JPH02500797A

JPH02500797A - ヒトアポリポタンパク質ａｉもしくはその変異体の前駆体又は融合体の発現用ベクター及びそのベクターを含む細菌宿主

Info

Publication number: JPH02500797A
Application number: JP62506754A
Authority: JP
Inventors: ロレンツエツテイ，ロランド; モナコ，ルチア; ソリア，マルコ; パロンバ，ラツフアエレ; イサツキ，アントネラ; サルミエントス，パオロ
Original assignee: フアルマシア・エ・アツプジヨン・エツセ・ピー・アー
Priority date: 1986-10-23
Filing date: 1987-10-21
Publication date: 1990-03-22
Anticipated expiration: 2013-01-28
Also published as: CN87107991A; ES2044950T3; ZA877911B; JP2777126B2; JP2706247B2; GB8625435D0; EP0267703A1; AU8230587A; NO882763D0; ATE64619T1; PT85977B; JPH1052287A; EP0267703B1; KR890700163A; WO1988003166A1; PT85977A; NO882763L; DE3770915D1; CZ761587A3; IL84229A0

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】大腸菌中で発繞されるヒトアポリポタンパク質＾Ｉ及びその変異形本発明は組換えＤＮＡ技術を用いたヒトアポリポタンパク質＾１　（ａｐｏＡＩ）及びその変異体の産生に係る。

アテローム性動脈硬化及びその合併症（例えば冠性心疾思、ＣＨＤ）は恐らく健康上の最も危険な問題の１つである。

この病気の進行には多数の危険要因（ｒｉｓｋ　ｆａｃｔｏｒ）が伴っており、最も重要な危険要因の１つは血漿コレステロール（ＣＨＬ）レベルの上昇である。従って、ヒト体内のＣＨＬ代謝の研究が非常な注目を浴びている。

ヒト体内の血漿ＣＨＬ及びトリグリセリド（ＴＧ）のレベルを調節する遺伝子、治療食（＋（ｉｅｔ）及びホルモンの相互作用のメカニズムを理解する鍵はりボタンバク質運搬系にある。

血漿中のりボタンバク質の機能は主として脂質を１つの器官から別の器官に運搬することである。これらのりボタンバク質は疎水性脂質を可溶化するだけでなく各クラスの脂質を配給すべき身体部位を指令することが最近明らかにされた。主として４つのクラスのりボタンバク質、即ちキロミクロン（ＣＭ）、極低密度（ＶＬＤＬ）、低密度（ＬＤＬ）及ヒ高密度（ＩＩＤＬ）リポタンパク質が存在する。

血漿中で運搬されるときＴＧ及びコレステリルエステル（ＣＨＬＥ）はりボタンバク質粒子にパッケージされ極性リン脂質（ＰＬ）の表面単層によって包囲された疎水性コアを形成する８表面皮膜はアポリポタンパク質（ａｐｏ）と指称されるタンパク質と共に比較的少量の非エステル化ＣＨＬも含有する。

少なくとも９種類ノａｐｏ、即ちＡＩ、Ａ１１、ＡＩＶ、Ｂ（４８−１００＞、ＣＩ　、ＣＩＩ、　Ｃｕ１ｌ、Ｄ及びＥが同定されている。

血漿リポタンパク質レベルとＣＨＤの進行の危険との関連を研究することは特に重要である。　）ＩＤＬ及びＬＤＬは双方ともＣＨＬ及びＣＦＩＬＥの担体である。しかしながらＬＤＬ−Ｃ）ＩＬレベルはプラスの危険要因であるが（Ｋａｎｎｅｌ等、＾ｎｎ、　Ｉｎｔｅｒｎ、　Ｍｅｄ、、９０：８５−９１．１９７９）、ＨＤＬレベルは重要なマイナスの危険要因である（Ｙａａｒｉ等、Ｌａｎｃｅｔ、　ｉ：１０１１−１０１５．１９８１）ことが指摘されている。これらのりボタンバク質の正確な機能及び作用モードはまだ完全には解明されていないが、ＨＤＬは特に末梢組織からＣＨＬを除去しＣ）ＩＬ逆輸送（ＲＣＴ）と指称されるメカニズムによって肝臓に逆輸送する機能を果たすと考えられる。

１１ＤＬの主なアポリポタンパク質はａｐｏ八Ｉへあり、いくつかの研究によれば血漿ａｐｏ＾ＩレベルとＣＨＤとの間にはＩＩＤＬ−ＣＨＬレベルとＣＨＤとの間で報告されたような（ｌｓｈｉｋａｗａ等、Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｉｎｖｅｓｔ、、８：１７９−１８２．１９７８）逆相関関係があることが判明した。更に、ＨＤＬ−ＣＨＬ及びａｐｏ＾■のレベルは血管造影法で診断される難性アテローム動脈硬化病巣の容態に対して逆の相関関係をもつ（Ｐｅａｒｓｏｎ等、＾ｍｅｒ、　Ｊ。

旺セμシ、１０９：２８５−２９５．１９７９；Ｍａｃｉｅｊｋｏ等、ＮｅｗＥｎ、Ｊ。

Ｈｅｄ　、、３０９　：３８５−３８９．１９８３）　、従って、血漿中の高濃度ＨＤＬは粥腹の形成を遅らせ及び／または既存病巣の退行を促進することによってＣＨＤに影響を与えると考えられる。

）ＩＤＬアポリポタンパク質主としてａｐｏＡＩとレシチンとの複合体は、培養された動脈平滑筋細胞のごとき細胞から１ｎｖｉｔｒｏで遊離ＣＨＬの流出を促進する（Ｓｔｅｉｎ等、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏ−吐■工醸比、３８０：１０６ −１１８．１９７５）　、実験的に誘発したアテロームをもつ動物に対するリン脂質の静脈注入はこの流出に有利に作用しく＾ｄａｍｓ等、Ｊ、　Ｐａｔｈ、　Ｂａｅｔ、、９４ニア７−８７．１９６７）、ａｐｏＡ　ｌ　／レシチン複合体は天然ＨＤＬ粒子と同様の速度で血漿から除去される（Ｍａｌ＋ｎｅｎｄｉｅｒ等、Ｃｌ１ｎ、　Ｃｈｅｗ、＾ｅｔａ、１３１：２０１−２１０．１９８３）　。

ＣＩＩＬを与えたウサギにａｐｏＡ１を静脈注入すると病巣波及範囲が５０％縮小する。これは、ａｐｏＡ　ｌがアテローム性動脈硬化の病巣形成に対する防御効果をもつことを示し、その理由は恐らく大動脈壁に吸収されてＣＨＬが減少するためである（Ｍａｃｌｅｊｋｏ　ａｎｄ　Ｍａｏ、＾ｒｔｈｅｒｉｏｓｅｌｅｒｏｓｉｓ、　２：４０７ｍ。

１９８２；Ｍａｏ等、　Ｆｅｄ、Ｐｒｏｃ、　ＬＩＳ＋〜）−１４２、ｎｏ７　ｐＡＢＳＴＲＡＣＴ　３５７．１９８３；Ｂａｄｉｍｏｎ等、Ｃａｒｄｉｏｖａｓｅｕｌａｒ　Ｄｉｓｅａｓｅ　’８６．１９８６＾ＢＳ−ＴＲＡＣＴ　８１）。

Ａｐｏ　ｌはＨＤＬの約７０％を占める主要タンパク質であり、血漿中に濃度１．０〜１．２ｍｇ／ｘ（ｌで比較的多量に存在している（Ｓｃｈｏｎｆ　１ｅｌｄ等、Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｉｎｖｅｓｔ、、６９：１０７２．１９８２）、血漿ａｐｏＡ　ｌは２４３個のアミノ酸から成るポリペプチド単鎖でありその一次配列は既知である（Ｂｒｅｗｅｒ等、Ｂｉｏｅｈｅｍ、ユ匡−ｈ　ｓ、　Ｒｅｓ、　Ｃｏｍｍｕｎ、工、８０：６２３−６３０．１９７８）。細胞内でａｐｏＡ　ｌは２６７個のアミノ酸から成る前駆体の形態で存在する。この長いタンパク質の最初の１８個のト末端残基は粗面小胞体のシグナルペプチダーゼによって細胞内で開裂される。新しく分泌されたａｐｏＡＩは依然として６個のアミノ酸から成るＮ−末端延長部をもち、血漿及び／またはリンノ（特異的プロテアーゼによって成熟形に変換される（Ｚａｎｎｉｓ　ａｎｄ　Ｂｒｅ−ｓｌｏｔｕ、＾ｄｖａｎｃｅｓ　ｉｎ　ｔｌｕｍａｎ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ＋Ｈａｒｒｉｓ　ａｎｄ　Ｈｉｒｓｃｈ−ｈｏｒｎ　ｅｄｓ、、Ｐｌｅｎｕｍ、１２５−２１５．１９８５）　。

＾ｐＯ＾Ｉ分子のＣ−末端部は１１または２２個のアミノ酸の反復単位から成ることが判明した（ＭｅＬａｃｈｌａｎ、　Ｎａｔｕｒｅ、２６７：４６５−４６６．１９７９）　、縦列セグメントは正確な重複ではないが、アミノ酸置換物は一般に反復セグメントの対応位置の残基の化学的タイプを保存していた。これらの反復セグメントは、両親媒性螺旋コンホーメーションで存在すると推定され＜Ｓｅｇｒｅｓｔ等、ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ、、３８：２４７−２５３．１９７４）、ａｐｏＡ　１の主要生物学的活性即ち脂質結合及びレシチンＣＨＬアシルると考えられる。　ａｐｏＡ１のその他の２つの機能、即ちレセプターによってＨＤＬ粒子を認識するリガンドの機能及び末梢組織からＣＨＬを除去する機能とａｐｏＡ　１分子の特異的配列またはドメインとの関連はまだ解明されていない。

最初に文献に発表されたヒトａｐｏ＾Ｉの分子変異体は旧１ａｎｏ（ｓ＋ｐｏＡ　Ｉ　−Ｍ　Ｉ　）変異体であった（Ｆｒａｎｃｅｓｃｈｉｎｉ等、≧Ｃｌ１ｎ、　Ｉｎｖｅｓｔ、、６６　：８９２−９００．１９８０）　、この特徴は、へｒｇ１７３−Ｃｙｓ置換にあり（Ｗｅｉｓｇｒａｂｅｒ等、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、、２５８：２５０８−２５１３．１９８３）、同じ血縁に属する３３人の被験者において同定された。これらの被験者全員が常染色体性優性形質として伝達される突然変異アポリポタンパク質にヘテロ接合性であった、被験者においては）ＩＤＬ−Ｃ）ＩＬ濃度が顕著に低下しており、ＨＤＬレベルに対してマイナスの相関関係をもつ種々の程度のトリグリセリド過多を示した。突然変異と特異的病理状態との間の関連は全く確認できなかった。実際、罹患被験者は早期アテローム性動脈硬化の進行から明らかに保護されていた（Ｇｕａｌｎａｃｌｒｉ等、＾ｍ、　Ｊ、　Ｈｕｍ、　［：ｅｎ、、１９８６、印刷中）。

