JP2706247B2 - ヒトアポリポタンパク質ａｉもしくはその変異体の前駆体又は融合体の発現用ベクター及びそのベクターを含む細菌宿主 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は組換えDNA技法を用いたヒトアポリポタンパ
ク質A I（apoA I）及びその変異体の産生用の発現ベク
ター及びそのベクターを含む細菌宿主に係る。 アテローム性動脈硬化及びその合併症（例えば冠性心
疾患、CHD）は恐らく健康上の最も危険な問題の１つで
ある。この病気の進行には多数の危険要因（risk facto
r）が伴っており、最も重要な危険要因の１つは血漿コ
レステロール（CHL）レベルの上昇である。従って、ヒ
ト体内のCHL代謝の研究が非常な注目を浴びている。 ヒト体内の血漿CHL及びトリグリセリド（TG）のレベ
ルを調節する遺伝子、治療食（diet）及びホルモンの相
互作用のメカニズムを理解する鍵はリポタンパク質運搬
系にある。血漿中のリポタンパク質の機能は主として脂
質を１つの器官から別の器官に運搬することである。こ
れらのリポタンパク質は疎水性脂質を可溶化するだけで
なく各クラスの脂質を配給すべき身体部位を指令するこ
とが最近明らかにされた。主として４つのクラスのリポ
タンパク質、即ちキロミクロン（CM）、極低密度（VLD
L）、低密度（LDL）及び高密度（HDL）リポタンパク質
が存在する。 血漿中で運搬されるときTG及びコレステリルエステル
（CHLE）はリポタンパク質粒子にパッケージされ極性リ
ン脂質（PL）の表面単層によって包囲された疎水性コア
を形成する。表面皮膜はアポリポタンパク質（apo）と
指称されるタンパク質と共に比較的少量の非エステル化
CHLも含有する。少なくとも９種類のapo、即ち、A I、A
II、A IV、Ｂ（48−100）、C I、C II、C III、Ｄ及び
Ｅが同定されている。 血漿リポタンパク質レベルとCHDの進行の危険との関
連を研究することは特に重要である。HDL及びLDLは双方
ともCHL及びCHLEの担体である。しかしながらLDL−CHL
レベルはプラスの危険要因であるが（Kannel等、Ann.In
tern.Med.、90:85−91、1979）、HDLレベルは重要なマ
イナスの危険要因である（Yaari等、Lancet、i:1011−1
015、1981）ことが指摘されている。これらのリポタン
パク質の正確な機能及び作用モードはまだ完全には解明
されていないが、HDLは特に末梢組織からCHLを除去しCH
L逆輸送（RCT）と指称されるメカニズムによって肝臓に
逆輸送する機能を果たすと考えられる。 HLDの主なアポリポタンパク質はapoA Iであり、いく
つかの研究によれば血漿apoA IレベルとCHDとの間にはH
DL−CHLレベルとCHDとの間で報告されたような（Ishika
wa等、Eur.J.Clin.Invest.、8:179−182、1978）逆相関
関係があることが判明した。更に、HDL−CHL及びapoA I
のレベルは血管造影法で診断される冠性アテローム動脈
硬化病巣の容態に対して逆の相関関係をもつ（Pearson
等、Amer.J.Epidem.、109:285−295、1979;Maciejko
等、New Eng.J.Med.、309;385−389、1983）。従って、
血漿中の高濃度HDLは粥腫の形成を遅らせ及び／または
既存病巣の退行を促進することによってCHDに影響を与
えると考えられる。 HDLアポリポタンパク質主としてapoA Iとレシチンと
の複合体は、培養された動脈平滑筋細胞のごとき細胞か
らinvitroで遊離CHLの流出を促進する（Stein等、Bioch
em.Biophys.Acta、380:106−118、1975）。実験的に誘
発したアテロームをもつ動物に対するリン脂質の静脈注
入はこの流出に有利に作用し（Adams等、j.Path.Bac
t.、94:77−87、1967）、apoA I/レシチン複合体は天然
HDL粒子と同様の速度で血漿から除去される（Malmendie
r等、Clin.Chem.Acta、131:201−210、1983）。 CHLを与えたウサギにapoA Iを静脈注入すると病巣波
及び範囲が50％縮小する。これは、apoA Iがアテローム
性動脈硬化の病巣形成に対する防御効果をもつことを示
し、その理由は恐らく大動脈壁に吸収されてCHLが減少
するためである（Meclejko and Mao、Artheriosclerosi
s、2:407a、1982;Mao等、Fed.Proc.（USA）、42、no7 p
ABSTRACT357、1983;Badimon等、Cardiovascular Diseas
e‘86、1986 ABSTRACT 81）。 Apo IはHDLの約70％を占める主要タンパク質であり、
血漿中に濃度1.0〜1.2mg/mlで比較的多量に存在してい
る（Schonfield等、J.Clin.Invest.、69:1072、198
2）。血漿apoA Iは243個のアミノ酸から成るポリペプチ
ド単鎖でありその一次配列は既知である（Brewer等、Bi
ochem.Biophys.Res.Commun.、80:623−630、1978）。細
胞内でapoA Iは267個のアミノ酸から成る前駆体の形態
で存在する。この長いタンパク質の最初の18個のＮ−末
端残基は粗面小胞体のシグナルペプチダーゼによって細
胞内で開裂される。新しく分泌されたapoA Iは依然とし
て６個のアミノ酸から成るＮ−末端延長部をもち、血漿
及び／またはリンパ特異的プロテアーゼによって成熟形
に変換される（Zannis and Breslow、Advances in Huma
n Genetics、Harris and Hirschhorn eds.、Plenum、12
5−215、1985）。 ApoA I分子のＣ−末端部は11または22個のアミノ酸の
反復単位から成ることが判明した（McLachlan、Natur
e、267:465−466、1979）。縦列セグメントは正確な重
複ではないが、アミノ酸置換物は一般に反復セグメント
の対応位置の残基の化学的タイプを依存していた。これ
らの反復セグメントは、両親媒性螺旋コンホーメーショ
ンで存在すると推定され（Segrest等、FEBS Lett.、38:
247−253、1974）、apoA Iの主要生物学的活性即ち脂質
結合及びレシチンCHLアシルトランスフェラーゼ（LCA
T）賦活を与える主な構造要件であると考えられる。apo
A Iのその他の２つの機能、即ちレセプターによってHDL
粒子を認識するリガンドの機能及び末梢組織からCHLを
除去する機能とapoA I分子の特異的配列またはドメイン
との関連はまだ解明されていない。 最初に文献に発表されたヒトapoA Iの分子特異体はMI
lano（apoA I−M I）変異体であった（Franceschini
等、J.Clin.Invest.、66:892−900、1980）。この特徴
は、Atg173−Cys置換にあり（Weisgraber等）、J.Biol.
