PT85977B - Process for the preparation of human apolipoprotein ai and their variant forms by recombinant dna methods - Google Patents

Description

asseo para a preparação de apolipcroteina AI humana e suas formas variStrtes mediante técnicas de AEN reccmbinante

A presente invenção refere-se à produção de apolipopretei. na AI (apoAl) humana e às suas variantes por meio de tecnologia BNA recdmbinante.

A arterosclerose e as suas doenças secundarias associadas é, doenças coronárias, CHD), é talvez um dos problemas de . !·.

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-/ saúde mais críticos no mundo. Um grande numero de factores de ris ?'Co tem sido associado com a evolução da doença, sendo um dos mais importantes o elevado nível de colestrol no plasma (CHL). Portan......in' ( to, tem-se prestado uma grande atenção ao estudo do metabolismo * de CHL nos seres humanos.

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Κι·' fes gistema de transporte da lipoproteína constitui a chave v para a compreensão do mecanismo pelo qual os genes, regime alimen f tar e hormonas interactuam para regular o CHL do plasma e os ní._;. veis de triglicérido (TG) no homem. A função das lipoproteínas no plasma consiste principalmente em transportar os lípidos de um or gão para outro. Descobriu-se recentemente que elas não só solubilizam os lípidos hidrofóbicos mas também determinam o local do os? ganismo em que deve ser libertada cada classe de lípidos. Existem quatro classes principais de lipoproteínas: cros (CM), de muita baixa densidade (VLDL), e de elevada densidade (HDL).

lipoproteínas quilomi de baixa densidade

Para o transporte no plasma, o TG e os ésteres de colestrol ÇCHIÍB) são envolvidos por partículas de lipoproteína nas quais ? formam um núcleo hidrófobo rodeado por uma superfície mono-camada ·; dte fosfolípidos polares (PL). 0 revestimento da superfície também *»'« il·. '! ^,:·'·¹· V,* ϊ oontém CHL não esterificado em quantidades relativamente pequenas em conjunto com proteínas designadas apolipoproteíras (apo). Foram identificadas pelo menos nove apos : AI, AII, AIV, B (48-100), 01, CII, CIII, D e E.

E de particular interesse a investigação das relações en tre os níveis de lipoproteína do plasma e o risco de desenvolvi mento de CHI. Tanto as HDL como LDL são veículos de CHL e de CHLE; contudo existem indicações de que, enquanto os níveis de LDL-CHL são um factor de risco positivo (Kannel e outros, Ann. Intem, Med.. 90:85-91, 1979), as HDL são um importante factor de risco negativo (Yaari e outros, Lancet, 1:1011-1015, 19Ô1). Embora a função exacta e o modo de acção destas lipoproteínas não tenha sido air.da completamente compreendido, pensa-se que a HDL serve particularmente para remover o CHL dos tecidos periféricos e para o transportar de regresso ao fígado, segundo um mecanismo designado por transporte inverso de CHL (RCT).

Umaapolipoproteína principal de HDL é apoAI e diversos estudos demonstraram uma associação inversa entre os níveis de apoAI do plasma e CHD semelhante ao que está documentado pa^a os níveis de HDL-CHL e de CHL (Ishikawa e outros, Eur. J. Clin. Invest.. 8:179-182, 1978)· Além disso, ambos os níveis de HDL-CHL e de apoAI estão inversamente correlacionados com a gravida de das lesões arterioscleróticas das coronárias demonstráveis angiograficamente (Pearson e outros, Amer. J, Epidem., 109-285-295, 1979; Maciejko e outros, Nev Eng, j, Ked., 309:385-389, 1983). Deste modo pode afirmar-se que as concentrações elevadas de HDL no plasma influenciam o CHD originando 0 atraso da aterogenese e/ou promovendo a regressão das lesões existentes.

Os complexos de spolipoproteínas de HDL, principalmente apoAI, e lecitina promovem o efluxo de CHL livre a partir das células in vitro, incluindo ss culturas de células de músculo liso arterial (Stein e outros, Biochem. Bjophss. Acta, 380:106-118, 1975). A perfusão intravenosa de fosfolípidos em animais com ate roma induzido experimentalmente, influência de modo favorável este efluxo (Adams e outros, J, Path, Baet., 94:77-87, 1967), e os complexos de apoAI/lecitina são removidos do plasma a uma velocidade semelhante à das partículas de HDL naturais (Malmendier e outros, Clin, Chem. Acta, 131:201-210, 1983).

A perfusão intravenosa de apoAI em coelhos alimentados com CHL reduz as áreas de lesão em 5θ /· Isto significa que a apoAI possui um efeito protector sobre a formação da lesão ateros clerótica, possivelmente por originar 0 decréscimo de absorção de CHL na parede da aorta (Maclejko e Mao, Artheriosclerosis, 2:407a, 1982; Mso e outros, Fed, Proc, (USA), 42, no 7 pABSTBACT 357, 1983; Badimon e outros , Cardiovascular Disease *86, 1986 ABSTBACT 81).

A apoAI é a proteína principal de HDL, cerca de 70 /, ® é relativamente abundante no plasma com uma concentração de 1,0-1,2 mg/nl (Schonfield e outros, J, Clin, Invés., 69:1072, 1982). A apoAI do plasma é uma cadeia de polipeptídica simples de 243 aminoácidos cuja sequência primária é conhecida (Brewer e outros, Biochem. Biophys, Res. Commun.. 80:623-630, 1978). Na sua forma intracelular a apoAI está presente como um precursor longo de 267 aminoácidos; os primeiros 18 resíduos do N-terminal desta proteína mais longa são clivados intracelularmente pela pepti dase signal do reticulo endoplásmico, A apoAI recentemente excretada possui ainda uma extensão longa de 6 aminoácidos N-terminal; a conversão na sua forma adulta é efectuada por uma protease es— /

...

£ pecífica do plasma e/ou da linfa (Zannis and Breslow, in Advances in Human Genetics, Harris and Hirschhorn eds., Flenum, 125-215, 1985).

Demonstra-se que a parte C-terminal da molécula apoAI é constituída por unidades repetidas de 11 ou 22 aminoácidos (McLachlan, Nature. 267:465-466, 1979); todavia, os segmentos dis, postos em paralelo não são duplicações exactas, mas as substituições de aminoácidos conservam ger^lmente o tipo químico dos resíduos nas posições correspondentes das repetições. Admite-se que estes segmentos duplicados existam na configuração helicoidal anfipática (Segrest e outros, FEBS Lett.. 38:247-253» 197*1·), que se pensa ser a exigência estrutural principal para as actividades biológicas mais importantes da apo/.I, isto é, ligação de lipidos e activaçao da acil-transferase (LCAT) de CHL de lecitina. As outras duas funções da apoAI, acção como ligando para a identificação de partículas de HDL por um receptor e remoção de CHL dos tecidos periféricos, ainda não foram relacionadas com as sequências ou domínios específicos na molécula da apoAI.

A primeira variante molecular descrita de apoAI humana é a mutante de Milano (apoAI-Μ) (Franceschini e outros, J. Clin. Invest., 66:892-900, I98O). Esta caracteriza-se pela substituição Argl73-Cys (Weisgraber e outros, J. Biol. Chem.,258:2508-2513, 1983), e foi identificada em 33 indivíduos pertencentes à mesma família. Todos eles eram heterozigóticos para a apoproteína mutante, a qual é transmitida como uma característica autossomica dominante. Apresentam concentrações de HDL-CHL nitidamente reduzidas e hiper-trigliceridemia de um grau variável, existindo cor relação negativa com os níveis de HDL. Não foi possível estabe lecer qualquer associação entre a mutante e os estados patológicos específicos; ηε realidade os indivíduos afectados estavam aparentemente protegidos do desenvolvimento da aterosclerose prematura (Gualandri e outros, Am. J, Hum, Gen.. 1936,em preparação) .

A substituição do aminoácido na apoAI-ΜΙ modifica a estrutura da apoproteína mutante, conduzindo a uma redução da estrutura ordenada alfa-helicoidal e a uma exposição acrescida de resíduos hidrófobos (Franceschini e outros, J, Biol. Chem._T 260:16321-16325, 1965). A remodelação da apoproteína mutante altera significativamente as propriedades de ligação dos lípidos da molécula a qual se associa com lípidos mais facilmente do que a apoAI normal. Os complexos apoproteína/lípido são semelhantes aos que se formam com a apoAI normal mas são mais facilmente destruídos pelos agentes de desnaturação. A presença de um resíduo de cisteíns na forma, variante permite a. formação de complexos com apoAII e também dímeros apoAI; estes complexos de proteína são provavelmente responsa'veis pela formação das par tículas HDL anómalas observadas nos indivíduos afectados”.

Todos estes aspectos da apoAI-ΜΙ podem contribuir para 0 seu catabolismo acelerado e também para uma eficiente capacidade de absorção para os lípidos dos tecidos.

Até agora foram descritos diversos variantes genéticos de apoAI (Breslow, Ann, Rev. Biochem,. 54:699-727, 1985), mas nenhuma delas está associada com qualquer estado patológico ou, em geral, com alterações significativas do metabolismo de lipoproteína nos portadores (Tabela I anexa).

Os clones DNA de apoAI foram obtidos por diversos labo

4.,,,...

ratórios (Breslow, Ann. Rev. Biochem., 54, 699-727, 1985; Sharpe e outros, Nucl. Acids Res., 12: 3917-3932, 1984). 0 RNA possui um comprimento de cerca de 890 pares de bases (pb) e apresenta uma sequência 5' não traduzida de 35 pb, uma sequência de codificação de 801pb (267 aminoácidos), um codão de terminação de tradução (TGA) e uma sequência 3' não traduzida de 54pb, seguida por uma cauda poli-A. A sequência nucleotídica de cDNA completa apresenta -se na Eigura 1 dos desenhos em anexo.

