプトマイ
シンと2mM のグルタミンと10mMのHEPES 緩衝液pH7.4 と
を加えたCoon改質Ham 培地(Seromed) で単層培養したも
のを用いた。 【００９２】J774細胞としては、マウスマクロファージ
細胞系（Ralph 等、J. Immunology114、898-905 、197
5）を 4.5％のFCS とペニシリンとストレプトマイシン
とグルタミンとHEPES 緩衝液pH7.4 とを後述の濃度で含
むDMEM培地で遠心懸濁培養したものを用いた。 【００９３】細菌株及びプラスミド 細菌宿主は大腸菌HB101 株（Boyer and Roulland-Dusso
ix、J. Mol. Biol. 41、459-472 、1969）及び RR1 M15
（Langley 等、Proc. Natl. Acad. Sci. USA72、1254-1
257 、1975）。プラスミドは pNF2690（Nilsson 等、EM
BO J. 4、1075-1080 、1985）、pLM3（Monaco等、Atti
Convegno Congiunto A.G.I.-S.I.B.B.M.、195-196 、
1985）及び Pharmacia、SwedenのpRIT2Tを使用した。 【００９４】DNA 構築物 制限酵素、Klenow DNAポリメラーゼ及びT4 DNAリガーゼ
はBoehringer Mannheim から購入し製造業者の指示通り
に使用した。大腸菌の形質転換はMorrisonの方法（Meth
ods Enzymol. 68、326-331 、1979）で行なった。 【００９５】ハイブリッド遺伝子の発現 ハイブリッド遺伝子はλPRプロモーターのコントロール
下に実質的に Zabeauand Stanley の方法（EMBO J. 1
、1217-1224 、1982）で発現させた。細菌を30℃でOD
600 ＝0.9 まで増殖させた。54℃に予熱した等容のブイ
ヨンを添加して温度を急激に42℃に上げた。採取以前に
培養物を42℃で90分間インキュベートした。細胞溶解物
全部をZabeauとStanley(1982) に記載のごとくゲルに充
填した。 【００９６】ハイブリッドタンパク質の精製 ハイブリッドタンパク質の精製には Marston等（Biotec
h-nology 2、800-804、1984) の方法を用いた。細菌ペ
レットを3 倍容(w/v) の緩衝液 A（50mMのTris/HCl pH
8.0、50mMのNaCl、1mM のEDTA）に再懸濁させ、氷上で
5×20sec 超音波処理した。遠心後(Sorvall SS34 ロー
タ、10,000rpm 、 4℃で10分間) 、ペレットを 0.5％の
Triton X-100と10mMのEDTAとを含む9 倍容(w/v) の緩衝
液A に再懸濁させ、室温で 5分間静置した。懸濁液を上
記のごとく遠心し、ペレットを8M尿素を含む9 倍容(w/
v) の緩衝液A に再懸濁させ、室温で1 時間インキュベ
ートした。 【００９７】尿素懸濁液を9 倍容(v/v) の50mMのリン酸
カルシウム緩衝液 pH10.7 、50mMのNaCl、1mM のEDTAに
添加し、KOH の添加によってpH10.7を維持しつつ室温で
30分間攪拌した。次に懸濁液を中和し、 4℃で緩衝液A
に透析した。透析した懸濁液を上記のごとく遠心した。
透明上清中のハイブリッドタンパク質は既に適度に純粋
であり、この段階のハイブリッドタンパク質の平均収量
は細菌培養物1l当たり50〜60mgであった。IgG-Sepharos
e 6 FF(Pharmacia) を用いたアフィニティクロマトグラ
フィーによって更に精製した。標本をカラムに充填し、
0.05％Tween20含有のPBS 、PBS 及び5mM の AcONH4 pH5
を順次用いて洗浄し、1MのAcOH/AcONH4 pH2.8 で溶出
した。精製タンパク質を緩衝液A に透析した。 【００９８】Biogel 1.5A ゲル濾過カラムを用いた較正 BioRadのBiogel 1.5A カラム（40cm×1cm ）を50mMのTr
is／HCl pH8.0 、50mMのNaCl、1mM のEDTA中で平衡させ
た。標本を流速3 ml／時で溶出させ、250 mlの分画を回
収した。カラムをデキストランブルー(2,000kD) 、チロ
グロブリン(699kD) 、フェリチン(440kD) 、HDL(285kD)
及びアルドラーゼ(158kD) で較正した。1.25μg の [
125Ｉ]- CPA-AＩまたは800 μg の非標識CPA-A Ｉを使
用してハイブリッドタンパク質の分子量を決定した。 【００９９】タンパク質のヨウ素化 Iodo-Gen試薬(Pierce Chemical Co.) を使用してタンパ
ク質をヨウ素化した。ヨウ素化反応は100 μg のIodo-G
en、200 μl のPBS 中の1 mgのタンパク質、1mCiの無担
体 Na[ 125I]、16.5mCi/μg(Amersham International)
を含んだ。4 ℃に10分間維持後10mlのSephadex G50カラ
ムで遊離ヨウ素をタンパク質から分離した。 PBS(0.2％
BSA)でカラムからHDL 、トランスフェリン及びIgG を溶
出し、50mMのTris/HCl pH8.0、0.15M のNaCl、1mM のED
TA、 0.2％のBSA でハイブリッドタンパク質を溶出し
た。ハイブリッドタンパク質、IgG 及びトランスフェリ
ンは透析しないで使用した。HDL は、標識の 5％未満が
10％(w/v) トリクロロ酢酸に可溶になるまでPBS 、0.5m
M のEDTAにおおまかに透析する必要があった。クロロホ
ルム／メタノールを用いた脂質抽出後の測定によれば、
5％未満の標識が脂質と結合した。得られた特異的活性
はタンパク質1ng 当たり 200〜400cpmであった。 【０１００】結合アッセイ 懸濁細胞に対して 4℃で2 時間の結合アッセイを行なっ
た。Fao 細胞の懸濁液を得るために、単層をPBS 、1mM
のEDTAで37℃で30分間インキュベートした。これらの細
胞または懸濁液で増殖させたJ774マクロファージを 4℃
で1000g ×5 分間ペレット化し3 mlのHanks/BSA に再懸
濁させることによって3 回洗浄した。各結合アッセイ
は、1 mlのHanks/BSA 中に 1×106 細胞と指標量の [
125I]-apoA-Ｉ-PA または [ 125I]-HDLとを含有してい
た。 4℃で2 時間維持後、細胞をHanks/BSA で4 回洗浄
し、Eppendorf 管に移し、γカウンタで放射能を測定し
た。競合実験として10μg のヨウ素化リガンドを10〜80
0 μg の非標識HDL 、CPA-A Ｉ、プロテインA またはト
ランスフェリンによって競合させた。これらは夫々ヨウ
素化リガンドの添加30分前に 4℃で細胞に添加した。 【０１０１】HDL 及びCPA-A Ｉのリガンドブロット J774細胞(2×108 ) をPBS で2 回洗浄し、10mMのTris/H
Cl pH7.4、0.1mM のEDTA中で均質化した。2000g で10分
間遠心してポスト核上清(PNS) を調製した。PNS を 1％
(v/v)Triton X-114(Bordier 、J. Biol. Chem.、256 、
1604-1607 、1981) で抽出した。洗剤相をジチオトレイ
トール含有の等容の標本緩衝液と混合し、沸騰させ、次
にヨードアセトアミドでアルキル化した。レーン当たり
約1 mgのタンパク質を 5〜15％のSDS ポリアクリルアミ
ドゲルに塗布した。ゲルをニトロセルロースフィルター
にブロットし、Ponceau S 染色によってバンドを可視化
した。10％(w/v) の低脂肪粉乳を含有するHanks 中でニ
トロセルロースストリップを6 時間消光(quench)させ
た。リガンド、即ち [ 125I]-CPA-AＩまたは [ 125I]-H
DLを12.5μg/mlで Hanks／乳に16時間結合した。次にHa
nks/乳でストリップを4 回洗浄し、ヒトHDL 、 CPA-AＩ
またはプロテインA(血清で1/50に希釈) に対するウサギ
抗血清でリガンドを検出し、ジアミノベンジジン反応(B
ur-nette、Anal. Biochem.、112 、195-203 、1981) で
検出される抗ウサギIgG ペルオキシダーゼの存在下にイ
ンキュベートした。乾燥ブロットをX 線フィルムに露光
した。 【０１０２】分析方法 Frank and Trosin(H.Tschesce 編:Modern Methods inPr
otein Chemistry 、Walter de Gruyter & Co. 、Berli
n、287-302 、1985) に記載の構造の気- 液相マイクロ
シーケンサにおいてLottspeich（Hoppe Seyler's Z. Ph
ysiol. Chem.、361 、1829-1834 、1980）に従って全自
動化Edman 分解によってアミノ末端の配列決定を行なっ
た。ハイブリッドタンパク質のカルボキシ末端配列を決
定するために、カルボキシペプチダーゼ、ε、A 及び／
またはB をTadros等（Eur. J. Biochem.、138 、209-21
2 、1983）の方法で使用した。アミノ酸分析のためにタ
ンパク質をTadros等（Eur. J. Biochem.、127 、315-31
8 、1982）の方法で加水分解し、全自動アミノ酸アナラ
イザー(Durrum D-500)を使用してアミノ酸組成を決定し
た。トリプトファン及びシステインは決定しなかった。 【０１０３】鏡検のために2 ％ホスホタングステン酸を
使用しHDL 及び CPA-AＩの標本をネガティブ染色した。
Bradfordの方法（Anal. Biochem.、72、248-254 、197
6）でタンパク質濃度を検定した。 【０１０４】結果 ハイブリッドタンパク質 CPA-AＩをコードする遺伝子を
担うプラスミドpLM8の構築 ベクターpRIT2Tは大腸菌中で細胞内タンパク質を温度誘
発的に発現させるべく設計されたpRIT2 の誘導体である
(Nilsson等、1985) 。構築物はλPRプロモーターのコン
トロール下にブドウ球菌プロテインA のIgG 結合ドメイ
ンを含む。多重クローニング部位はプロテインA の3'端
に外来遺伝子を容易に挿入せしめる。プロテインA 転写
終了配列は多重クローニング部位の直ぐ下流に挿入され
る。プラスミドpLM3はヒトapoAＩの成熟遺伝子に枠内融
合した大腸菌lacZ遺伝子を含む(Monaco 等、1985) 。 【０１０５】PAとapoAＩとの融合を担うプラスミドpLM8
を図７の手順で構築した。制限部位EcoRＩ及びCla Ｉを
末端にもつ949 bpのフラグメントをpLM3から単離し、Kl
enowDNAポリメラーゼによって埋め戻した。フラグメン
トの突出端を SmaＩ直線化pRIT2Tに結合させた。得られ
たプラスミドpLM8はタンパク質分解性切断の特異的配列
によって隔てられた5'端のプロテインA の遺伝子と3'端
の成熟ヒトapoAＩ遺伝子とから構成された541 個のアミ
ノ酸から成る融合タンパク質をコードする読取枠を保有
する。 【０１０６】ハイブリッドタンパク質の発現、単離及び
精製 温度感受性CI857 λリプレッサー突然変異体をコードす
る適合プラスミドpNF2690 の存在下にpLM8を保有する大
腸菌細胞は大量のハイブリッドタンパク質を発現するこ
とが可能であった。42℃で増殖させると誘発 CPA-AＩの
量が総量の約20％を示した。ハイブリッドタンパク質の
見掛け分子量は予想通りSDA-PAGEで62kDであった。標準
抽出方法（超音波、凍結乾燥、リゾチーム−Triton X-1
00）では成功しなかった。8M尿素中での超音波処理細菌
のインキュベーションとアルカリ緩衝液の添加とを順次
に含む変性手順を採用した。中和及び透析によって再生
後、懸濁液を遠心すると、透明上清は90％を上回る純度
の融合タンパク質をを含有していた。IgG Sepharose に
よるアフィニティクロマトグラフィーによって更に精製
した。 【０１０７】ハイブリッドタンパク質の特性決定 ハイブリッドタンパク質をヒツジで調製した特異的apoA
Ｉ抗体による認識によって同定した。プロテインA はヒ
ツジ抗体を認識しない。 【０１０８】最初の8 個のアミノ酸から成るアミノ末端
配列と最終3 個のアミノ酸から成るカルボキシ末端配列
とは既知のapoAＩ及びプロテインA の配列と一致した。
またアミノ酸組成分析も予想組成と一致した。 【０１０９】細胞表面に対するハイブリッドタンパク質
の結合を定量するために（後記参照）、天然の分子量を
決定することが必要であった。これは、Biogle 1.5A を
使用するゲル濾過によって行なった。カラム溶出のピー
ク分画は分子量316kD を与え、これは単量体の分子量62
kDの5 倍に相当した。ハイブリッドタンパク質溶出のプ
ロフィール(profile) は、別の多量体も存在しまたボイ
ド容量(void volume)に少量の凝集物質が存在すること
を示した。すべての実験において天然分子量として平均
サイズ316kD を使用した。これを同じカラムで標準とし
て使用したHDLの285kD に比較した。ヨウ素化ハイブリ
ッドタンパク質の溶出分布は非標識ハイブリッドタンパ
ク質で得られたものと同様であった。 【０１１０】電子顕微鏡によるネガティブ染色後にHDL
及びハイブリッドタンパク質粒子を試験した。顕微鏡写