へｐｏ＾Ｉ−Ｍｌ中のアミノ酸置換は突然変異アポタンパク質の構造を修飾しα 螺旋秩序構造を減少させ疎水性残基の露出を増加させる（Ｆｒａｎｅｅｓｃｈｉｎｉ等、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、、２６０：１６３２１−１６３２５．１９８５）　、突然変異アポタンパク質の構造再生（ｒｅｎｏｄｅ　Ｉ　Ｉ　ｉＢ）は、正常ａｐｏ＾Ｉよりも容易に脂質と会合する分子の脂質結合性を有意に変化させる。アポタンパク質／脂質複合体は、正常ａｐｏ＾Ｉによって形成される複合体と同様であるが変性剤による破壊が容易である。変異形の内部にシスティン残基が存在するので、ａｐｏ＾■との複合体及びａｐｏＡ　ｌ二量体の形成が可能である。これらのタンパク質複合体が「罹患」被験者で観察された異常ＨＤＬ粒子の形成の主因であると推定される。＾ｐｏＡ　Ｉ　−Ｍ　Ｉのこれらの特徴すべてがその異化作用促進及び組織脂質の有効吸収能に寄与すると考えられる。

ａｐｏＡ　ｌのその他のいくつかの遺伝変異体がこれまで文献に発表されたが（Ｂｒｅｓｌｏｗ、＾ｎｎ、　Ｒｅｖ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、、５４　：６９９−７２７．１９８５）、これらのうちでキャリアにおける何らかの病理状Ｂまたはりボタンバク質代謝作用の有意な変化と関連づけられたものはない（表１参照）。

＾ｐＯ＾１　ｅＤＮ＾ＤＮＡンはいくつかの研究室で得られた（Ｂｒｅｓｌｏｗ、　八ｎｎ、Ｒｅｖ、Ｂｉｏｅｈｅｍ、、　５４　：６９９−７２７、１９８５　；５ｈａｒ−ｐｅ等、Ｎｕｃｌ、＾ｃｉｄｓ　Ｒｅｓ、、１２　：３９１７− ３９３２．１９８４）。ｍＲＮ＾は約８９０塩基対（ｂｐ）の長さをもち、３５ｂｐの５′非非翻訳列と８０１ｂｐ（２６７個のアミノ酸）のコード配列と翻訳終止コドン（ＴＧ＾）とポリへテイルを付けた５４ｂｐの３°非非翻訳列とをもつ、完全ｃＤＮ＾ＤＮＡオチド配列を添付の第１図に示す。

出願人等は、ａｐｏＡ　ｌまたはその遺伝変異体を含むタンパク質を産生ずるために組換えＤＮＡ技術の使用が有効であることを知見した。変異体としては、６ −５ｅｒがＴｈｒ’ｔ”１ｆｆｉ換されたａｐｏＡＩ　（ａｐｏＡＩ−７６）、ａｐｏＡＩ−Ｍｌ、または、ａｐｏＡＩ　−Ｔ６とａｐｏＡ　Ｉ　−Ｍ　Ｉの双方の突然変異を含む変異体（ａｐｏＡＩ　−Ｔ６／Ｍ　ｌ　）がある。タンパク質は、抗ａｐｏＡ　Ｉ抗血清と用いる酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳ＾）によって検出できる。産生じたタンパク質はａｐｏＡＩまたはその遺伝変異体がＮ −末端で担体ペプチドに融合した融合タンパク質の形態でもよい。

従って本発明は、抗ヒトａｐｏＡ　Ｉ抗血清を用いるＥＬＴＳ八によって検出可能な式（１）％式％（１）〔式中、Ｘは結合、β−ガラクトシダーゼのＮ−末端アミノ酸残基に由来の配列もしくはプロティンへの１つ以上の１．に−結合ドメインを含む配列を含む担体ペプチド配列またはヒ）　ａｐｏＡ　Ｉのプロ配列を示し、ＹはヒトａｐｏＡ　Ｉまたはその遺伝変異体を示す〕で示されるタンパク質を形質転換宿主中で発現させ得る発現ベクターを提供する。

Ｍｅｔ残基は、翻訳開始コドンの機能をもつと考えられる。

かかる発現ベクターで形質転換され内部で前記タンパク質を発現せしめる宿主が式（１）のタンパク質の産生に使用できる。形質転換宿主を培養し、得られた式（１）のタンパク質を回収する８式（１）のタンパク質も本発明の一部を成す。

好ましい実施態様によれば本発明は、（八〇　、　ａｐｏＡＩ　（第１図参照）、２、ａｐｏＡＩ　−Ｔ６．３、ａｐｏＡＩ　−Ｍ　Ｉ、４、ａｐｏＡＩ　−Ｔ６／Ｍ　Ｉ　、５、Ｎ−末端延長部Ｔｈｒ−Ｍｅｔ−１１ｅ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ −Ａｓｐ−Ｇ　ｌ　ｙ−Ｓｅｒ−Ｍｅｔ−をもつａｐｏＡ　ｌ　（ａｐｏＡ　ｌ　−ＲＰ５）、６．８−末端延長部Ｔｈｒ−Ｍｅｔｉｌｅ−Ｔｈｒ−＾５ｎ−Ｓｅｒ−＾ｒｇ−Ｃ１ｙ−５ｅｒ−Ｍｅｔ−をもつａｐｏＡ　ｌ　（ａｐｏＡ　ｌ　−ＩＰＩ）、７、ａｐｏＡＩ　−Ｔ６とａｐｏＡ　Ｉ−ＲＰ５とを結合したタンパク質（ａｐｏＡ１−ＲＰ５／Ｔ６）、８、ａｐｏＡＩ　−Ｔ６とａｐｏＡ１−ＩＰＩとを結合したタンパク質（ａｐｏＡ１−ＩＰＩ／Ｔ６）、９、ａｐｏＡＩ−ＭｌとａｐｏＡ１−ＲＰ５とを結合したタンパク質（ａｐ。

＾１−ＲＰ５／Ｍ　Ｉ　）、１０、　ａｐｏＡ　Ｉ　−Ｍ　ＩとａｐｏＡＩ−ＩＰＩとを結合したタンパク質（ａｐ。

八ｌ　ＩＰＩ／Ｍ　Ｉ　）、１１、　ａｐｏＡ　Ｉ　−Ｔ６／Ｍ　ＩとａｐｏＡＩ−ＲＰ５とを結合したタンパク質（ａｐｏＡ　Ｉ　−ＲＰ５／Ｔ６／Ｍ　Ｉ　）、１２、　ａｐｏＡＩ　− Ｔ６／Ｍ　ＩとａｐｏＡ　Ｉ−ＩＰＩとを結合したタンパク質（ａｐｏＡ　Ｉ　 −ＩＰＩ／Ｔ６／Ｍ　Ｉ　）、１３、Ｎ−末端延長部＾ｒｇ−Ｈｉｓ−Ｐｈｅ− Ｔｒｐ−Ｇｉｎ−ＧｌｎをもつａｐｏＡ　１（ｐｒｏａｐｏＡＩ）、１４、　ｐｒｏａｐｏＡ　ＩとａｐｏＡ　Ｉ　−Ｍ　Ｉを結合したタンパク質（ｐｒｏａｐ。

＾１−Ｍ１）、１５．ブドウ球菌プロティン肩こよって与えられたＮ−末端延長部をもちＮ−末端から順に（λファージのＣＲＯタンパク質の最初の１１個のアミノ酸）−（ブドウ球菌プロティン＾の２４８個のアミノ酸（残基２：３−２７０））−（Ｐｒｏにｌｙ−＾５ｐ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ）−（β−ガラクトシダーゼの最終１７個のアミノ酸）−（タンパク質分解酵素エンテロキナーゼの認識配列を含みＧｌｙ− ＾５ｐ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−八ｓｐ−＾ｓｐ−＾ｓｐ−＾５ｐ− Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−＾ｒＨ−Ｃ１ｙ−Ｓｅｒ−Ｎｅｔ）で示される１７個のアミノ酸）−（ａｐｏＡ　ｌ　、　ａｐｏＡ　１−Ｔ６、ａｐｏＡ　１−ＭＩまたはａｐｏＡ　Ｉ　−Ｔ６／Ｍ　Ｉ　）の構造をもつ５４１個のアミノ酸残基から成るタンパク質をコードする遺伝子を担う組換えプラスミドの構築、及び、（Ｂ）大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｅｈｉａ　ｃｏｌｉ、Ｅ、ｃｏｌｉ株）中での前記遺伝子の発現に係る。これらの遺伝子の発現によって以下のタンパク質が得られる。

−Ｍｅｔ−ａｐｏＡ　ｌ　、Ｎｅｔ−ａｐｏＡ　Ｉ−Ｔ６、Ｍｅｔ−ａｐｏＡ　ｌ　−Ｍ　ｌ及びＮｅｔ−ａｐｏＡ　Ｉ　−Ｔ６／Ｍ　Ｉから選択されたアポリポタンパク質、−アミノ酸配列Ｎｅｔ−Ｔｈｒ−Ｎｅｔ−１１ｅ４ｈｒ−Ｐｒｏ −Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−＾ｓｐ−Ｃ１ｙ−Ｓｅｒ−Ｍｅｔ−がａｐｏＡｌ　、ａｐｏＡ　１−Ｔ６、ａｐｏＡ　Ｉ　−Ｍ　Ｉ及びａｐｏＡ　ｌ　−Ｔ６／Ｍｌから選択されたアポリポタンパク質に融合した融合タンパク質、一アミノ酸配列ＭｅｉＴｈｒ−Ｍｅｔ−１１ｅ−Ｔｈｒ−＾５ｎ−Ｓｅｒ−＾ｒｇ−Ｃｌｙ−Ｓｅｒ−ＮｅｔがａｐｏＡｌ　、　ａｐｏＡ１−Ｔ６、ａｐｏＡ　ｌ　−Ｍ　Ｉ及びａｐｏＡ　Ｉ　−Ｔ６／Ｍ　Ｉから選択されたアポリポタンパク質に融合した融合タンパク質、一プロアポリボタンバク質ｐｒｏａｐｏＡ　ＩまたはｐｒｏａｐｏＡＩ−Ｍｌ、（ブドウ球菌プロティン＾の２４８個のアミノ酸（残基２３〜２７０））−（Ｐｒｏ−（：Ｉｙ−＾５ｐ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ）−（β−ガラクトシダーゼの最終１７個のアミノｉり−（タンパク質分解酵素エンテロキナーゼの認識配列を含みＧｌｙ−＾５ｐ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−＾ｓｐ−＾ｓｐ−＾ｓｐ−＾５ｐ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−＾ｒｇ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｍｅｔ）で示される１７個のアミノ酸）−（ａｐｏＡｌ　、　ａｐｏＡ　１−Ｔ８、ａｐｏＡｌ−ＭｌまたはａｐｏＡｌ　−Ｔ６／Ｍ　Ｉ　）から構成された融合タンパク質。