Descobriu-se que a tecnologia do DNA recombinante pode ser utilizada, com sucesso, para produzir proteínas constituídas por apoAI ou uma sua variante genética. A variante pode ser apoAI em que a 6-Ser foi substituída por Thr (apoAI-T6), apoAI-ΜΙ ou uma variante que combine as mutações de ambos apoAI-T6 e apoAI-MI (apoAI-T6/MI). As proteínas podem ser detectadas pelo ensaio de imuno-absorção ligado a enzima (ELISA) com anti-soro anti-apoAI. As proteínas produzidas podem estar sob a forma de proteínas de fu são em que a apoAI ou uma sua variante genética é-fundida, na sua extremidade N, com um veículo peptídico.

Em consequência a presente invenção proporciona um vector de expressão susceptível de exprimir, num hospedeiro transformado, uma proteína que é susceptível de ser detectada por ELISA” com anti-soro anti-apoAI humano e que possui a fórmula geral (1):

Met-X-Y (1)

Em que X representa uma ligação, uma sequência peptídica de trans porte constituída por uma sequência derivada de resíduos de amino ácido N-terminal de beta-galactosidase ou uma sequência constituída por uma ou várias áreas de ligação IGG de proteína A, ou a pro sequência de apoAI humana; e Y representa a sequência de apoAI humana ou uma sua variante genética.

resíduo Met é imputável ao codão de iniciação da tradução, Os hospedeiros transformados com tal vector de expressão e em que a referida proteína é susceptível de ser exprimida, podem utilizar-se para preparar a proteína de fórmula (1). Faz-se uma cultura de hospedeiro transformado e recolhe-se a proteína de fórmula (1) assim obtida. As proteínas de fórmula geral (1) também fazem parte da presente invenção.

Nos seus aspectos preferenciais, a presente invenção refere-se a A) construção de plasmídeos recombinantes que suportam os genes para:

1- apoAI (ver Figura 1)

2- apoAI-Tó

3- apoAI-MI

4- apoAI-TóAI

5- apoAI com a seguinte extensão N-terminal Thr-Met-Ile-Thr-Pro-Ser-Phe-Asp-Gly-Ser-Met- (apoAI-RP5)

6- apoAI com a seguinte extensão N-terminal

Thr-Met-Ile-Thr-Asn-Ser-Arg-uly-Ser-Met- (apoAI-IPl),

7- a proteína que combina apoAI-Tó e apoAI-R?5 (apoAI-R?5A6),

8- a proteína que combina apoAI-Tó e apoAI-IPl (apoAI-IPl/Γό),

9- a proteína que combina apoAI-ΜΙ e apoAI-RP? (apoAI-R?5AI),

10- a proteína que combina apoAI-ΜΙ e apoAI-IPl (apoAI-ΙΡΙΛ’Ι),

11- a proteína que combina apoAI-Tó/tel e apoAI-RP5 (apoAI-RP5/T6/Ml),

12- a proteína que combina apoAI-ΤόΛΐΙ e apoAI-IPl (apoAI-IPl/Tó/Ml) e

13- apoAI com a seguinte extensão N-terminal

Arg-rHis-Phe-Trp-Gln-Gln (proapoAI)

14- a proteína que combina proapoAI e apoAI-ΜΙ (proapoAI-MI)

15- as proteínas de resíduos de aminoácido com uma extenso N-terminal proporcionadas pela proteína A de estafilococos e que são compostas a partir da sua extremidade N por:

(os primeiros 11 aminoácidos da proteína ORO do bacteridfago lambda)-(243 aminoácidos da proteína A de estafilococo (resíduos 23 a 270))-(Pro-Gly-Asp-Ser-Thr)-(os últimos 17 aminoáciI dos de beta-galactosidase)-(os 17 aminoácidos que contêm uma sequência de reconhecimento para o enzima proteolítico enteroquinase e que são Gly-Asp-Pro-Glu-rhe-Val-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys-Ser-Ser-Arg-Gly-Ser-Met)-(apoAI, apoAI-Tó, apoAI-MI ou apoAI-Tó/ΚΙ); e

B) a expressão destes genes em estirpes Escherichia coli (E, coli). Por expressão destes genes obtêm-se as proteínas seguin tes:

- uma polipoproteína seleccionada entre Met-apoAI, Met-apoAI-T6, I Met-apoAI-MI e Met-apoAI-ΤόΛΙ;

- uma proteína de fusão em que a sequência de aminoácidos, Met-Thr-Met-Ile-Thr-Pro-Ser-Phe-Asp-Gly-Ser-Met- está fundida com uma apolipoproteína seleccionada entre apoAI, apoAI-Tó, apoAI-ΜΙ e apoAI-Tó/fól}

- uma proteína de fusão em que a sequência de aminoácido Met-Thr-Met-Ile-Thr-Asn-Ser-Arg-Gly-Ser-Met está fundida a uma apolipoproteína seleccionada entre apoAI, apoAI-τό, apoAI-ΜΙ e apoAI-T6Z4I;

- uma proapolipoproteína proapoAI ou proapoAI-ΜΙ; e í *

- uma proteína de fusão composta por (os primeiros 11 aminoácidos da proteína CRO do bacteriófago lambda)-(243 aminoácidos da proteína A de estsfilococo (resíduos 23 a 270))-(Pro-Gly-Asp-Ser-Thr)-(os últimos 17 aminoácidos de beta-galactosidase)-(os 17 aminoácidos que contêm uma sequência de identificação para o enzima proteolítico enteroquinase e que são Gly-Asp-Pro-Glu-Phe-Val -Asp-Asp-Asp-Asp-Lys-Ser-Ser-Arg-Gly-Ser-Met)-(apoAI, apoAI-T6, apoAI-ΜΙ ou apoAI-T6/MI).

Nos desenhos anexos temos a considerar:

A fig. 1 apresenta a sequência de nucleótidos completa que corresponde à fôrma madura de apoAI humana. A sequência apresenta-se no sentido mRNA na direcção de 5' para 3'; a linha inferior apresenta a sequência de aminoácidos.

A 2 apresenta a reconstrução do terminal 5' do gene que codifica a apoAI humana madura. Ligou-se um .fragmento de DNA de plasmídeo pAI/A, iniciando no primeiro sítio de restrição Sau 3AI a um adaptador de oligonucleotídico sintético agregado por recircularização e ligação aos precursores 1-4 de cadeia simples. 0 fragmento de 79Opb resultante, flanquedo por dois sítios de res. trição BAM Hl codofoca para a molécula madura de apoAI.

A fig. 3 refere-se a uma sequência de nucleótidos de pLS66 e pMLll-20. As sequência apresentam a junção entre o codão inicia dor ATG de pBCE4⁺ e o começo do gene apoAI antes (pLS66,A) e após a delecção de (pMLll-20,B).

A fig. 4 refere-se à sequência de nucleótidos de pIL8-6 e pIL8-I. As sequências indicam a presença da mutação apoAI-MI (de C até T) em pIL8-I (A) e da mutação apoAI-T6 (de G até C) em pIL8-6 (B).

A fig. 5 representa a análise de imuno-mareação de pMLll-20. Fez-se a ebulição e a electroforese de alíquotas de material eluído da coluna de afinidade e de uma fraeção de HD1 humana normalizada, em duplicado em SDS-PAGE a 12,5 $. A cloraçao em filtro de nitrocelulose efectuou-se conforme descrito no texto. Vias: 1-HDL normalizada 2-eluído a partir da coluna de afinidade; 3-padroes M .

A fig. 6 apresenta a análise de imuno-blot de pRP5 e de pUC9. Aliquotas de cultura bacterianas, suportando o plasmídeo pUC9 tipo selvagem ou o plasmídeo pRP5 recombinante induzidas com IPTG, foram aglutinadas e fez-se nova suspensão em tampão apropriado para electroforese de gel, em paralelo com uma fraeçao de HDL humana, normalizada; após a ebulição fez-se a electroforese das amostras em SDS-PAGE a 12,5 /. A marcação em filtro de nitrocelulose efectuou-se conforme descrito no texto. Vias: 1-padrões M ; 2-HDL normalizada; 3-pUC9; 4-pRP5·

A fig. 7 apresenta a construção de um plasmídeo pLNS, em que as tarjetas indicam o seguinte: PROT A, AMP, LAC Z e APOAI: ge nes que codificam para proteína A, P-lactamase, p -galactosidase e apoAI adulta humana; CRO: sequência que codifica para os primeiros 11 aminoácidos da proteína lambda cro; T: sequência de terminação d? transcrição da proteína A; Fl: a sequência que envolve o bacteriófago fl;ORI origem da replicaçao; EK, AD: sequência do sítio proteolítico reconhecido pela enteroquinase. Os sí tios EcoRI e Ciai no plasmídeo pLMs não são únicos.

A fig. 8 apresenta a reconstrução da sequência proapoAI

5’.

A fig. 9 apresenta a construção do vector pF833 que é susceptível de exprimir proapoAI.

A fig. 10 apresenta uma electroforese em gel e análise de imuno-mareação da proapoAI exprimida, por pFC33. Via 1: HDL normalizada, Via 2: estirpe não recombinante, Via 3: proapoAI e Via 4: padrão de peso molecular.