真は、直径 9〜12nmの範囲の均質粒子集団を示した。ハ
イブリッドタンパク質粒子はHDL よりやや大きいサイズ
をもちゲル濾過によって得られた結果を追認した。 【０１１１】ハイブリッドタンパク質及びHDL の生物学
的活性の比較 細胞表面レセプターに対する結合能を試験するために大
腸菌から精製されたハイブリッドタンパク質とヒト血漿
から精製されたHDL とを平行に使用した。複数の細胞タ
イプ、即ちマウスマクロファージ(J774)及びラット肝細
胞(Fao) の細胞系を試験した。これらの２つの細胞タイ
プはHDL を異なる方法で処理することが判明している。
マクロファージにおいてはコレステロール交換が生じ肝
細胞においては分解が生じる。 【０１１２】4 ℃における結合データ ヨウ素化リガンドを 4℃で2 時間細胞に結合させた。30
分間で結合量が平坦域に到達した。非特異的な量を判定
するために500 μg の非標識リガンドとの競合を使用
し、この値を総結合曲線から減算して特異的結合値を与
えた。特異的結合値を使用しScatchard 分析(Scatchar
d、Ann. N. Y. Acad. Sci. 51、660-672、1949) によ
って親和性を計算した。HDL 及びハイブリッドタンパク
質の双方で結合は特異的で高い親和性を有していた。J7
74またはFao 細胞で高親和性結合はHDL では 2.8〜 3.0
×10-8M のKd、ハイブリッドタンパク質では 3.5〜 4.9
×10-8M のKdを有していた。結果を後出の表２に示す。
更に、HDL 及びハイブリッドタンパク質の双方で非標識
リガンドに完全には競合しない低親和性成分が存在す
る。 【０１１３】双方の細胞タイプの高親和性結合成分は 1
×106 細胞当たり90〜155 ngの最大結合を与える。これ
は細胞当たり 1.9〜 3.6×105 部位を示す。細胞当たり
の結合部位の数及び結合親和性はHDL 及びハイブリッド
タンパク質の双方で顕著に類似していた。これは、単一
レセプターが関与しHDL のレセプター媒介結合にapoAＩ
成分だけが関係することを示唆する。 【０１１４】競合試験 apoAＩの特異的結合の付加的な証拠は競合試験によって
得られる。HDL 及びハイブリッドタンパク質の双方がJ7
74及びFao 細胞に対する結合において互いに有効に競合
した。非特異的成分に達するまで競合が有効であった。
プロテインA はハイブリッドタンパク質またはHDL の結
合に競合できなかった。競合試験における独立対照とし
てトランスフェリンを使用した。トランスフェリンはト
ランスフェリンレセプターを介して細胞表面に結合する
が、HDL またはハイブリッドタンパク質の結合に競合で
きなかった。 【０１１５】プロテインA 及びIgG 結合活性 ハイブリッドタンパク質は同時にプロテインA を含有す
るので、プロテインA自体が細胞に結合できるか否かを
判断することが重要である。プロテインA を同様に特異
的活性にヨウ素化し、J774及びFao 細胞に対する結合を
検定した。高濃度のプロテインA(100 μg/ml) が存在す
る場合にも特異的結合は検出されなかった。細胞結合放
射能の量はハイブリッドタンパク質の非特異的結合より
も少なかった。 【０１１６】J774細胞はIgG に対するFcレセプターを発
現させるので、ハイブリッドタンパク質によってこれら
の実験を行なうためには配慮が必要であった。従って、
[ 125I]- ウサギIgG は高親和性（Kd＝ 1×10-8M ）で
細胞表面Fcレセプターに結合する。 [ 125I]-CPA-AＩが
ウサギIgG の存在下に結合すると、結合ハイブリッドタ
ンパク質の量は2.7 倍に増加した。逆に、 [ 125I]- ウ
サギIgG がハイブリッドタンパク質の存在下に結合した
ときも結合が増加した(1.6倍) 。明らかに、IgG とCAP-
A Ｉとの複合体はFcレセプターまたはHDL レセプターに
結合し得る。HDL レセプターだけを試験するために、す
べての結合実験をIgG 非含有培地で行なった。培地中に
存在するIgG を除去するためにBSA(実質的にIgG 非含
有) を加えたHanks 緩衝液で細胞を3 回洗浄した。 【０１１７】HDL レセプターの特性決定 HDL 、ハイブリッドタンパク質またトランスフェリンの
結合を検定する前にJ774細胞を 4℃のトリプシンで処理
した。トリプシン処理はHDL またはハイブリッドタンパ
ク質結合を減少させなかった。しかしながら、 [ 125I]
- トランスフェリンの結合は対照の38％まで減少した。
HDL レセプターはトランスフェリンレセプターに比較し
て比較的トリプシン耐性である。 【０１１８】HDL 及びハイブリッドタンパク質の結合に
関与するレセプターを同定するために、リガンドブロッ
トを実施した。J774細胞からのPNS のTriton X-114抽出
物を還元条件下にSDS-PAGEにかけニトロセルロースに移
した。 [ 125I]-HDL及び [ 125I]-CPA-AＩの各々は約11
0kD のバンドに結合した。このバンドをフィルターのオ
ートラジオグラフ上で [ 125I]- 標識リガンドを可視化
することによって直接に同定するかまたはHDL に対する
ウサギ抗血清を用いて抗体を検出しヒツジ抗ウサギIgG
ペルオキシダーゼで可視化することによって間接に同定
した。HDL の場合、ニトロセルロース上にヨウ素化ラベ
ルの極めて高いバックグラウンドが存在し、これがオー
トラジオグラフ上の特異的バンドの検出を妨害した。 【０１１９】実施例３ ヒトapoAＩを前駆体即ち267 個のアミノ酸から成る pre
-proapoAＩとして合成する。18個のアミノ酸から成るプ
レペプチドを分泌中に開裂し、 proapoAＩと指称される
プロタンパク質を残す。従って、 proapoAＩは6 個のア
ミノ酸から成るN-末端延長部即ちArg-His-Phe-Trp-Gln-
Gln とこれに続く成熟タンパク質とから構成される。 【０１２０】proapoAＩを発現させるためにapoAＩ遺伝
子の5'を図８に示すように合成的に復元する。6 個のア
ミノ酸プロペプチドを含む proapoAＩの最初の15個のア
ミノ酸をコードする NdeＩ- BamHＩオリゴヌクレオチド
を合成した。合成DNA はBamHＩ部位の直前に NcoＩ部位
を含んでいた。プラスミド pDR72（Pharmacia 、Swede
n;Russel and Bennet、Gene、20、231 、1982）に由来
のtrp プロモーターを担うEcoRＩ-SalＩフラグメントを
λcIIShine-Dalgarno 配列をコードする合成 SalＩ-Nde
Ｉフラグメントに結合して図示のEcoRＩ-NdeＩ 107bpフ
ラグメントを得た。このDNA 断片を proapoAＩ 5' 配列
をコードするフラグメントに結合し、M13mp8(Messing
等、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、74、3642、1977) に
サブクローニングし配列決定した。 【０１２１】組換え proapoAＩを発現させるために図９
のごとく発現ベクターを構築した。発現シグナルとこれ
に続く proapoAＩ遺伝子の5'端とを内包するEcoRＩ-Nco
Ｉフラグメントを組換えM13mp8から切除し（図８Ａ、図
８Ｂ参照）、以下の２つのフラグメントに結合した。 【０１２２】(a) EcoRＩ- BamHＩで切断したプラスミド
pDS20 の大きいフラグメント(Duester等、Cell、30、85
5 、1982) 、(b) apoAＩ配列の残りの部分を含むpML11-
20に由来の NcoＩ-BamH Ｉフラグメント。 【０１２３】得られたプラスミドpFC33 は、大腸菌B 株
（Delbruck、1946、Bacterial viruses or bacteriopha
ges Biol. Rev.、21: 30-40)中のtrp プロモーター下に
proapoAＩタンパク質またはより特定的には Met-proap
oAＩを発現させ得た。誘発のために、アンピシリンを加
えたLB培地で細胞を1 晩増殖させた。次の日に細胞をト
リプトファン非添加のM9培地に希釈し、37℃で6 時間維
持後に採取した。 【０１２４】図１０は proapoAＩのゲル電気泳動及びイ
ムノブロット分析を示す。細菌培養物のアリコートをペ
レット化し、標準ヒト分画と平行にゲル電気泳動バッフ
ァに再懸濁させた。沸騰後、標本を12.5％SDS-PAGEで電
気泳動させた。実施例１と同様にニトロセルロースフィ
ルターにブロッティングした。 【０１２５】 【表１】 【０１２６】 【表２】
いたヒトアポリポタンパク質ＡＩ(apoAI) 及びその変異
体の産生に係る。 【０００２】 【従来の技術および発明が解決しようとする課題】アテ
ローム性動脈硬化症及びその合併症（例えば冠性心疾
患、 CHD）は恐らく健康上の最も危険な問題の１つであ
る。この病気の進行には多数の危険要因(risk factor)
が伴っており、最も重要な危険要因の１つは血漿コレス
テロール(CHL) レベルの上昇である。従って、ヒト体内
のCHL 代謝の研究が非常な注目を浴びている。 【０００３】ヒト体内の血漿CHL 及びトリグリセリド(T
G)のレベルを調節する遺伝子、治療食(diet)及びホルモ
ンの相互作用のメカニズムを理解する鍵はリポタンパク
質運搬系にある。血漿中のリポタンパク質の機能は主と
して脂質を１つの器官から別の器官に運搬することであ
る。これらのリポタンパク質は疎水性脂質を可溶化する
だけでなく各クラスの脂質を配給すべき身体部位を指令
することが最近明らかにされた。主として４つのクラス
のリポタンパク質、即ちキロミクロン(CM)、極低密度(V
LDL)、低密度(LDL) 及び高密度(HDL) リポタンパク質が
存在する。 【０００４】血漿中で運搬されるときTG及びコレステリ
ルエステル(CHLE)はリポタンパク質粒子にパッケージさ
れ極性リン脂質(PL)の表面単層によって包囲された疎水
性コアを形成する。表面皮膜はアポリポタンパク質(ap
o) と指称されるタンパク質と共に比較的少量の非エス
テル化CHL も含有する。少なくとも９種類のapo 、即ち
ＡＩ、ＡII、ＡIV、Ｂ(48-100)、ＣＩ、ＣII、ＣIII 、
Ｄ及びＥが同定されている。 【０００５】血漿リポタンパク質レベルとCHD の進行の
危険との関連を研究することは特に重要である。HDL 及
びLDL は双方ともCHL 及びCHLEの担体である。しかしな
がらLDL-CHL レベルはプラスの危険要因であるが（Kann
el等、Ann. Intern. Med. 、90:85-91、1979）、HDL レ
ベルは重要なマイナスの危険要因である（Yaari 等、La
ncet、i:1011-1015 、1981）ことが指摘されている。こ
れらのリポタンパク質の正確な機能及び作用モードはま
だ完全には解明されていないが、HDL は特に末梢組織か
らCHL を除去しCHL 逆輸送(RCT) と指称されるメカニズ
ムによって肝臓に逆輸送する機能を果たすと考えられ
る。 【０００６】HDL の主なアポリポタンパク質はapoAＩで
あり、いくつかの研究によれば血漿apoAＩレベルとCHD
との間にはHDL-CHL レベルとCHD との間で報告されたよ
うな（Ishikawa等、Eur. J. Clin. Invest. 、8:179-18
2 、1978）逆相関関係があることが判明した。更に、HD
L-CHL 及びapoAＩのレベルは血管造影法で診断される冠
性アテローム動脈硬化病巣の容態に対して逆の相関関係
をもつ（Pearson 等、Amer. J. Epidem.、109:285-295
、1979;Maciejko 等、New Eng. J. Med.、309:385-389
、1983）。従って、血漿中の高濃度HDL は粥腫の形成
を遅らせ及び／または既存病巣の退行を促進することに
よってCHD に影響を与えると考えられる。 【０００７】HDL アポリポタンパク質主としてapoAＩと
レシチンとの複合体は、培養された動脈平滑筋細胞のご
とき細胞からinvitro で遊離CHL の流出を促進する（St
ein等、Biochem.Bio-phys. Acta、380:106-118 、197
5）。実験的に誘発したアテロームをもつ動物に対する
リン脂質の静脈注入はこの流出に有利に作用し(Adams
等、J. Path. Bact.、94:77-87、1967）、apoAＩ／レシ
チン複合体は天然HDL 粒子と同様の速度で血漿から除去
される（Malmendier等、Clin. Chem. Acta、131:201-21
0 、1983）。 【０００８】CHL を与えたウサギにapoAＩを静脈注入す
ると病巣波及範囲が50％縮小する。これは、apoAＩがア
テローム性動脈硬化の病巣形成に対する防御効果をもつ
ことを示し、その理由は恐らく大動脈壁に吸収されてCH
L が減少するためである（Maclejko and Mao、Artherio
sclerosis 、2:407a、1982;Mao等、Fed. Proc. (USA)、4
2、no7 pABSTRACT 357 、1983;Badimon等、Cardiovascu
lar Disease '86、1986 ABS-TRACT 81）。 【０００９】Apo ＩはHDL の約70％を占める主要タンパ
ク質であり、血漿中に濃度 1.0〜1.2 mg／mlで比較的多