添付図面において、第１図は成熟形ヒトａｐｏ＾Ｉに対応する完全ヌクレオチド配列を示す０図示の配列はｍＲＮ＾を５′→３°方向で示す、下の列はアミノ酸配列を示す。

第２図は成熟しトａｐｏ＾Ｉをコードする遺伝子の５°末端の復元を示す、最初のＳａｕ　３＾Ｉ制限部位から開始するプラスミドｐＡ］／へに由来のＤＮＡフラグメントを、単鎖前駆体１−４のアニーリング及び結合によって組み立てた合成オリゴヌクレオチドアダプターに結合した。２つのＢ＆ＩＩＨＩ制限部位を末端にもつけ１ａｎｋｅｃｌ）７９０ｂｐのフラグメントは成熟ａｐｏＡ　１分子をコードしている。

第３図はｐＬＳ６６及びｐＭＬｌｌ−２０のヌクレオチド配列に関する。配列は、ｐＦＣＥ４“の＾ＴＧ開始コドンと欠失前（ｐＬＳ６６、＾）及び欠失後（ｐＭＬｌｌ−２０、Ｂ）のａｐｏＡ　ｌ遺伝子の起点との間の接合を示す。

第４図はｐＩＬ８−６及びｐｌＬ８−１のヌクレオチド配列に関する図である。

配列はｐＩＬ８−１　（＾）におけるａｐｏＡＴ−ＭＩ突然変異（ＣからＴ）の存在及びｐｌＬ８−６（Ｂ）におけるａｐｏＡｌ　−Ｔ６突然変異（ＣからＣ）の存在を示す。

第５図はｐＭＬｌｌ−２０のイムノプロット分析を示す、アフイニテイ力ラム及び標準ヒトＨ肚分画からの溶出物質のアリコートを沸騰させ１２．５％５ＤＳ− ＰＡ（１；Ｅで重複（ｉｎ　ｄｕｐｌｉｅａＬｅ）電気泳動にかけた。本文に記載の手順でニトロセルロースフィルターにブロッティングした。レーン：１−標準ＨＤＬ、２−アフィニティ力ラムの溶出物−３−分子量標準。

第６図はｐＲＰ５及びｐＵｃ９のイムノプロット分析を示す。

ＩＰＴ（：で誘発した野性型ｐＵｃ９または組換えｐＲＰ５プラスミドを担う細菌培養物のアリコートをペレット化し、適当な緩衝液に再懸濁させ、標準ヒト）ＩＤＬ分画と平行にゲル電気泳動にかけた。標本を沸騰させた後、１２．５％５ＤＳ−ＰＡにＥで電気泳動させた０本文に記載の手順でニトロセルロースフィルターにブロッティングした。レーン：１−分子量標準；２−標準ＨＤＬ；　３− ｐＬＩｃ９：４−ｐＲＰ５゜第７図はプラスミドｐＬＭ８の構築を示し、枠で囲んだ部分は夫々、ＰＲＯＴ　Ａ、　ＡＭＰ、ＬＡＣＺ及び＾ＰＯ＾Ｉヲ示す、これラバ夫々、プロティン＾、−ラクタマーゼ、−ガラクトシダーゼ及びヒト成熟ａｐｏＡ　ｌをコードする遺伝子である。　ＣＲＯはλｃｒｏタンパク質の最初の１１個のアミノ酸をコードする配列、Ｔはプロティン八転写終了配列、Ｆｌはファージｆ１パ・ンケージング配列、ＯＲｉは複製起点、Ｅｋ、＾Ｄはエンテロキナーゼによって認識されるタンパク質分解部位配列を示す、プラスミドｐＬＭ８中のＥｅｏＲｌ及びＣｌａ　１部位は非反復（ｕｎｉｑｕｅ）でない。

第８図は５’　ｐｒｏａｐｏ＾■配列の復元を示す。

第９図はｐｒｏａｐｏＡ　Ｔを発現し得るベクターｐＦＣ３３の構築を示す。

第１０図はｐＦＣ３３によって発現されたｐｒｏａｐｏＡ　ｌのゲル電気泳動及びイムノプロット分析を示す、レーン１　：ＨＤＬ標準、レーン２：弁組換え菌株、レーン３　：ｐｒｏｉｐｏＡ　Ｉ及びレーン４：分子量標準。

本発明の発現ベクターは、該ベクターに含まれたＤＮＡ配列、特に構造遺伝子の配列を発現し得るベクターである。

発現されるべきＤＮＡ配列はそれらの発現をコントロールする上流配列に対して正しく配置されている０発現されるべきタンパク質、宿主の性質等を考慮して適当な任意のプロモーター系を使用するとよい、従って、ＰＬ、　Ｉａｃ、凪及びＵ」−プロモーターから選択されたプロモーターを使用し得る０本発明の場合、５°−調節配列は発現されるべきａｐｏＡｌまたはその遺伝変異体に対して非相同である。調節配列はＩａｃまたはｔｒｐオペロンの調節配列でもよい、言い替えると、本発明の発現ベクターは、ａｐｏＡｌまたはその遺伝変異体である非相同タンパク質を発現し得る。好ましい遺伝変異体はａｐｏＡ）−Ｔ６、ａｐｏＡｌ−Ｍｌ及びａｐｏＡｌ　−Ｔ６／Ｍ　Ｉである。

式（１）のタンパク質をコードするＤＮＡ配列を含む本発明の発現ベクターは典型的にはプラスミドである。これらは単鎖でもよい。各ベクターは複製起点を有しており複製可能である。好ましい発現ベクターは、ａｐｏＡ　ｌまたはその遺伝変異体を発現する場合はプラスミドｐＦＣＥ４＋に由来し、担体配列がβ−ガラクトシダーゼのＮ−末端アミノ酸残基に由来の配列を含む融合タンパク質を発現する場合はｐＵｃ８またはｐＵｃ９に由来し、担体配列がプロティンへの１つ以上のＩεＧ結合ドメインを含む場合はｐＬＭ３に由来し、ｐｒｏａｐｏＡＩまたはその遺伝変異体を発現させる場合はｐＤｓ２０である。

ａｐｏＡｌまたはその遺伝変異体を含むタンパク質を発現させるために適当な宿主を本発明の発現ベクターによって形質転換させる。細菌、酵母または哺乳類細胞系のごとき原核細胞または真核細胞の宿主を使用し得る。代表的な宿主は大腸菌株である。所望のタンパク質が細胞プロテアーゼによって分解されないように宿主を選択する必要がある、一般には、ａｐｏＡｌまたはその遺伝変異体を含むタンパク質は以下の手順で得られる。

１、クローンａｐｏＡ　ｌ　ｃＤＮ＾を選択する。

２、ａｐｏＡｌ遺伝子を易動性にする制限部位が両端に形成されるようにｃＤＮ＾を裁断（ｔａｉｌｏｒ）する。これに付随してシグナルペプチド及びプロペプチドをコードする配列が除去される。

３、ａｐｏ＾Ｉ遺伝子を発現ベクターに正しい読取枠で挿入する。突然変異Ｔ６及び／またはＭｌを導入してもよい、　ａｐｏ＾Ｉ遺伝子またはその変異遺伝子はオペロン内の唯一の精造遺伝子でもよい、または、ａｐｏＡ　ｌまたはその遺伝変異体を融合タンパク質として発現させたい場合にその５゛端を担体ペプチドをコードするＤＮＡ配列に付着させてもよい。

４、ａｐｏＡｌまたはその遺伝変異体を内部で発現させ得る宿主を発現ベクターで形質転換する。

５、形質転換した宿主を培養し、得られた所望タンパク質を回収する。

ａｐｏＡ　ｌまたはその遺伝変異体をコードする遺伝子が１つ以上のイントロンを含まずに入手できる場合、この遺伝子はベクター内に存在するプロモーターの転写コントロール下にベクターに枠内（ｉｎ　ｆｒａｍｅ）挿入される。遺伝子は担体ペプチド配列をコードするＤＮＡ配列の直後に挿入され得る。

従って式（１）のタンパク質をコードするＤＮＡ配列は適当なプロモーターを備えたベクター内の転写開始コドンと終了コドンとの間に挿入され得る。ｐｒｏａｐｏＡ　Ｉまたはその遺伝変異体をコードする遺伝子も同様にベクター内に挿入され得る。得られた発現ベクターによって形質転換された宿主の培養によって所望のタンパク質を産生じ得る。

融合タンパク質の担体ペプチド部分は、β−ガラクトシダーゼのＮ−末端アミノ酸残基に由来してもよい。例えば、β−ガラクトシダーゼの最初の１５個以内のＮ−末端アミノ酸残基に由来し得る。好ましくは残基５〜１５、より好ましくは残基８〜１２に由来する。このようにして得られた好ましい担体ペプチドは配列、Ｔｈｒ−Ｍｅｔ−１１ｅ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−＾５ｌ）−に　Ｉｙ−Ｓｅｒ−ＭｅｔまたはＴｈｒ−Ｍｅｔ−１１ｅ−Ｔｈｒ−へ５ｎ−Ｓｅｒ− 八ｒｇ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｍｅｔを含む。

かかる担体ペプチドを組み込んだ融合タンパク質を発現させるとき、その前にＮｅｔが存在する。これはプロティンへの１つ以上のＩｇＣ−結合ドメインを含む別の担体ペプチドを使用する場合にも同じである。かかる担体配列は、ブドウ球菌プロティンへの完全配列または該タンパク質の残基２３〜２７０を含み得る。

エンテロキナーゼ、Ｘ因子またはコラゲナーゼのごときタンパク質分解酵素の認識部位を含むアミノ酸配列が、ａｐｏＡ　Ｉまたはその変異体の配列の直前に存在してもよい、適当な配列は、ｃｒｙ−八５ｐ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｖｉｌ−へｓｐ−＾ｓｐ−＾ｓｐ− へｓｐ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−八ｒｇ−Ｇ　Ｉｙ−Ｓｅｒ−Ｍｙｔである。

これはエンテロキナーゼの認識配列である。担体配列中に別のアミノ酸配列が存在してもよい０例えばプロティン＾配列とタンパク質分解酵素認識部位の配列との間に３０個以内の残基から成る結合配列が存在してもよい、担体配列のＮ−末端部分が発現ベクター中のプロモーターによって天然にコントロールされる構造遺伝子の第１残基例えば２０個以内の残基を含んで°いてもよい、プロティンへのＩｇＧ−結合ドメインを含む融合タンパク質は水溶性であり、水性環境で適度に安定であり、例えばＩｇＧ−結合５ｅｐｈａｒｏｓｅを用いたアフィニテイクロマトグラフィーによって均質になるまで容易に精製できる。