Chem.、258:2508−2513、1983）、同じ血縁に属する33
人の被験者において同定された。これらの被験者全員が
常染色体性優性形質として伝達される突然変異アポリポ
タンパク質にヘテロ接合性であった。被験者においては
HDL−CHL濃度が顕著に低下しており、HDLレベルに対し
てマイナスの相関関係をもつ種々の程度のトリグリセリ
ド過多を示した。突然変異と特異的病理状態との間の関
連は全く確認できなかった。実際、羅患被験者は早期ア
テローム性動脈硬化の進行から明らかに保護されていた
（Gualnadri等、Am.J.Hum.Gen.、1986、印刷中）。 Apoa I−M I中のアミノ酸置換は突然変異アポタンパ
ク質の構造を修飾しα螺旋秩序構造を減少させ疎水性残
基の露出を増加させる（Franceschini等、J.Biol.Che
m.、260:16321−16325、1985）。突然変異アポタンパク
質の構造再生（remodelling）は、正常apoA Iよりも容
易に脂質と会合する分子の脂質結合性を有意に変化させ
る。アポタンパク質／脂質複合体は、正常apoA Iによっ
て形成される複合体と同様であるが変性剤による破壊が
容易である。変異形の内部にシステイン残基が存在する
ので、apoA IIとの複合体及びapoA I二量体の形成が可
能である。これらのタンパク質複合体が「羅患」被験者
で観察された異常HDL粒子の形成の主因であると推定さ
れる。ApoA I−M Iのこれらの特徴すべてがその異化作
用促進及び組織脂質の有効吸収能に寄与すると考えられ
る。 apoA Iのその他のいくつかの遺伝変異体がこれまで文
献に発表されたが（Breslow、Ann.Rev.Biochem.、54:69
9−727、1985）、これらのうちでキャリアにおける何ら
かの病理状態またはポリタンパク質代謝作用の有意な変
化と関連づけられたものはない（表１参照）。 ApoA I cDNAクローンはいくつかの研究室で得られた
（Breslow、Ann.Rev.Biochem.、54:699−727、1985;Sha
rpe等、Nucl.Acids Res.、12:3917:3932、1984）。mRNA
は約890塩基対（bp）の長さをもち、35bpの５′非翻訳
配列と801bp（267個のアミノ酸）のコード配列と翻訳終
止コドン（TGA）とポリＡテイルを付けた54bpの３′非
翻訳配列とをもつ。完全cDNAヌクレオチド配列を添付の
第１図に示す。 出願人等は、apoA Iまたはその遺伝変異体を含むタン
パク質を産生するために組換えDNA技術の使用が有効で
あることを知見した。変異体としては、６−SerがThrで
置換されたapoA I（apoA I−T6）、apoA I−M I、また
は、apoA I−T6とapoA I−M Iの双方の突然変異を含む
変異体（apoA I−T6/M I）がある。タンパク質は、抗ap
oA I抗血清を用いる酵素結合免疫吸着検定法（ELISA）
によって検出できる。産生したタンパク質はapoA Iまた
はその遺伝変異体がＮ−末端で担体ペプチドに融合した
融合タンパク質の形態でもよい。 従って本発明は、抗ヒトapoA I抗血清を用いるELISA
によって検出可能な式（１） Met−Ｘ−Ｙ （１） 〔式中、Ｘは結合、β−ガラクトシダーゼのＮ−末端ア
ミノ酸残基に由来の配列もしくはプロテインＡの１つ以
上のIgG−結合ドメインを含む配列を含む担体ペプチド
配列またはヒトapoA Iのプロ配列を示し、ＹはヒトapoA
Iまたはその遺伝変異体を示す〕で示されるタンパク質
を形質転換宿主中で発現させ得る発現ベクターを提供す
る。 Met残基は、翻訳開始コドンの機能をもつと考えられ
る。かかる発現ベクターで形質転換され内部で前記タン
パク質を発現せしめる宿主が式（１）のタンパク質の産
生に使用できる。形質転換宿主を培養し、得られた式
（１）のタンパク質を回収する。式（１）のタンパク質
も本発明の一部を成す。 好ましい実施態様によれば本発明は、 （Ａ）1.apoA I（第１図参照）、 2.apoA I−T6、 3.apoA I−M I、 4.apoA I−T6/M I、 7.apoA I−T6とapoA I−RP5とを結合したタンパク質（a
poA I−PR5/T6）、 8.apoA I−T6とapoA I−IP1とを結合したタンパク質（a
poA I−IP1/T6）、 9.apoA I−M IとapoA I−RP5とを結合したタンパク質
（apoA I−RP5/M I）、 10.apoA I−M IとapoA I−IP1とを結合したタンパク質
（apoA I−IP1/M I）、 11.apoA I−T6/M IとapoA I−RP5とを結合したタンパク
質（apoA I−PR5/T6/M I）、 12.apoA I−T6/M IとapoA I−IP1とを結合したタンパク
質（apoA I−IP1/T6/M I）、 14.proapoA IとapoA I−M Iを結合したタンパク質（pro
apoA I−M I）、（Ｂ）大腸菌（Escherichia coli、E.coli株）中での前
記遺伝子の発現に係る。これらの遺伝子の発現によって
以下のタンパク質が得られる。 −アミノ酸配列 がapoA I、apoA I−T6、apoA I−M I及びapoA I−T6/M
Iから選択されたアポリポタンパク質に融合した融合タ
ンパク質、 −プロアポリポタンパク質proapoA IまたはproapoA I−
M I、または、 添付図面において、 第１図は成熟形ヒトapoA Iに対応する完全ヌクレオチ
ド配列を示す。図示の配列はmRNAを５′→３′方向で示
す。下の列はアミノ酸配列を示す。 第２図は成熟ヒトapoA Iをコードする遺伝子の５′末
端の復元を示す。最初のSau 3A I制限部位から開始する
プラスミドpA I/Aに由来のDNAフラグメントを、単鎖前
駆体１−４のアニーリング及び結合によって組み立てた
合成オリゴヌクレオチドアダプターに結合した。２つの
BamH I制限部位を末端にもつ（flanked）790bpのフラグ
メントは成熟apoA I分子をコードしている。 第３図はpLS66及びpML11−20のヌクレオチド配列に関
する。配列は、pFCE4⁺のATG開始コドンと欠失前（pLS6
6、Ａ）及び欠失後（pML11−20、Ｂ）のapoA I遺伝子の
起点との間の接合を示す。 第４図はpIL8−６及びpIL8−Ｉのヌクレオチド配列に
関する図である。配列はpIL8−Ｉ（Ａ）におけるapoA I
−M I突然変異（ＣからＴ）の存在及びpIL8−６（Ｂ）
におけるapoA I−T6突然変異（ＧからＣ）の存在を示
す。 第５図はpML11−20のイムノブロット分析を示す。ア
フィニテイカラム及び標準ヒトHDL分画からの溶出物質
のアリコートを沸騰させ12.5％SDS−PAGEで重複（in du
plicate）電気泳動にかけた。本文に記載の手順でニト
ロセルロースフィルターにブロッティングした。レー
ン:1−標準HDL−;2−アフィニティカラムの溶出物;3−
分子量標準。 第６図はpRP5及びpUC9のイムノブロット分析を示す。
IPTGで誘発した野性型pUC9または組換えpRP5プラスミド
を担う細菌培養物のアリコートをペレット化し、適当な
緩衝液に再懸濁させ、標準ヒトHDL分画と平行にゲル電
気泳動にかけた。標本を沸騰させた後、12.5％SDS−PAG
Eで電気泳動させた。本文に記載の手順でニトロセルロ
ースフィルターにブロッティングした。レーン:1−分子
量標準;2−標準HDL;3−pUC9;4−pRP5。 第７図はプラスミドpLM8の構築を示し、枠で囲んだ部
分は夫々、PROT A、AMP、LAC Z及びAPOA Iを示す。これ
らは夫々、プロテインＡ、−ラクタマーゼ、−ガラクト
シダーゼ及びヒト成熟apoA Iをコードする遺伝子であ
る。CROはλcroタンパク質の最初の11個のアミノ酸をコ
ードする配列、ＴはプロテインＡ転写終了配列、F1はフ
ァージf1パッケージング配列、OR Iは複製起点、Ek.AD
はエンテロキナーゼによって認識されるタンパク質分解
部位配列を示す。プラスミドpLM8中のEcoR I及びCla I
部位は非反復（unique）でない。 第８図は５′proapoA I配列の復元を示す。 第９図はproapoA Iを発現し得るベクターpFC33の構築
を示す。 第10図はpFC33によって発現されたproapoA Iのゲル電
気泳動及びイムノブロット分析を示す。レーン1:HDL標
準、レーン2:非組換え菌株、レーン3:proapoA I及びレ
ーン4:分子量標準。 本発明の発現ベクターは、該ベクターに含まれたDNA
配列、特に構造遺伝子の配列を発現し得るベクターであ
る。発現されるべきDNA配列はそれらの発現をコントロ
ールする上流配列に対して正しく配置されている。発現
されるべきタンパク質、宿主の性質等を考慮して適当な
任意のプロモーター系を使用するとよい。従って、PL、
lac、tac及びtrpプロモーターから選択されたプロモー