量に存在している（Schonfield等、J. Clin. Invest.、
69:1072 、1982）。血漿apoAＩは243 個のアミノ酸から
成るポリペプチド単鎖でありその一次配列は既知である
（Brewer等、Biochem. Bio-phys. Res. Commun. 、80:6
23-630、1978）。細胞内でapoAＩは267 個のアミノ酸か
ら成る前駆体の形態で存在する。この長いタンパク質の
最初の18個のN-末端残基は粗面小胞体のシグナルペプチ
ダーゼによって細胞内で開裂される。新しく分泌された
apoAＩは依然として6 個のアミノ酸から成るN-末端延長
部をもち、血漿及び／またはリンパ特異的プロテアーゼ
によって成熟形に変換される(Zannis and Bre-slow、Ad
vances in Human Genetics、Harris and Hirsch-horn e
ds. 、Plenum、125-215 、1985)。 【００１０】ApoAＩ分子のC-末端部は11または22個のア
ミノ酸の反復単位から成ることが判明した(McLachlan、
Nature、267:465-466、1979) 。縦列セグメントは正確な
重複ではないが、アミノ酸置換物は一般に反復セグメン
トの対応位置の残基の化学的タイプを保存していた。こ
れらの反復セグメントは、両親媒性螺旋コンホーメーシ
ョンで存在すると推定され(Segrest等、FEBS Lett.、3
8:247-253、1974) 、apoAＩの主要生物学的活性即ち脂
質結合及びレシチンCHL アシルトランスフェラーゼ(LCA
T)賦活を与える主な構造要件であると考えられる。apoA
Ｉのその他の２つの機能、即ちレセプターによってHDL
粒子を認識するリガンドの機能及び末梢組織からCHL を
除去する機能とapoAＩ分子の特異的配列またはドメイン
との関連はまだ解明されていない。 【００１１】最初に文献に発表されたヒトapoAＩの分子
変異体はMilano(apoＡＩ-MＩ) 変異体であった（France
schini等、J. Clin. Invest.、66:892-900、1980）。こ
の特徴は、Arg173-Cys置換にあり（Weisgraber等、J. B
iol. Chem.、258:2508-2513、1983）、同じ血縁に属する
33人の被験者において同定された。これらの被験者全員
が常染色体性優性形質として伝達される突然変異アポリ
ポタンパク質にヘテロ接合性であった。被験者において
はHDL-CHL 濃度が顕著に低下しており、HDLレベルに対
してマイナスの相関関係をもつ種々の程度のトリグリセ
リド過多を示した。突然変異と特異的病理状態との間の
関連は全く確認できなかった。実際、罹患被験者は早期
アテローム性動脈硬化の進行から明らかに保護されてい
た（Gualnadri 等、Am. J. Hum. Gen.、1986、印刷
中）。 【００１２】ApoAＩ-MＩ中のアミノ酸置換は突然変異ア
ポタンパク質の構造を修飾しα螺旋秩序構造を減少させ
疎水性残基の露出を増加させる（Franceschini等、J. B
iol.Chem.、260:16321-16325 、1985）。突然変異アポ
タンパク質の構造再生(remodelling) は、正常apoAＩよ
りも容易に脂質と会合する分子の脂質結合性を有意に変
化させる。アポタンパク質／脂質複合体は、正常apoAＩ
によって形成される複合体と同様であるが変性剤による
破壊が容易である。変異形の内部にシステイン残基が存
在するので、apoAIIとの複合体及びapoAＩ二量体の形成
が可能である。これらのタンパク質複合体が「罹患」被
験者で観察された異常HDL 粒子の形成の主因であると推
定される。ApoAＩ-MＩのこれらの特徴すべてがその異化
作用促進及び組織脂質の有効吸収能に寄与すると考えら
れる。 【００１３】apoAＩのその他のいくつかの遺伝変異体が
これまで文献に発表されたが(Breslow、Ann. Rev. Bioc
hem.、54:699- 727 、1985) 、これらのうちでキャリア
における何らかの病理状態またはリポタンパク質代謝作
用の有意な変化と関連づけられたものはない（表1 参
照）。 【００１４】ApoAＩ cDNA クローンはいくつかの研究室
で得られた（Breslow 、Ann. Rev.Biochem.、54:699-72
7、1985;Shar-pe等、Nucl. Acids Res.、12:3917-393
2、1984）。mRNAは約890 塩基対(bp)の長さをもち、35b
pの5'非翻訳配列と 801bp（267 個のアミノ酸）のコー
ド配列と翻訳終止コドン(TGA) とポリA テイルを付けた
54bpの3'非翻訳配列とをもつ。完全cDNAヌクレオチド配
列を添付の図１に示す。 【００１５】 【課題を解決するための手段】本出願人は、apoAＩまた
はその遺伝変異体を含むタンパク質を産生するために組
換えDNA 技術の使用が有効であることを知見した。変異
体としては、6-Ser がThr で置換されたapoAＩ(apoＡＩ
-T6)、apoAＩ-MＩ、または、apoAＩ-T6 とapoAＩ-MＩの
双方の突然変異を含む変異体(apoＡＩ- T6/MＩ) があ
る。タンパク質は、抗apoAＩ抗血清を用いる酵素結合免
疫吸着検定法(ELISA) によって検出できる。産生したタ
ンパク質はapoAＩまたはその遺伝変異体がN-末端で担体
ペプチドに融合した融合タンパク質の形態でもよい。 【００１６】本発明においては、抗ヒトapoAＩ抗血清を
用いるELISA によって検出可能な式(1) Ｍｅｔ−Ｘ−Ｙ （１） ［式中、X は結合、β- ガラクトシダーゼのN-末端アミ
ノ酸残基に由来の配列もしくはプロテインA の１つ以上
のIgG-結合ドメインを含む配列を含む担体ペプチド配列
またはヒトapoAＩのプロ配列を示し、Y はヒトapoAＩま
たはその遺伝変異体を示す］で示されるタンパク質を形
質転換宿主中で発現させ得る発現ベクターが該タンパク
質の製造のために使用される。 【００１７】Met 残基は、翻訳開始コドンの機能をもつ
と考えられる。かかる発現ベクターで形質転換され内部
で前記タンパク質を発現せしめる宿主が式(1) のタンパ
ク質の産生に使用できる。形質転換宿主を培養し、得ら
れた式(1) のタンパク質を回収する。 【００１８】従って、本発明は式(1) のタンパク質を提
供する。 【００１９】好ましい実施態様によれば本発明は、 (A) １．apoAＩ（図１参照）、 ２．apoAＩ-T6 、 ３．apoAＩ-MＩ、 ４．apoAＩ- T6/MＩ、 ５．N-末端延長部Thr-Met-Ile-Thr-Pro-Ser-Phe-Asp-Gl
y-Ser-Met-をもつapoAＩ(apoＡＩ-RP5) 、 ６．N-末端延長部Thr-Met-Ile-Thr-Asn-Ser-Arg-Gly-Se
r-Met-をもつapoAＩ(apoＡＩ-IP1) 、 ７．apoAＩ-T6 とapoAＩ-RP5とを結合したタンパク質(a
poＡＩ-RP5/T6)、 ８．apoAＩ-T6 とapoAＩ-IP1とを結合したタンパク質(a
poＡＩ-IP1/T6)、 ９．apoAＩ-MＩとapoAＩ-RP5とを結合したタンパク質(a
poＡＩ-RP5/MＩ) 、 10．apoAＩ-MＩとapoAＩ-IP1とを結合したタンパク質(a
poＡＩ-IP1/MＩ) 、 11．apoAＩ-T6/M ＩとapoAＩ-RP5とを結合したタンパク
質(apoＡＩ-RP5/T6/MＩ) 、 12．apoAＩ- T6/MＩとapoAＩ-IP1とを結合したタンパク
質(apoＡＩ-IP1/T6/MＩ) 、 13．N-末端延長部Arg-His-Phe-Trp-Gln-Gln をもつapoA
Ｉ(proapoAＩ) 、 14．proapoＡＩとapoAＩ-MＩを結合したタンパク質(pro
apoAＩ-MＩ) 、 15．ブドウ球菌プロテインA によって与えられたN-末端
延長部をもちN-末端から順に（λファージのCRO タンパ
ク質の最初の11個のアミノ酸）−（ブドウ球菌プロテイ
ンA の248 個のアミノ酸 (残基23〜270))-(Pro-Gly-Asp
-Ser-Thr)-（β- ガラクトシダーゼの最終17個のアミノ
酸)-（タンパク質分解酵素エンテロキナーゼの認識配列
を含みGly-Asp-Pro-Glu-Phe-Val-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys-
Ser-Ser-Arg-Gly-Ser-Met)で示される17個のアミノ酸)-
(apoＡＩ、apoAＩ-T6 、apoAＩ-MＩまたはapoAＩ-T6/M
Ｉ) の構造をもつ541 個のアミノ酸残基から成るタンパ
ク質をコードする遺伝子を担う組換えプラスミドの構
築、及び、 (B) 大腸菌（Escherichia coli、E.coli株）中での前記
遺伝子の発現に係る。これらの遺伝子の発現によって以
下のタンパク質が得られる。 【００２０】−Met-apoAＩ、Met-apoAＩ-T6 、Met-apoA
Ｉ-MＩ及びMet-apoAＩ- T6/MＩから選択されたアポリポ
タンパク質、 −アミノ酸配列Met-Thr-Met-Ile-Thr-Pro-Ser-Phe-Asp-
Gly-Ser-Met-がapoAＩ、apoAＩ-T6 、apoAＩ-MＩ及びap
oAＩ- T6/MＩから選択されたアポリポタンパク質に融合
した融合タンパク質、 −アミノ酸配列Met-Thr-Met-Ile-Thr-Asn-Ser-Arg-Gly-
Ser-Met がapoAＩ、apoAＩ-T6 、apoAＩ-MＩ及びapoAＩ
- T6/MＩから選択されたアポリポタンパク質に融合した
融合タンパク質、 −プロアポリポタンパク質proapoＡＩまたはproapoＡＩ
-MＩ、または、 −（λファージのCRO タンパク質の最初の11個のアミノ
酸)-（ブドウ球菌プロテインA の248 個のアミノ酸 (残
基23〜270))-(Pro-Gly-Asp-Ser-Thr)- (β- ガラクトシ
ダーゼの最終17個のアミノ酸)-（タンパク質分解酵素エ
ンテロキナーゼの認識配列を含みGly-Asp-Pro-Glu-Phe-
Val-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys-Ser-Ser-Arg-Gly-Ser-Met ）
で示される17個のアミノ酸)-(apoＡＩ、apoAＩ-T6 、ap
oAＩ-MＩまたはapoAＩ- T6/MＩ) から構成された融合タ
ンパク質。 【００２１】 【発明の実施の形態】本発明で使用される発現ベクター
は、該ベクターに含まれたDNA 配列、特に構造遺伝子の
配列を発現し得るベクターである。発現されるべきDNA
配列はそれらの発現を調節する上流配列に対して正しく
配置されている。発現されるべきタンパク質、宿主の性
質等を考慮して適当な任意のプロモーター系を使用する
とよい。従って、PL、lac 、tac 及びtrp プロモーター
から選択されたプロモーターを使用し得る。本発明の場
合、5'- 調節配列は発現されるべきapoAＩまたはその遺
伝変異体に対して非相同である。調節配列はlac または
trp オペロンの調節配列でもよい。言い替えると、本発
明の発現ベクターは、apoAＩまたはその遺伝変異体であ
る非相同タンパク質を発現し得る。好ましい遺伝変異体
はapoAＩ-T6 、apoAＩ-MＩ及びapoAＩ- T6/MＩである。 【００２２】式(1) のタンパク質をコードするDNA 配列
を含む本発明で使用可能な発現ベクターは典型的にはプ
ラスミドである。これらは単鎖でもよい。各ベクターは
複製起点を有しており複製可能である。好ましい発現ベ
クターは、apoAＩまたはその遺伝変異体を発現する場合
はプラスミドpFCE4+に由来し、担体配列がβ- ガラクト
シダーゼのN-末端アミノ酸残基に由来の配列を含む融合
タンパク質を発現する場合はpUC8またはpUC9に由来し、
担体配列がプロテインA の１つ以上のIgG 結合ドメイン
を含む場合はpLM3に由来し、proapoＡＩまたはその遺伝
変異体を発現させる場合はpDS20 である。 【００２３】apoAＩまたはその遺伝変異体を含むタンパ
ク質を発現させるために適当な宿主を本発明の発現ベク
ターによって形質転換させる。細菌、酵母または哺乳類
細胞系のごとき原核細胞または真核細胞の宿主を使用し
得る。代表的な宿主は大腸菌株である。所望のタンパク
質が細胞プロテアーゼによって分解されないように宿主
を選択する必要がある。一般には、apoAＩまたはその遺
伝変異体を含むタンパク質は以下の手順で得られる。 【００２４】１．クローンapoAＩ cDNA を選択する。 【００２５】２．apoAＩ遺伝子を易動性にする制限部位
が両端に形成されるようにcDNAを裁断(tailor)する。こ
れに付随してシグナルペプチド及びプロペプチドをコー
ドする配列が除去される。 【００２６】３．apoAＩ遺伝子を発現ベクターに正しい
読取枠で挿入する。突然変異T6及び／または MＩを導入
してもよい。apoAＩ遺伝子またはその変異遺伝子はオペ
ロン内の唯一の構造遺伝子でもよい。または、apoAＩま
たはその遺伝変異体を融合タンパク質として発現させた
い場合にその5'端を担体ペプチドをコードするDNA 配列
に付着させてもよい。 【００２７】４．apoAＩまたはその遺伝変異体を内部で