Ｎ−末端延長部が担体ペプチドによって準備されたか否かにかかわりなく、式（１）の組換えタンパク質は典型的にはヒト起源のその他のタンパク質を実質的に含まない、言い替えると、該タンパク質は実質的に純粋な形態で形成され、通常なら該タンパク質と会合しているタンパク質が付随しａｐｏ＾１またはその遺伝変異体を含むタンパク質は始原効果をもつのでヒトまたは動物の体内治療に使用され得る。

より詳細には、血漿コレステロール及び／またはトリグリセリドのレベルを低下させるために使用され得る。従って、このタンパク質は、アテローム性動脈硬化及び冠性心疾患のごとき心血管疾患に対して使用され得る。このタンパク質は予防のために投与されてもよくまたは既往の病状の改善及び／または治療のために投与されてもよい。

従って本発明によって産生されるタンパク質は、薬剤的に活性の担体または希釈剤を含む薬剤組成物として提供され得る。かかる組成物は公知の方法で処方され得る。タンパク質は非経口投与例えば静注投与されてもよい。

以下に本発明の詳細な説明する。

え１九り彬ｆｆｉｙｔｂ菌株：大腸菌に１２ＪＭ１０１（Ｍｅｓｓｉｎｇ等、Ｎａｔｕｒｅ、３１４：３０９−３２１．１９８１）、ＭＣ１０６１（Ｃａｓａｄａｂａｎ　ａｎｄ　Ｃｏｈｅｎ、Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　１３８：１７９−２０７．１９８０）、７１／１８ｃ１８５７（Ｌｏｒｅｎｚｅｔｔｉ等、販岨、３９：８５−８７．１９８５）、ＲＬ８４１（Ｋｅｎｋｅｌ、Ｐｒｏｅ、　Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、　Ｓｅｉ。

竪ム８２　：４８８−４９２．１９８５）、ＣＡＣ６２９（■好遅狙、臆ｎ−；Ｃ，＾。

Ｇｒｏｓｓ−Ｍａｄｉｓｏｎ＋Ｗｉｓｅｏｎｓｉｎ）。

培地：全部の菌株を必要に応じて５０μｇ／ｗｌ！のアンピシリンを加えたＬＢ培地（Ｌ＾培地）で増殖させた。適当な場合には匪プロモーターを抑制解除するために１ｍＭのＩＰＴにを培地に添加した。

素　１〒′　びＤＮＡ　」リゾチームはＳｉｇｍａ（Ｓｔ、　Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ，ＵＳＡ）から入手、制限エンドヌクレアーゼはＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ（Ｍａｎｎｈｅｉｍ、ＤＥ）、ＢＲＬＩｎｃ、　（Ｃａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、　ＭＤ、ＵＳＡ）またはＮｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ（Ｂｅｖｅｒｌｙ、　Ｍ＾、ＵＳＡ）から入手、　Ｔ４リガーゼ及びその他の全部の酵素はＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒから入手、特に注釈がなければすべての酵素反応は酵素を製造業者の指示通りに使用して行なった。制限エンドヌクレアーゼ分解によって得られたＤＮＡフラグメントをアガロース水平ゲルまたはポリアクリルアミド垂直ゲルを用いた電気泳動によって分離し、ｌ５ＣＯＭｏｄ。

１７５ｏ濃縮器（ＩＳＣＯＣＯ，、Ｌｉｎｃｏｌｎ、　ＮＥ、ＵＳＡ）を使用し電気溶出法の修正方法でゲルマトリクスから抽出し、更にＥｌｕｔｉｐ−ｄカラム（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ　ａｎｄ　５ｅｈｕｅｌｌ、Ｋｅｅｎｅ、ＮＨ，Ｌ！Ｓ＾）で精製した。

γ′　のａＯ＾　坤客のためのエン　イムイムノ　・・ペレット化した細胞を溶菌緩衝液（５０＋ｅＭのＴｒｉｓ−Ｃ１ｐＨ７，０，３０ＪのＮａＣ１，０，１％のＮａＮ３．１０ｗｇ／ｌのフェニルメチルスルホニルフルオリド）に再懸濁させた。溶液をリゾチームでＩＨ／ｘｉにし、４℃で３０分間攪拌した。５回の凍結乾燥サイクル後に抽出物を以下のごときエンザイムイムノアッセイで試験した。

標準９６ウエルのマイクロタイタープレートを、ヒツジで感作した適当な希釈度の抗ヒトａｐｏ＾Ｉ抗血清で４℃で１晩被覆した（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ、Ｍａｎｎｈｅｉｗ＋、　ＤＥ）、　０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０と０．０１％のＭｅｒｔｈｉｏｌａｔｅとを含む１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＣＮ　ｐＨ８，ｏで３回洗浄後、５０μ！の系列希釈度の標準ａｐｏＡ　Ｉ　（ＴＡＧＯＣｏｒｐ、、Ｂｕｒ−Ｉｉｎｇａｍｅ、　Ｃ＾、ＵＳＡ）または細菌抽出物を添加し、３７℃で１時間インキュベートした。同じ緩衝液で３回洗浄後、５０μ！の適当な希釈度のウサギ抗ヒトａｐｏＡ　ｌ抗血清（１＋＋＋ｍｕｎｏ　Ｌｔｄ、、Ｄｕｎｔｏｎ　Ｇｒｅｅｎ＋Ｎｒ、　５ｅｖｅｎｏａｋｓ＋Ｋｅｎｔ＋ＣＢ）を添加し　、１酸アンモニウム沈殿によって更に精製した。３７℃で１時間維持し、更に３回洗浄後に、Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒ（Ｂｏｓｔｏｎ、Ｈ＾、ＵＳＡ）から提供されるプロティンへ−西洋ワサビペルオキシダーゼキットを製造業者の指示通りに用いてウェルを染色した。

＾ｆｆ１ｅ１１０に・　るヒ・ソジ　ヒトミｏへ■の結ムヒツジ抗ａｐｏ＾Ｉ抗体（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ、Ｍａｎｎｅｈｅｉｍ、　ＤＥ）の調製：２０ｘｌの非希釈抗体溶液を不断に攪拌しながら０．１Ｍリン酸Ｍ＠液ｐ）１７に４℃で１晩透析した０次に遠心して破片と上滑とを分離した。

＾ｆｆｉｇｅｌ　１０（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｒｉｅｈｍｏｎｄ、　Ｃ＾）の調１！：１／２容のイソプロピルアルコールと倍容の蒸留水とを順次用いた洗浄サイクルの繰り返しく４〜５回）を行なう前に４０ｉｆを室温で平衡させた。濾過によってゲルを乾燥させ、５０ｗ１のｆａｌｃｏｎ管に移し透析抗体を加えた。次に管を絶えず攪拌しながら４℃で８時間インキュベートし、１ｘｌのＩＭのグリシンエチルエステルを添加し、インキュベーションを１晩継続した。次に以下の溶液でゲルをおおまかに洗浄した。

−１００ｚｌのＦＢ’Ｓ＋０．１％ナトリウムアジド−１００禦ｌのＩＨ酢酸 −１００ｚ１の０．１Ｍリン酸緩衝液ｐＨ７＋　０．５ＭのＮａＣＺ−１００ｘ？７）　ＰＢＳ＋　０．１％ナトリウムアジドゲルをカラムに詰めローディングバッファ（ＰＢＳ＋１０ｉｙ／１のＰＭＳＦ＋１０ｘｇ／ｌのＰｅｐｓｔａｔｉｎ＾）で平衡させた。

イムノプロット（Ｌａｅｍｍｌｉ法を使用し標本を（適当な濃度で）ポリアクリルアミド平板ゲルに流した０次にｔｒａｎｓｂｌｏｔ装置（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を２５ｍＭのＴｒｉｓ塩基、１９２−のグリシン、２０％のメタノール中で０．２八で４℃で４時間使用しゲルをニトロセルロースフィルターに移した。ゲルを受容したフィルターを蒸留水で洗浄し、次にＰＢＳ＋３％ＢＳ八と共に穏やかに攪拌しながら１時間インキュベートした。フィルターを蒸留水で再度洗浄し、ＰＢＳで１：２５０に希釈した第゛１抗体（ＥＬＩＳ八で第２抗体として使用されるものと同じ）と共に室温で１時間インキュベートした。

ＰＢＳ及びＰＢＳ＋　０．０５％Ｔｌ１ｌｅｅｎ２０で２回洗浄後、１ニア５００に希釈した第２抗体く西洋ワサビペルオキシダーゼと結合したヤギで３作した抗ウサギＩｇＧ；Ｂｉｏ−Ｒａｄ）と共にフィルターを室温で１時間インキュベートした。更に２回洗浄後、フィルターを４−クロロ−１−ナフトールで染色した。

ａＯΔＩ３１！什　ノ５“端７元ａｐｏ八■へコードする完全ｃＤＮ＾クローン（ｐへＩ／＾）は、シグナルペプチドとプロペプチドと完全成熟ａｐｏＡ　ｌタンパク質とのコード配列をもつヒト肝臓ｃＤＮパライブラリイから得られた（Ｓｈａｒｐｅ等、ＮＵｃｌ、＾ｃｉｄｓ　Ｒｅｓ、、１２：３９１７−３９３２＞。成熟ａｐｏ＾Ｉの最初のコドンの上流配列全部が除去されるように遺伝子の５°端を復元した。このために、プラスミドｐＡ　Ｉ　／＾をＥｅｏＲｌ及びＢａｍＨＩで分解し、ｃＤＮ＾インサートを含む８９０ｂｐのフラグメントを単離し、１％アガロースゲルから回収した。フラグメントを部分分解条件下に５ａｕ３＾■で制限し、混合物を成熟タンパク質の最初の９個のアミノ酸のコード配列を復元するように設計されたリン酸化合成アダプターに結合し、大腸菌におけるコドン使用に従って最適な配列を得た。アダプターは以下の手順で調製した。ホスホトリエステル法（Ｃｒｅａ　ａｎｄ　Ｈｏｒｎ、　Ｎｕｃｌ、＾ｃｉｄｓ　Ｒｅｓ、、８：２２３１−２３４８．１９８０）によって４つのオリゴヌクレオチドを合成した。

１　、５°−にＡＴＣＣＡＴＧ（：ＡＣにＡＧＣＣ−３゜２　、５′−＾ＣＣＣＣＡＣＡＧＴＣＣＡＴにＧ−３゜３　、５’　−ＣＧＧＴＣＧＣＴＣＧＴＣＣＡＴＧ−３゜４　、５’　−ＧＡＴＣＣＣＡＴＧＧＡＣＴＣＴＧ−３’等モルｌの４つのオリゴヌクレオチド全部を一緒に結合し、結合混合物を５ａｕ３＾Ｉで処理し、アダプターを溶出し、ポリアクリルアミドゲルから精製した。得られたアダプターの配列を第２図に示す。