Um vector de expressão de acordo com a invenção, é um vector susceptível de exprimir as sequências de DNA e, em particular, as sequências dos genes estruturais que o vector contém. As sequências de DNA que se pretendem exprimir estão na cadeia em relação com as sequências a montante que controlam a sua expressão. Pode utilizar-se qualquer sistema de promotor adequado tendo em consideração a proteína que se pretende exprimir, a natureza do hospedeiro, etc. Deste modo, pode utilizar-se um promotor seleccionado entre os promotores lac, tac e trp. No ca so presente, as sequências reguladoras 5’ são heterólogas relatj. vamente à apoAI ou à sua variante genética que se pretende expr^ mir. As sequências reguladores podem ser as do operão lac ou trp. Por outras palavras, um vector de expressão desta invenção I é susceptível de exprimir uma proteína heteróloga em que a proteína heteróloga é apoAI ou uma sua variante genética. As variantes genéticas preferenciais são apoAI-Té, apoAI-ΜΙ e apoAI-T6/ /1'1.

Os vectores de expressão da presente invenção, contendo uma sequência de DNA que codifica a proteína de fórmula (1), são tipicamente plasmídeos. Podem ser de cadeia simples, cada vector é replicável, contendo a origem da replicação. Os vectores de expressão preferenciais derivam do plasmídeo pFCS4+ no caso da expressão de apoAI ou de uma sua variante genética, pUCÔ ou pUC9 no caso da expressão de uma proteína de fusão em que a sequência portadora engloba uma sequência derivada dos resíduos de aminoácido N-terminal de betagalactosidade, pLE3 quando a sequência veicular engloba uma ou várias áreas de ligação IgG de proteína A e de pDS20 quando se pretende exprimir proapoAI ou uma sua varante genética.

No sentido de exprimir a proteína constituída por apoAI ou uma sua variante genética, transforma-se um hospedeiro adequado com um vector de expressão de acordo com esta invenção. Pode utilizar-se um hospedeiro procariótico ou aucariótico tal como uma bactéria, levedura ou uma linha de célula de mamífero. Tipicamente, o hospedeiro é uma estirpe de 5, coli. Deve escolher-se um hospedeiro no qual a proteína desejada não seja degradada pelas proteases celulares. Deste modo, em termos gerais, pode obter-se uma proteína constituída por apoAI ou uma sua variante genética de acordo com o procedimento seguinte:

1. Selecciona-se o DNA de apoAI clonado.

2. 0 cADN é talhado de modo que o gene apoAI seja provido com sítios de restrição em ambas as extremidades de modo a que fique facilmente movível. Isto pode exigir a remoção das sequências que codificam para o propéptiob e péptido sinal.

3. Insere-se o gene apoAI em um vector de expressão na cadeia de leitura correcta. Podem introduzir-se as mutações Tó e/ou 1-Ί. 0 gene de apoAI ou o gene variante pode ser o único gene estrutu ral num operão. Em alternativa, pode proporcionar-se com a sua extremidade 5’ ligada a ume. sequência de DNA que codifica um péptido veicular quando for desejável exprimir a apoAI ou uma sua u

variante genética sob a forma de uma proteína de fusão.

4. Transforma-se um hospedeiro, em que apoAI ou ε sus variante genética seja susceptível de ser expressa, com o vector de expres sao.

5. Faz-se uma cultura de hospedeiro transformado e recolhe-se a proteína desejada assim obtida.

Quando um gene que codifica a apoAI ou uma sua variante genética esté disponível sem um ou vários intrões, pode inserir-se este gene na estrutura de um vector sob controlo transcripcional de um promotor proporcionado no vector. 0 gene pode inserir-se imediatamente apds a sequência de DNA que codifica uma sequência peptídica de transporte, por conseguinte, uma sequência de ΓΝΑ que codifica uma proteína de fórmula geral (1) pode ser proporcionada entre os eodoes de iniciação e de paragem da tradução num vector na estrutura relativa a um promotor. De modo seme lhante, pode inserir-se num vector um gene que codifica proapoAI ou uma sua variante genética. A cultura de um hospedeiro transformado com o vector de expressão resultante origina a produção da proteína desejada.

A porção de pêptido de transporte de unia proteína de fusão pode derivar de resíduos de aminoácidos do N-termir.al de betagalactosidase. Por exemplo, pode derivar no máximo dos primeiros 15 resíduos de aminoácido N-terminal, de beta-galactosidase. Os resíduos preferenciais são os de 5 a 15, mais preferencíalmente os resíduos de 8 a 12. Os péptidos veiculares pieferidcs dstidos desta modo englobam as sequências:

Thr-Met-Ile-Thr-Pro-Ser-Phe-Asp-Glj-Ser-Eet ou Thr-Met-Ile-Thr-Asn-Ser-Arg-Gly-Ser-Met.

Quando se expressam as proteínas de fusão que incorporam tais péptidos veiculares, elas são precedidas por Met. Isto também se aplica quando se utiliza o péptido veicular alternati vo constituído por uma ou várias áreas de ligação IgG de proteí. na A. Uma tal sequência veicular pode inglobar uma sequência completa de proteína A de Stafilococcus, ou os resíduos desde 23 ^até 270 desta proteína. Uma sequência de aminoácidos incluindo um sítio de identificação para um enzima proteolítico tal como a enteroquinase, factor X ou colagenase, pode preceder ime diatamente a sequência para apoAI ou uma sua variante. Uma sequência adequada: Gly-Asp-Pro-Glu-Phe-Val-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys-Ser-Ser-Arg-Gly-Ser-Met.

Isto é uma sequência de identificação para a enteroquinase. Podem estar presentes outros aminoácidos na sequência veicular. Por exemplo, pode existir uma sequência de ligação com 0 máximo de 3θ resíduos entre a sequência da proteína A e a sequên cia de um sítio de identificação de um enzima proteolítico. A porção N-terminal da sequência veicular pode inglobar os primei, ros resíduos, por exemplo até 20 resíduos, do gene estrutural naturalmente controlado pelo promotor, proporcionado no vector de expressão. As proteínas de fusão constituídas por uma área de ligação IgG da proteína A são solúveis em água, razoavelmente estáveis em meio ambiente aquoso e são facilmente purificáveis até à homogeneidade por cromatografia de afinidade, por exemplo, sobre Sepharose associada a IgG.

Com ou sem a extensão N-terminal proporcionada por um péptido veicular, as proteínas recombinantes de fórmula geral (1) proporcionam-se de modo típico essencialmente livres de ou15 (

- ¹ Λ tras proteínas de origem humana. Por outras palavras, proporciona-se uma proteína na forma essencialmente pura, não acompanhada por proteína que normalmente lhe está associada.

A proteína constituída por apoAI ou uma sua variante genética pode utilizar-se num método de tratamento de um ser humano ou animal, Mais particularmente, pode utilizar-se para reduzir os níveis de triglicéridos e/ou colesterol no plasma. Desta forma, pode utilizar-se uma proteína pera combater a eterosclero I se e as doenças cardio-vasculares tais como as doenças das coronárias. A proteína pode administrar-se de modo preventivo ou pa ra melhorar/curar um estado existente.

Por conseguinte pode proporcionar-se uma proteína produzi da de acordo com a presente invenção na forma de uma composição farmacêutica que seja também constituída por um veículo ou diluente farmaceuticamente activo. Tais composições podem formular-se por um processo conhecido. A proteína pode administrar-se parenteralmente, por exemplo, intravenosamente.

Os Exemplos seguintes ilustram a presente invenção.

I

Sxemplo 1

MATERIAIS E MÉTODOS

Estirpes e meios

Estirpes: E. Coli K12 JM101 (Messirg e outros, Nature 314:309-321, I98I), MC 1061 (Casadaban e Cohen, J, Mol, Biol. 138:179-207, 1980, 71/18cl857 (Lorenzetti e outros, gene 39:85-87. 1985), RL841 (Kenkel, Proc, Natl. Acad. Sei, USA. 82:488-492, 1985), CAG629 (rgoHló^, lon^; c.A. Gross, Medison, Wisconsin).

Meios: Todas as estirpes se desenvolveram em meio LB ccm 50. Jig/ml de ampicilina quando necessário (meio LA). Adicionou-se 1 mM de IPTG ao meio ps.ra descomprimir o promotor lac quando apropriado

Enzimas, reacções enzimáticas e purificação de DNA

Utilizou-se lisozima de Sigma (St. Louis, MO. USA), utiI lizaram-se endonucleases de restrição de Boehringer (Mannheim,

DE), BRL Inc. (Gaithesburg, MD, USA) ou New England Biolabs (Beverly, MA, USA); a Tyligase e os outros enzimas utilizados foram de Boehringer. Todas as reacções enzimáticas foram efectuadas de acordo com as instruções do fornecedor salvo quando especificado de outro modo. Os fragmentos de DNA obtidos por digestão da endonuclease de restrição foram sepaiados por electroforese em geles horizontais de agarose ou geles verticais de poliacrilamida e extrairam-se da matriz de gel através de uma modifi cação do método de electro-eluiçao, utilizando um concentrador ISCO Mod. 1750 (ISCO Co., Lincoln, NE, USA) e ainda se purificaram em colunas ^HElutip-d (Schleicher e Schuell, Keene, NH USA).

Imuno-ensaio de enzima para a identificação de apoAI em extractos bçcterianos (ELISA)

Fez-se uma nova suspensão com massas de células em tampão de lise (50 mM Tris-Cl pH 7,0; 30 mM NaCl, 0,1% NaN^, lOmgZL de fluoreto de fenilmetii-sulfonilo). Ajustou-se a solução para 1 mg/ml com lisozima e agitou-se a 4°C durante 30 minutos. Após

1Ζ ciclos de congelamento-descongelamento, submeteram-se o extractos a imuni-ensaio de enzima do modo seguinte.