発現させ得る宿主を発現ベクターで形質転換する。 【００２８】５．形質転換した宿主を培養し、得られた
所望タンパク質を回収する。 【００２９】apoAＩまたはその遺伝変異体をコードする
遺伝子が１つ以上のイントロンを含まずに入手できる場
合、この遺伝子はベクター内に存在するプロモーターの
転写調節下にベクターに枠内(in frame)挿入される。遺
伝子は担体ペプチド配列をコードするDNA 配列の直後に
挿入され得る。従って式(1) のタンパク質をコードする
DNA 配列は適当なプロモーターを備えたベクター内の転
写開始コドンと終了コドンとの間に挿入され得る。proa
poＡＩまたはその遺伝変異体をコードする遺伝子も同様
にベクター内に挿入され得る。得られた発現ベクターに
よって形質転換された宿主の培養によって所望のタンパ
ク質を産生し得る。 【００３０】融合タンパク質の担体ペプチド部分は、β
- ガラクトシダーゼのN-末端アミノ酸残基に由来しても
よい。例えば、β- ガラクトシダーゼの最初の15個以内
のN-末端アミノ酸残基に由来し得る。好ましくは残基5
〜15、より好ましくは残基8〜12に由来する。このよう
にして得られた好ましい担体ペプチドは配列、Thr-Met-
Ile-Thr-Pro-Ser-Phe-Asp-Gly-Ser-Met またはThr-Met-
Ile-Thr-Asn-Ser-Arg-Gly-Ser-Met を含む。 【００３１】かかる担体ペプチドを組み込んだ融合タン
パク質を発現させるとき、その前にMet が存在する。こ
れはプロテインA の１つ以上のIgG-結合ドメインを含む
別の担体ペプチドを使用する場合にも同じである。かか
る担体配列は、ブドウ球菌プロテインA の完全配列また
は該タンパク質の残基23〜270 を含み得る。エンテロキ
ナーゼ、X 因子またはコラゲナーゼのごときタンパク質
分解酵素の認識部位を含むアミノ酸配列が、apoAＩまた
はその変異体の配列の直前に存在してもよい。適当な配
列は、Gly-Asp-Pro-Glu-Phe-Val-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys-
Ser-Ser-Arg-Gly-Ser-Met である。 【００３２】これはエンテロキナーゼの認識配列であ
る。担体配列中に別のアミノ酸配列が存在してもよい。
例えばプロテインA 配列とタンパク質分解酵素認識部位
の配列との間に30個以内の残基から成る結合配列が存在
してもよい。担体配列のN-末端部分が発現ベクター中の
プロモーターによって天然にコントロールされる構造遺
伝子の第１残基例えば20個以内の残基を含んでいてもよ
い。プロテインA のIgG-結合ドメインを含む融合タンパ
ク質は水溶性であり、水性環境で適度に安定であり、例
えばIgG-結合Sepharose を用いたアフィニテイクロマト
グラフィーによって均質になるまで容易に精製できる。 【００３３】N-末端延長部が担体ペプチドによって準備
されたか否かにかかわりなく、式 (1)の組換えタンパク
質は典型的にはヒト起源のその他のタンパク質を実質的
に含まない。言い替えると、該タンパク質は実質的に純
粋な形態で形成され、通常なら該タンパク質と会合して
いるタンパク質が付随していない。 【００３４】apoAＩまたはその遺伝変異体を含むタンパ
ク質は治療効果をもつのでヒトまたは動物の体内治療に
使用され得る。より詳細には、血漿コレステロール及び
／またはトリグリセリドのレベルを低下させるために使
用され得る。従って、このタンパク質は、アテローム性
動脈硬化症及び冠性心疾患のごとき心血管疾患に対して
使用され得る。このタンパク質は予防のために投与され
てもよくまたは既往の病状の改善及び／または治療のた
めに投与されてもよい。 【００３５】従って本発明によって産生されるタンパク
質は、薬剤的に活性の担体または希釈剤を含む医薬組成
物として提供され得る。かかる組成物は公知の方法で処
方され得る。タンパク質は非経口投与例えば静注投与さ
れてもよい。 【００３６】以下に、本発明を要約する。 【００３７】１． 抗ヒトａｐｏＡＩ抗血清を用いたＥ
ＬＩＳＡによって検出可能であり、式（１） Ｍｅｔ−Ｘ−Ｙ （１） ［式中、Ｘはβ−ガラクトシダーゼの最初の15個以内の
Ｎ末端アミノ酸に由来する配列を有する担体ペプチド配
列又はヒトａｐｏＡＩのプロ配列であり、Ｙはヒトａｐ
ｏＡＩ配列か又は、ヒトａｐｏＡＩ配列中 173位のＡｒ
ｇがＣｙｓで置換された配列（ａｐｏＡＩ−ＭＩ）、６
位のＳｅｒがＴｈｒで置換された配列（ａｐｏＡＩ−Ｔ
６）もしくは上記２つの置換を有する配列（ａｐｏＡＩ
−Ｔ６／ＭＩ）を示す］で示されるタンパク質。 【００３８】２． 担体ペプチド配列が、-Thr-Met-Ile
-Thr-Pro-Ser-Phe-Asp-Gly-Ser-Met-又は-Thr-Met-Ile-
Thr-Asn-Ser-Arg-Gly-Ser-Metである、上記タンパク
質。 【００３９】３． アミノ酸配列Met-Thr-Met-Ile-Thr-
Pro-Ser-Phe-Asp-Gly-Ser-Met が、ａｐｏＡＩ、ａｐｏ
ＡＩ−Ｔ６、ａｐｏＡＩ−ＭＩ及びａｐｏＡＩ−Ｔ６／
ＭＩから選択されたアポリポタンパク質に融合してい
る、上記のタンパク質。 【００４０】４． アミノ酸配列 Met-Thr-Met-Ile-Thr
-Asn-Ser-Arg-Gly-Ser-Metが、ａｐｏＡＩ、ａｐｏＡＩ
−Ｔ６、ａｐｏＡＩ−ＭＩ及びａｐｏＡＩ−Ｔ６／ＭＩ
から選択されたアポリポタンパク質に融合している、上
記タンパク質。 【００４１】５． Met-プロ apoAIである、上記タンパ
ク質。 【００４２】６． 抗ヒトａｐｏＡＩ抗血清を用いたＥ
ＬＩＳＡによって検出可能であり、式（１） Ｍｅｔ−Ｘ−Ｙ （１） ［式中、Ｘはβ−ガラクトシダーゼの最初の15個以内の
Ｎ末端アミノ酸に由来する配列を有する担体ペプチド配
列又はヒトａｐｏＡＩのプロ配列であり、Ｙはヒトａｐ
ｏＡＩ配列か又は、ヒトａｐｏＡＩ配列中 173位のＡｒ
ｇがＣｙｓで置換された配列（ａｐｏＡＩ−ＭＩ）、６
位のＳｅｒがＴｈｒで置換された配列（ａｐｏＡＩ−Ｔ
６）もしくは上記２つの置換を有する配列（ａｐｏＡＩ
−Ｔ６／ＭＩ）を示す］で示されるタンパク質の製造方
法であって、（ｉ）前記タンパク質を発現させ得る発現
ベクターで形質転換した細菌宿主を培養し、（ii）得ら
れたタンパク質を回収する、ことを特徴とする方法。 【００４３】７． 担体ペプチド配列が、-Thr-Met-Ile
-Thr-Pro-Ser-Phe-Asp-Gly-Ser-Met又は-Thr-Met-Ile-T
hr-Asn-Ser-Arg-Gly-Ser-Met- である、上記方法。 【００４４】８． そのプラスミドのβ−ガラクトシダ
ーゼ遺伝子のα−ペプチドの９番目のアミノ酸のコドン
の直後のＢａｍＨＩ部位にａｐｏＡＩ、ａｐｏＡＩ−Ｔ
６、ａｐｏＡＩ−ＭＩ又はａｐｏＡＩ−Ｔ６／ＭＩをコ
ードする遺伝子をもつプラスミドｐＵＣ８で形質転換さ
れた宿主を培養することによって、式中のＸが -Thr-Me
t-Ile-Thr-Pro-Ser-Phe-Asp-Gly-Ser-Met-である式
（１）のタンパク質が得られる、上記方法。 【００４５】９． そのプラスミドの翻訳開始コドンの
直後の配列 -Thr-Met-Ile-Thr-Asn-Ser-Arg-Gly-Ser-Me
t-のコドンの直後にａｐｏＡＩ、ａｐｏＡＩ−Ｔ６、ａ
ｐｏＡＩ−ＭＩ又はａｐｏＡＩ−Ｔ６／ＭＩをコードす
る遺伝子をもつプラスミドｐＵＣ９で形質転換された宿
主を培養することによって、式中のＸが -Thr-Met-Ile-
Thr-Asn-Ser-Arg-Gly-Ser-Met-である式（１）のタンパ
ク質が得られる、上記方法。 【００４６】10． ＸがヒトａｐｏＡＩのプロ配列であ
る式（１）のタンパク質が、ｔｒｐプロモーターの調節
下でプラスミドから発現される、上記方法。 【００４７】 【実施例】本発明を以下の実施例でさらに具体的に説明
する。 【００４８】実施例１ 材料及び方法 菌株及び培地 菌株: 大腸菌K12JM101(Messing等、Nature、314:309-32
1 、1981) 、MC1061（Casadaban and Cohen 、J. Mol.
Biol. 138:179-207 、1980）、71/18cI857（Lorenzetti
等、Gene、39: 85-87 、1985) 、RL841(Kenkel、Proc.
Natl. Acad. Sci. USA、82:488-492、1985) 、CAG629
（rpoH165 、lon-;C. A. Gross、Madison、 Wisconsi
n）。 【００４９】培地: 全部の菌株を必要に応じて50mg／ml
のアンピシリンを加えたLB培地(LA培地) で増殖させ
た。適当な場合にはlac プロモーターを抑制解除するた
めに1mM のIPTGを培地に添加した。 【００５０】酵素、酵素反応及びDNA 精製 リゾチームはSigma(St. Louis 、MO、USA)から入手。制
限エンドヌクレアーゼはBoehringer(Mannheim 、DE) 、
BRL Inc. (Gaithersburg、MD、USA) またはNewEngland B
iolabs(Beverly 、MA、USA)から入手。T4リガーゼ及び
その他の全部の酵素はBoehringerから入手。特に注釈が
なければすべての酵素反応は酵素を製造業者の指示通り
に使用して行なった。制限エンドヌクレアーゼ分解によ
って得られたDNA フラグメントをアガロース水平ゲルま
たはポリアクリルアミド垂直ゲルを用いた電気泳動によ
って分離し、ISCO Mod. 1750濃縮器（ISCO CO.、Lincol
n、NE、 USA）を使用し電気溶出法の修正方法でゲルマ
トリクスから抽出し、更にElutip-dカラム（Schleicher
and Schuell、Keene 、NH、USA)で精製した。 【００５１】細菌抽出物中のapoAＩ認識のためのエンザ
イムイムノアッセイ(ELISA) ペレット化した細胞を溶菌緩衝液（50mMのTris-Cl pH7.
0 、30mMのNaCl、 0.1％の NaN3 、10mg／l のフェニル
メチルスルホニルフルオリド) に再懸濁させた。溶液を
リゾチームで1 mg／mlにし、 4℃で30分間攪拌した。5
回の凍結乾燥サイクル後に抽出物を以下のごときエンザ
イムイムノアッセイで試験した。 【００５２】標準96ウェルのマイクロタイタープレート
を、ヒツジで感作した適当な希釈度の抗ヒトapoAＩ抗血
清で 4℃で1 晩被覆した（Boehringer、Mannheim、D
E）。0.05％のTween-20と0.01％のMerthiolate とを含
む10mMのTris-Cl pH8.0 で3 回洗浄後、50μl の系列希
釈度の標準apoAＩ（TAGO Corp.、Bur-lingame、CA、 US
A）または細菌抽出物を添加し、37℃で1 時間インキュ
ベートした。同じ緩衝液で3回洗浄後、50μl の適当な
希釈度のウサギ抗ヒトapoAＩ抗血清(Immuno Ltd.、Dunt
on Green、Nr. Sevenoaks 、Kent、GB) を添加し、硫酸
アンモニウム沈殿によって更に精製した。37℃で1 時間
維持し、更に3 回洗浄後に、New England Nuclear(Bost
on、MA、USA)から提供されるプロテインA-西洋ワサビペ
ルオキシダーゼキットを製造業者の指示通りに用いてウ
ェルを染色した。 【００５３】Affigel 10に対するヒツジ抗ヒトapoAＩの
結合 ヒツジ抗apoAＩ抗体（Boehringer、Manneheim 、DE）の
調製:20 mlの非希釈抗体溶液を不断に攪拌しながら0.1M
リン酸緩衝液pH7 に 4℃で1 晩透析した。次に遠心して
破片と上清とを分離した。 【００５４】Affigel 10(Bio-Rad、Richmond、CA) の調
製:1/2容のイソプロピルアルコールと倍容の蒸留水とを
順次用いた洗浄サイクルの繰り返し(4〜5 回) を行なう
前に40mlを室温で平衡させた。濾過によってゲルを乾燥
させ、50mlのfalcon管に移し透析抗体を加えた。次に管
を絶えず攪拌しながら 4℃で8 時間インキュベートし、
1 mlの1Mのグリシンエチルエステルを添加し、インキュ
ベーションを1 晩継続した。次に以下の溶液でゲルをお
おまかに洗浄した。 【００５５】−100 mlのPBS ＋ 0.1％ナトリウムアジド −100 mlの1M酢酸 −100 mlの0.1Mリン酸緩衝液 pH7＋0.5MのNaCl −100 mlのPBS ＋ 0.1％ナトリウムアジド ゲルをカラムに詰めローディングバッファ(PBS＋10mg／
l のPMSF＋10mg／l のPepstatin A)で平衡させた。 【００５６】イムノブロット分析 Laemmli 法を使用し標本を（適当な濃度で）ポリアクリ
ルアミド平板ゲルに流した。次にtransblot 装置(Bio-R
ad) を25mMのTris塩基、192mM のグリシン、20％のメタ
ノール中で0.2Aで 4℃で4 時間使用しゲルをニトロセル
ロースフィルターに移した。ゲルを受容したフィルター
を蒸留水で洗浄し、次に PBS＋ 3％BSAと共に穏やかに
攪拌しながら1 時間インキュベートした。フィルターを
蒸留水で再度洗浄し、PBS で1:250 に希釈した第１抗体
（ELISA で第２抗体として使用されるものと同じ）と共
に室温で1 時間インキュベートした。PBS 及び PBS＋0.