ターを使用し得る。本発明の場合、５′−調節配列は発
現されるべきapoA Iまたはその遺伝変異体に対して非相
同である。調節配列はlacまたはtrpオペロンの調節配列
でもよい。言い替えると、本発明の発現ベクターは、ap
oA Iまたはその遺伝変異体である非相同タンパク質を発
現し得る。好ましい遺伝変異体はapoA I−T6、apoA I−
M I及びapoA I−T6/M Iである。 式（１）のタンパク質をコードするDNA配列を含む本
発明の発現ベクターは典型的にはプラスミドである。こ
れらは単鎖でもよい。各ベクターは複製起点を有してお
り複製可能である。好ましい発現ベクターは、apoA Iま
たはその遺伝変異体を発現する場合はプラスミドpFCE4
＋に由来し、担体配列がβ−ガラクトシダーゼのＮ−末
端アミノ酸残基に由来の配列を含む融合タンパク質を発
現する場合はpUC8またはpUC9に由来し、担体配列がプロ
テインＡの１つ以上のIgG結合ドメインを含む場合はpLM
3に由来し、proapoA Iまたはその遺伝変異体を発現させ
る場合はpDS20である。 apoA Iまたはその遺伝変異体を含むタンパク質を発現
させるために適当な宿主を本発明の発現ベクターによっ
て形質転換させる。細菌、酵母または哺乳類細胞系のご
とき原核細胞または真核細胞の宿主を使用し得る。代表
的な宿主は大腸菌株である。所望のタンパク質が細胞プ
ロテアーゼによって分解されないように宿主を選択する
必要がある。一般には、apoA Iまたはその遺伝変異体を
含むタンパク質は以下の手順で得られる。 1.クローンapoA I cDNAを選択する。 2.apoA I遺伝子を易動性にする制限部位が両端に形成さ
れるようにcDNAを裁断（tailor）する。これに付随して
シグナルペプチド及びプロペプチドをコードする配列が
除去される。 3.apoA I遺伝子を発現ベクターに正しい読取枠で挿入す
る。突然変異T6及び／またはM Iを導入してもよい。apo
A I遺伝子またはその変異遺伝子はオペロン内の唯一の
構造遺伝子でもよい。または、apoA Iまたはその遺伝変
異体を融合タンパク質として発現させたい場合にその
５′端を担体ペプチドをコードするDNA配列に付着させ
てもよい。 4.apoA Iまたはその遺伝変異体を内部で発現させ得る宿
主を発現ベクターで形質変換する。 5.形質変換した宿主を培養し、得られた所望タンパク質
を回収する。 apoA Iまたはその遺伝変異体をコードする遺伝子が１
つ以上のイントロンを含まずに入手できる場合、この遺
伝子はベクター内に存在するプロモーターの転写コント
ロール下にベクターに枠内（in frame）挿入される。遺
伝子は担体ペプチド配列をコードするDNA配列の直後に
挿入され得る。従って式（１）のタンパク質をコードす
るDNA配列は適当なプロモーターを備えたベクター内の
転写開始コドンと終了コドンとの間に挿入され得る。pr
oapoA Iまたはその遺伝変異体をコードする遺伝子も同
様にベクター内に挿入され得る。得られた発現ベクター
によって形質転換された宿主の培養によって所望のタン
パク質を産生し得る。 融合タンパク質の担体ペプチド部分は、β−ガラクト
シダーゼのＮ−末端アミノ酸残基に由来してもよい。例
えば、β−ガラクトシダーゼの最初の15個以内のＮ−末
端アミノ酸残基に由来し得る。好ましくは残基５〜15、
より好ましくは残基８〜12に由来する。このようにして
得られた好ましい担体ペプチドは配列、 かかる担体ペプチドを組み込んだ融合タンパク質を発
現させるとき、その前にMetが存在する。これはプロテ
インＡの１つ以上のIgG−結合ドメインを含む別の担体
ペプチドを使用する場合にも同じである。かかる担体配
列は、ブドウ球菌プロテインＡの完全配列または該タン
パク質の残基23〜270を含み得る。エンテロキナーゼ、
Ｘ因子またはコラゲナーゼのごときタンパク質分解酵素
の認識部位を含むアミノ酸配列が、apoA Iまたはその変
異体の配列の直前に存在してもよい。適当な配列は、 これはエンテロキナーゼの認識配列である。担体配列
中に別のアミノ酸配列が存在してもよい。例えばプロテ
インＡ配列とタンパク質分解酵素認識部位の配列との間
に30個以内の残基から成る結合配列が存在してもよい。
担体配列のＮ−末端部分が発現ベクター中のプロモータ
ーによって天然にコントロールされる構造遺伝子の第１
残基例えば20個以内の残基を含んでいてもよい。プロテ
インＡのIgG−結合ドメインを含む融合タンパク質は水
溶性であり、水性環境で適度に安定であり、例えばIgG
−結合Sepharoseを用いたアフィニテイクロマトグラフ
ィーによって均質になるまで容易に精製できる。 Ｎ−末端延長部が担体ペプチドによって準備されたか
否かにかかわりなく、式（１）の組換えタンパク質は典
型的にはヒト起源のその他のタンパク質を実質的に含ま
ない。言い替えると、該タンパク質は実質的に純粋な形
態で形成され、通常なら該タンパク質と会合しているタ
ンパク質が付随していない。 apoA Iまたはその遺伝変異体を含むタンパク質は治療
効果をもつのでヒトまたは動物の体内治療に使用され得
る。より詳細には、血漿コレステロール及び／またはト
リグリセリドのレベルを低下させるために使用され得
る。従って、このタンパク質は、アテローム性動脈硬化
及び冠性心疾患のごとき心血管疾患に対して使用され得
る。このタンパク質は予防のために投与されてもよくま
たは既往の病状の改善及び／または治療のために投与さ
れてもよい。 従って本発明によって産生されるタンパク質は、薬剤
的に活性の担体または希釈剤を含む薬剤組成物として提
供され得る。かかる組成物は公知の方法で処方され得
る。タンパク質は非経口投与例えば静注投与されてもよ
い。 以下に、本発明を要約する。 1. 抗ヒトapoA I抗血清を用いたELISAによって検出可
能であり、式（１） Met−Ｘ−Ｙ （１） ［式中、Ｘはβ−ガラクトシダーゼの最初の15個以内の
Ｎ末端アミノ酸に由来する配列を有する担体ペプチド配
列又はヒトapoA Iのプロ配列であり、ＹはヒトapoA I配
列か又は、ヒトapoA I配列中173位のArgがCysで置換さ
れた配列（apoA I−M I）、６位のSerがThrで置換され
た配列（apoA I−T6）もしくは上記２つの置換を有する
配列（apoA I−T6/M I）を示す］で示されるタンパク質
を、形質転換細菌宿主中で発現し得る発現ベクター。 5. ＸがヒトapoA Iのプロ配列である式（１）の前記タ
ンパク質をtrpプロモーターの調節下に発現させ得るプ
ラスミドである、上記発現ベクター。 6. 抗ヒトapoA I抗血清を用いたELISAによって検出可
能であり、式（１） Met−Ｘ−Ｙ （１） ［式中、Ｘはβ−ガラクトシダーゼの最初の15個以内の
Ｎ末端アミノ酸に由来する配列を有する担体ペプチド配
列又はヒトapoA Iのプロ配列であり、ＹはヒトapoA I配
列か又は、ヒトapoA I配列中173位のArgがCysで置換さ
れた配列（apoA I−M I）、６位のSerがThrで置換され
た配列（apoA I−T6）もしくは上記２つの置換を有する
配列（apoA I−T6/M I）を示す］で示されるタンパク質
を発現し得る発現ベクターで形質転換された細菌宿主。 9. 式（１）のタンパク質においてＸがヒトapoA Iのプ
ロ配列であり、trpプロモーターの調節下にある、上記
宿主。 10. 細菌宿主が大腸菌株である、上記宿主。 以下に本発明の実施例を説明する。 実施例１ 材料及び方法 菌株及び培地 菌株：大腸菌K12JM101（Messing等、Nature、314:309−
321、1981）、MC1061（Casadaban and Cohen、J.Mol.Bi
ol.138:179−207、1980）、71/18cI857（Lorenzetti
等、Gene、39:85−87、1985）、RL841（Kenkel、Proc.N
atl.Acad.Sci.USA、82:488−492、1985）、CAG629（rpo
H165、lon−;C.A.Gross、Madison、Wisconsin）。 培地：全部の菌株を必要に応じて50μg/mlのアンピシリ
ンを加えたLB培地（LA培地）で増殖させた。適当な場合
にはlacプロモーターを抑制解除するために1mMのIPTGを
培地に添加した。 酵素、酵素反応及びDNA精製 リゾチームはSigma（St.Louis、MO、USA）から入手。
制限エンドヌクレアーゼはBoehringer（Mannheim、D
E）、BRL Inc.（Gaithersburg、MD、USA）またはNew En
gland Biolabs（Beverly、MA、USA）から入手。T4ガー
ゼ及びその他の全部の酸素はBoehringerから入手。特に
注釈がなければすべての酵素反応は酵素を製造業者の指
示通りに使用して行なった。制限エンドヌクレアーゼ分
解によって得られたDNAフラグメントをアガロース水平
ゲルまたはポリアクリルアミド垂直ゲルを用いた電気泳