精製アダプターと部分５ａｕ３＾■切断ａｐｏＡ　ｌフラグメントとを含む結合混合物をＢａｍＨＩで分解した。　７９０ｂｐのフラグメントをポリアクリルアミドゲルから精製し、コウシ腸ホスファターゼで処理したＢａｍＨＩ切断ｐＡＴ１５３−ＰｖｕｌＩ８に結合した。　ＭＣ１０６１の形質転換後、リン酸化したオリゴヌクレオチド３をプローブとしたハイブリダイゼーションによって組換え体をスクリーニングした。陽性コロニーを単離し、更に制限酵素分解によって特性決定し、Ｍａｘａｍ　ａｎｄ　Ｃ１１ｂｅｒｔ（シ１上ｏｄｓ　Ｅｎｚ　ｍｏｌ’、、６５　：４９９−５６０．１９８０）に従って部分化学分解した。正しい方向付けのアダプターを含むプラスミドをｐΔ１／１２と命名した。

このような復元後にはＡＴＧ開始コドンとＢａｍＨｌ付着端とがａｐｏＡ　Ｉ遺伝子の５′端の前に存在していた。この戦略を用い、成熟ａｐｏ＾Ｉコード配列をＳｈｉｎｅ−Ｄａ１ｇａｒｎｏ配列の後にＢａｍＨ１部位を担う任意の発現ベクターに移動させ得る。

ＦＣＥ４＋を使用した組、えベクターの構築修飾ａｐｏＡ　Ｉ遺伝子を含むＢａｍＨｌフラグメントを精製し、ｐＦＣＥ４＋（Ｌｏｒｅｎｚｅｔｔｉ等、１９８５）のＢａｍ８１部位にサブクローニングした。得られた構築物が正しい方向付けのインサートを含むことをジデオキシチェーンターミネーション配列決定（第３八図）によって確認した。このプラスミドをｐＬＳ６６と命名した。

この戦略を用い、ベクター中に既に存在するへＴＧ開始コドンに対して枠外（ｏｕｔ　ｏｆ　ｆｒａ＠ｅ）にａｐｏ＾Ｉ遺伝子を挿入した。従って次の段階ではａｐｏ＾Ｉ遺伝子をこの＾ＴＧ開始コドンの直後に配置することによって読取枠を復元する。

灸友【ＬｐＦＣＥ４系を使用し、欠失させるべき領域の両端の塩基延長部に相補的な配列をもつ「ブリッジ」オリゴヌクレオチドを使用してクローン遺伝子の枠内配置を行なうことが可能である（Ｓｏｌｌａｚｚｏ等、旺眼、３７：１９９−２０６．１９８５）　。

このために、ホスホトリエステル法を使用し以下の配列をもつ単鎖オリゴヌクレオチドを合成した。

５°−ＣＴＴＡＣＡＴＡＴＧＣＡＣＣＡＧＣＣ−３゜このオリゴヌクレオチドはその５゛端でベクターの八ＴＣ（ヌクレオチド１〜１０）を含む直前領域にアニーリングし、その３′端でａｐｏ＾Ｉ遺伝子の最初の３個のヌクレオチドにアニーリングし、その結果ｐＬＳ６６に存在する余分な８つのヌクレオチドを鎖から除外する（ｌｏｏｐ　ｏｕｔ）。ｐｔ、ｓｓｓの５ｓＤＮＡｌよ大腸菌ＲＬ８４１を宿主として（Ｋｕｎｋｅｌ、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ８２：４８８−．４９２に記載のごとく）調製した。この細菌株はｐＦＣＥＡ中に存在するＰＬプロモーターの温度感受性リプレッサーを産生ずるプラスミドｐｃＩ８５７（Ｍ、　Ｚａｂｅａｕ）を含む大腸菌ＲＺ１０３２の誘導体である。

このプロトコルを使用してこの菌株から産生された５ｓＤＮ＾はチミンに置換したウラシル残基を数個含み、従ってｒｉｎν１ｔｒｏＪで正常な機能鋳型として作用するが、これらのプラスミドの正常宿主である野性型（ｕｎｇ＋）大腸菌７１／１８ｅ１８５７の形質転換に使用されたときは生物学的に活性でない。

１５ｍＭのＴｒｉｓ−ＣＩｐＨ８，５及び１５＋ｎＭのＭｇＣＬ’、中で０．１ピコモルのｐＬＳ６６５ｓＤＮ＾を２ピコモルのキナーゼ化した突然変異オリゴヌクレオチド（２０倍過剰）と５６℃で３０分間アニーリングした。室温に冷却後、延長−結合混合物を添加し反応を１５℃で１晩継続させた。延長反応混合物は以下のごとく調製したく最終濃度）、　１０ｍＭのＴｒｉｓ−Ｃｆ　ｐ）１８．５：１０ｍＭのＭｇＣＬ；０．５ｍＭの＾ＴＰ；０．０５ｍＭのｄＮＴＰｓ；５ｍＭのＤＴ７　、１単位のＤＮＡポリメラーゼ、Ｋｌｅｎｏｗフラグメント及び１．５単位のＴ４　ＤＮ＾リガーゼ。

インキュベーション後に反応混合物をフェノール抽出し、イソプロパツール及びエタノールで沈殿させた。７１／１８ｅ１８５７、コンピテント細胞を形質転換し、選択培地ＬＡにプレートした。所望の欠失を含むクローンを同定するために１５０のコロニーを採取し、定序プレートで増殖させニトロセルロースフィルターに移した。突然変異オリゴヌクレオチドをプローブとして使用し６ｘＳＳＣ及び１０ｘ　Ｄｅｎｈａｒｄｔ’　ｓ中で室温でハイブリダイゼーションを行なった０次に６ｘＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳ中で異なる２つの温度でフィルターを洗浄した。最初の温度はハイブリダイゼーション効率を検査するために室温であり、次の温度は理論的融解温度より４℃低い５０℃である。これは式Ｔｍ＝　４Ｘ　（１；Ｃ＋２Ｘ＾Ｔ〔式中、ＧＣ及び八Ｔは突然変異鋳型とオリゴヌクレオチドとによって形成された対合の数である（Ｎｏｒｒａｎｄｅｒ等、Ｇｅｎｅ、２６：１０１−１０６．１９８３）によって計算した。毎回の洗浄後にフィルターをχ緑感受性フィルムに露光した。ストリンジェントな温度でも陽性シグナルを生じる有望な突然変異コロニーをジデオキシチェーンターミネーション配列決定（第３Ｂ図）によって確認した。このプロトコルの効率はかなり高く約５０％である。　ａｐｏ＾１遺伝子が正しく枠内配置されたｐＦＣＥ４＋をｐＭＬｌｌ− ２０と命名した。

ａＯ＾Ｉ亦　Ｔ６　びＭｌの２つの変異体ａｐｏ＾Ｉ　−Ｔ６及びａｐｏＡ　ｌ　−Ｍ　Ｔを構築するためにｐＬｓ６Ｂ及びｐＭＬｌｌ−２０を鋳型として使用した。転移ＢａｍＲＩフラグメント内に正しく枠内配置された変異体遺伝子を同時に得るために双方の鋳型を使用したのである。

このために、常用のプロトコルによって２つの単鎖オリ、　ゴヌクレオチドを合成した。

１、Ｔ６突然変異のために５°−ＣＡＣＣ［：ＣＡＧＡＣＴＣＣＡＴＧ［ニー３ ″２、Ｍ１突然変異のために５’　−ＣＣＧＣＣＡＧＴＧＣＴＴｔｌ：ＧＣ−３ ”オリゴヌクレオチド１は成熟ａｐｏ＾■の第１コドンの第１ヌクレオチドを示す、オリゴヌクレオチド１は１７位に不適正（Ｇ対Ｃ）を伴って残基８〜２４にアニーリングする。オリゴヌクレオチド２は５１７位に不適正（Ｃ対丁）を伴って残基５１０〜５２４にアニーリングする。

枠内配置と同じプロトコルで突然変異誘発実験を行なった（第４八図及び第４Ｂ図）０重複突然変異体（ｄｏｕｂｌｅ　ｍｕｔａｎｔ）を得るためにまずＴ６突然変異を誘発し次にＭｌ突然変異を追加した。

得られたプラスミドを以下のごとく命名した。

ｐＩｔ、−５＝ｚつのＢａｖｌｌ　Ｔ部位間のａｐｏＡ　ｌ　−７６ｐｌＬ−５１＝２つのＢａｍＨ１部位間のａｐｏＡＴ−ＭｌｐｌＬ５−６１　＝　２つのＢａｍ８１部位間のａｐｏＡＩ　−Ｔ６／Ｍ　ＩｐｌＬ８−６＝枠内のａｐｏＡ　Ｉ−７６ｐＴＬ８−１　＝枠内のａｐｏＡＩ−ＭｌｐｌＬ８−６　ｉ−枠内のａｐｏＡ　Ｉ　−Ｔ６／Ｍ　Ｉ亦　ａｐｏＡｌ　−ＲＰ５　びＩＰＩの　１ａｐｏ＾Ｉ遺伝子及びその変異体Ｔ６及びＭｌを含むＤＮ＾フラグメントをＢａｍＨＩ分解によってプラスミドｐＬＳ６６、ｐｌＬ５−６、ｐｎｓ−１及びｐｌＬ５− ６がら切除し、記載のごとく１％アガロースゲルで精製した０次にフラグメントをｐＵｃ８及びｐｔｌＣ９（Ｖｉ−ｅｉｒａ　ａｎｃｌ　Ｍｅｓｓｉｎｇ、　Ｇｅｎｅ、１９：２５９−２６８．１９８２）に結合し、双方をＢａｗｌ　Ｉで直線化した。ＪＭＩＯＩコンピテント細胞の形質転換後、組換えプラスミドを高速破壊法で同定し、単離物をＢａ翔Ｈｌで切断することによって確認した。Ｈｉｎｄｌｌ及びＸｈｏ　Ｉで切断することによってインサートの対向する２つの方向（ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ）を識別した。

ｐＵｃ８を用いた構築物は、メチオニン残基と細菌β−ガラクトシダーゼ遺伝子に由来のα−ペプチドの最初の９個のアミノ酸とがその直前に存在する既に枠内配置されたａｐｏＡ　１遺伝子を含んでいた。その結果、β−ガラクトシダーゼのａｐｏ＾Ｉ分子のＮ−末端に１０個のアミノ酸から成る延長部が存在した。