05％Tween20 で2 回洗浄後、1:7500に希釈した第２抗体
（西洋ワサビペルオキシダーゼと結合したヤギで感作し
た抗ウサギ IgG;Bio-Rad）と共にフィルターを室温で1
時間インキュベートした。更に２回洗浄後、フィルター
を4-クロロ-1- ナフトールで染色した。 【００５７】結果 apoAＩ遺伝子の5'端復元 apoAＩをコードする完全cDNAクローン(pＡＩ/A) は、シ
グナルペプチドとプロペプチドと完全成熟apoAＩタンパ
ク質とのコード配列をもつヒト肝臓cDNAライブラリイか
ら得られた（Sharpe等、Nucl. Acids Res.、12:3917-39
32）。成熟apoAＩの最初のコドンの上流配列全部が除去
されるように遺伝子の5'端を復元した。このために、プ
ラスミドpAＩ/AをEcoRＩ及びBamHＩで分解し、cDNAイン
サートを含む890bp のフラグメントを単離し、 1％アガ
ロースゲルから回収した。フラグメントを部分分解条件
下にSau3ＡＩで制限し、混合物を成熟タンパク質の最初
の9 個のアミノ酸のコード配列を復元するように設計さ
れたリン酸化合成アダプターに結合し、大腸菌における
コドン使用に従って最適な配列を得た。アダプターは以
下の手順で調製した。ホスホトリエステル法(Crea and
Horn、Nucl. AcidsRes.、8:2231- 2348、1980) によっ
て４つのオリゴヌクレオチドを合成した。 【００５８】１．5'-GATCCATGGACGAGCC-3' 2.5'-ACCGCAGAGTCCATGG-3' ３．5'-CGGTGGCTCGTCCATG-3' ４．5'-GATCCCATGGACTCTG-3' 等モル量の４つのオリゴヌクレオチド全部を一緒に結合
し、結合混合物をSau3ＡＩで処理し、アダプターを溶出
し、ポリアクリルアミドゲルから精製した。得られたア
ダプターの配列を図２に示す。 【００５９】精製アダプターと部分Sau3ＡＩ切断apoAＩ
フラグメントとを含む結合混合物をBamHＩで分解した。
790bp のフラグメントをポリアクリルアミドゲルから精
製し、仔ウシ腸ホスファターゼで処理したBamHＩ切断pA
T153-PvuII8 に結合した。MC1061の形質転換後、リン酸
化したオリゴヌクレオチド３をプローブとしたハイブリ
ダイゼーションによって組換え体をスクリーニングし
た。陽性コロニーを単離し、更に制限酵素分解によって
特性決定し、 Maxam and Gilbert（Methods Enzymol.、
65:499-560、1980）に従って部分化学分解した。正しい
方向付けのアダプターを含むプラスミドをpAＩ/12 と命
名した。 【００６０】このような復元後にはATG 開始コドンとBa
mHＩ付着端とがapoAＩ遺伝子の5'端の前に存在してい
た。この戦略を用い、成熟apoAＩコード配列をShine-Da
lgarno配列の後にBamHＩ部位を担う任意の発現ベクター
に移動させ得る。 【００６１】pFCE4+を使用した組換えベクターの構築 修飾apoAＩ遺伝子を含むBamHＩフラグメントを精製し、
pFCE4+(Lorenzetti 等、1985) のBamHＩ部位にサブクロ
ーニングした。得られた構築物が正しい方向付けのイン
サートを含むことをジデオキシチェーンターミネーショ
ン配列決定（図３のＡ）によって確認した。このプラス
ミドをpLS66 と命名した。 【００６２】この戦略を用い、ベクター中に既に存在す
るATG 開始コドンに対して枠外(outof frame)にapoAＩ
遺伝子を挿入した。従って次の段階ではapoAＩ遺伝子を
このATG 開始コドンの直後に配置することによって読取
枠を復元する。 【００６３】枠内配置 pFCE4 系を使用し、欠失させるべき領域の両端の塩基延
長部に相補的な配列をもつ「ブリッジ」オリゴヌクレオ
チドを使用してクローン遺伝子の枠内配置を行なうこと
が可能である（Sollazzo等、Gene、37:199-206、198
5）。 【００６４】このために、ホスホトリエステル法を使用
し以下の配列をもつ単鎖オリゴヌクレオチドを合成し
た。 【００６５】5'-CTTACATATGGACGAGCC-3' このオリゴヌクレオチドはその5'端でベクターの ATG
（ヌクレオチド 1〜10）を含む直前領域にアニーリング
し、その3'端でapoAＩ遺伝子の最初の8 個のヌクレオチ
ドにアニーリングし、その結果pLS66 に存在する余分な
8 つのヌクレオチドを鎖から除外する(loop out)。pLS6
6 のssDNA は大腸菌RL841 を宿主として（Kunkel、Pro
c. Natl. Acad. Sci. USA、82:488-492に記載のごと
く）調製した。この細菌株はpFCE4 中に存在するPLプロ
モーターの温度感受性リプレッサーを産生するプラスミ
ドpCI857(M. Zabeau) を含む大腸菌RZ1032の誘導体であ
る。 【００６６】このプロトコルを使用してこの菌株から産
生されたssDNA はチミンに置換したウラシル残基を数個
含み、従って「in vitro」で正常な機能鋳型として作用
するが、これらのプラスミドの正常宿主である野性型(u
ng+)大腸菌71/18cI857の形質転換に使用されたときは生
物学的に活性でない。 【００６７】15mMのTris-Cl pH8.5 及び15mMのMgCl2 中
で0.1 ピコモルのpLS66 ssDNA を2ピコモルのキナーゼ
化した突然変異オリゴヌクレオチド（20倍過剰）と56℃
で30分間アニーリングした。室温に冷却後、延長−結合
混合物を添加し反応を15℃で1 晩継続させた。延長反応
混合物は以下のごとく調製した（最終濃度）。10mMのTr
is-Cl pH8.5;10mMのMgCl2 ；0.5mM のATP;0.05mMのdNTP
s;5mM のDTT;1 単位のDNA ポリメラーゼ、Klenowフラグ
メント及び1.5 単位のT4 DNAリガーゼ。 【００６８】インキュベーション後に反応混合物をフェ
ノール抽出し、イソプロパノール及びエタノールで沈殿
させた。71/18cI857コンピテント細胞を形質転換し、選
択培地LAにプレートした。所望の欠失を含むクローンを
同定するために150 のコロニーを採取し、定序プレート
で増殖させニトロセルロースフィルターに移した。突然
変異オリゴヌクレオチドをプローブとして使用し 6×SS
C 及び10×Denhardt's中で室温でハイブリダイゼーショ
ンを行なった。次に 6×SSC 及び 0.1％SDS 中で異なる
2 つの温度でフィルターを洗浄した。最初の温度はハイ
ブリダイゼーション効率を検査するために室温であり、
次の温度は理論的融解温度より 4℃低い50℃である。こ
れは式Tm＝4 ×GC＋2 ×AT［式中、Gc及びATは突然変異
鋳型とオリゴヌクレオチドとによって形成された対合の
数である(Norrander等、Gene、26:101-106、1983) によ
って計算した。毎回の洗浄後にフィルターをX 線感受性
フィルムに露光した。ストリンジェントな温度でも陽性
シグナルを生じる有望な突然変異コロニーをジデオキシ
チェーンターミネーション配列決定（図３のＢ）によっ
て確認した。このプロトコルの効率はかなり高く約50％
である。apoAＩ遺伝子が正しく枠内配置されたpFCE4+を
pML11-20と命名した。 【００６９】apoAＩ変異体T6及び MＩの構築 ２つの変異体apoAＩ-T6 及びapoAＩ-MＩを構築するため
にpLS66 及びpML11-20を鋳型として使用した。転移BamH
Ｉフラグメント内に正しく枠内配置された変異体遺伝子
を同時に得るために双方の鋳型を使用したのである。 【００７０】このために、常用のプロトコルによって２
つの単鎖オリゴヌクレオチドを合成した。 【００７１】１． T6 突然変異のために 5'-CACCGCAGAC
TCCATGG-3' ２． MＩ突然変異のために 5'-GCGCCAGTGCTTGGC-3' オリゴヌクレオチド１は成熟apoAＩの第1 コドンの第1
ヌクレオチドを示す。オリゴヌクレオチド１は17位に不
適正(G対C)を伴って残基 8〜24にアニーリングする。オ
リゴヌクレオチド２は517 位に不適正(C対T)を伴って残
基 510〜524 にアニーリングする。 【００７２】枠内配置と同じプロトコルで突然変異誘発
実験を行なった（図４のＡ及びＢ）。重複突然変異体(d
ouble mutant) を得るためにまずT6突然変異を誘発し次
にMＩ突然変異を追加した。 【００７３】得られたプラスミドを以下のごとく命名し
た。 【００７４】pIL-5 ＝2 つのBamHＩ部位間のapoAＩ-T6
； pIL-5 Ｉ＝2 つのBamHＩ部位間のapoAＩ-MＩ； pIL5-6Ｉ＝2 つのBamHＩ部位間のapoAＩ- T6/MＩ； pIL8-6＝枠内のapoAＩ-T6 ； pIL8- Ｉ＝枠内のapoAＩ-MＩ； pIL8-6Ｉ＝枠内のapoAＩ-T6/M Ｉ。 【００７５】変異体apoAＩ-RP5及び IP1の構築 apoAＩ遺伝子及びその変異体T6及び MＩを含むDNA フラ
グメントをBamHＩ分解によってプラスミドpLS66 、pIL5
-6、 pIL5-Ｉ及びpIL5-6から切除し、記載のごとく 1％
アガロースゲルで精製した。次にフラグメントをpUC8及
びpUC9(Vi-eiraand Messing、Gene、19:259-268、1982)
に結合し、双方をBamHＩで直線化した。JM101 コンピ
テント細胞の形質転換後、組換えプラスミドを高速破壊
法で同定し、単離物をBamHＩで切断することによって確
認した。HindIII 及びXho Ｉで切断することによってイ
ンサートの対向する２つの方向(orientation) を識別し
た。 【００７６】pUC8を用いた構築物は、メチオニン残基と
細菌β- ガラクトシダーゼ遺伝子に由来のα- ペプチド
の最初の9 個のアミノ酸とがその直前に存在する既に枠
内配置されたapoAＩ遺伝子を含んでいた。その結果、β
- ガラクトシダーゼのapoAＩ分子のN-末端に10個のアミ
ノ酸から成る延長部が存在した。 【００７７】apoAＩ遺伝子を正しい方向付けで含むすべ
ての組換えpUC9誘導体では、更にapoAＩ遺伝子を枠内配
置する操作が必要であった。まずATG 翻訳開始とapoAＩ
遺伝子との間を制限酵素HindIII 及び SalＩで切断し
た。切断によって生じた付着端をDNA ポリメラーゼ（Kl
enowフラグメント）で埋め戻し、T4 DNAリガーゼで再結
合した。この結果、apoAＩ遺伝子の前方のpUC9の多重(m
ultiple)クローニング部位で10個のヌクレオチドが欠失
し、正しい読取枠が復元された。 【００７８】組換えプラスミドを以下のごとく命名し
た。 【００７９】(a) pUC8 系列 pIPI ＝apoAＩ-IPI； pIPI-6＝apoAＩ-IPI/T6 ； pIPI- Ｉ＝apoAＩ-IPI/MＩ； pIPI-6Ｉ＝apoAＩ-IPI/T6/M Ｉ。 【００８０】(b) pUC9 系列 pRP5 ＝apoAＩ-RP5； pRP5-6＝apoAＩ-RP5/T6 ； pRP5- Ｉ＝apoAＩ-RP5/MＩ； pRP-6 Ｉ＝apoAＩ- RP5/T6/MＩ。 【００８１】延長変異体を形成した理由は、プラスミド
中に存在する調節要素の後に天然の配列たる細菌β- ガ
ラクトシダーゼのN-末端が存在することによって発現レ
ベルが向上するからである。 【００８２】大腸菌株における発現 (1) （「枠内配置」の項で既に説明した）プラスミドpC
I856を担う細菌宿主CAG629をすべての組換えpFCE4 誘導
体で形質転換させた。 【００８３】32℃で1 晩増殖させた培養物をLAで1:10に
希釈し、震盪フラスコ中でOD650 0.5〜0.6 まで増殖さ
せ、次に温度を42℃に上昇させてインキュベーションを
1〜2 時間継続した。誘発後、細胞を10分間氷冷し遠心
によってペレット化した。次にペレットを「ELISA 」の
項で記載のごとく処理して細胞を破壊した。細胞抽出物
を16,000rpm で 4℃で30分間遠心し、上清を「材料及び
方法」の項に記載のごとくアフィニティカラムに通し
た。保持されたタンパク質をおおまかに洗浄し、1Mの酢
酸で溶出させた。溶出分画をイムノブロット分析（図
５）及び「ELISA 」によって検定した。pML11-20で得ら
れた予備結果を平均すると培養物1l当たり約0.2 mgのap
oAＩが存在した。 【００８４】突然変異体apoAＩ-T6 、apoAＩ-MＩ及びap
oAＩ- T6/MＩを担う他のすべての構築物に関しても同様
の結果が得られた。 【００８５】(2) すべての組換えpUC8/9誘導体で細菌宿
主MC1061を形質転換させた。 【００８６】37℃で1 晩増殖させた培養物をLAで1:100
に希釈し、震盪フラスコで1 時間増殖させてから1mM の
IPTGを添加し、次に更に 4〜6 時間インキュベーション
を継続した。このインキュベーション後、細胞を10分間
氷冷し遠心によってペレット化した。この段階以後はpF