動によって分離し、ISCO Mod.1750濃縮器（ISCO CO.、L
incoln、NE、USA）を使用し電気溶出法の修正方法でゲ
ルマトリクスから抽出し、更にElutip−ｄカラム（Schl
eicher and Schuell、Keene、NH、USA）で精製した。 細菌抽出物のapoA I認識のためのエンザイムイムノアッ
セイ（ELISA） ペレット化した細菌を溶菌緩衝液（50mMのTris−Cl p
H7.0、30mMのNaCl、0.1％のNaN₃、10mg/のフェニルメ
チルスルホニルフルオリド）に再懸濁させた。溶液をリ
ゾチームで1mg/mlにし、４℃で30分間撹拌した。５回の
凍結乾燥サイクル後に抽出物を以下のごときエンザイム
イムノアッセイで試験した。 標準96ウェルのマイクロタイタープレートを、ヒツジ
で感作した適当な希釈度の抗ヒトapoA I抗血清で４℃で
１晩被覆した（Boehringer、Mannheim、DE）。0.05％の
Tween−20と0.01％のMerthiolateとを含む10mMのTris−
Cl pH8.0で３回洗浄後、50μの系列希釈度の標準apoA
I（TAGO Corp.、Burlingame、CA、USA）または細菌抽
出物を添加し、37℃で１時間インキュベートした。同じ
緩衝液で３回洗浄後、50μの適当な希釈度のウサギ抗
ヒトapoA I抗血清（Immuno Ltd.、Dunton Green、Nr.Se
venoaks、Kent、GB）を添加し、硫酸アンモニウム沈殿
によって更に精製した。37℃で１時間維持し、更に３回
洗浄後に、New England Nuclear（Boston、MA、USA）か
ら提供されるプロテインＡ−西洋ワサビペルオキシダー
ゼキットを製造業者の指示通りに用いてウェルを染色し
た。 Affigel 10に対するヒツジ抗ヒトapoA Iの結合 ヒツジ抗apoA I抗体（Boehringer、Manneheim、DE）の
調製:20mlの非希釈抗体溶液を不断に撹拌しながら0.1M
リン酸緩衝液pH7に４℃で１晩透析した。次に遠心して
破片と上清とを分離した。 Affigel 10（Bio−Rad、Richmond、CA）の調製:1/2容の
イソプロピルアルコールと倍容の蒸留水とを順次用いた
洗浄サイクルの繰り返し（４〜５回）を行なう前に40ml
を室温で平衡させた。過によってゲルを乾燥させ、50
mlのfalcon管に移し透析抗体を加えた。次に管を絶えず
撹拌しながら４℃で８時間インキュベートし、1mlの1M
のグリシンエチルエステルを添加し、インキュベーショ
ンを１晩継続した。次に以下の溶液でゲルをおおまかに
洗浄した。 −100mlのPBS＋0.1％ナトリウムアジド −100mlの1M酢酸 −100mlの0.1Mリン酸緩衝液pH7＋0.5MのNaCl −100mlのPBS＋0.1％ナトリウムアジド ゲルをカラムに詰めローディングバッファ（PBS＋10m
g/のPMSF＋10mg/のPepstatin A）で平衡させた。 イムノブロット分析 Laemmli法を使用し標本を（適当な濃度で）ポリアク
リルアミド平板ゲルに流した。次にtransblot装置（Bio
−Rad）を25mMのTris塩基、192mMのグリシン、20％のメ
タノール中で0.2Aで４℃で４時間使用しゲルをニトロセ
ルロースフィルターに移した。ゲルを受容したフィルタ
ーを蒸留水で洗浄し、次にPBS＋３％BSAと共に穏やかに
撹拌しながら１時間インキュベートした。フィルターを
蒸留水で再度洗浄し、PBSで1:250に希釈した第１抗体
（ELISAで第２抗体として使用されるものと同じ）と共
に室温で１時間インキュベートした。PBS及びPBS＋0.05
％Tween20で２回洗浄後、1:7500に希釈した第２抗体
（西洋ワサビペルオキシダーゼと結合したヤギで感作し
た抗ウサギIgG;Bio−Rad）と共にフィルターを室温で１
時間インキュベートした。更に２回洗浄後、フィルター
を４−クロロ−１−ナフトールで染色した。 結果 apoA I遺伝子の５′端復元 apoA Iをコードする完全cDNAクローン（pA I/A）は、
シグナルペプチドとプロペプチドと完全成熟apoA Iタン
パク質とのコード配列をもつヒト肝臓cDNAライブラリイ
から得られた（Sharpe等、Nucl.Acids Res.、12:3917−
3932）。成熟apoA Iの最初のコドンの上流配列全部が除
去されるように遺伝子の５′端を復元した。このため
に、プラスミドpA I/AをEcoR I及びBamH Iで分解し、cD
NAインサートを含む890bpのフラグメントを単離し、１
％アガロースゲルから回収した。フラグメントを部分分
解条件下にSau3A Iで制限し、混合物を成熟タンパク質
の最初の９個のアミノ酸のコード配列を復元するように
設計されたリン酸化合成アダプターに結合し、大腸菌に
おけるコドン使用に従って最適な配列を得た。アダプタ
ーは以下の手順で調製した。ホスホトリエステル法（Cr
ea and Horn、Nucl.Acids Res.、8:2231−2348、1980）
によって４つのオリゴヌクレオチドを合成した。 等モル量の４つのオリゴヌクレオチド全部を一緒に結
合し、結合混合物をSau3A Iで処理し、アダプターを溶
出し、ポリアクリルアミドゲルから精製した。得られた
アダプターの配列を第２図に示す。 精製アダプターと部分Sau3A I切断apoA Iフラグメン
トとを含む結合混合物をBamH Iで分解した。790bpのフ
ラグメントをポリアクリルアミドゲルから精製し、コウ
シ腸ホスファターゼで処理したBamH I切断pAT153−Pvu
II8に結合した。MC1061の形質転換後、リン酸化したオ
リゴヌクレオチド３をプローブとしたハイブリダイゼー
ションによって組換え体をスクリーニングした。陽性コ
ロニーを単離し、更に制限酵素分解によって特性決定
し、Maxam and Gilbert（Methods Enzymol．、65:499−
560、1980）に従って部分化学分解した。正しい方向付
けのアダプターを含むプラスミドをpa I/12と命名し
た。 このような復元後にはATG開始コドンとBamH I付着端
とがapoA I遺伝子の５′端の前に存在していた。この戦
略を用い、成熟apoA Iコード配列をShine−Dalgarno配
列の後にBamH I部位を担う任意の発現ベクターに移動さ
せ得る。 pFCE4＋を使用した組換えベクターの構築 修飾apoA I遺伝子を含むBamH Iフラグメントを精製
し、pFCE4＋（Lorenzetti等、1985）のBamH I部位にサ
ブクローニングした。得られた構築物が正しい方向付け
のインサートを含むことをジデオキシチェーンターミネ
ーション配列決定（第3A図）によって確認した。このプ
ラスミドをpLS66と命名した。 この戦略を用い、ベクター中に既に存在するATG開始
コドンに対して枠外（out of frame）にapoA I遺伝子を
挿入した。従って次の段階ではapoA I遺伝子をこのATG
開始コドンの直後に配置することによって読取枠を復元
する。 枠内配置 pFCE4系を使用し、欠失させるべき領域の両端の塩基
延長部に相補的な配列をもつ「ブリッジ」オリゴヌクレ
オチドを使用してクローン遺伝子の枠内配置異を行なう
ことが可能である（Sollazzo等、Gane、37:199−206、1
985）。 このために、ホスホトリエステル頬を使用し以下の配
列をもつ単鎖オリゴヌクレオチドを合成した。 このオリゴヌクレオチドはその５′端でベクターのAT
G（ヌクレオチド１〜10）を含む直前領域にアニーリン
グし、その３′端でapoA I遺伝子の最初の８個のヌクレ
オチドにアニーリングし、その結果pLS66に存在する余
分な８つのヌクレオチドを鎖から除外する（loop ou
t）。pLS66のssDNAは大腸菌RL841を宿主として（Kunke
l、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、82:488−492に記載のごと
く）調製した。この細菌株はpFCE4中に存在するPLプロ
モーターの温度感受性リプレッサーを産生するプラスミ
ドpCI857（M.Zabeau）を含む大腸菌RZ1032の誘導体であ
る。 このプロトコルを使用してこの菌株から産生されたss
DNAはチミンに置換したラウシル残基を数個含み、従っ
て「in vitro」で正常な機能鋳型として作用するが、こ
れらのプラスミドの正常宿主である野性型（ung＋）大
腸菌71/18cI1857の形質転換に使用されたときは生物学
的に活性でない。 15mMのTris−Cl pH8.5及び15mMのMgCl₂中で0.1ピコモ
ルのpLS66 ssDNAを２ピコモルのキナーゼ化した突然変
異オリゴヌクレオチド（20倍過剰）と56℃で30分間アニ
ーリングした。室温に冷却後、延長−結合混合物を添加
し反応を15℃で１晩継続させた。延長反応混合物は以下
のごとく調製した（最終濃度）。10mMのTris−Cl pH8.