ａｐｏＡ　ｌ遺伝子を正しい方向付けで含むすべての組換えｐＵＣ９誘導体では、更にａｐｏＡ　ｌ遺伝子を枠内配置する操作が必要であった。まず＾ＴＧ翻訳開始とａｐｏＡ　ｌ遺伝子との間を制限酵素ｔｌｉｎｄｌ［及び５ａｉｌで切断した。切断によって生じた付着端をＤＮＡポリメラーゼ（Ｋ　ｌ　ｅｎｏｗフラグメント）で埋め戻し、Ｔ４　ＤＮ＾リガーゼで再結合した。この結果、ａｐｏＡ　ｌ遺伝子の前方のｐＵｃ９の多重（ｍｕｌｔｉｐｌｅ）クローニング部位で１０個のヌクレオチドが欠失し、正しい読取枠が復元された。

組換えプラスミドを以下のごとく命名した。

（ａ）ｐＵｃ８系列ｐｌＰＩ　＝　ａｐｏＡＩ　−ＩＰＩｐｌＰ１６１　＝　−／Ｔ６／Ｍ　１（ｂ）ｐＵＣ９系列ｐＲＰ−６Ｉ　＝　”　“／Ｔ６／Ｍ　１延長変異体を形成した理由は、プラスミド中に存在する調節要素の後に天然の配列たる細菌β−ガラクトシダーゼのＮ −末端が存在することによって発現レベルが向上するからである。

株にお（る（１）（ｒ枠内配置」の項で既に説明した）プラスミドｐｃ１８５６を担う細菌宿主ＣＡＣ６２９をすべての組換えｐＦＣＥ４誘導体で形質転換させた。

３２℃で１晩増殖させた培養物をＬＡで１：１０に希釈し、ｉ＝フラスコ中で０Ｄ６ｓｏ０．５〜０．６まで増殖させ、次に温度を４２℃に上昇させてインキュベーションを１〜２時間継続した。

誘発後、細胞を１０分間氷冷し遠心によってベレット化した。

次にペレットをｒＥＬＩｓＡＪの項で記載のごとく処理して細胞を破壊した０ｍ胞抽出物を１６，０００ｒｐｍで４℃で３０分間遠心し、上清を「材料及び方法」の項に記載のごとくアフィニティ力ラムに通した。保持されたタンパク質をおおまかに洗浄し、ＩＭの酢酸で溶出させた。溶出分画をイムノプロット分析（第５図）及びｒＥＬＩｓ＾」によって検定した。ｐＭＬｌｌ−２０で得られた予備結果を平均すると培養物１！当たり約０．２にｇのａｐｏＡ　ｌが存在した。

突然変異体ａｐｏ＾Ｉ−Ｔ６、ａｐｏ八ＩへＭｌ及びａｐｏＡ　Ｉ　−Ｔ６／Ｍ　Ｉを担う他のすべての構築物に関しても同様の結果が得られた。

（２）すべての組換えｐＵＣ８／９誘導体で細菌宿主ＭＣ１０６１を形質転換させた。

３７℃で１晩増殖させた培養物をＬＡで１：１００に希釈し、震盪フラスコで１時間増殖させてがらＩＩＭＭのＩＰＴにを添加し、次に更に４〜６時間インキュベーションを継続した。このインキュベーション後、細胞を１０分間水冷し遠心によってベレット化した。この段階以後はｐＦＣＥ４誘導体で記載した手順と同じ抽出手順で処理した。ｐｌＰＩ及びｐＲＰ５を含む細胞の狙抽出物をイムノプロット分析（第６図）及びｒＥＬＩｓ＾」によって検定した。予備結果を平均すると培養物１１当たり１０ｙＦＩのａｐｏＡＩが得られた。

ａｐｏＡ１−ＰＲ５及びａｐｏＡＩ−ＩＰＩに組み込まれた突然変異体ａｐｏＡ　１−Ｔ６、ａｐｏＡＩ−Ｍｌ及びａｐｏＡ　Ｉ　−Ｔ６／Ｍ　Ｉを担う他のすべての構築物に関しても同様の結果が得られた。

えＩ匠１ａｐｏ＾Ｉ遺伝子を担う９４９ｂｐのフラグメントがＳｍａ　１部位に挿入されているベクターｐＲＩＴ２Ｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、　Ｓｗｅｄｅｎ）を使用して別の変異体を構築した。このプラスミドによって発現されたタンパク質は５４１個のアミノ酸から構成されていた。これらはＮ−末端から順にλファージのＣＲＯタンパク質の最初の１１個の、アミノ酸とブドウ球菌プロティンへの配列の２４８個のアミノ酸（残基２３〜２７０）と５つの異常なアミノ酸（Ｐｒｏ−［：ｌｙ−＾５ｐ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ）と大腸菌のβ−ガラクトシダーゼの最終１７個のアミノ酸とタンパク質分解酵素エンテロキナーゼの認識配列を含む１７個のアミノ酸ｃｒｙ−＾５ｐ−Ｐｒｏ−に１ｕ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−＾ｓｐ− ＾ｓｐ−＾５ｐ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−＾ｒｇにＩｙ−Ｓｅｒ−Ｍｅｔとを含み、これらは成熟しトａｐｏ＾Ｉ　（ＣＰ八−ＡＩと命名）またはその変異体ａｐｏ＾Ｉ−Ｔ６、’ａｌ）ｏＡ　Ｉ　−Ｍ　Ｉ　−ａｐｏＡ　ｌ　−７６７Ｍ　ｌの配列の直前に存在した。これらのキメラタンパク質は安定でありまた水溶液に可溶である。

ＣＰ＾−ＡＩとラット肝細胞及び培養マウスマクロファージとの相互作用を試験した。＋′Ｉ標識ＣＰ＾−ＡＩを培養細胞と共に４℃でインキュベートするとハイブリッドタンパク質が）ＩＤＬに対する場合と同様の結合パラメータで細胞表面に結合することが判明した。ハイブリッドタンパク質は３７℃で細胞に吸収され内在化（ｉｎｔｅｒｎａｌ　１ｚｅ）することが判明した。この挙動は脂質と会合してＩＩＤＬ粒子を形成するときの天然ａｐｏＡ　ｌの挙動に類似する。

彬１支ＬＬ泥佑１ヒト血漿から不連続ＫＢｒ勾配の上でＨＤＬ（１，０９＜　ｄ＜　１．２１ｇ／ｗｌ）を調製した。　ＨＤＬをＰＢＳ、１ｍＭのＥＤＴＡにおおまかに透析しＫＢｒを除去して４℃で保存した。Ｋｌａｕｓｎｅｒ等（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　ＣｈｅＬ、２５８．４７１５−４７２４．１９８３）の方法でヒトトランスフェリン（Ｓｉｇｍａ）に鉄を充填した。　ＢＳ＾は実質的にｔｉｃ非含有であった（Ｓｉｇｍｍ、＾７６３８）、　Ｓｔａ　ｈ　１ｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓプロティン＾はＰｈａｒｍａｃｉａから入手した。フェノールレッドを含有するＢａｎｋ’　ｓ平衡塩溶液はＧｉｂｃｏから入手した。

細　び細　培Ｆａｏ細胞としては、Ｄｅｓｅｈａｔｒｅｔｔｅ　ａｎｄ　Ｗｅｉｓｓ（Ｂｉｏｅｈｅｍｉｅ５６．１６０３−１６１１．１９７４）によって樹立され特性決定されたラット肝癌細胞系を、５％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）と１００単位／ｚｌのペニシリンと１００μｇ／＊１のストレプトマイシ〉・と２ｍＭのグルタミンと１０１１ＩＮのＨＥＰＥＳＩＪ衝液ｐＨ７，４とを加えたＣｏｏｎ改質）Ｉａｍ培地（Ｓｅｔｏｍｅｄ）で単層培養したものを用いた。

Ｊ７７４細胞としては、マウスマクロファージ細胞系（Ｒａｌｐｈ等、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌｏ　１１４．８９８−９０５．１９７５）を４．５％のＦＣＳとペニシリンとストレプトマイシンとグルタミンとＨＥＰＥＳＭ衝液ｐＨ７，４とを後述の濃度で含むＤＭＥＭ培地で遠心懸濁培養したものを用いた。

細菌株　びプラスミド細菌宿主は大腸菌８８１０１株（Ｂｏｙｅｒ　ａｎｄ　Ｒｏｕｌｌａｎｄ−Ｄｕｓｓｏｉｘ、Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　４１．４５９−４７２．１９６９）及びＲＲＩ　Ｍ１５’（Ｌａｎｇｌｅｙ等、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、八ａｉｄ、Ｓｅｉ、υＳ＾　７２、１２５４−１２５７、１９７５）。

プラスミドはｐＮＦ２６９０（Ｎｉｌｓｓｏｎ等、ＥＭＢＯＪ、　４．１０７５ −１０８０．１９８５）、ｐＬＭ３　（Ｍｏｎａｅｏ等、＾ｔｔｉ　Ｃｏｎｖｅ　ｎｏ　Ｃａｎ　、１ｕｎｔｏ＾、Ｇ、１゜−Ｓ、１．Ｂ、Ｂ、Ｍ、、１９５− １９６．１９８５）及びＰｈａｒｍａｅｉａ、　ＳｗｅｄｅｎのｐＲＩＴ２Ｔを使用した。

賭！制限酵素、Ｋｌｅｎｏ＠ＤＮＡポリメラーゼ及びＴ４　ＤＮ＾Ｎｉ−ゼはＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　ＭａｎｎｈｅｉＩｌｌから購入し製造業者の指示通りに使用した。大腸菌の形質転換はＭｏｒｒｉｓｏｎの方法（Ｍｅｔｈｏｃｌｓ旺止阻１．６８．３２６−３３１．１９７９）で行なった。

ハイブリッド１伝　のハイブリッド遺伝子はλＰＲプロモーターのコントロール下に実質的にＺａｂｅａｕ　ａｎｄ　５ｔａｎｌｅｙの方法（ＥＭＢＯＪ、　１．１２１７−１２２４．１９８２）で発現させた。細菌を３０℃でＯＤａ。。＝０．９まで増殖させた。５４℃に予熱した等容のブイヨンを添加して温度を急激に４２℃に上げた。採取以前に培養物を４２℃で９０分開インキュベートした。：Ａ胞溶解物全部をＺａｂｅａｕ　ａｎｄＳＬａｎｌｅｙ（１９８２）に記載のごとくゲルに充填した。

バイブ１ツドタンバ　のハイブリッドタンパク質の精製にはＭａｒｓｔｏｎ等（Ｂｉｏｔｅｃｈ−肱肢江２、’　８００−８０４．１９８４）の方法を用いた。細菌ペレットを３倍容ｈ／ｖ）の緩衝液＾（５０ｍＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌｐＨ８，０，５０ｍＭのＮａＣ１’、１−のＥＤＴＡ）に再懸濁させ、氷上で５　Ｘ　２０ｓｅｃ超音波処理した。遠心後（Ｓｏｒｖａｌｌ　５Ｓ３４０−夕、１０．ＯＯＯｒｐｍ、４℃で１０分間）、ペレットを０．５％のＴｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００と１０ｍＭのＥＤＴＡとを含む９倍容（、／ν）の緩衝液＾に再懸濁させ、室温で５分間静置した。