Revestiu-se uma placa microtituladora com 96 cavidades, com diluições apropriadas de anti-soro anti-apoAI humano desenvolvido em ovídeos (tíoehringer, Mannheim, DE) durante a noite a 4°C. Após 3 lavagens com 10 mM de Tris-Cl, pH 8,0. contendo 0,05 % de Tween-20 e de 0,01 / de Mertiolato, adicionou-se 50 /lide diluições de série de apoAI padrão (TAGO Corp., Burlingame, CA. USA) ou de extractos bacterianos e fez-se a incubação duran' te 1 hora a 37°C. Após 3 lavagens com 0 mesmo tampão, adicionou-se 50 /il de uma diluição apropriada de anti-soro anti-apoAI humana desenvolvido em coelho (Immuno Lda., Dunton Green,Nr.

Sevenoaks, Kent, qB) purificada ainda por precipitação de sulfato de amónio. Decorrida 1 hora a 37°C e após mais 3 lavagens, os reservatórios foram tratadas com um conjunto de proteína A-peroxX dase de rábano fornecido por New England Nuclear (Boston, MA, USA) de acordo com as instruções do fabricante.

Ligação de anti-apoAI humana desenvolvido em ovídeos ao

Afígel 10

Preparação de anticorpo anti-apoAI desenvolvido em ovídeo (Boehringer, Mannheim, DE): fez-se a diálise de 20 ml de so lução de anticorpo não diluída em tampão fosfato 0,1 M, pH 7, djj rante a noite a 4^o C com agitação permanente; depois eliminaram-se todos os fragmentos e recuperou-se o sobrenadante.

Preparação de Affigel 10 (Bio-rad, Richmond, CA): foram equilibrados 40 ml, à temperatura ambiente antes de se proceder a ciclos repetidos (4-5 vezes) de lavagens com meio volume de álcool isopropílico e depois com água redestilada5 secou-se o gel por filtração e transferiu-se para um balão de £0 ml adiei, nando-se o anticorpo submetido a diálise. F'ez-se a incubação do balão a 4°C durante 8 horas sob agitação contínua e adicionou-se 1 ml de éster etílico de glicina 1E, prolongou-se a incubação durante a noite. Depois lavou-se o gel intensivamente com as soluções seguintes:

- 100 ml de PBS + azida de sódio a 0,1 /

- 100 ml de ácido acético 1M

- 100 ml de tampão de fosfato 0,1 E, pH 7 + Na Cl

0,5 M

- 100 ml de PBS + azida de sódio a 0,1 empacotado numa coluna e equilibrado com um tampão de carga (PBS + 10 mg/1 PMSF + 10 mg/1 Pepstatina A).

Análise de Imunoblot

Efectuaram-se experiências com as amostras em placas de gel de poliacrilamida (na concentração apropriada) utilizan do o método de Laemmli. Depois fez-se a transferência das pia cas de gel para filtros de microcelulose utilizando um equipamento de transblot-marcação (Bio-Rad a 0,2 n;A durante 4 horas a 4°C em 25 mM de Tris base, 192 mM de glicina, e metanol a 20 Após a transferência fez-se a lavagem dos filtros com água destilada e depois fez-se a incubação durante 1 hora com PBS + 3 / de BSA com agitação suave. íez-se nova lavagem dos filtros com água destilada β fez-se a incubação com o primeiro anticorpo (o mesmo utilizado no método ELISA como segundo anticorpo) diluí do a 1:250 com PBS, e fez-se a incubação durante uma hora à tem peratura ambiente. Após duas lavagens com PBS e PBS + 0,05 % de Tween 20, fez-se a incubação dos filtros com o segundo anticorpo (anti-IgG de coelho desenvolvida em cabra associada com peroxida se de rábano; Bio-Rad) diluída a 1: 7500 durante 1 hora à temperatura ambiente. Após mais duas lavagens, os filtros foram tratados com 4-cloro-l-naftol.

RESULTADOS

Reconstrução da extremidade 5’ do gene apoAI

Obteve-se um clone de DNA de comprimento completo que co difica a apoAI (pAI/A) a partir de uma biblioteca de DNA de fíga do humano possuindo as sequências de codificação para o péptido sinal do propéptido e da proteína apoAI adulta global (Sharpe e outros, Nucl.Acids Res., 12:3917-3932). Fez-se a reconstrução da extremidade 5’ óo gene de tal modo que todas as sequências a montante do primeiro codão da apoAI adulta foram removidas. Para se conseguir este objectivo, o plasimídeo pAI/A foi digerido com EcoRI e BamHI tendo-se isolado um fragmento de 8y0 pb conten do a inserção de DNA e recuperou-se a partir de gel de agarose a 1 %.

sez-se a restrição do fragmento com Sau3AI sob condições de digestão parcial, e a mistura foi ligada com um adaptador sin tético fosforilado que havia sido conseguido para reconstruir a sequência de codificação dos primeiro 9 aminoácidos da proteína madura, optimizando a sequência de acordo com a utilização de codão em E, coli. 0 adaptador preparou-se do modo seguinte: Fez-se a síntese dos quatro oligonucleótidos pelo método de fosfo20

-tri-éster (Crea e Horn, Nucl.Acids Res., 8:2231-2348, 1980).

1.	5’	- GATCCATGGACGAGCC-3'
2.	pi ✓	- ACCGCAGAGTCCATGG-3'
3.	5’	-CGGTGGCTCGTCCATG-3'
4.	5'	-GATCCCATGGACTCTG-3'

Os quatro oligonucleótidos ligaram-se em conjunto em quantidades molares iguais, tratou-se a mistura de ligação com Sau3AI e fez-se a eluição do adaptador e purificou-se a partir ) de gel de poli-acrilamida. A sequência resultante do adaptador está ilustrada na figura 2.

A mistura de ligação contendo o adaptador purificado e 0 fragmento de apoAI cortado em Sau3AI parcial foi digerido com BamHI. Purificou-se o fragmento de 790 pb a partir de gel de poliacrilamida e ligou-se a pAT153-Bvu!l8, cortado com BamHI, tratado com fosfatase de intestino de vitela. Após a transformação de MC 1061, fez-se a sondagem dos recombinantes por hibridação com oligonucleótido fosforilado 3 ^como sonda. Isolaram-se as colénias positivas e ainda se caracterizaram por digestão com enzima de restrição e sequénciação por degradação química parcial de acordo com Maxam e Gilber (Methods Snzymol.. 65:499-560, 1980). 0 plasmídeo qúe possuía adaptador na orientação correcta designou-se por pAI/12.

Reconstruída desta forma, fez-se preceder a extremidade 5’ do gene por um codão iniciador ATG e por uma extremidade coesiva BamHI. Utilizando esta estratégia, é possível deslocar a sequência de codificação de apoAI madura para qualquer vector de expressão que suporte um sítio EamHI depois das sequências de Shine-Dalgarno.

Construção dos vectores recombinantes utilizando pFCZ4+

Purificou-se o fragmento de BamHI contendo o gene de apoAI modificado e sub-clonou-se no sítio BamHI de pFCE4+ (Lorenzetti e outros, I985). A construção resultante com a. correcta orientação da. inserção verificou-se pela sequênciação de terminação de cadeia didesoxi (figura 3A). Este plasmídeo foi designado pLS66.

Utilizando esta estratégia, inseriu-se o gene apoAI fora da estrutura em relação ao codão iniciador ATG já presente no vector. Deste modo, o passo seguinte éonsistiu em restaurar a cadeia de leitura posicionando 0 gene apoAI imediatamente a seguir a este codão ATG.

Posicionamento na estrutura

Utilizando o sistema pFCE4 pode efectuar-se 0 posicionamento np estrutura de um gene clonado utilizando-se uma ponte oligonucleotídica, que possua sequências complementares às extenI soes de bases que flanqueiam a região que se pretende excisar de cada lado (Sollazzo e outros, Gene, 37:199-206, 1985).

Para proceder deste modo sintetizou-se pelo método do fo£ fo-triéster um oligonucleótido de cadeia simples que possui a s§, quência seguinte:

5' - CTTACATATGGACGAGCC-3’.

Este oligonucleótido deve ligar-se com a sua extremidade 5* à região imediatamente precedente e que engloba 0 ATG do vector (nucleótidos 1 a 10), e com a sua extremidade 3’ ^a°s pririleiros 8 nucleótidos do gene da apoAI, isolando daste fcama ® S nucleóti ( _ .. X dos suplementares presentes em pLSóó (fig. 2). 0 ssADN de pLS66 preparou-se conforme descrito (hunkel. Proc, Natl, Acad, Sei, ASA. 82: 488-492, 1985) utilizando E. coli RL841 como hospedeiro. Esta estirpe bacteriana é derivada de E, coli RZIO32 que contêm 0 plasmídeo pCl857 (N. Zabeau) o qual produz um repressor sensível à temperatura para o promotor presente em pFGE4.

Utilizando este protocolo, o ssDNA produzido por esta estirpe continha diversos resíduos de uracilo em vez de tinina, actuando desta forma como uma matriz funcional normal ”in vitro”.

I não sendo contudo biologicamente activo ao transformar-se numa estirpe do tipo selvagem (ung+) E. coli 71/18cl857 a qual é 0 hospepedeiro normal para este plasmídeo. 0,1 pmoles de ssDNA de pLSóó foi reforçado com 2 pmoles de oligonucleótido mutagénico fosfatado (um excesso 20 vezes superior) a 5ú°C durante 30 minutos em 15 mM Tris-Cl, pl-l 8,5, e 15 mM de MgCl^. Depois de arrefecer para a temperatura ambiente adicionou-se a mistura elongação-ligação e manteve-se a reac>ção a 15°G durante a noite. A mistura de reacção de elongação foi a seguinte (concentração final): 10 mM } de Tris-Cl, pH 8,5; 10 mM de MgCl^; 0,5 mM de ATP; 0,05 de mM de dNTPs; 5 de DTT; 1 unidade de DNA polimerase, fragmento de Klenow e 1,5 unidades de T4 DNA ligase.