5;10mMのMgCl₂;0.5mMのATP;0.05mMのdNTPs;5mMのDTT;1
単位のDNAポリメラーゼ、Klenowフラグメント及び1.5単
位のT4 DNAリガーゼ。 インキュベーション後に反応混合物をフェノール抽出
し、イソプロパノール及びエタノールで沈殿させた。71
/18cI857コンピテント細胞を形質転換し、選択培地LAに
プレートした。所望の欠失を含むクローンを同定するた
めに150にコロニーを採取し、定序プレートで増殖させ
ニトロセルロースフィルターに移した。突然変異オリゴ
ヌクレオチドをプローブとして使用し６×SSC及び10×D
enhardt's中で室温でハイブリダイゼーションを行なっ
た。次に６×SSC及び0.1％SDS中で異なる２つの温度で
フィルターを洗浄した。最初の温度はハイブリダイゼー
ション効率を検査するために室温であり、次の温度は理
論的融解温度より４℃低い50℃である。これは式Tm＝４
×CG＋２×AT〔式中、GC及びATは突然変異鋳型とオリゴ
ヌクレオチドとによって形成された対合の数である（No
rrander等、Gene、26:101−106、1983）によって計算し
た。毎回の洗浄後にフィルターをＸ線感受性フィルムに
露光した。ストリンジェントな温度でも陽性シグナルを
生じる有望な突然変異コロニーをジデオキシチェーンタ
ーミネーション配列決定（第3B図）によって確認した。
このプロトコルの効率はかなり高く約50％である。apoA
I遺伝子が正しく枠内に配置されたpFCE4＋をpML11−20
と命名した。 apoA I変異体T6及びM Iの構築 ２つの変異体apoA I−T6及びapoA I−M Iを構築する
ためにpLS66及びpML11−20を鋳型として使用した。転移
BamH Iフラグメント内に正しく枠内配置された変異体遺
伝子を同時に得るために双方の鋳型を使用したのであ
る。 このために、常用のプロトコルによって２つの単鎖オ
リゴヌクレオチドを合成した。 オリゴヌクレオチド１は成熟apoA Iの第１コドンの第
１ヌクレオチドを示す。オリゴヌクレオチド１は17位に
不適正（Ｇ対Ｃ）を伴って残基８〜24にアニーリングす
る。オリゴヌクレオチド２は517位に不適正（Ｃ対Ｔ）
を伴って残基510〜524にアニーリングする。 枠内配置と同じプロトコルで突然変異誘発実験を行な
った（第4A図及び第4B図）。重複突然変異体（double m
utant）を得るためにまずT6突然変異を誘発し次にM I突
然変異を追加した。 得られたプラスミドを以下のごとく命名した。 pIL−５＝２つのBamH I部位間のapoA I−T6 pIL−5I＝２つのBamH I部位間のapoA I−M I pIL5−6I＝２つのBamH I部位間のapoA I−T6/M I pIL8−６＝枠内のapoA I−T6 pIL8−Ｉ＝枠内のapoA I−M I pIL8−6I＝枠内のapoA I−T6/M I 変異体apoA I−RP5及びIP1の構築 apoA I遺伝子及びその変異体T6及びM Iを含むDNAフラ
グメントをBamH I分解によってプラスミドpLS66、pIL5
−６、pIL5−Ｉ及びpIL5−６から切除し、記載のごとく
１％アガロースゲルで精製した。次にフラグメントをpU
C8及びpUC9（Vieira and Messing、Gene、19:259−26
8、1982）に結合し、双方をBamH Iで直線化した。JM101
コンピテント細胞の形質転換後、組換えプラスミドを高
速破壊法で同定し、単離物をBamH Iで切除することによ
って確認した。Hind III及びXho Iで切除することによ
ってインサートの対向する２つの方向（orientation）
を識別した。 pUC8を用いた構築物は、メチオニン残基と細菌β−ガ
ラクトシダーゼ遺伝子に由来のα−ペプチドの最初の９
個のアミノ酸とがその直前に存在する既に枠内配置され
たapoA I遺伝子を含んでいた。その結果、β−ガラクト
シダーゼのapoA I分子のＮ−末端に10個のアミノ酸から
成る延長部が存在した。 apoA I遺伝子を正しい方向付けで含むすべての組換え
pUC9誘導体では、更にapoA I遺伝子を枠内配置する操作
が必要であった。まずATG翻訳開始とapoA I遺伝子との
間を制限酵素Hind III及びSal Iで切断した。切断によ
って生じた付着端をDNAポリメラーゼ（Klenowフラグメ
ント）で埋め戻し、T4 DNAリガーゼで再結合した。この
結果、apoA I遺伝子の前方のpUC9の多重（multiple）ク
ローニング部位で10個のヌクレオチドが欠失し、正しい
読取枠が復元された。 組換えプラスミドを以下のごとく命名した。 （ａ）pUC8系列 pIPI＝apoA I−IPI pIPI−６＝apoA I−IPI/T6 pIPI−Ｉ＝apoA I−IPI/M I pIPI−6I＝apoA I−IPI/T6/M I （ｂ）pUC9系列 pRP5＝apoA I−RP5 pRP5−６＝apoA I−RP5/T6 pRP5−Ｉ＝apoA I−RP5/M I pRP−6I＝apoA I−RP5/T6/M I 延長変異体を形成した理由は、プラスミド中に存在す
る調節要素の後に天然の配列たる細菌β−ガラクトシダ
ーゼのＮ−末端が存在することによって発現レベルが向
上するからである。 大腸菌株における発現 （１）（「枠内配置」の項で既に説明した）プラスミド
pCI856を担う細菌宿主CAG629をすべての組換えpFCE4誘
導体で形質転換させた。 32℃で１晩増殖させた培養物をLAで1:10に希釈し、震
盪フラスコ中でOD₆₅₀0.5〜0.6まで増殖させ、次に温度
を42℃に上昇させてインキュベーションを１〜２時間継
続した。誘発後、細胞を10分間氷冷し遠心によってペレ
ット化した。次にペレットを「ELISA」の項で記載のご
とく処理して細胞を破壊した。細胞抽出物を16,000rpm
で４℃で30分間遠心し、上清を「材料及び方法」の項に
記載のごとくアフィニティカラムに通した。保持された
タンパク質をおおまかに洗浄し、1Mの酢酸で溶出させ
た。溶出分画をイムノブロット分析（第５図）及び「EL
ISA」によって検定した。pML11−20で得られた予備結果
を平均すると培養物１当たり約0.2mgのapoA Iが存在
した。 突然変異体apoA I−T6、apoA I−M I及びapoA I−T6/
M Iを担う他のすべての構築物に関しても同様の結果が
得られた。 （２）すべての組換えpUC8/9誘導体で細菌宿主MC1061を
形質転換させた。 37℃で１晩増殖させた培養物をLAで1:100に希釈し、
震盪フラスコで１時間増殖させてから1mMのIPTGを添加
し、次に更に４〜６時間インキュベーションを継続し
た。このインキュベーション後、細胞を10分間氷冷し遠
心によってペレット化した。この段階以後はpFCE4誘導
体で記載した手順と同じ抽出手順で処理した。pIPI及び
pRP5を含む細胞の粗抽出物をイムノブロット分析（第６
図）及び「ELISA」によって検定した。予備結果を平均
すると培養物１当たり10mgのapoA Iが得られた。 apoA I−PR5及びapoA I−IPIに組み込まれた突然変異
体apoA I−T6、apoA I−M I及びapoA I−T6/M Iを担う
他のすべての構築物に関しても同様の結果が得られた。 実施例２ apoA I遺伝子を担う949bpのフラグメントがSma I部位
に挿入されているベクターpPIT2T（Pharmacia、Swede
n）を使用して別の変異体を構築した。このプラスミド
によって発現されたタンパク質は541個のアミノ酸から
構成されていた。これらはＮ−末端から順にλファージ
のCROタンパク質の最初の11個のアミノ酸とブドウ球菌
プロテインＡの配列の248個のアミノ酸（残基23〜270）
と５つの異常なアミノ酸 とを含み、これらは成熟ヒトapoA I（CPA−A Iと命名）
またはその変異体apoA I−T6、apoA I−M I、apoA I−T
6/M Iの配列の直前に存在した。これらのキメラタンパ
ク質は安定でありまた水溶液に可溶である。 CPA−A Iとラット肝細胞及び培養マウスマクロファー
ジとの相互作用を試験した。¹²⁵I標識CPA−A Iを培養細
胞と共に４℃でインキュベートするとハイブリッドタン
パク質がHDLに対する場合と同様の結合パラメータで細
胞表面に結合することが判明した。ハイブリッドタンパ
ク質は37℃で細胞に吸収され内在化（internalize）す
ることが判明した。この挙動は脂質と会合してHDL粒子
を形成するときの天然apoA Iの挙動に類似する。 材料及び方法 材料 ヒト血漿から不連続KBr勾配の上でHDL（1.09＜ｄ＜1.