CE4 誘導体で記載した手順と同じ抽出手順で処理した。
pIPI及びpRP5を含む細胞の粗抽出物をイムノブロット分
析（図６）及び「ELISA 」によって検定した。予備結果
を平均すると培養物1l当たり10mgのapoAＩが得られた。 【００８７】apoAＩ-PR5及びapoAＩ-IPIに組み込まれた
突然変異体apoAＩ-T6 、apoAＩ-MＩ及びapoAＩ- T6/MＩ
を担う他のすべての構築物に関しても同様の結果が得ら
れた。 【００８８】実施例２ apoAＩ遺伝子を担う949bp のフラグメントが SmaＩ部位
に挿入されているベクターpRIT2T(Pharmacia、Sweden)
を使用して別の変異体を構築した。このプラスミドによ
って発現されたタンパク質は541 個のアミノ酸から構成
されていた。これらはN-末端から順にλファージのCRO
タンパク質の最初の11個のアミノ酸とブドウ球菌プロテ
インA の配列の248 個のアミノ酸（残基23〜270 ）と5
つの異常なアミノ酸(Pro-Gly-Asp-Ser-Thr) と大腸菌の
β- ガラクトシダーゼの最終17個のアミノ酸とタンパク
質分解酵素エンテロキナーゼの認識配列を含む17個のア
ミノ酸Gly-Asp-Pro-Glu-Phe-Val-Asp-Asp-Asp-Asp--Lys
-Ser-Ser-Arg-Gly-Ser-Metとを含み、これらは成熟ヒト
apoAＩ(CPA-AＩと命名) またはその変異体apoAＩ-T6 、
apoAＩ-MＩ、apoAＩ- T6/MＩの配列の直前に存在した。
これらのキメラタンパク質は安定でありまた水溶液に可
溶である。 【００８９】CPA-A Ｉとラット肝細胞及び培養マウスマ
クロファージとの相互作用を試験した。 125Ｉ標識CPA-
A Ｉを培養細胞と共に 4℃でインキュベートするとハイ
ブリッドタンパク質がHDL に対する場合と同様の結合パ
ラメータで細胞表面に結合することが判明した。ハイブ
リッドタンパク質は37℃で細胞に吸収され内在化(inter
nalize) することが判明した。この挙動は脂質と会合し
てHDL 粒子を形成するときの天然apoAＩの挙動に類似す
る。 【００９０】材料及び方法 材料 ヒト血漿から不連続KBr 勾配の上でHDL(1.09＜d ＜1.21
g/ml) を調製した。HDL をPBS 、1mM のEDTAにおおまか
に透析しKBr を除去して 4℃で保存した。Klausner等
（J. Biol. Chem.、258 、4715-4724 、1983）の方法で
ヒトトランスフェリン(Sigma) に鉄を充填した。BSA は
実質的にIgG 非含有であった(Sigma、A 7638) 。Staphy
lococcus aureus プロテインA はPharmacia から入手し
た。フェノールレッドを含有するHank's平衡塩溶液はGi
bco から入手した。 【００９１】細胞及び細胞培養物 Fao 細胞としては、Deschatrette and Weiss（Biochemi
e 56、1603-1611 、1974）によって樹立され特性決定さ
れたラット肝癌細胞系を、 5％ウシ胎児血清(FCS) と10
0 単位／mlのペニシリンと100 μg/mlのストレプトマイ
シンと2mM のグルタミンと10mMのHEPES 緩衝液pH7.4 と
を加えたCoon改質Ham 培地(Seromed) で単層培養したも
のを用いた。 【００９２】J774細胞としては、マウスマクロファージ
細胞系（Ralph 等、J. Immunology114、898-905 、197
5）を 4.5％のFCS とペニシリンとストレプトマイシン
とグルタミンとHEPES 緩衝液pH7.4 とを後述の濃度で含
むDMEM培地で遠心懸濁培養したものを用いた。 【００９３】細菌株及びプラスミド 細菌宿主は大腸菌HB101 株（Boyer and Roulland-Dusso
ix、J. Mol. Biol. 41、459-472 、1969）及び RR1 M15
（Langley 等、Proc. Natl. Acad. Sci. USA72、1254-1
257 、1975）。プラスミドは pNF2690（Nilsson 等、EM
BO J. 4、1075-1080 、1985）、pLM3（Monaco等、Atti
Convegno Congiunto A.G.I.-S.I.B.B.M.、195-196 、
1985）及び Pharmacia、SwedenのpRIT2Tを使用した。 【００９４】DNA 構築物 制限酵素、Klenow DNAポリメラーゼ及びT4 DNAリガーゼ
はBoehringer Mannheim から購入し製造業者の指示通り
に使用した。大腸菌の形質転換はMorrisonの方法（Meth
ods Enzymol. 68、326-331 、1979）で行なった。 【００９５】ハイブリッド遺伝子の発現 ハイブリッド遺伝子はλPRプロモーターのコントロール
下に実質的に Zabeauand Stanley の方法（EMBO J. 1
、1217-1224 、1982）で発現させた。細菌を30℃でOD
600 ＝0.9 まで増殖させた。54℃に予熱した等容のブイ
ヨンを添加して温度を急激に42℃に上げた。採取以前に
培養物を42℃で90分間インキュベートした。細胞溶解物
全部をZabeauとStanley(1982) に記載のごとくゲルに充
填した。 【００９６】ハイブリッドタンパク質の精製 ハイブリッドタンパク質の精製には Marston等（Biotec
h-nology 2、800-804、1984) の方法を用いた。細菌ペ
レットを3 倍容(w/v) の緩衝液 A（50mMのTris/HCl pH
8.0、50mMのNaCl、1mM のEDTA）に再懸濁させ、氷上で
5×20sec 超音波処理した。遠心後(Sorvall SS34 ロー
タ、10,000rpm 、 4℃で10分間) 、ペレットを 0.5％の
Triton X-100と10mMのEDTAとを含む9 倍容(w/v) の緩衝
液A に再懸濁させ、室温で 5分間静置した。懸濁液を上
記のごとく遠心し、ペレットを8M尿素を含む9 倍容(w/
v) の緩衝液A に再懸濁させ、室温で1 時間インキュベ
ートした。 【００９７】尿素懸濁液を9 倍容(v/v) の50mMのリン酸
カルシウム緩衝液 pH10.7 、50mMのNaCl、1mM のEDTAに
添加し、KOH の添加によってpH10.7を維持しつつ室温で
30分間攪拌した。次に懸濁液を中和し、 4℃で緩衝液A
に透析した。透析した懸濁液を上記のごとく遠心した。
透明上清中のハイブリッドタンパク質は既に適度に純粋
であり、この段階のハイブリッドタンパク質の平均収量
は細菌培養物1l当たり50〜60mgであった。IgG-Sepharos
e 6 FF(Pharmacia) を用いたアフィニティクロマトグラ
フィーによって更に精製した。標本をカラムに充填し、
0.05％Tween20含有のPBS 、PBS 及び5mM の AcONH4 pH5
を順次用いて洗浄し、1MのAcOH/AcONH4 pH2.8 で溶出
した。精製タンパク質を緩衝液A に透析した。 【００９８】Biogel 1.5A ゲル濾過カラムを用いた較正 BioRadのBiogel 1.5A カラム（40cm×1cm ）を50mMのTr
is／HCl pH8.0 、50mMのNaCl、1mM のEDTA中で平衡させ
た。標本を流速3 ml／時で溶出させ、250 mlの分画を回
収した。カラムをデキストランブルー(2,000kD) 、チロ
グロブリン(699kD) 、フェリチン(440kD) 、HDL(285kD)
及びアルドラーゼ(158kD) で較正した。1.25μg の [
125Ｉ]- CPA-AＩまたは800 μg の非標識CPA-A Ｉを使
用してハイブリッドタンパク質の分子量を決定した。 【００９９】タンパク質のヨウ素化 Iodo-Gen試薬(Pierce Chemical Co.) を使用してタンパ
ク質をヨウ素化した。ヨウ素化反応は100 μg のIodo-G
en、200 μl のPBS 中の1 mgのタンパク質、1mCiの無担
体 Na[ 125I]、16.5mCi/μg(Amersham International)
を含んだ。4 ℃に10分間維持後10mlのSephadex G50カラ
ムで遊離ヨウ素をタンパク質から分離した。 PBS(0.2％
BSA)でカラムからHDL 、トランスフェリン及びIgG を溶
出し、50mMのTris/HCl pH8.0、0.15M のNaCl、1mM のED
TA、 0.2％のBSA でハイブリッドタンパク質を溶出し
た。ハイブリッドタンパク質、IgG 及びトランスフェリ
ンは透析しないで使用した。HDL は、標識の 5％未満が
10％(w/v) トリクロロ酢酸に可溶になるまでPBS 、0.5m
M のEDTAにおおまかに透析する必要があった。クロロホ
ルム／メタノールを用いた脂質抽出後の測定によれば、
5％未満の標識が脂質と結合した。得られた特異的活性
はタンパク質1ng 当たり 200〜400cpmであった。 【０１００】結合アッセイ 懸濁細胞に対して 4℃で2 時間の結合アッセイを行なっ
た。Fao 細胞の懸濁液を得るために、単層をPBS 、1mM
のEDTAで37℃で30分間インキュベートした。これらの細
胞または懸濁液で増殖させたJ774マクロファージを 4℃
で1000g ×5 分間ペレット化し3 mlのHanks/BSA に再懸
濁させることによって3 回洗浄した。各結合アッセイ
は、1 mlのHanks/BSA 中に 1×106 細胞と指標量の [
125I]-apoA-Ｉ-PA または [ 125I]-HDLとを含有してい
た。 4℃で2 時間維持後、細胞をHanks/BSA で4 回洗浄
し、Eppendorf 管に移し、γカウンタで放射能を測定し
た。競合実験として10μg のヨウ素化リガンドを10〜80
0 μg の非標識HDL 、CPA-A Ｉ、プロテインA またはト
ランスフェリンによって競合させた。これらは夫々ヨウ
素化リガンドの添加30分前に 4℃で細胞に添加した。 【０１０１】HDL 及びCPA-A Ｉのリガンドブロット J774細胞(2×108 ) をPBS で2 回洗浄し、10mMのTris/H
Cl pH7.4、0.1mM のEDTA中で均質化した。2000g で10分
間遠心してポスト核上清(PNS) を調製した。PNS を 1％
(v/v)Triton X-114(Bordier 、J. Biol. Chem.、256 、
1604-1607 、1981) で抽出した。洗剤相をジチオトレイ
トール含有の等容の標本緩衝液と混合し、沸騰させ、次
にヨードアセトアミドでアルキル化した。レーン当たり
約1 mgのタンパク質を 5〜15％のSDS ポリアクリルアミ
ドゲルに塗布した。ゲルをニトロセルロースフィルター
にブロットし、Ponceau S 染色によってバンドを可視化
した。10％(w/v) の低脂肪粉乳を含有するHanks 中でニ
トロセルロースストリップを6 時間消光(quench)させ
た。リガンド、即ち [ 125I]-CPA-AＩまたは [ 125I]-H
DLを12.5μg/mlで Hanks／乳に16時間結合した。次にHa
nks/乳でストリップを4 回洗浄し、ヒトHDL 、 CPA-AＩ
またはプロテインA(血清で1/50に希釈) に対するウサギ
抗血清でリガンドを検出し、ジアミノベンジジン反応(B
ur-nette、Anal. Biochem.、112 、195-203 、1981) で
検出される抗ウサギIgG ペルオキシダーゼの存在下にイ
ンキュベートした。乾燥ブロットをX 線フィルムに露光
した。 【０１０２】分析方法 Frank and Trosin(H.Tschesce 編:Modern Methods inPr
otein Chemistry 、Walter de Gruyter & Co. 、Berli
n、287-302 、1985) に記載の構造の気- 液相マイクロ
シーケンサにおいてLottspeich（Hoppe Seyler's Z. Ph
ysiol. Chem.、361 、1829-1834 、1980）に従って全自
動化Edman 分解によってアミノ末端の配列決定を行なっ
た。ハイブリッドタンパク質のカルボキシ末端配列を決
定するために、カルボキシペプチダーゼ、ε、A 及び／
またはB をTadros等（Eur. J. Biochem.、138 、209-21
2 、1983）の方法で使用した。アミノ酸分析のためにタ
ンパク質をTadros等（Eur. J. Biochem.、127 、315-31
8 、1982）の方法で加水分解し、全自動アミノ酸アナラ
イザー(Durrum D-500)を使用してアミノ酸組成を決定し
た。トリプトファン及びシステインは決定しなかった。 【０１０３】鏡検のために2 ％ホスホタングステン酸を
使用しHDL 及び CPA-AＩの標本をネガティブ染色した。
Bradfordの方法（Anal. Biochem.、72、248-254 、197