Após a incubação extraiu-se a misture· reaccional com fenol, e precipitou-se com isopropanol e etanol; as células competentes 71/18c11857 foram transformadas e plaqueadas em meio selec tivo, LA. No sentido de identificar os clones que continham a delecção desejada, repicaram-se 150 colónias, desenvolveram-se em placas ordenadas e fez-se a sua transferência para filtros de nitrocelulose. A hibridação efectuou-se à temperatura ambiente em 6 x SSC e 10 x meio de Eenhardt utilizando o oligonucleótido mutagénico como sonda. Depois fez-se a lavagem dos filtros em x SSC e 0,1 % de SDS a duas temperaturas diferentes: a primei ra vez à temperatura ambiente, para se verificar a eficácia da hibridação, e depois a 5θ°8, isto é, 4°C abaixo da temperatura de fusão teórica. Os cálculos efectuaram-se de acordo com a fórmula seguinte: T = x GC + 2 x AT, em que GC e AT representam os números de emparelhamento formados pelo oligonucleótido com ma triz mutagénica (Norrander e outros, Gene, 26; 101-106, 1983). Após cada lavagem fez-se a exposição dos filtros a películas sensíveis aos Raios X. As colónias candidatas a mutantes, que também proporcionam sinais positivos a uma temperatura exacta, foram confirmadas pela sequenciação de terminação de cadeia didesoxi (Fig. 3B). A eficiência desse protocolo é bastante elevada, cerca de 5θ /^· θ PFCE4+ com 0 gene apoAI correctamente posicionado na estrutura designou-se por pML1120.

Construção das variantes T6 e MI da apoAI

Utilizou-se pLS 66 e pML 11-20 como matrizes pau a construção das duas variantes apoAI-Tó e apoAI-ml. Decidiu-se a utilização de ambas as matrizes para se obter simultaneamente os genes variantes correctamente posicionados na estrutura e num fragmento de BamHl transponível.

Com este objectivo efectuou-se a síntese de dois oligonucleótidos simples pelo protocolo usual:

1, 5’ -CACCGCAGACTCCATGG-3' para a mutação T6

2. 5' -GCGCCAGTGCTTGGC-3» para a mutação MI

Indicando com o número 1 o primeiro nucleótido do primei24 ro codão da apoAI madura, o oligonucleótiço 1 deve reforçar-se a partir do resíduo 8 a 24, com um mau emp-relhamento na posição 17 (de G até C). 0 oligonucleótido 2 deve reforçar-se a partir dos resíduos $10 s 524, com um mau emparelhamento na posição 517 (de C a T).

As experiências de mutagénese efectuaram-se utilizando o mesmo protocolo descrito para o posicionamento na estrutura (Fig. 4A e B). Para os duplos mutantes obteve-se primeiro a mutação T6 e depois adicionou-se a mutação MI.

Os plasmideos resultantes designaram-se por:

PIL5-6 * apoAI-T6 entre dois sítios Eam Hl pIL5-1 · apoAI-ΜΙ entre dois sítios Bam Hl PIL5-6I » apoAI-Tó/MI entre dois sítios Bam Hl pIL8-6 * apoAI-Tó na estrutura

PIL8-I - apoAI-ΜΙ na estrutura pIL8-6l - apoAI-Tó/kl na estrutura

Construção das variantes R?5 θ IP1 da apoAI

I

Os fragmentos de DNA contendo o gene apoAI e as suas variantes T6 e MI foram excisados a partir dos plasmideos pLSóó, pILÇ-6, pIL5-X e pIL5-6l por digestão com BamHI e purificaram-se com gel de agarose a 1 % conforme descrito. Depois fez-se a ligação dos fragmentos a pUCÒ e pUC9 (Vieira e Messing, Gene . 19:259-268, 1982), linearizados ambos com BamHI. Após a transfor mação das células competentes JM101, fez-se a identificação dos plasmideos recombir.antes pelo método de disrrupção rápida e fez-se a verificação cortando os elementos isolados com BamHI. Foi possível distinguir duas orientações opostas para a inserção cortando com Hind III e Xho I.

As construções com pUCó possuíam o gene apoAI já na estrutura imediatamente precedido por um resíduo de metionina e pelos primeiros 9 aminoácidos do alfa-péptido do gene de beta-ga lactosidase bacteriano; isto originou uma extensão de 10 aminoácidos no N-terminal da molécula de apoAI de beta-õalactosídase.

Todos os derivados de pUC9 recombinantes, contendo os genes apoAI na orientação correcta, exigiram mais elaboração pa ^a colocar o gene apoAI na estrutura. Primeiro cortaram-se com enzimas de restrição Hind III e Sal I entre o início da tradução Αϊθ'0'o gene apoAI. As extremidades coesivas geradas por corte preencheram-se com DNA polimerase (fragmento de klenow) e depois ligaram-se de novo com ligase de T4DNA-ligase. Isto origi nou a delecção de 10 nueleótidos no sítio de clonagem múltipla de pUC9, em frente ao gene apoAI, refazendo deste modo a cadeia de leitura correcta.

)s plasmídeos recombinantes designaram-se por:

a) série pUC3 pipi « com apoAI-IPI pIpI-6 » com apoAI-IPI/Tó plpl-l = com apoAI-IPI/fcl plpl-6l = com apoAI-IPI/Tó/frlI

b) série pUC9 pRP5 = com apoAI-RP5 pR?5-6 =com apoAI-RPJ/Tó pRPS-I = com apoAI-RP5/MI pRP5-6l = com apoAI-RP5/Tó/teI fundamento para a obtenção de variantes aumentadas, e os níveis de expressão serem acrescidos pela presença da extremi ./ dade N-terminal da beta-galactosidade bacteriana, a sequência que ocorre naiuralmente depois dos elementos reguladores presentes nos plasmídeos.

Expressão em estirpe E. coli

1) Todos os derivados pFCEá recombinantes se transformaram no hospedeiro CAGÓ29 bacteriano que incorpora o plasmfdeo pCI 8Ç6 (já descrito na secção Posicionamento na estrutura”).

As culturas desenvolvidas durante a noite a 3^{1 2}°C na proporção 1:10 em LA e desenvolveram-se em balões de agitação até ^d06$0 ^{= 0}>5-0,6, depois gumentou-se a temperatura para 42°C e man teve-se a incubação durante 1-2 horas. Após a incubação as células foram arrefecidas em gelo durante 10 minutos e reunidas por centrifugação. Os grânulos de células foram tratadas conforme descrito na secção ELISA” para romper as células. Fez-se a centrifugação dos extractos das células a 16.000 rpm durante 30 minutos a 4°C e aplicou-se o sobrenadante à coluna de afinidade des crita em Materiais e Métodos”. Após lavagem intensa fez-se a eluição das proteínas retidas com ácido acétido 1M. Fez-se 0 ensaio das fracções eluídas por análise de imuno-marcaçao (figura 5) e Pelo método ELISA; os resultados preliminares obtidos com pMLll-20 foram em média cerca de 0,2 mg de apoAI por litro de cultura.

Obtiveram-se resultados semelhantes com todas as outras construções que incorporam mutações apoAI-Tó, apo AI-MI e apoAI-T6/MI.

2) Todos os derivados de pUC8/9 recombinante se transformaram no hospedeiro MGlOól bacteriano.

! ZL _: ..._: * Ζ ΐ:

Fez-se a diluição das culturas desenvolvidas durante a noite à temperatura de 37° C na. proporção de 1:100 em meio LA e desenvolveram-se em balões de agitação durante 1 hora antes da adição de 1 mM de IPTG, depois manteve-se a incubação durante mais 4-6 horas. Decorrido este tempo as células foram arrefecj. das sobre gelo durante 10 minutos e reunidas por centrifugação. A partir deste passo, os procedimentos de extracção foram idênticos aos descritos para os derivados de pFCA4. Os extractos brutos de células contendo pIPI e pR?5 foram ensaiados por análise de imunoblot (Figura 6) e por ELISA; os resultados preliminares aproximaram-se de uma média de 10 mg de apoAI por litro de cultura.

Obtiveram-se resultados semelhantes com todas as outras construções que incorporavam mutações apoAI-T6, apoAI-ΜΙ e apoAI-T6/MI em associação com apoAI-BP5 θ apoAI-IPl.

Exemplo 2

Construíram-se outras variantes utilizando o vector pRíTST (Farmácia, Suécia) no qual se inseriu um fragmento de 949 pb que incorpora o gene apoAI, no sítio Sma 1 desse vector. A proteína expressa por esse plasmídeo era composta de 541 aminoácidos. Estes eram, a partir da extremidade N-terminal, os primeiros 11 aminoácidos da proteína CRO do brcteriófago lambda, seguindo-se os 248 aminoácidos da sequência da proteína A de estafilococo (desde os resíduos 23 até ao 270), 5 aminoácidos não usuais (Pro-Gly-Asp-Ser-Thr) devido à junção com os últimos 17 aminoácidos da beta-galactosidade da S, coli e 17 aminoácidos, os quais contêm a sequência de identificação para 0 enzima protedlica enteroquinase,.(Gly-Asp-Pro-Glu-rhe-Val-Asp-Asp-Asp Asp-Lys-Ser-Ser-Arg-Gly-Ser-Met), a qual precede imediatamente a sequência da apoAI humana madura (designada CPA-AI) ou as suas variantes apoAI-Tó, apoAI-ΜΙ, apoAI-Tó/Ml. Estas proteínas quiméricas são estáveis e solúveis em soluções aquosas.

Estudou-se a interacção de CPA-AI com hepatócitos de ratazana com macrdfagos de ratos em cultura. A incubação de CPA-AI marcado com com células cultivadas a 4^o C demonstra que a proteína híbrida se liga à superfície da célula com parâmetros de ligação idênticos a HDL. A proteína híbrida foi absorvida pelas células a 37°C e demonstrou ser de natureza interna. Este com portamento assemelha-se ao de apoAI natural quando associada com líquidos para formar partículas de HDL.