21g/ml）を調製した。HDLをPBS、1mMのEDTAにおおまか
に透析しKBrを除去して４℃で保存した。Klausner等
（J.Biol.Chem.、258、4715−4724、1983）の方法でヒ
トトランスフェリン（Sigma）に鉄を充填した。BSAは実
質的にIgG非含有であった（Sigma、A 7638）。Staphylo
coccus aureusプロテインＡはPharmaciaから入手し
た。フェノールレッドを含有するHank's平衡塩溶液はGi
bcoから入手した。 細胞及び細胞培養物 Fao細胞としては、Deschatrette and Weiss（Biochem
ie 56、1603−1611、1974）によって樹立され特性決定
されたラット肝癌細胞系を、５％ウシ胎児血清（FCS）
と100単位/mlのペニシリンと100μg/mlのストレイプト
マイシンと2mMのグルタミンと10mMのHEPES緩衝液pH7.4
とを加えたCoon改質Ham培地（Seromed）で単層培養した
ものを用いた。 J774細胞としては、マウスマクロファージ細胞系（Ra
lph等、J.Immunology 114、898−905、1975）を4.5％の
FCSとペニシリンとストレプトマイシンとグルタミンとH
EPES緩衝液pH7.4とを後述の濃度で含むDMEM培地で遠心
懸濁培養したものを用いた。 細菌株及びプラスミド 細菌宿主は大腸菌HB101株（Boyer and Roulland−Dus
soix、J.Mol.Biol.41、459−472、1969）及びRR1 M15
（Langley等、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 72、1254−125
7、1975）。プラスミドはpNF2690（Nilsson等、EMBO J.
４、1075−1080、1985）、pLM3（Monaco等、Atti Conve
gno Congiunto A.G.I.−S.I.B.B.M.、195−196、1985）
及びPharmacia、SwedenのpRIT2Tを使用した。 DNA構築物 制限酵素、Klenow DNAポリメラーゼ及びT4 DNAリガー
ゼはBoehringer Mannheimから購入し製造業者の指示通
りに使用した。大腸菌の形質転換はMorrisonの方法（Me
thods Enzymol.68、326−331、1979）で行なった。 ハイブリッド遺伝子の発現 ハイブリッド遺伝子はλPRプロモーターのコントロー
ル下に実質的にZabeau and Stanleyの方法（EMBO J.
１、1217−1224、1982）で発現させた。細菌を30℃でOD
₆₀₀＝0.9まで増殖させた。54℃に予熱した等容のブイヨ
ンを添加して温度を急激に42℃に上げた。採取以前に培
養物を42℃で90分間インキュベートした。細胞溶解物全
部をZabeau and Stanley（1982）に記載のごとくゲルに
充填した。 ハイブリッドタンパク質の精製 ハイブリッドタンパク質の精製にはMarston等（Biote
chnology 2、800−804、1984）の方法を用いた。細菌ペ
レットを３倍容（w/v）の緩衝液Ａ（50mMのTris/HCl pH
8.0、50mMのNaCl、1mMのEDTA）に再懸濁させ、氷上で５
×20sec超音波処理した。遠心後（Sorvall SS34ロー
タ、10,000rpm、４℃で10分間）、ペレットを0.5％のTr
iton X−100と10mMのEDTAとを含む９倍容（w/v）の緩衝
液Ａに再懸濁させ、室温で５分間静置した。懸濁液を上
記のごとく遠心し、ペレットを8M尿素を含む９倍容（w/
v）の緩衝液Ａに再懸濁させ、室温で１時間インキュベ
ートした。 尿素懸濁液を９倍容（w/v）の50mMのリン酸カルシウ
ム緩衝液pH10.7、50mMのNaCl、1mMのEDTAに添加し、KOH
の添加によってpH10.7を維持しつつ室温で30分間撹拌し
た。次に懸濁液を中和し、４℃で緩衝液Ａに透析した。
透析した懸濁液を上記のごとく遠心した。透明上清中の
ハイブリッドタンパク質は既に適度に純粋であり、この
段階のハイブリッドタンパク質の平均収量は細菌培養物
１当たり50〜60mgであった。IgG−Sepharose 6 FF（P
harmacia）を用いたアフィニティクロマトグラフィーに
よって更に精製した。標本をカラムに充填し、0.05％Tw
een20含有のPBS、PBS及び5mMのAcONH₄ pH5を順次用いて
洗浄し、1MのAcOH/AcONH₄ pH2.8で溶出した。精製タン
パク質を緩衝液Ａに透析した。 Biogel 1.5Aゲル過カラムを用いた較正 BioRadのBiogel 1.5Aカラム（40cm×1cm）を50mMのTr
is/HCl pH8.0、50mMのNaCl、1mMのEDTA中で平衡させ
た。標本を流速3ml/時で溶出させ、250μの分画を回
収した。カラムをデキストランブルー（2,000kD）、チ
ログロブリン（699kD）、フェリチン（440kD）、HDL（2
85kD）及びアルドラーゼ（158kD）で較正した。1.25μ
ｇの［¹²⁵I］−CPI−A Iまたは800μｇの非標識CPA−A
Iを使用してハイブリッドタンパク質の分子量を決定し
た。 タンパク質のヨウ素化 Iodo−Gen試薬（Pierce Chemical Co.）を使用してタ
ンパク質をヨウ素化した。ヨウ素化反応は100μｇのIod
o−Gen、200μのPBS中の1mgのタンパク質、1mCiの無
担保Na［¹²⁵I］、16.5mCi/μｇ（Amersham Internation
al）を含んだ。４℃に10分間維持後10mlのSephadex G50
カラムで遊離ヨウ素をタンパク質から分離した。PBS
（0.2％BSA）でカラムからHDL、トランスフェリン及びI
gGを溶出し、50mMのTris/HCl pH8.0、0.15MのNaCl、1mM
のEDTA、0.2％のBSAでハイブリッドタンパク質を溶出し
た。ハイブリッドタンパク質、IgG及びトランスフェリ
ンは透析しないで使用した。HDLは、標識の５％未満が1
0％（w/v）トリクロロ酢酸に可溶になるまでPBS、0.5mM
のEDTAにおおまかに透析する必要があった。クロロホル
ム／メタノールを用いた脂質抽出後の測定によれば、５
％未満の標識が脂質と結合した。得られた特異的活性は
タンパク質1ng当たり200〜400cpmであった。 結合アッセイ 懸濁細胞に対して４℃で２時間の結合アッセイを行な
った。Fao細胞の懸濁液を得るために、単層をPBS、1mM
のEDTAで37℃で30分間インキュベートした。これらの細
胞または懸濁液で増殖させたJ774マクロファージを４℃
で1000g×５分間ペレット化し3mlのHanks/BSAに再懸濁
させることによって３回洗浄した。各結合アッセイは、
1mlのHanks/BSA中に１×10⁶細胞と指標量の［¹²⁵I］−a
poA I−PAまたは［¹²⁵I］−HDLとを含有していた。４℃
で２時間維持後、細胞をHanks/BSAで４回洗浄し、Eppen
dorf管に移し、γカウンタで放射能を測定した。競合実
験として10μｇのヨウ素化リガンドを10〜800μｇの非
標識HDL、CPA−A I、プロテインＡまたはトランスフェ
リンによって競合させた。これらは夫々ヨウ素化リガン
ドの添加30分前に４℃で細胞に添加した。 HDL及びCPA−A Iのリガンドブロット J774細胞（２×10⁸）をPBSで２回洗浄し、10mMのTris
/HCl pH7.4、0.1mMのEDTA中で均質化した。2000gで10分
間遠心してポスト核上清（PNS）を調製した。PNSを１％
（v/v）Triton X−114（Bordier、J.Biol.Chem.、256、
1604−1607、1981）で抽出した。洗剤相をジチオトレイ
トール含有の等容の標本緩衝液と混合し、沸騰させ、次
にヨードアセトアミドでアルキル化した。レーン当たり
約1mgのタンパク質を５〜15％のSDSポリアクリルアミド
ゲルに塗布した。ゲルをニトロセルロースフィルターに
ブロットし、Ponceau S染色によってバンドを可視化し
た。10％（w/v）の低脂肪粉乳を含有するHanks中でニト
ロセルロースストリップを６時間消光（quench）させ
た。リガンド、即ち［¹²⁵I］−CPA−A Iまたは［¹²⁵I］
−HDLを12.5μg/mlでHanks/乳に16時間結合した。次にH
anks/乳でストリップを４回洗浄し、ヒトHDL、CPA−A I
またはプロテインＡ（血清で1/50に希釈）に対するウサ
ギ抗血清でリガンドを検出し、ジアミノベンジジン反応