6）でタンパク質濃度を検定した。 【０１０４】結果 ハイブリッドタンパク質 CPA-AＩをコードする遺伝子を
担うプラスミドpLM8の構築 ベクターpRIT2Tは大腸菌中で細胞内タンパク質を温度誘
発的に発現させるべく設計されたpRIT2 の誘導体である
(Nilsson等、1985) 。構築物はλPRプロモーターのコン
トロール下にブドウ球菌プロテインA のIgG 結合ドメイ
ンを含む。多重クローニング部位はプロテインA の3'端
に外来遺伝子を容易に挿入せしめる。プロテインA 転写
終了配列は多重クローニング部位の直ぐ下流に挿入され
る。プラスミドpLM3はヒトapoAＩの成熟遺伝子に枠内融
合した大腸菌lacZ遺伝子を含む(Monaco 等、1985) 。 【０１０５】PAとapoAＩとの融合を担うプラスミドpLM8
を図７の手順で構築した。制限部位EcoRＩ及びCla Ｉを
末端にもつ949 bpのフラグメントをpLM3から単離し、Kl
enowDNAポリメラーゼによって埋め戻した。フラグメン
トの突出端を SmaＩ直線化pRIT2Tに結合させた。得られ
たプラスミドpLM8はタンパク質分解性切断の特異的配列
によって隔てられた5'端のプロテインA の遺伝子と3'端
の成熟ヒトapoAＩ遺伝子とから構成された541 個のアミ
ノ酸から成る融合タンパク質をコードする読取枠を保有
する。 【０１０６】ハイブリッドタンパク質の発現、単離及び
精製 温度感受性CI857 λリプレッサー突然変異体をコードす
る適合プラスミドpNF2690 の存在下にpLM8を保有する大
腸菌細胞は大量のハイブリッドタンパク質を発現するこ
とが可能であった。42℃で増殖させると誘発 CPA-AＩの
量が総量の約20％を示した。ハイブリッドタンパク質の
見掛け分子量は予想通りSDA-PAGEで62kDであった。標準
抽出方法（超音波、凍結乾燥、リゾチーム−Triton X-1
00）では成功しなかった。8M尿素中での超音波処理細菌
のインキュベーションとアルカリ緩衝液の添加とを順次
に含む変性手順を採用した。中和及び透析によって再生
後、懸濁液を遠心すると、透明上清は90％を上回る純度
の融合タンパク質をを含有していた。IgG Sepharose に
よるアフィニティクロマトグラフィーによって更に精製
した。 【０１０７】ハイブリッドタンパク質の特性決定 ハイブリッドタンパク質をヒツジで調製した特異的apoA
Ｉ抗体による認識によって同定した。プロテインA はヒ
ツジ抗体を認識しない。 【０１０８】最初の8 個のアミノ酸から成るアミノ末端
配列と最終3 個のアミノ酸から成るカルボキシ末端配列
とは既知のapoAＩ及びプロテインA の配列と一致した。
またアミノ酸組成分析も予想組成と一致した。 【０１０９】細胞表面に対するハイブリッドタンパク質
の結合を定量するために（後記参照）、天然の分子量を
決定することが必要であった。これは、Biogle 1.5A を
使用するゲル濾過によって行なった。カラム溶出のピー
ク分画は分子量316kD を与え、これは単量体の分子量62
kDの5 倍に相当した。ハイブリッドタンパク質溶出のプ
ロフィール(profile) は、別の多量体も存在しまたボイ
ド容量(void volume)に少量の凝集物質が存在すること
を示した。すべての実験において天然分子量として平均
サイズ316kD を使用した。これを同じカラムで標準とし
て使用したHDLの285kD に比較した。ヨウ素化ハイブリ
ッドタンパク質の溶出分布は非標識ハイブリッドタンパ
ク質で得られたものと同様であった。 【０１１０】電子顕微鏡によるネガティブ染色後にHDL
及びハイブリッドタンパク質粒子を試験した。顕微鏡写
真は、直径 9〜12nmの範囲の均質粒子集団を示した。ハ
イブリッドタンパク質粒子はHDL よりやや大きいサイズ
をもちゲル濾過によって得られた結果を追認した。 【０１１１】ハイブリッドタンパク質及びHDL の生物学
的活性の比較 細胞表面レセプターに対する結合能を試験するために大
腸菌から精製されたハイブリッドタンパク質とヒト血漿
から精製されたHDL とを平行に使用した。複数の細胞タ
イプ、即ちマウスマクロファージ(J774)及びラット肝細
胞(Fao) の細胞系を試験した。これらの２つの細胞タイ
プはHDL を異なる方法で処理することが判明している。
マクロファージにおいてはコレステロール交換が生じ肝
細胞においては分解が生じる。 【０１１２】4 ℃における結合データ ヨウ素化リガンドを 4℃で2 時間細胞に結合させた。30
分間で結合量が平坦域に到達した。非特異的な量を判定
するために500 μg の非標識リガンドとの競合を使用
し、この値を総結合曲線から減算して特異的結合値を与
えた。特異的結合値を使用しScatchard 分析(Scatchar
d、Ann. N. Y. Acad. Sci. 51、660-672、1949) によ
って親和性を計算した。HDL 及びハイブリッドタンパク
質の双方で結合は特異的で高い親和性を有していた。J7
74またはFao 細胞で高親和性結合はHDL では 2.8〜 3.0
×10-8M のKd、ハイブリッドタンパク質では 3.5〜 4.9
×10-8M のKdを有していた。結果を後出の表２に示す。
更に、HDL 及びハイブリッドタンパク質の双方で非標識
リガンドに完全には競合しない低親和性成分が存在す
る。 【０１１３】双方の細胞タイプの高親和性結合成分は 1
×106 細胞当たり90〜155 ngの最大結合を与える。これ
は細胞当たり 1.9〜 3.6×105 部位を示す。細胞当たり
の結合部位の数及び結合親和性はHDL 及びハイブリッド
タンパク質の双方で顕著に類似していた。これは、単一
レセプターが関与しHDL のレセプター媒介結合にapoAＩ
成分だけが関係することを示唆する。 【０１１４】競合試験 apoAＩの特異的結合の付加的な証拠は競合試験によって
得られる。HDL 及びハイブリッドタンパク質の双方がJ7
74及びFao 細胞に対する結合において互いに有効に競合
した。非特異的成分に達するまで競合が有効であった。
プロテインA はハイブリッドタンパク質またはHDL の結
合に競合できなかった。競合試験における独立対照とし
てトランスフェリンを使用した。トランスフェリンはト
ランスフェリンレセプターを介して細胞表面に結合する
が、HDL またはハイブリッドタンパク質の結合に競合で
きなかった。 【０１１５】プロテインA 及びIgG 結合活性 ハイブリッドタンパク質は同時にプロテインA を含有す
るので、プロテインA自体が細胞に結合できるか否かを
判断することが重要である。プロテインA を同様に特異
的活性にヨウ素化し、J774及びFao 細胞に対する結合を
検定した。高濃度のプロテインA(100 μg/ml) が存在す
る場合にも特異的結合は検出されなかった。細胞結合放
射能の量はハイブリッドタンパク質の非特異的結合より
も少なかった。 【０１１６】J774細胞はIgG に対するFcレセプターを発
現させるので、ハイブリッドタンパク質によってこれら
の実験を行なうためには配慮が必要であった。従って、
[ 125I]- ウサギIgG は高親和性（Kd＝ 1×10-8M ）で
細胞表面Fcレセプターに結合する。 [ 125I]-CPA-AＩが
ウサギIgG の存在下に結合すると、結合ハイブリッドタ
ンパク質の量は2.7 倍に増加した。逆に、 [ 125I]- ウ
サギIgG がハイブリッドタンパク質の存在下に結合した
ときも結合が増加した(1.6倍) 。明らかに、IgG とCAP-
A Ｉとの複合体はFcレセプターまたはHDL レセプターに
結合し得る。HDL レセプターだけを試験するために、す
べての結合実験をIgG 非含有培地で行なった。培地中に
存在するIgG を除去するためにBSA(実質的にIgG 非含
有) を加えたHanks 緩衝液で細胞を3 回洗浄した。 【０１１７】HDL レセプターの特性決定 HDL 、ハイブリッドタンパク質またトランスフェリンの
結合を検定する前にJ774細胞を 4℃のトリプシンで処理
した。トリプシン処理はHDL またはハイブリッドタンパ
ク質結合を減少させなかった。しかしながら、 [ 125I]
- トランスフェリンの結合は対照の38％まで減少した。
HDL レセプターはトランスフェリンレセプターに比較し
て比較的トリプシン耐性である。 【０１１８】HDL 及びハイブリッドタンパク質の結合に
関与するレセプターを同定するために、リガンドブロッ
トを実施した。J774細胞からのPNS のTriton X-114抽出
物を還元条件下にSDS-PAGEにかけニトロセルロースに移
した。 [ 125I]-HDL及び [ 125I]-CPA-AＩの各々は約11
0kD のバンドに結合した。このバンドをフィルターのオ
ートラジオグラフ上で [ 125I]- 標識リガンドを可視化
することによって直接に同定するかまたはHDL に対する
ウサギ抗血清を用いて抗体を検出しヒツジ抗ウサギIgG
ペルオキシダーゼで可視化することによって間接に同定
した。HDL の場合、ニトロセルロース上にヨウ素化ラベ
ルの極めて高いバックグラウンドが存在し、これがオー
トラジオグラフ上の特異的バンドの検出を妨害した。 【０１１９】実施例３ ヒトapoAＩを前駆体即ち267 個のアミノ酸から成る pre
-proapoAＩとして合成する。18個のアミノ酸から成るプ
レペプチドを分泌中に開裂し、 proapoAＩと指称される
プロタンパク質を残す。従って、 proapoAＩは6 個のア
ミノ酸から成るN-末端延長部即ちArg-His-Phe-Trp-Gln-
Gln とこれに続く成熟タンパク質とから構成される。 【０１２０】proapoAＩを発現させるためにapoAＩ遺伝
子の5'を図８に示すように合成的に復元する。6 個のア
ミノ酸プロペプチドを含む proapoAＩの最初の15個のア
ミノ酸をコードする NdeＩ- BamHＩオリゴヌクレオチド
を合成した。合成DNA はBamHＩ部位の直前に NcoＩ部位
を含んでいた。プラスミド pDR72（Pharmacia 、Swede
n;Russel and Bennet、Gene、20、231 、1982）に由来
のtrp プロモーターを担うEcoRＩ-SalＩフラグメントを
λcIIShine-Dalgarno 配列をコードする合成 SalＩ-Nde
Ｉフラグメントに結合して図示のEcoRＩ-NdeＩ 107bpフ
ラグメントを得た。このDNA 断片を proapoAＩ 5' 配列
をコードするフラグメントに結合し、M13mp8(Messing
等、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、74、3642、1977) に
サブクローニングし配列決定した。 【０１２１】組換え proapoAＩを発現させるために図９
のごとく発現ベクターを構築した。発現シグナルとこれ
に続く proapoAＩ遺伝子の5'端とを内包するEcoRＩ-Nco
Ｉフラグメントを組換えM13mp8から切除し（図８Ａ、図
８Ｂ参照）、以下の２つのフラグメントに結合した。 【０１２２】(a) EcoRＩ- BamHＩで切断したプラスミド
pDS20 の大きいフラグメント(Duester等、Cell、30、85
5 、1982) 、(b) apoAＩ配列の残りの部分を含むpML11-
20に由来の NcoＩ-BamH Ｉフラグメント。 【０１２３】得られたプラスミドpFC33 は、大腸菌B 株
（Delbruck、1946、Bacterial viruses or bacteriopha
ges Biol. Rev.、21: 30-40)中のtrp プロモーター下に
proapoAＩタンパク質またはより特定的には Met-proap
oAＩを発現させ得た。誘発のために、アンピシリンを加
えたLB培地で細胞を1 晩増殖させた。次の日に細胞をト
リプトファン非添加のM9培地に希釈し、37℃で6 時間維
持後に採取した。 【０１２４】図１０は proapoAＩのゲル電気泳動及びイ
ムノブロット分析を示す。細菌培養物のアリコートをペ
レット化し、標準ヒト分画と平行にゲル電気泳動バッフ
ァに再懸濁させた。沸騰後、標本を12.5％SDS-PAGEで電
気泳動させた。実施例１と同様にニトロセルロースフィ
ルターにブロッティングした。 【０１２５】 【表１】 【０１２６】 【表２】
【図面の簡単な説明】
【図１】この図は成熟形ヒトapoAＩに対応する完全ヌク
レオチド配列を示す。図示の配列はmRNAを5'→3'方向で
示す。下の列はアミノ酸配列を示す。 【図２】この図は成熟ヒトapoAＩをコードする遺伝子の
5'末端の復元を示す。最初のSau 3AＩ制限部位から開始
するプラスミドpAＩ/Aに由来のDNA フラグメントを、単
鎖前駆体1-4 のアニーリング及び結合によって組み立て
た合成オリゴヌクレオチドアダプターに結合した。２つ
のBamHＩ制限部位を末端にもつ(flanked)790bpのフラグ
メントは成熟apoAＩ分子をコードしている。 【図３】この図はpLS66 及びpML11-20のヌクレオチド配