懸濁液を上記のごとく遠心し、ペレットを８Ｍ尿素を含む９倍容（１／ν）の緩衝液＾に再懸濁させ、室温で１時間インキュベートした。

尿素懸濁液を９倍容（ν／ｖ）の５０ｍＭのリン酸カルシウム緩衝液ｐＨ１０，７，５０ｍＭのＮａＣ１，１ｍＭのＥＤＴ屓こ添加し、ＫＯＨの添加によってｐＨ１０，７を維持しつつ室温で３０分間攪拌した０次に懸濁液を中和し、４℃でＭ衝液＾に透析した。透析した懸濁液を上記のごとく遠心した。透明上滑中のハイブリッドタンパク質は既に適度に純粋であり、この段階のハイブリッドタンパク質の平均収量は細菌培養物１１当たり５０〜６０ｍｇであった。　ＩｇＣ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　６　ＦＦ（Ｐｈａｒｍａｅｉａ）を用いたアフイニティクロマトグラフィーによって更に精製した。標本をカラムに充填し、０．０５％丁ｗｅｅｎ２０含有のＰＢＳ、ＰＢＳ及び５ｍＭの＾ｃＯＮＨ＜　ｐＨ５を順次用いて洗浄し、ＩＭの＾ｃＯＨ／＾ｅＯＮＨ，ｐＨ２，８で溶出した。精製タンパク質を緩衝液へに透析した。

Ｂ１０ｅ１１．５八ゲル−゛、カラムを　いたＢｉｏＲａｄのＢｉｏｇｅｌ　１．５＾カラム（４０ｃｍＸ　Ｉｃ＠）を５０Ｊの７ｒｉｓ／ＨＣ１ｐ１１８．ｏ、５０ｎ＋ＭのＮａＣ４’、１ｍＭのＥＤＴＡ中で平衡させた。標本を流速３１１／時で溶出させ、２５０μｌの分画を回収した。カラムをデキストランブルー（２，０ＯＯｋＤ）、チログロブリン（６９９ｋＤ）、フェリチン（４４０ｋＤ）、）ＩＤＬ（２８５ｋＤ）及びアルドラーゼ（１５８ｋＤ）テ較正Ｌ　ｆｓ　、１．２５ｕｔｔノ［”　’１ｌ−ＣＰＡ−Ａ　Ｉ　＊　７’、：　ハ８００μ ｙの非標識ＣＰ＾−＾Ｉを使用してハイブリッドタンパク質の分子量を決定した。

タンパク　のヨウ素化１ｏｄｏ−Ｇｅｎ試薬（Ｐｉｅｒｃｅ　Ｃｈｅｍｉｅ−ａｔ　Ｃｏ、）を使用してタンパク質をヨウ素化した。ヨウ素化反応は１００μｇの１ｏｄｏ−Ｇｅｎ、２００ｕｌのＰＢＳ中の１ｍｇのタンパク質、１ｍＣ１の無担体ＨＩＬ［１％■ ］、１６．５ｓＣｉ／＃ｇ（＾ｍｅｒｓｈａｍ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）を含んだ。４℃に１０分間維持後１０１１の５ｅｐｈａｄｅｘ　に５０カラムで遊離ヨウ素をタンパク質から分離した。ＰＢＳ（０，２％ＢＳ＾）でカラムからＨＤＬ、トランスフェリン及び１．Ｇを溶出し、５０ｍＨのＴｒｉｓ／）ＩＣＮ　ｐＨ８，ｏ、０．１５８のＮａＣ１，１ｍＭのＥＤＴＡ、０．２％のＢＳ八でハイブリッドタンパク質を溶出した。ハイブリッドタンパク質、ＩｇＧ及びトランスフェリンは透析しないで使用した。ＨＤＬは、標識の５％未満が１０％（― ／ν）１〜リクロロ酢酸に可溶になるまでＰＢＳ、０．５ｍＭのＥＤＴＡにおおまかに透析する必要があった。クロロホルム／メタノールを用いた脂質抽出後の測定によれば、５％未満の標識が脂質と結合した。得られた特異的活性はタンパク質１ｎｇ当たり２００〜４００ｃｐｍであった。

結合アッセイ懸濁細胞に対して４℃で２時間の結合アッセイを行なった。

Ｆａｏ細胞の懸濁液を得るために、単層をＰＢＳ、１ｍＭのＥＤＴＡて３７℃で３０分間インキュベートした。これらの細胞または懸濁液で増殖させたｊ７７４マクロファージを４℃で１００１００Ｏ分間ペレット化し３１のＢａｎｋｓ中ＢＳ八に再懸濁させることによって３回洗浄した。各結合アッセイは、１１１のＢａｎｋｓ／ＢＳ＾中に１×１０’細胞と指標量の［１２５■１−＠ｐ〇八−へ− Ｐ＾または［１２５ＩコーＨＤＬとを含有していた。４℃で２時間維持後、細胞をＢａｎｋｓ／ＢＳＡで４回洗浄し、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ管に移し、γカウンタで放射能を測定した。競合実験として１０μ９のヨウ素化リガンドを１０〜８００μｇの非標識ＩＩＤＬ、　ＣＰ＾−ＡＩ、プロティンΔまたはトランスフェリンによって競合させた。これらは夫々ヨウ素化リガンドの添加３０分前に４℃で細胞に添加した。

１（ＤＬ　びＣＰ＾−＾■の１ガントプロツトＪ７７４細胞（２ｘ１０’）をＰＢＳで２回洗浄し、１０１１１８（７）　Ｔｒｉｓ／）ＩＣ１ｐＨ７，４，０，１１＠ＭノＥＤＴＡ中で均質化しり、　２０００ｇテ１０分間遠心してポスト核上滑（ＰＮＳ）を調製した。　ＰＮＳを１％（ｖ／ｖ）丁ｒｉｔｏｎＸ−１１４（Ｂｏｒｄｉｅｒ、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　ＣｈｅＬ、２５６．１６０４−１６０７．１９８１）で抽出した。洗剤相をジチオトレイトール含有の等容の標本緩衝液と混合し、沸騰させ、次にヨードアセトアミドでアルキル化した。レーン当たり約１２１１のタンパク質を５〜１５％のＳＤＳポリアクリルアミドゲルに塗布した。ゲルをニトロセルロースフィルターにプロットし、Ｐｏｎｃｅａｕ　Ｓ染色によってバンドを可視化した。１０％（、／ν）の低脂肪粉乳と含有するＢａｎｋｓ中でニトロセルロースストリップを６時間消光（ｑｕｅｎｃｈ）させた、リガンド、即ち［＋　２５１］−ＣＰ八−ＡＩまたは［’　２５１］−ＨＤＬを１２．５μｇ／ｉ１でＢａｎｋｓ中乳に１６時間結合した６次にＢａｎｋｓ中乳でストリップを４回洗浄し、ヒトＨＤＬ、　ＣＰ＾−ＡＩまたはプロティン屓血清で１７５０に希釈）に対するウサギ抗血清でリガンドを検出し、ジアミノベンジジン反応（Ｂｕｒ−ｎｅｔｔｅ、＾ｎａ１．　Ｂｉｏｅｈｅ＋＋＋、、１１２．１９５−２０３．１９８１）で検出される抗つサギＩｇＧペルオキシダーゼの存在下にインキュベートした。乾燥プロットをＸ線フィルムに露光した。

分１於法− Ｆｒａｎｋ　ａｎｄ　Ｔｒｏｓｉｎ（Ｈ，Ｔｓｃｈｅｓｃｅ編：Ｍｏｄｅｒｎ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　１ｎＰｒｏｔｅｉｎ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ＋Ｗａｉｔｅｒ　ｄｅ　Ｇｒｕｙｔｅｒ　＆　Ｃｏ、、Ｂｅｒｌｉｎ＋２８７−３０２．１９８５）に記載の構造の気−液相マイクロシーケンサにおいてＬｏｔ、ｔｓｐｅｉｅｈ（Ｈｏ　ｅ　５ｅｙｌｅ冗ｓ　Ｚ、　Ｐｈ　５ｉｏ１．　Ｃｈｅｗ、、３６１．１８２９−１８３４．１９８０）に従って全自動化Ｅｃ１ｍａｎ分解によってアミノ末端の配列決定を行なった。ハイブリッドタンパク質のカルボキシ末端配列を決定するために、カルボキシペプチダーゼ、ε、八及び／またはＢをＴａｄｒｏｓ等（Ｅｕｒ、　、１゜Ｂｉｏｃｈｅｎ、、１３８．２０９−２１２．１９８３）の方法で使用した。アミノ酸分析のためにタンパク質をＴａｄｒｏｓ等（Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ。

、１２７．３１５−３１８．１９８２）の方法で加水分解し、全自動アミノ酸アナライザー（Ｄｕｒｒｕｍ　Ｄ−５００）を使用してアミノ酸組成を決定した。

トリプトファン及びシスティンは決定しなかった。

鏡検のために２％ホスホタングステン酸を使用しＨＤＬ及びＣＰΔ−ＡＩの標本をネガティブ染色した。Ｂｒａｄｆｏｒｄの方法（＾ｎａ１．　Ｂｉｏｅｈｅｍ、、７２．２４８−２５４．１９７６）でタンパク質濃度を検定した。

バイブ１ツドタンパク　ＣＰ＾−＾ｌをコード　る　云　をうブースミドＬＭ８の構築ベクターｐＲＩＴ２Ｔは大腸菌中で細胞内タンパク質を温度誘発的に発現させるべく設計されたｐＲＩＴ２の誘導体である（Ｎｉｌｓｓｏｎ等、１９８５）。構築物はλＰＲプロモーターのコントロール下にブドウ球菌プロティンへのＩｇＧ結合ドメインを含む、多重クローニング部位はプロティンへの３”端に外来遺伝子を容易に挿入せしめる。プロティン＾転写終了配列は多重クローニング部位の直ぐ下流に挿入される。プラスミドｐＬＭ３はヒトａｐｏ＾Ｉの成熟遺伝子に枠内融合した大腸菌１ａｅＺ遺伝子を含む（Ｍｏｎａｃｏ等、１９８５）。