（Burnette、Anal.Biochem.、112、195−203、1981）で
検出される抗ウサギIgGペルオキシダーゼの存在下にイ
ンキュベートした。乾燥ブロットをＸ線フィルムに露光
した。 分析方法 Frank and Trosin（H.Tschesce編:Modern Methods in
Protein Chemistry、Walter de Gruyter ＆ Co.、Berl
in、287−302、1985）に記載の構造の気−液相マイクロ
シーケンサにおいてLottspeich（Hoppe Seyler's Z.Phy
siol.Chem.、361、1829−1834、1980）に従って全自動
化Edman分解によってアミノ末端の配列決定を行なっ
た。ハイブリッドタンパク質のカルボキシ末端配列を決
定するために、カルボキシペプチダーゼ、ε、Ａ及び／
またはＢをTadros等（Eur.J.Biochem.、138、209−21
2、1983）の方法で使用した、アミノ酸分析のためにタ
ンパク質をTadros等（Eur.J.Biochem.127、315−318、1
982）の方法で加水分解し、全自動アミノ酸アナライザ
ー（Durrum D−500）を使用してアミノ酸組成を決定し
た。トリプトファン及びシステインは決定しなかった。 鏡検のために２％ホスホタングステン酸を使用しHDL
及びCPA−A Iの標本をネガティブ染色した。Bradfordの
方法（Anal.Biochem.、72、248−254、1976）でタンパ
ク質濃度を検定した。 結果 ハイブリッドタンパク質CPA−A Iをコードする遺伝子を
担うプラスミドpLM8の構築 ベクターpRIT2Tは大腸菌中の細胞内タンパク質を温度
誘発的に発現させるべく設計されたpRIT2の誘導体であ
る（Nilsson等、1985）。構築物はλPRプロモーターの
コントロール下にブドウ球菌プロテインＡのIgG結合ド
メインを含む。多重クローニング部位はプロテインＡの
３′端に外来遺伝子を容易に挿入せしめる。プロテイン
Ａ転写終了配列は多重クローニング部位の直ぐ下流に挿
入される。プラスミドpLM3はヒトapoA Iの成熟遺伝子に
枠内融合した大腸菌IacZ遺伝子を含む（Monaco等、198
5）。 PAとapoA Iとの融合を担うプラスミドpLM8を第７図の
手順で構築した。制限部位EcoR I及びCla Iを末端にも
つ949bpのフラグメントをpLM3から単離し、Klenow DNA
ポリメラーゼによって埋め戻した。フラグメントの突出
端をSma I直線化pRIT2Tに結合させた。得られたプラス
ミドpLM8はタンパク質分解性切断の特異的配列によって
隔てられた５′端のプロテインＡの遺伝子と３′端の成
熟ヒトapoA I遺伝子とから構成された541個のアミノ酸
から成る融合タンパク質をコードする読取枠を保有す
る。 ハイブリッドタンパク質の発現、単離及び精製 温度感受性CI857λリプレッサー突然変異体をコード
する適合プラスミドpNF2690の存在下にpLM8を保有する
大腸菌細胞は大量のハイブリッドタンパク質を発現する
ことが可能であった。42℃で増殖させると誘発CPA−A I
の量が総量の約20％を示した。ハイブリッドタンパク質
の見掛け分子量は予想通りSDA−PAGEで62kDであった。
標準抽出方法（超音波、凍結乾燥、リゾチーム−Triton
X−100）では成功しなかった、8M尿素中での超音波処
理細菌のインキュベーションとアルカリ緩衝液の添加と
を順次に含む変性手順を採用した。中和及び透析によっ
て再生後、懸濁液を遠心すると、透明上清は90％を上回
る純度の融合タンパク質をを含有していた。IgG Sephar
oseによるアフィニティクロマトグラフィーによって更
に精製した。 ハイブリッドタンパク質の特性決定 ハイブリッドタンパク質をヒツジで調製した特異的ap
oA I抗体による認識によって同定した。プロテインＡは
ヒツジ抗体を認識しない。 最初の８個のアミノ酸から成るアミノ末端配列と最終
３個のアミノ酸から成るカルボキシ末端配列とは既知の
apoA I及びプロテインＡの配列と一致した。またアミノ
酸組成分析も予想組成と一致した。 細胞表面に対するハイブリッドタンパク質の結合を定
量するために（後記参照）、天然の分子量を決定するこ
とが必要であった。これは、Biogle 1.5Aを使用するゲ
ル過によって行なった。カラム溶出のピーク分画は分
子量316kDを与え、これは単量体の分子量62kDの５倍に
相当した。ハイブリッドタンパク質溶出のプロフィール
（profile）は、別の多量体も存在しまたボイド容量（v
oid volume）に少量の凝集物質が存在することを示し
た。すべての実験において天然分子量として平均サイズ
316kDを使用した。これを同じカラムで標準として使用
したHDLの285kDに比較した。ヨウ素化ハイブリッドタン
パク質の溶出分布は非標識ハイブリッドタンパク質で得
られたものと同様であった。 電子顕微鏡によるネガティブ染色後にHDL及びハイブ
リッドタンパク質粒子を試験した。顕微鏡写真は、直径
９〜12nmの範囲の均質粒子集団を示した。ハイブリッド
タンパク質粒子はHDLよりやや大きいサイズをもちゲル
過によって得られた結果を追認した。 ハイブリッドタンパク質及びHDLの生物学的活性の比較 細胞表面レセプターに対する結合能を試験するために
大腸菌から精製されたハイブリッドタンパク質とヒト血
漿から精製されたHDLとを平行に使用した。複数の細胞
タイプ、即ちマウスマクロファージ（J774）及びラット
肝細胞（Fao）の細胞系を試験した。これらの２つの細
胞タイプはHDLを異なる方法で処理することが判明して
いる。マクロファージにおいてはコレステロール交換が
生じ肝細胞においては分解が生じる。 ４℃における結合データ ヨウ素化リガンドを４℃で２時間細胞に結合させた。
30分間で結合量が平坦域に到達した。非特異的な量を判
定するために500μｇの非標識リガンドとの競合を使用
し、この値を総結合曲線から減算して特異的結合値を与
えた。特異的結合値を使用しScatchard分析（Scatchar
d、Ann.N.Y.Acad.Sci.51、660−672、1949）によって親
和性を計算した。HDL及びハイブリッドタンパク質の双
方で結合は特異的で高い親和性を有していた。J774また
はFao細胞で高親和性結合はHDLでは2.8×3.0×10^-8MのK
d、ハイブリッドタンパク質では3.5〜4.9×10^-8MのKdを
有していた。結果を後出の表２に示す。更に、HDL及び
ハイブリッドタンパク質の双方で非標識リガンドに完全
には競合しない低親和性成分が存在する。 双方の細胞タイプの高親和性結合成分は１×10⁶細胞
当たり90〜155ngの最大結合を与える。これは細胞当た
り1.9〜3.6×10⁵部位を示す。細胞当たりの結合部位の
数及び結合親和性はHDL及びハイブリッドタンパク質の
双方で顕著に類似していた。これは、単一レセプターが
関与しHDLのレセプター媒介結合にapoA I成分だけが関
係することを示唆する。 競合試験 apoA Iの特異的結合の付加的な証拠は競合試験によっ
て得られる。HDL及びハイブリッドタンパク質の双方がJ
774及びFao細胞に対する結合において互いに有効に競合
した。非特異的成分に達するまで競合が有効であった。
プロテインＡはハイブリッドタンパク質またはHDLの結
合に競合できなかった。競合試験における独立対照とし
てトランスフェリンを使用した。トランスフェリンはト
ランスフェリンレセプターを介して細胞表面に結合する
が、HDLまたはハイブリッドタンパク質の結合に競合で
きなかった。 プロテインＡ及びIgG結合活性 ハイブリッドタンパク質は同時にプロテインＡを含有
するので、プロテインＡ自体が細胞に結合できるか否か
を判断することが重要である。プロテインＡを同様に特
異的活性にヨウ素化し、J774及びFao細胞に対する結合
を検定した。高濃度のプロテインＡ（100μg/ml）が存
在する場合にも特異的結合は検出されなかった。細胞結
合放射能の量はハイブリッドタンパク量の非特異的結合
よりも少なかった。 J774細胞はIgGに対するFcレセプターを発現させるの
で、ハイブリッドタンパク質によってこれらの実験を行
なうためには配慮が必要であった。従って、［¹²⁵I］−
ウサギIgGは高親和性（Kd＝１×10^-8M）で細胞表面Fcレ
セプターに結合する。［¹²⁵I］−CPA−A IがウサギIgG
の存在下に結合すると、結合ハイブリッドタンパク質の
量は2.7倍に増加した。逆に、［¹²⁵I］−ウサギIgGがハ
イブリッドタンパク質の存在下に結合したときも結合が
増加した（1.6倍）。明らかに、IgGとCAP−A Iとの複合