MATERIAIS E MÉTODOS

Materiais

Preparou-se HDL (l,09< d< 1,21 g/ml) a partir de plasma humano num gradiente descontínuo de KBr. Fez-se a diálise extensivamente de HDL contra PBS, lmM de EDTA para se remover o KBr e armazenou-se a 4°C. Carregou-se a transferrina humana (Sigma) com ferro de acordo com o método de Klausner e outros (J. Biol, Chem, 258, 4715-4724, 1983). A BSA era essencialmente isenta de IgG (Sigma, A 7638). A proteína A de stafilococcus aureus obteve-se em Pharmacia. A solução de sal equilibrada de Hanks contendo fenol vermelho obteve-se da Gibco”.

Células e cultura de células í'ez-se a cultura de células de Fao, uma linha de células de hepatoma de ratazana estabelecida e caracterizada por Deschatrette e Weiss (Biochemie 56, 1603-1611, 197^), numa mono-camada em meio F12 de Ham modificado por Coon (seromed) complementado com 5 % de soro de vitela fetal (FCS), 100 unidades/ml de penicilina, 100 jug/ml de estreptomicina, 2 mM de glutamina e 10 mM de tampão HEPES, pH ?Λ· Manteve-se uma linha de células macrófagas de rato, células J77^ (Rolph e outros. J. Immunology 114, 898-905, 1975), numa cultura de suspensão rotativa em meio de D-MEM contendo 4,5 M de FSCS, penicilina, estreptomicina, glutamina e tampão HEPES, pH 7Λ, ^em concentrações indicadas a seguir.

Estirpes bacterianas e plasmídeos

Os hospedeitos bacterianos foram as estirpes Ξ, coli HB101 (Boyer e Roulland-Dussoix, J. Mol, Biol, 41. 459-472, 1969) e RR1 M15 (Langley e outros, Proc. Natl, Acad. Sei, USA 72, 1254-1257, 1975). 0s plasmídeos utilizados foram pNF 2690 (Nilsson e outros. EMBO J. 4, 1075-ΙθθΟ, 1985) ® pLM3 (Monaco e outros Atti Convegno congiunto A. G. I, - S.I.B.B.M., 195-196, 1985) ;pRIT2T. 0 pRIT2T é vendido por Farmácia, Suécia.

Construções de DNA

Os enzimas de restrição, DNA polimerase de Klenow e INA T4 ligase foram obtidos da Boehringer Mannheima e utilizados de acordo com as especificações do fornecedor.

A transformação de Ξ. coli efectuou-se de acordo com Morrison (Methods Enzymol, 68, 326-331» 1979).

Expressão do gene híbrido

Fez-se a expressão do gene híbrido sob o controlo do promotor lambda P^, essencialmente de acordo com Zabeau e Stanley (EMBO J. 1, 1217-1224, 1982). As bactérias desenvolveram-se a 30°C até ΓΟ^θθ = 0,9. Aumentou-se rapidamente a tempe ratura para 42°C por adição de igual volume de caldo de cultura pré-aquecido à temperatura de 54°C. Incubaram-se as culturas a 42°C durante 90 minutos antes da colheita. Os lisatos de células totais foram conservados em geles conforme descrito por Zabeau e Stanley (1982).

Purificação da proteína híbrida

Seguiu-se o método de Marston e outros (Biotechnology

2, 800-804, 1984) para a purificação de proteína híbrida. Fez-se uma nova suspensão das massas bacterianas em 3 volumes (p/v) de tampão A (50 mM Tris/KCl, pH 8,0; 50 mM de NaCl lmM de EDTA) e sonicou-se 5 ^x 20 segundos sobre gelo. Após a centrifugação (10.000 rpm, 10 minutos a 4°C num centrifugador Sorvall SS34), fez-se nova suspensão da massa em 9 volumes (p/v) de tampão,A, contendo 0,5 / de Triton X-100,10 mM de EDTA e deixou-se à temperatura ambiente durante 5 minutos. Centrifugou-se a suspensão conforme descrito antes e fez-se nova suspensão da massa em novos volumes (p/v) de tampão A , contendo 8M de ureia e fez-se a incubação à temperatura ambiente durante 1 hora.

Adicionou-se a suspensão de ureia a 9 volumes (v/v) de mM de tampão de fosfato de potássio, pH 10,7, 50 mM de NaCl, 1 mM de EDTA e agitou-se durante 30 minutos à temperatura ambiente enquanto se mantinha o pH a 10,7 por adição de K0H. Depois neutralizou-se a suspensão e fez-se a diálise a 4C em contacto com tampão A . A suspensão submetida a diálise foi centrifugada conforme atrás descrito: a proteína híbrida e o sobrenadante líquido apresentou-se num estado razoavelmente puro, sendo o rendi mento médio de proteína híbrida nesta fase de 50-60 mg por litro de cultura bacteriana. Efectuou-se uma purificação adicional por cromatografia de afinidade sobre IgG-Sepharose 6FF (Pharmacia). Carregou-se a amostra na coluna, lavou-se sequencialmente com PBS contendo 0,05 % de Tween 20, PBS e 5 mM de AcONH^, pH 5 e eluiu-se com 1M de AcOH/AcONH^, pH 2,8. Fez-se a diálise da pro teína purificada em contacto com tampão A .

Calibração utilizando uma coluna de filtração de gel

Biogel 1,5 A

Equilibrou-se uma coluna Biogel 1,5 A da Bio-Rad (40 cm x 1 cm) em 50 mM de Tris/HCl, pH 8,0, 5θ mM de NaCl, 1 ml: de EDTA. Eluiu-se a amostra a uma velocidade de fluxo de 3 ml/h e recolheram-se fracções de 250 /11 . Calibrou-se a coluna com azul de dextrano (2.000 KD), tiroglobulina (699 KD), ferritina (440KD), HDL (285 KD) e aldoase (158 KD). 0 Mr da proteína híbrida determinou-se utilizando 1,25 yug de I J -CPA-AI ou

800 yug de CPA-AI não marcado.

Iodação de proteínas

As proteínas foram iodadas utilizando 0 reagente Iodo82

-gene (Pierce Chemical Co.). A reacção de iodação continha 100/ig de Iodo-gene, 1 mg de proteína em 200 yil de PBS e ImCi de veículo isento de La I _7, 16,5mCi//ig (amersham International). Decorridos 10 minutos a 4^o C separou-se o iodo livre da proteína numa coluna de 10 ml Sephadex GJO¹’. Eluiu-se a coluna com PBS (0,2 . de BSA) para HDL, transferrina e IgG e com 50 mM de Tris/HCl, pH 8,0, 0,15 M de NaCl, ImM de EDTA, 0,2 % de BSA para a proteína híbrida. A proteína híbrida, IgG e transferrina utilizaram-se sem diálise. Foi necessário fazer a diálise extensiva de HDL em contacto com PBS, 0,5 mM de EDTA até que menos de que 5 % do marcador ficou solúvel em 10 % (p/v) de ácido trícloroacético. Menos do que 5 4 do marcador ficou associado com o líquido conforme determinado após a extracção do líquido com clorofórmio/metanol. A actividade específica obtida foi de 200-400 cpm/hg de proteína.

Ensaios de ligação

Os ensaios de ligação nas células em suspensão efectuaram -se durante 2 horas a 4°C. Para se obter uma suspensão de células Fao, fez-se a incubação das mono-camadas com PBS, e em ImM de EDTA, durante 30 minutos a 3/°C. Tanto estas células como os macro fagos <L774 desenvolvidos em suspensão foram lavados 3 vezes por centrifugação de uma massa a 1000 g x 5 minutos a 4°C e fez-se nova suspensão em 3 ml de Hanks/BSA. Cada ensaio de ligação continha 1 x 10 células em 1 ml de Hanks/BSA e a. quantidade indi cada f¹²5i _7-apoA-*-l-PA ou /^^1 _/-HDL. Decorridas duas horas a 4°C lavaram-se as células 4 vezes em Hanks/BSA, transferiram-se para tubo Eppendorf e contou-se a radiactividade com um contador gama. Para as experiências de competição colocaram-se 10/ig de

AÀ / .*** ligando iodado em concorrência com 10-300 jug quer de HDL não marcado CPA-AI, proteína A ou transferrina, tendo-se adicionado cada um deles às células a 4°C, 3θ minutos antes da adição dos ligandoGiodados.

Marcação do ligando de HDL e CPA-AI o

Lavaram-se as células J7/4 (2 x 10 ) 2 x com PBS e homogeneizaram-se em 10 mM de Tris/HCl, pH 7,4, 0,1 mM de EDTA. Preparou-se um sobrenadante pés-nuclear (NS) por centrifugação a 2000 g durante 10 minutos. Extraíu-se o PNS com 1 % de (v/v) de Triton X-114 (Bordier, J. Biol, Chem. 256, 16θ4-16θ7, 1981). A fase detergente misturou-se com igual volume de tampão da amos tra contendo ditiotreitol em ebulição, e depois alquilou-se com iodo-acetamida. Em cada, via aplicou-se aproximadamente 1 mg de proteína a 5-15 % de gel de poliacrilamida SDS. Fez-se a mancha do gel sobre nitrocelulose e fez-se a visualização por tratamento com corante S de Ponceau. As tiras de nitrocelulose foram temperadas durante 6 horas em meio de HaPks contendo 10 (p/v) de leite em pó magro.