列に関する電気泳動写真である。配列は、 pFCE4+ のAT
G 開始コドンと欠失前(pLS66、A)及び欠失後(pML11-2
0、B)のapoAＩ遺伝子の起点との間の接合を示す。 【図４】この図はpIL8-6及び pIL8-Ｉのヌクレオチド配
列に関する電気泳動写真である。配列は pIL8-Ｉ(A) に
おけるapoAＩ-MＩ突然変異(CからT)の存在及びpIL8-6
(B) におけるapoAＩ-T6 突然変異(GからC)の存在を示
す。 【図５】この図はpML11-20の電気泳動およびイムノブロ
ット分析結果を示す写真である。アフィニテイカラム及
び標準ヒトHDL 分画からの溶出物質のアリコートを沸騰
させ12.5％SDS-PAGEで重複(in duplicate)電気泳動にか
けた。本文に記載の手順でニトロセルロースフィルター
にブロッティングした。レーン: １- 標準HDL;２- アフ
ィニティカラムの溶出物; ３- 分子量標準。 【図６】この図はpRP5及びpUC9の電気泳動およびイムノ
ブロット分析結果を示す写真である。IPTGで誘発した野
性型pUC9または組換えpRP5プラスミドを担う細菌培養物
のアリコートをペレット化し、適当な緩衝液に再懸濁さ
せ、標準ヒトHDL 分画と平行にゲル電気泳動にかけた。
標本を沸騰させた後、12.5％SDS-PAGEで電気泳動させ
た。本文に記載の手順でニトロセルロースフィルターに
ブロッティングした。レーン: １- 分子量標準; ２- 標
準HDL;３-pUC9;4-pRP5。 【図７】この図はプラスミドpLM8の構築を示し、枠で囲
んだ部分は夫々、PROT A、AMP、LAC Z 及びAPOAＩを示
す。これらは夫々、プロテインA 、- ラクタマーゼ、-
ガラクトシダーゼ及びヒト成熟apoAＩをコードする遺伝
子である。CRO はλcroタンパク質の最初の11個のアミ
ノ酸をコードする配列、T はプロテインA 転写終了配
列、F1はファージf1パッケージング配列、ORＩは複製起
点、Ek. ADはエンテロキナーゼによって認識されるタン
パク質分解部位配列を示す。プラスミドpLM8中のEcoRＩ
及びCla Ｉ部位は単一(unique)でない。 【図８Ａ】この図は5'proapoＡＩ配列の復元を示す。 【図８Ｂ】この図は5'proapoＡＩ配列の復元を示す（図
８Ａの続きを示す図）。 【図９】この図はproapoＡＩを発現し得るベクターpFC3
3 の構築を示す。 【図１０】この図はpFC33 によって発現されたproapoＡ
Ｉのゲル電気泳動及びイムノブロット分析結果を示す写
真である。レーン１：HDL 標準、レーン２：非組換え菌
株、レーン３:proapoAＩ及びレーン４: 分子量標準。
レオチド配列を示す。図示の配列はmRNAを5'→3'方向で
示す。下の列はアミノ酸配列を示す。 【図２】この図は成熟ヒトapoAＩをコードする遺伝子の
5'末端の復元を示す。最初のSau 3AＩ制限部位から開始
するプラスミドpAＩ/Aに由来のDNA フラグメントを、単
鎖前駆体1-4 のアニーリング及び結合によって組み立て
た合成オリゴヌクレオチドアダプターに結合した。２つ
のBamHＩ制限部位を末端にもつ(flanked)790bpのフラグ
メントは成熟apoAＩ分子をコードしている。 【図３】この図はpLS66 及びpML11-20のヌクレオチド配
列に関する電気泳動写真である。配列は、 pFCE4+ のAT
G 開始コドンと欠失前(pLS66、A)及び欠失後(pML11-2
0、B)のapoAＩ遺伝子の起点との間の接合を示す。 【図４】この図はpIL8-6及び pIL8-Ｉのヌクレオチド配
列に関する電気泳動写真である。配列は pIL8-Ｉ(A) に
おけるapoAＩ-MＩ突然変異(CからT)の存在及びpIL8-6
(B) におけるapoAＩ-T6 突然変異(GからC)の存在を示
す。 【図５】この図はpML11-20の電気泳動およびイムノブロ
ット分析結果を示す写真である。アフィニテイカラム及
び標準ヒトHDL 分画からの溶出物質のアリコートを沸騰
させ12.5％SDS-PAGEで重複(in duplicate)電気泳動にか
けた。本文に記載の手順でニトロセルロースフィルター
にブロッティングした。レーン: １- 標準HDL;２- アフ
ィニティカラムの溶出物; ３- 分子量標準。 【図６】この図はpRP5及びpUC9の電気泳動およびイムノ
ブロット分析結果を示す写真である。IPTGで誘発した野
性型pUC9または組換えpRP5プラスミドを担う細菌培養物
のアリコートをペレット化し、適当な緩衝液に再懸濁さ
せ、標準ヒトHDL 分画と平行にゲル電気泳動にかけた。
標本を沸騰させた後、12.5％SDS-PAGEで電気泳動させ
た。本文に記載の手順でニトロセルロースフィルターに
ブロッティングした。レーン: １- 分子量標準; ２- 標
準HDL;３-pUC9;4-pRP5。 【図７】この図はプラスミドpLM8の構築を示し、枠で囲
んだ部分は夫々、PROT A、AMP、LAC Z 及びAPOAＩを示
す。これらは夫々、プロテインA 、- ラクタマーゼ、-
ガラクトシダーゼ及びヒト成熟apoAＩをコードする遺伝
子である。CRO はλcroタンパク質の最初の11個のアミ
ノ酸をコードする配列、T はプロテインA 転写終了配
列、F1はファージf1パッケージング配列、ORＩは複製起
点、Ek. ADはエンテロキナーゼによって認識されるタン
パク質分解部位配列を示す。プラスミドpLM8中のEcoRＩ
及びCla Ｉ部位は単一(unique)でない。 【図８Ａ】この図は5'proapoＡＩ配列の復元を示す。 【図８Ｂ】この図は5'proapoＡＩ配列の復元を示す（図
８Ａの続きを示す図）。 【図９】この図はproapoＡＩを発現し得るベクターpFC3
3 の構築を示す。 【図１０】この図はpFC33 によって発現されたproapoＡ
Ｉのゲル電気泳動及びイムノブロット分析結果を示す写
真である。レーン１：HDL 標準、レーン２：非組換え菌
株、レーン３:proapoAＩ及びレーン４: 分子量標準。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ
//(Ｃ１２Ｎ 1/21
Ｃ１２Ｒ 1:19）
(Ｃ１２Ｐ 21/02
Ｃ１２Ｒ 1:19）
(72)発明者 ラツフアエレ・パロンバ
イタリー国、ミラン、ビア・フオルナ
リ・46
(72)発明者 アントネラ・イサツキ
イタリー国、ミラン、ビアレ・ラツイ
オ・27
(72)発明者 パオロ・サルミエントス
イタリー国、ミラン、ビア・エム・ビア
ンキ・24
(56)参考文献 ＦＥＢＳ ＬＥＴＴ．，194（２)
（1986），Ｐ．343−346
(58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名)
C12N 15/09 ZNA
ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ)
ＣＡ（ＳＴＮ)
ＥＰＡＴ（ＱＵＥＳＴＥＬ)
ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ)
ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (1)
- (57)【特許請求の範囲】 １．抗ヒトａｐｏＡＩ抗血清を用いたＥＬＩＳＡによっ
て検出可能であり、式（１） Ｍｅｔ−Ｘ−Ｙ （１） ［式中、Ｘはβ−ガラクトシダーゼの最初の15個以内の
Ｎ末端アミノ酸に由来する配列を有する担体ペプチド配
列又はヒトａｐｏＡＩのプロ配列であり、Ｙはヒトａｐ
ｏＡＩ配列か又は、ヒトａｐｏＡＩ配列中 173位のＡｒ
ｇがＣｙｓで置換された配列（ａｐｏＡＩ−ＭＩ）、６
位のＳｅｒがＴｈｒで置換された配列（ａｐｏＡＩ−Ｔ
６）もしくは上記２つの置換を有する配列（ａｐｏＡＩ
−Ｔ６／ＭＩ）を示す］で示されるタンパク質。 ２．担体ペプチド配列が、-Thr-Met-Ile-Thr-Pro-Ser-P
he-Asp-Gly-Ser-Met- 又は-Thr-Met-Ile-Thr-Asn-Ser-A
rg-Gly-Ser-Metである、請求項１に記載のタンパク質。 ３．アミノ酸配列Met-Thr-Met-Ile-Thr-Pro-Ser-Phe-As
p-Gly-Ser-Met が、ａｐｏＡＩ、ａｐｏＡＩ−Ｔ６、ａ
ｐｏＡＩ−ＭＩ及びａｐｏＡＩ−Ｔ６／ＭＩから選択さ
れたアポリポタンパク質に融合している、請求項２に記
載のタンパク質。 ４．アミノ酸配列 Met-Thr-Met-Ile-Thr-Asn-Ser-Arg-G
ly-Ser-Metが、ａｐｏＡＩ、ａｐｏＡＩ−Ｔ６、ａｐｏ
ＡＩ−ＭＩ及びａｐｏＡＩ−Ｔ６／ＭＩから選択された
アポリポタンパク質に融合している、請求項２に記載の
タンパク質。 ５． Met-プロ apoAIである、請求項１に記載のタンパ
ク質。 ６．抗ヒトａｐｏＡＩ抗血清を用いたＥＬＩＳＡによっ
て検出可能であり、式（１） Ｍｅｔ−Ｘ−Ｙ （１） ［式中、Ｘはβ−ガラクトシダーゼの最初の15個以内の
Ｎ末端アミノ酸に由来する配列を有する担体ペプチド配
列又はヒトａｐｏＡＩのプロ配列であり、Ｙはヒトａｐ
ｏＡＩ配列か又は、ヒトａｐｏＡＩ配列中 173位のＡｒ
ｇがＣｙｓで置換された配列（ａｐｏＡＩ−ＭＩ）、６
位のＳｅｒがＴｈｒで置換された配列（ａｐｏＡＩ−Ｔ
６）もしくは上記２つの置換を有する配列（ａｐｏＡＩ
−Ｔ６／ＭＩ）を示す］で示されるタンパク質の製造方
法であって、 （ｉ）前記タンパク質を発現させ得る発現ベクターで形
質転換した細菌宿主を培養し、 （ii）得られたタンパク質を回収する、ことを特徴とす
る前記方法。 ７．担体ペプチド配列が、-Thr-Met-Ile-Thr-Pro-Ser-P
he-Asp-Gly-Ser-Met又は-Thr-Met-Ile-Thr-Asn-Ser-Arg
-Gly-Ser-Met- である、請求項６に記載の方法。 ８．そのプラスミドのβ−ガラクトシダーゼ遺伝子のα
−ペプチドの９番目のアミノ酸のコドンの直後のＢａｍ
ＨＩ部位にａｐｏＡＩ、ａｐｏＡＩ−Ｔ６、ａｐｏＡＩ
−ＭＩ又はａｐｏＡＩ−Ｔ６／ＭＩをコードする遺伝子
をもつプラスミドｐＵＣ８で形質転換された宿主を培養
することによって、式中のＸが -Thr-Met-Ile-Thr-Pro-
Ser-Phe-Asp-Gly-Ser-Met-である式（１）のタンパク質
が得られる、請求項７に記載の方法。 ９．そのプラスミドの翻訳開始コドンの直後の配列 -Th
r-Met-Ile-Thr-Asn-Ser-Arg-Gly-Ser-Met-のコドンの直
後にａｐｏＡＩ、ａｐｏＡＩ−Ｔ６、ａｐｏＡＩ−ＭＩ
又はａｐｏＡＩ−Ｔ６／ＭＩをコードする遺伝子をもつ
プラスミドｐＵＣ９で形質転換された宿主を培養するこ
とによって、式中のＸが -Thr-Met-Ile-Thr-Asn-Ser-Ar
g-Gly-Ser-Met-である式（１）のタンパク質が得られ
る、請求項７に記載の方法。 １０．ＸがヒトａｐｏＡＩのプロ配列である式（１）の
タンパク質が、ｔｒｐプロモーターの調節下でプラスミ
ドから発現される、請求項７に記載の方法。
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|---|---|---|---|
| GB868625435A GB8625435D0 (en) | 1986-10-23 | 1986-10-23 | Human apolipoprotein ai |
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
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| JP62506754A Expired - Fee Related JP2706247B2 (ja) | 1986-10-23 | 1987-10-21 | ヒトアポリポタンパク質ａｉもしくはその変異体の前駆体又は融合体の発現用ベクター及びそのベクターを含む細菌宿主 |
| JP9134703A Expired - Fee Related JP2777126B2 (ja) | 1986-10-23 | 1997-05-26 | 細菌中で発現されるヒトアポリポタンパク質ａｉ及びその変異体、並びにそれらの製造方法 |
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62506754A Expired - Fee Related JP2706247B2 (ja) | 1986-10-23 | 1987-10-21 | ヒトアポリポタンパク質ａｉもしくはその変異体の前駆体又は融合体の発現用ベクター及びそのベクターを含む細菌宿主 |
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| CZ (1) | CZ761587A3 (ja) |
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