体はFcレセプターまたはHDLレセプターに結合し得る。H
DLレセプターだけを試験するために、すべての結合実験
をIgG非含有培地で行なった。培地中に存在するIgGを除
去するためにBSA（実質的にIgG非含有）を加えたHanks
緩衝液で細胞を３回洗浄した。 HDLレセプターの特性決定 HDL、ハイブリッドタンパク質またトランスフェリン
の結合を検定する前にJ774細胞を４℃のトリプシンで処
理した。トリプシン処理はHDLまたはハイブリッドタン
パク質結合を減少させなかった。しかしながら、
［¹²⁵I］−トランスフェリンの結合は対照の38％まで減
少した。HDLレセプターはトランスフェリンレセプター
に比較して比較的トリプシン耐性である。 HDL及びハイブリッドタンパク質の結合に関与するレ
セプターを同定するために、リガンドブロットを実施し
た。J774細胞からのPNSのTriton X−114抽出物を還元条
件下にSDS−PAGEにかけニトロセルロースに移した。［
¹²⁵I］−HDL及び［¹²⁵I］−CPA−A Iの各々は約110kDの
バンドに結合した。このバンドをフィルターのオートラ
ジオグラフ上で［¹²⁵I］−標識リガンドを可視化するこ
とによって直接に同定するかまたはHDLに対するウサギ
抗血清を用いて抗体を検出しヒツジ抗ウサギIgGペルオ
キシダーゼで可視化することによって間接に同定した。
HDLの場合、ニトロセルロース上にヨウ素化ラベルの極
めて高いバックグラウンドが存在し、これがオートラジ
オグラフ上の特異的バンドの検出を妨害した。 実施例３ ヒトapoA Iを前駆体即ち267個のアミノ酸から成るpre
proapoA Iとして合成する。18個のアミノ酸から成るプ
レペプチドを分泌中に開裂し、proapoA Iと指称される
プロタンパク質を残す。従って、proapoA Iは６個のア
ミノ酸から成るＮ−末端延長部即ちArg−His−Phe−Trp
−Gln−Glnとこれに続く成熟タンパク質とから構成され
る。 proapoA Iを発現させるためにapoA I遺伝子の５′を
第８図に示すように合成的に復元する。６個のアミノ酸
プロペプチドを含むproapoA Iの最初の15個のアミノ酸
をコードするNde I−BamH Iオリゴヌクレオチドを合成
した。合計DNAはBamH I部位の直前にNco I部位を含んで
いた。プラスミドpDR72（Pharmacia、Sweden;Russel an
d Bennet、Gene、20、231、1982）に由来のtrpプロモー
ターを担うEcoR I−Sal IフラグメントをλcIIShine−D
algarno配列をコードする合成Sal I−Nde Iフラグメン
トに結合して図示のEcoR I−Nde I 107bpフラグメント
を得た。このDNA断片をproapoA I5′配列をコードする
フラグメントに結合し、M13mp8（Messing等、Proc.Nat
l.Acad.Sei.USA、74、3642、1977）にサブクローニング
し配列決定した。 組換えproapoA Iを発現させるために第９図のごとく
発現ベクターを構築した。発現シグナルとこれに続くpr
oapoA I遺伝子の５′端とを内包するEcoR I−Nco Iフラ
グメントを組換えM13mp8から切除し（第８図参照）、以
下の２つのフラグメントに結合した。 （ａ）EcoR I−BamH Iで切断したプラスミドpDS20の大
きいフラグメント（Duester等、Cell、30、855、198
2）、 （ｂ）apoA I配列の残りの部分を含むpML11−20に由来
のNco I−BamH Iフラグメント。 得られたプラスミドpFC33は、大腸菌Ｂ株（Delbruc
k、1946、Bacterial viruses or bacteriophages Biol.
Rev.、21:30−40）中のtrpプロモーター下にproapoA I
タンパク質またはより特定的にはMet−proapoA Iを発現
させ得た。誘発のために、アンピシリンを加えたLB培地
で細胞を１晩増殖させた。次の日に細胞をトリプトファ
ン非添加のM9培地に希釈し、37℃で６時間維持後に採取
した。 第10図はproapoA Iのゲル電気泳動及びイムノブロッ
ト分析を示す。細菌培養物のアリコートをペレット化
し、標準ヒト分画と平行にゲル電気泳動バッファに再懸
濁させた。沸騰後、標本を12.5％SDS−PAGEで電気泳動
させた。実施例１と同様にニトロセルロースフィルター
にブロッティングした。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 パロンバ，ラツフアエレ イタリー国、ミラン、ビア・フオルナ リ・46 (72)発明者 イサツキ，アントネラ イタリー国、ミラン、ビアレ・ラツイ オ・27 (72)発明者 サルミエントス，パオロ イタリー国、ミラン、ビア・エム・ビア ンキ・24 (56)参考文献 ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ，194（２) （1986），ｐ．343−346

Claims (1)

1. (57)【特許請求の範囲】 １．抗ヒトapoA I抗血清を用いたELISAによって検出可
   能であり、式（１） Met−Ｘ−Ｙ （１） ［式中、Ｘはβ−ガラクトシダーゼの最初の15個以内の
   Ｎ末端アミノ酸に由来する配列を有する担体ペプチド配
   列又はヒトapoA Iのプロ配列であり、ＹはヒトapoA I配
   列か又は、ヒトapoA I配列中173位のArgがCysで置換さ
   れた配列（apoA I−M I）、６位のSerがThrで置換され
   た配列（apoA I−T6）もしくは上記２つの置換を有する
   配列（apoA I−T6/M I）を示す］で示されるタンパク質
   を、形質転換細菌宿主中で発現し得る発現ベクター。 ２．担体ペプチド配列が、 又は である請求の範囲第１項に記載の発現ベクター。 ３．式（１）のタンパク質においてＸが であり、ベクターがそのβ−ガラクトシダーゼ遺伝子の
   α−ペプチドの９番目のアミノ酸のコドンの直後のBamH
   I部位にapoA I、apoA I−T6、apoA I−M I又はapoA I
   −T6/M Iをコードする遺伝子をもつプラスミドpUC8であ
   る、請求の範囲第２項に記載の発現ベクター。 ４．式（１）のタンパク質においてＸが であり、ベクターがその翻訳開始コドンの直後の配列 のコドンの直後にapoA I、apoA I−T6,apoA I−M I又は
   apoA I−T6/M Iをコードする遺伝子をもつプラスミドpU
   C9である、請求の範囲第２項に記載の発現ベクター。 ５．ＸがヒトapoA Iのプロ配列である式（１）の前記タ
   ンパク質をtrpプロモーターの調節下に発現させ得るプ
   ラスミドである、請求の範囲第１項に記載の発現ベクタ
   ー。 ６．抗ヒトapoA I抗血清を用いたELISAによって検出可
   能であり、式（１） Met−Ｘ−Ｙ （１） ［式中、Ｘはβ−ガラクトシダーゼの最初の15個以内の
   Ｎ末端アミノ酸に由来する配列を有する担体ペプチド配
   列又はヒトapoA Iのプロ配列であり、ＹはヒトapoA I配
   列か又は、ヒトapoA I配列中173位のArgがCysで置換さ
   れた配列（apoA I−M I）、６位のSerがThrで置換され
   た配列（apoA I−T6）もしくは上記２つの置換を有する
   配列（apoA I−T6/M I）を示す］で示されるタンパク質
   を発現し得る発現ベクターで形質転換された細菌宿主。 ７．式（１）のタンパク質においてＸが であり、前記発現ベクターが、そのβ−ガラクトシダー
   ゼ遺伝子のα−ペプチドの９番目のアミノ酸のコドンの
   直後のBamH I部位にapoA I、apoA I−T6、apoA I−M I
   又はapoA I−T61M Iをコードする遺伝子をもつプラスミ
   ドpUC8である、請求の範囲第６項に記載の宿主。 ８．式（１）のタンパク質において、Ｘが であり、前記発現ベクターが、その翻訳開始コドンの直
   後の配列 のコドンの直後にapoA I、apoA I−T6、apoA I−M I又
   はapoA I−T6/M Iをコードする遺伝子をもつプラスミド
   pUC9である、請求の範囲第６項に記載の宿主。 ９．式（１）のタンパク質においてＸがヒトapoA Iのプ
   ロ配列であり、trpプロモーターの調節下にある、請求
   の範囲第６項に記載の宿主。 １０．細菌宿主が大腸菌株である、請求の範囲第６〜９
   項のいずれか一項に記載の宿主。