Fez-se a ligação dos ligandQs Z¹²^I .7-CPA-AI ou y-125i y_HDL a 12,5 /ig/ml em meio de 'lanks/leite durante 16 horas. Depois lavou-se as tiras 4 xcan meio de Hanks/leite e fez-se a detecção dos ligandos com enti-soro de coelho em contacto com: HDL humana, CPA-AI ou proteína A (com uma diluição em soro de 1/50), lavou-se e fez-se a incubação na presença de peroxi dase de anti-IgG de coelho a qual foi revelada com a reacção de dlamino-benzidina (Burnette, Anal, Biochem, 112, 195-203, 1981) A mancha seca expos-se depois a uma película sensível ao raio X.

&

Métodos analíticos

A sequenciação de amino-terminal efectuou-se por degradação de Edman automática efectuada num micro-sequenciador de fase gás-líquido construído conforme descrito por Frank e Trosin (H. Tschesce (editor): Modera Methods in Proteín Chemistry, Walter de Gruyter à Co., Berlin, 287-302, 1935) de acordo com Lottspeich (Hoppe Seyle^s Z, Piiysio .... Chem. 361, 1829-1834, 1980). Para se determinar a sequência carboxi-terminai da proteína híbrida, utilizou-se carboxi~peptidase£ , A e/ou B de acordo com Tadros e outros (Eur, J, Biochem. 138, 209-212, 1983). Para a análise de aminoácido fez-se a análise da proteína de acordo com Tadros e outros (Eur. J, Biochem. 127, 315-318, 19θ2) e determinou-se a composição do aminoácido utilizando um analisador de amino-ácido automático (Durrum D-500). Não se determinou o triptofan e a cisteína.

Para a microscopia, as amostras de HDL e de CPA-AI foram submetidas a coloração negativa utilizando-se ácido fosfo-túngs) tico a 2 %. Determinou-se a concentração de proteína pelo método de Bradford (Anal. Biochem. 72, 248-254, 19/ó).

RESULTADOS

Construção do plasmídeo pLMÔ que transporta o gene que codifica a proteína híbrida CPA-AI vector pRIT2T, é um derivado de pRIT2 (Nilsson e outros 1985), concebido para expressão indutível por temperatura, de pro teína híbridas intracelulares em E._ coli, Ssta construção contém os domínios de ligação IgG de proteína A de estafilococcus, as

quais se encontram sob controlo do promotor lambde Um sítio de clonagem múltiplo facilita a inserção dos genes estranhos na extremidade 3’ 8? proteína A . A sequência de terminação da transcrição da proteína A insere-se imediatamente a. jusante do sítio de clonagem múltipla. 0 plasmídeo pLM3 possui o gene lacZ de E, coli fundido na estrutura do gene maduro para a apoAI humana (Fbnaco e outros 1985)· plasmídeo pLMÔ que incorpora a fusão entre PA e apoAI | construíu-se conforme descrito na figura 7. A partir de pLM3 isolou-se o fragmento 9^9 de pb ladeado pelos sítios de restrição EcoRI e Clal e as extremidades resultantes foram preenchidas com DNA pólimerase de xJLenow. Ligou-se o fragmento e o pRITST foi linearizado com Smal. 0 plasmídeo resultante pLMÔ que trans porta a cadeia de leitura aberta, que codifica para proteína de fusão de 5^1 aminoáeid^s, composts pelo gene para a proteína A na extremidade 5' e o gene da apoAI humana madura na extremidade 3' separado por uma sequência específica para clivagem proteolítica.

I

Expressão,isolamento e purificação da proteína híbrida

As células E, coli que transportam pLLÔ na presença de pNF 2690, um plasmídeo compatível que codifica o mutante repressor lambda Cl 057 sensível à temperatura, foram susceptíveis de exprimir grandes quantidades de proteína híbrida. Quando desenvolvida a h-2°C, a quantidade de CrA-AI induzida representa cerca de 20 % do total. Conforme esperado, 0 Mr aparente da proteína híbrida é 62 KD em SDS-PAGE. Os métodos normalizados para a extracção (sonicáção ',congelamento-desconglamento, lisózima-Triton

-............

Σ-100) demonstraram ser infrutíferos. Adoptou-se um procedimento de desnaturação, envolvendo a incubação de bactérias sonicadas em ureia 8M, seguindo-se a adição de um tampão alcalino. Após a renaturação por neutralização e diálise, fez-se a centri fugação da suspensão e o sobrenadante límpido continha proteína de fusão com um grau de pureza superior a 90 %. consegui-se uma purificação adicional por cromatografia de afinidade em IgG-Sepharose.

Caracterização da proteína híbrida

A identidade da proteína híbrida confirmou-se pelo reconhecimento por um anti-corpo apoAI específico preparado em ovídeos. A proteína A não reconhece os anticorpos de carneiro.

A sequência amino-terminal dos primeiros oito aminoácidos e a sequência carboxi-terminal dos últimos três aminoácidos apresentaram-se de acordo com a sequência conhecida de apo AI e proteína A. A análise de composição de aminoácidos também estava de acordo com a composição esperada.

Para quantificar a ligação da proteína híbrida à superfí cie da célula (ver adiante) foi necessário determinar o seu Mr natural. Isto efectuou-se por filtração sobre gel utilizando Biogel 1,5 A. A fracção de pico da eluição em coluna proporcionou um Mr de 316kD, o que corresponde a 5 vezes o monómero Mr de 62kD. 0 perfil largo da eluição de proteína híbrida indicou que também estavam presentes outros multímeros, assim como uma pequena quantidade de material agregado no volume vazio. Utilizou-se a dimensão média de J16kD com um Mr natural para todas as experiências. Comparou-se isto com 285 kD para HDL utilizado como padrão na mesma coluna. 0 perfil de eluição da proteína híbrida λ' Í iodada foi idêntico ao que se obteve para a proteína híbrida não marcada.

Após coloração negativa o HDL e as partículas de proteína híbrida foram examinados com um microscópio electrónico. Os micro-diagramas apresentaram uma população homogénea de partícu las com diâmetro variável entre £-12 nm. As partículas de proteína híbrida possuem uma dimensão ligeiramente superior à da HDL, confirmando os resultados obtidos por filtração em gel.

| Comparação da actividade biológica da proteína híbrida e de HDL

Utilizou-se em paralelo a proteína híbrida purificada a partir de 3, coli e HDL purificado a partir de plasma humano, para se estudar a sua capacidade para se ligar receptores à superfície das células. Investigaram-se diversos tipos de células: linhas de células de um nepatócito de ratazana (Fao) e macrófagos de um rato (17/4). 3 evidente que estes dois tipos de células actuam sobre HDL de modo diferente. Nos macrófagos ocorre a permuta de colesterol e nos hepatócitos ocorre a degradação. Dados de ligação a 4°C

Permitiu-se que os ligandos iodados se ligassem às células a 4°C durante 2 horas. Decorridos 30 minutos atingiu-se um patamar na quantidade ligada. Proporcionou-se a competição com 500 /ig de ligando não marcado para se avaliar a quantidade que era não específica e subtraíu-se esse valor à curva de ligação total para se obter o valor da ligação específica. Os valores de ligação específica utilizaram-se para se calcular a afinidade por análise de Scatchard (Scatchard, Ann, N, Y, Acad, Sei,

660-672, 1949). Tanto com HDL como com a proteína híbrida a ligação foi específica e de afinidade elevada. A ligação de eleva da afinidade apresentou o kd de 2,8-3,0 x 10 M jgra HDL e de —8

3,5-4,9 x 10 h para a proteína híbrida tanto com as células J774 como com as células Fao. Os resultados apresentam-se no Quadro 2 seguinte. Além disso, existe um componente de fraca afinidade que não reagiu completamente com 0 ligando não marcado tanto no caso de HDL como da proteína híbrida.

componente de ligação de afinidade elevada em ambos os tipos de células proporciona uma ligação máxima de 9θ-155 ng/ Λ x 10 células: isto representa 1,9-3,6 χ ΙΟ' sítios por célula. 0 número de sítios de ligação por célula e as afinidades de ligação foram notavelmente idênticas tanto em HDL como na proteí na híbrida. Isto sugere a existência de um único receptor e que 0 componente apoAI isoladamente pode ser 0 responsável pela liga ção indirecta de HDL ao receptor.

Estudos de competição

A prova adicional para a ligação específica de apoAI advém dos estudos de competição. Tanto 0 HDL como a proteína híbrida competem eficazmente entre si para se ligarem às células J774 e Fao. A competição foi eficiente até se atingir o componente não específico. A proteína A não foi capaz de competir com a ligação da proteína híbrida ou de HDL. Utilizou-se transferrina como um controlo independente nos estudos de competição. Embora a transferrina se ligue através do receptor de transferrina à superfície da célula, não pode competir com a ligação de HDL ou da proteína híbrida.

Actividades de ligação da proteína A e de IgG

Uma vez que a proteína híbrida também contém proteína A, foi imurtante determinar se a própria proteína A podia ligar-se às cé lulas. A proteína A foi iodada para uma actividade específica idêntica e fez-se o ensaio para determinar a ligação às células 1774 e Fao. Mesmo para as concentrações elevadas de proteína A (100 /ig/ml, não se detectou ligação específica. A quantidade de radioactividade associada às células foi inferior à da ligação não específica para a proteína híbrida.

Foi necessário tomar uma precaução ao efectuar estas experiências com a proteína híbrida porque as células 177^ expri12^c mem os receptores de Fc para IgG. Por isso, Z~ ^yI_7-IgG de coe lho liga-se aos receptores Fc da superfície das células com elevada afinidade (kd = 1 x 10^-¾). Quando se ligou JtPA-AI na presença de IgG de coelho, a quantidade de proteína, híbrida ligada aumentou 2,7 vezes. Inversamente, quando se ligou ^7-Igu de coelho na presença de proteína híbrida a ligação também aumentou (1,6 vezes). Aparentemente, o complexo entre IgG e CPA-AI pode ligar-se tanto ao receptor de Fc como ao receptor HDL. Para se estudar apenas o receptor HDL, todas as experiências de ligação se efectuaram em meio isento de IgG. As células lavaram-se três vezes em tampão de Haiks acrescido com BSA (essencialmente isento de IgG) para se remover o IgG presente nr> meio de cultura.

Caracterização do receptor de HDL

As células J774 foram tratadas com tripsina a 4°C antes de se efectuar o ensaio para a ligação de HDL, proteína híbrida ou transferrina. 0 tratamento com tripsina não diminui a ligação de HDL ou de proteína híbrida. Contudo, a ligação de 2 125j y-transferrina foi reduzida para 3θ % do controlo. 0 receptor de HDL é relativamente resistente â tripsina quando compara, do com o receptor de transferrina.

Para identificar o receptor envolvido na ligação de HDL e da proteína híbrida efectua-se uma mancha de ligando. Um. extracto Triton x-114 de um PUS a partir de células J774 submeteu -se a SDS-PAGE sob condições de redução e transfere-se parà microcelulose. _/_HDL e [ _/-ΟΡΑ-ΑΙ ligam-se individualmente a uma banda de cerca de 110 kD. Esta banda foi identificada quer directamente por visualização dos ligandos marcados com £ j _n0 autoradiógrafo do filtro ou indirectamente por detecção de anticorpos utilizando anti-soro de coelho em contacto com HDL e visualização com anti-IgG de coelho de peroxidase de ovídeo. Para o HDL existiu um contraste muito elevado do marcador iodado sobre a nitrocelulose, o que tornou obscura a detecção de uma banda específica no autoradiógrafo.

Exemplo 3

Sintetizou-se apoAI humana sob a forma de uma proteína precursora, preproapo AI de 267 aminoácidos. 0 péptido com o comprimento de 18 aminoâcido foi cortado durante a secreção, proporcionando uma pro-proteína designada proapoAI. Por isso a proapoAI é constituída por seis aminoácidos de extensão N-termi nal Arg-His-Phe-Trp-Gln-Gln, seguindo-se a proteína madura.

No sentido de se exprimir a proapoAI, a extremidade 5' do gene apoAI foi reconstruída sinteticamente conforme se indi ca na figura 8. Sintetizou-se um oligonucleético Nde Ι-BamHI que codifica para os primeiros 15 aminoácidos de proapo AI incluindo os 6 aminoácidos do pro-péptido. 0 DNA de síntese continha um sítio Nco I imediatamente entes do sítio Bam Hl. Ligou-se um fragmento Eco-BI-Sal I transportando o promotor trp de plasmideo pDR720 (Farmácia, Suécia; Russel e Benet, Gene 20, 231, 1982) a um fragmento sintético Sal I-Nde I que codifica para uma sequência lambda cll Shine-Dalgarno, para se obter o fragmento Eco RI-Nde I 107 pb ilustrado na figura. Esta porção de DNA ligou-se ao fragmento que codifica a sequência 5’ de proapoAI e subclonou-se em M13mp8 (messing e outros, Proc. Nath, Acad. Sei, ASA 74, 3642, 1977) psra ser sequenciado.

No sentido de se exprimir o proapoAI recombinante, construiu-se um vector de pressão conforme ilustrado na figura 9. A partir do E13mp8 recombinante (ver figura 8) cortou-se um fragmento Eco RI-Ncol que comporta os sinais de expressão seguidos pela extremidade 5’ 80 gene proapoAI e ligou-se aos dois fragmentos seguintes:

a) π fragmento grande de plasmideo pDS20 (Duester e outros, Cell 30, 855, 1982) cortados com Eco RI-Bam Hl

b) um fragmento Nco I-Bam Hl a partir de pMLll-20 contendo o res to da sequência apoAI.

plasmideo pFc33 resultante foi capaz de exprimir uma proteína proapoAI, ou mais especificamente Met-proapoAI, sujeito ao promotor trp numa estirpe E. coli B (Delbruck, 1946», Vírus bacterianos ou baeteríófagos Biol. Rev. 21:30-40). Para a indução as células desenvolveram-se durante a noite num meio LB com ampicilina. No dia seguinte as células foram diluídas em meio /

/

Μ9 sem triptofano e recolheram-se decorridas 6 horas a 37°C.

A Figura 10 apresenta uma electroforese em gel e uma an£ lise de imuno-mancha de proapoAI. Aliquotas de culturas bacterianas reuniram-se e suspenderam-se com tampão de gel de electro forese em paralelo com uma fracção humana normalizada. Após a ebulição, fez-se a electroforese das amostras em 12,5 % SDS-PAGE. A coloração sobre um filtro de nitrocelulose efectuou-se como descrito no Exemplo 1.

I

I rH

Quadro

	1	1
	•H		•H
			4-5
	Ό		Q
	tó		CB
	V		4)
	TJ		Ό
	0)		Φ
	Ό		Ό
	CO		¢0
	15
	•H	r-4	*1-1	H
	u	Ctí	0	Cti
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J J	«<	a,	O,	1

Quadro 2

Ligação de Z¹²⁵! 7-HDL e Z¹²⁵I 7-CPA-AI quer as células

Fao quer as células 1774

	Mr	Ligação Kd	Afinidade elevada
Fao		jug/nl	M	Sítios/célula
HDL	285,000	8,6	3,οχΐο”δ	362,000
CPA-AI	316,000	11,0	3,5x10*®	248,000
J774
HDL	285,000	8,0	2,9xl08	190,000
CPA-AI	316	15,5	4,9xl0'8	277,000

Rei45 . X

Reivindicações

Claims (18)

1. Reivindicações

   1. - Vector de expressão, caracterizado por ser susceptível de exprimir em um hospedeiro transformado, uma proteína que é susceptível de ser detectada por ELISA com antisoro de anti-apo AI humano e que tem a fórmula geral (1)

   Met-X-Y (1) em que X representa uma ligação, uma sequência de péptido de suporte que consiste numa sequência derivada dos resíduos de aminoácidos N-terminal de beta-galactosidade ou uma sequência que inclui uma ou mais áreas de ligação IgG de Proteína A, ou a pro-sequência de apo AI humana; e Y representa a sequência de apo AI humana ou uma variante genética correspondente.
2. 2. - Vector de expressão de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a referida proteína ser Met-apo AI, Met-apo AI-T6, Met-apo AI-MI ou Met-apo AI-T6/MI.
3. 3. - Vector de expressão de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por ser derivado do plasmídeo pFCE4+.
4. 4. - Vector de expressão de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por ser o plasmídeo pML11-20, pIL8-6, pIL8-I ou pIL8-6I.
5. 5. - Vector de expressão de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a sequência de péptido de suporte consistir numa sequência derivada no máximo dos quinze primeiros resíduos de aminoácidos N-terminais de beta-galactosidase.
6. 6. - Vector de expressão de acordo com a reivindicação 5, caracterizado por o péptido de suporte consistir na sequência

   Thr-Met-Ile-Thr-Pro-Ser-Phe-Asp-Gly-Ser-Met ou

   Thr-Met-Ile-Thr-Asn-Ser-Arg-Gly-Ser-Met.
7. 7. - Vector de expressão de acordo com a reivindicação 6, caracterizado por ser derivado do plasmídeo pUC8 ou pUC9.
8. 8. - Vector de expressão de acordo com a reivindicação 7, caracterizado por ser o plasmídeo pIPI, plPI-6, pIPI-Ι, plPI-6I, pRP5, pRP5-6, pRP5-I ou pRP5-6l.
9. 9. - Vector de expressão de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o péptido de suporte consistir na proteína A ) estafilococal ou nos seus resíduos 23 a 270.
10. 10. - Vector de expressão de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a sequência de suporte que consiste numa ou mais áreas de ligação IgG da proteína A ser fundida ã sequência de apo AI humana ou uma variante genética correspondente via uma sequência de identificação para um enzima proteolítico.
11. 11. - Vector de expressão de acordo com a reivindicação 10, caracterizado por a sequência de péptido de suporte ser composta de (os primeiros 11 aminoácidos da proteína CRO de fago lambda)-[248 aminoácidos de proteína A estafilococal (resíduos 23 a 270)]-(Pro-Gly-Asp-Ser-Thr)-(os últimos 17 aminoácidos de beta-galactosidase)- (os 17 aminoácidos que contêm uma sequência de identificação para a enteroquinase de enzima proteolítico e que são Gly-Asp-Pro-Glu-Phe-Val-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys-Ser-Ser-Arg-Gly-Ser-Met).
12. 12. - Vector de expressão de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a sequência de péptido de suporte consistir numa ou mais áreas de ligação IgG de proteína A e que deriva do plasmídeo pLM3.
13. 13. - Vector de expressão de acordo com a reivindicação 12, caracterizado por ser o plasmídeo pLM8.
14. 14. - Vector de expressão de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a pro-sequência de apo AI humana ser fundida à sequência de apo AI humana ou uma variante genética correspondente e que é derivada do plasmídeo pDS20.
15. 15. - Vector de expressão de acordo com a reivindicação 14, caracterizado por ser o plasmídeo pFC33.
16. 16. - Hospedeiro que foi transformado com um vector de expressão tal como definido em uma qualquer das reivindicações | anteriores e caracterizado por uma proteína de fórmula geral (1) definida na reivindicação 1 ser susceptível de ser expressa.
17. 17. - Hospedeiro de acordo com a reivindicação 16, caracterizado por o hospedeiro ser uma estirpe de E. coli.
18. 18. - Processo para a produção de uma proteína susceptível de ser detectada por ELISA com um antisoro de anti-apo AI humano, caracterizado pelo facto de se cultivar um hospedeiro transformado como definido na reivindicação 16 ou 17 e de se recuperar a referida proteína assim obtida.