ＰＡとＪｌｌ）Ｏ＾１との融合を担うプラスミドｐｔ、Ｍｓを第７図の手順で構築した。制限部位ＥｃｏＲｌ及びＣｌａ　Ｉを末端にＬつ９４９ｂｐのフラグメントをｐＬＭ３から単離し、Ｋｌｅｎｏｗ　ＤＮＡポリメラーゼによって埋め戻した。フラグメントの突出端をＳｍａ　ｌ直線化ｐＲＩＴ２Ｔに結合させた。得られたプラスミドｐＬＭ８はタンパク質分解性切断の特異的配列によって隔てられた５′端のプロティンへの遺伝子と３１端の成熟しトａｐｏＡ　Ｉ　’；！ｉ伝子とから構成された５４１個のアミノ酸から成る融合タンパク質をコードする読取枠を保有する。

ハイブリッドタンパク　の　、単離　び精０温度感受性Ｃｌ８５７λリプレッサー突然変異体をコードする適合プラスミドｐＮＦ２６９０の存在下にｐＬＭ８を保有する大腸菌細胞は大量のハイブリッドタンパク質を発現することが可能であった。４２℃で増殖させると誘発ＣＰ＾−＾Ｉの量が総量の約２０％を示した。

ハイブリッドタンパク質の見掛は分子量は予想通りＳＤ＾−ＰＡにＥで６２ｋＤであった。標準抽出方法（Ｍ音波、凍結乾燥、リゾチーム−Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ− １００）では成功しなかった。　８Ｍ尿素中での超音波処理細菌のインキュベーションとアルカリＭ衝液の添加とを順次に含む変性手順を採用した。中和及び透析によって再生後、懸濁液を遠心すると、透明上清は９０％を上回る純度の融合タンパク質をを含有していた。　ＩｇＧ　５ｅｐｈａｒｏｓｅによるアフィニティクロマトグラフィーによって更に精製した。

ハイブリッド　ンパク　の、　゛ハイブリッドタンパク質をヒツジで調製した特異的ａｐｏ＾ジ抗体を認識しない。

最初の８個のアミノ酸から成るアミノ末端配列と最終３個のアミノ酸から成るカルボキシ末端配列とは既知のａｐｏＡ　ｌ及びプロティン＾の配列と一致した。

またアミノ酸組成分析も予想組成と一致した。

細胞表面に対するハイブリッドタンパク質の結合を定量するために（後記参照）、天然の分子量を決定することが必要であった。これは、Ｂｉｏｇｌｅ　１．５八を使用するゲル沢過によって行なった。カラム溶出のピーク分画は分子量３１６ｋＤを与え、これは単量体の分子量６２ｋＤの５倍に相当した。ハイブリッドタンパク質溶出の広い分布（ｐｒｏｆ　ｉ　ｌｅ）は、別の多量体も存在しまた間隙（ｖｏｉｄ　ｖｏｌｕｍｅ）に少量の凝集物質が存在することを示した。すべての実験において天然分子量として平均サイズ３１６ｋＤを使用した。これを同じカラムで標準として使用したＨＤＬの２８５ｋＤに比較した。ヨウ素化ハイブリッドタンパク質の溶出分布は非標識ハイブリッドタンパク質で得られたものと同様であった。

電子盟微鏡によるネガティブ染色後にＨＤＬ及びハイブリッドタンパク質粒子を試験した６顕微鏡写真は、直径９〜１２ｎｍの範囲の均質粒子集団を示した。ハイブリッドタンパク質粒子はＨＤＬよりやや大きいサイズをもちゲル濾過によって得られた結果を追認した。

バイブ１ツドタンパク　びＨＤＬの　８・ゞ性の細胞表面レセプターに対する結合能を試験するために大腸菌から精製されたハイブリッドタンパク質とヒト血漿から精製されたＨＤＬとを平行に使用した。複数の細胞タイプ、即ちマウスマクロファージ（Ｊ７７４）及びラット肝細胞（Ｆａｏ）の細胞系を試験した。これらの２つの細胞タイプはＨＤＬを異なる方法で処理することが判明している。マクロファージにおいてはコレステロール交換が生じ肝細胞においては分解が生じる。

４℃にお番る結合−一ヨウ素化リガンドを４℃で２時間細胞に結合させた。３０分間で結合量が平坦域に到達した。非特異的な量を判定するために５００ｕｇの非標識リガンドとの競合を使用し、この値を総結合曲線から減算して特異的結合値を与えた。特異的結合値を使用しＳｃａｔｃｈｉｒｄ分析（Ｓｃａｔｃｈｉｒｄ、＾ｎｎ、　Ｎ、　Ｙ。

＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　５１．６６０−６７２．１９４９）によって親和性を計算した。ＨＤＬ及びハイブリッドタンパク質の双方で結合は特異相性結合はＨＤＬ・では２．８〜３．Ｏｘ　１０−”ＭのＫｄ、ハイブリッドタンパク質では３．５〜４．９ｘ　１０−”ＭのＫｄを有していた。結果を後出の表２に示す、更に、ＨＤＬ及びハイブリッドタンパク質の双方で非標識リガンドに完全には競合しない低親和性成分が存在する。

双方の細胞タイプの高親和性結合成分はｌＸｌ０’細胞当たり９０〜１５５Ｂの最大結合を与える。これは細胞当たり１．９〜３．６ｘ　１０’部位を示す°、細胞当たりの結合部位の数及び結合親和性はＨＤＬ及びハイブリッドタンパク質の双方で非著に類似していた。これは、単一レセプターが関与しＨＤＬのレセプター媒介結合にａｐｏＡ　ｌ成分だけが関係することを示唆する。

鼠遣］υＩａｐｏＡ　ｌの特異的結合の付加的な証拠は競合試験によって得られる。　ＨＤＬ及びハイブリッドタンパク質の双方がＪ７７４及びＦａｏ細胞に対する結合において互いに有効に競合した。

非特異的成分に達するまで競合が有効であった。プロティン＾はハイブリッドタンパク質またはＨＤＬの結合に競合できなかった。競合試験における独立対照としてトランスフェリンを使用した。トランスフェリンはトランスフエリンレ七ブタ−を介して細胞表面に結合するが、）ＩＤＬまたはハイブリッドタンパク質の結合に競合できなかった。

プローイン＾　びＩ−〇結合活性ハイブリッドクンバク質は同時にプロティン八を含有するので、プロティンΔ自体が細胞に結合できるか否かを判断することが重要である。プロティン八を同様に特異的活性にヨウ素化し、Ｊ７７４及びＦａｏ細胞に対する結合き検定した。

高濃度のプロティンΔ（１００μｇ／ｗｌ）が存在する場合にも特異的結合は検出されなかった。細胞結合放射能の量はハイブリッドタンパク質の非特異的結合よりも少なかった。

Ｊ７７４細胞はＩｇＧに対するＦｃレセプターを発現させるので、ハイブリッドタンパク質によってこれらの実験を行なうためには配慮が必要であった。従って、［”５１］−ウサギＩｇＧは高親和性（Ｋｄ＝　ｌｘ　１ｏ”Ｍ）で細胞表面Ｆｃレセプターに結合する。腔２ＳＩｌ−ＣＰ＾−＾工がウサギＩｇＧの存在下に結合すると、結合ハイブリッドタンパク質の量は２．７倍に増加した。逆に、［１＝ＳＪ］−ウサギ■εＧがハイブリッドタンパク質の存在下に結合したときも結合が増加した（１．６倍）。明らかに、ＩｇＧとＣＡＰ−ＡＩとの複合体はＦｃレセプターまたは）ＩＤＬレセプターに結合し得る。ＨＤＬレセプターだけを試験するために、すべての結合実験をＩεＧ非含有培地で行なった。培地中に存在するＩｇＧを除去するためにＢＳＡ（実貫的にｌεＧ非含有）を加えたＲａｎｋｓ緩衝液で細胞を３回洗浄した。

ＨＤＬレセブ　−の、性゛ＨＤＬ、ハイブリッドタンパク質またトランスフェリンの結合を検定する前にＪ７７４細胞を４℃のトリプシンで処理した。トリプシン処理は）ＩＤＬまたはハイブリッドタンパク質結合を減少させなかった。しかしながら、［１２’Ｉ］− トランスフェリンの結合は対照の３８％まで減少した。ＨＤＬレセプターはトランスフェリンレセプターに比較して比較的トリプシン耐性である。

ＨＤＬ及びハイブリッドタンパク質の結合に関与するレセプターを同定するために、リガンドプロットを実施した。

Ｊ７７４細胞からのＰＮＳのＴｒｉｔｏｎ　Ｘ−１１４抽出物を還元条件下に５ＤＳ−ＰＡ［；Ｅにかけニトロセルロースに移した。［１２５Ｉコー）ＩＤＬ及び［”５１］−ＣＰ＾−ＡＩの各々は約１１０ｋＤのバンドに結合した。

このバンドをフィルターのオートラジオグラフ上で［１２５１］−標識リガントを可視化することによって直接に同定するかまたは）ＩＤＬに対するウサギ抗血清を用いて抗体を検出しヒツジ抗つサギＩｇＧペルオキシダーゼで可視化することによって間接に同定した。ＨＤＬの場合、ニトロセルロース上にヨウ素化ラベルの極めて高いバックグラウンドが存在し、これがオートラジオグラフ上の特異的バンドの検出を妨害した。

夾１」［Ｌヒトａｐｏ＾■を前駆体即ち２６７個のアミノ酸から成るｐｒｅ−ｐｒｏａｐｏＡ　Ｉとして合成する。１８個のアミノ酸から成るプレペプチドを分泌中に開裂し、ｐｒｏａｐｏＡ　Ｉと指称されるプロタンパク質を残す。従って、ｐｒｏａｐｏＡＩは６個のアミノ酸から成るＮ−末端延長部即ち八ｒＨ−Ｈｉｓ−Ｐｈｅ −Ｔｒｐ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎとこれに続く成熟タンパク質とから精成される。

ｐｒｏａｐｏ＾■を発現させるためにａｐｏＡ　ｌ遺伝子の５゛を第８図に示すように合成的に復元する。６個のアミノ酸プロペプチドを含むｐｒｏａｐｏ八Ｉの最初へ１５個のアミノ酸をコードするＮｄｅ　ｌ　−Ｂａａ＋ＨＩオリゴヌクレオチドを合成した。合成ＩＮＮΔはＢａｍＨ１部位の直前にＮｅｏ　１部位を含んでいた。プラスミドｐＤＲ７２（Ｐｈａｒ＋ｎａｃｉａ−Ｓｗｅｄｅｎ；Ｒｕ５ｓｅｌ　ａｎｄ　Ｂｅｎｎｅｔ、　Ｇｅｎｅ、２０．２３１．１９８２）に由来のｔｒｐプロモーターを担うＥｃｏＲｌ　−５ａｌ　ｌフラグメントをλｃｌｌｓｈｉｎｅ−Ｄａ１ｇａｒｎｏ配列をコードする合成Ｓａｌ　Ｉ　−Ｎｄｅ　ｌフラグメントに結合して図示のＥｃｏＲｌ　−Ｎｄｅ　Ｉ　１０７ｂｐフラグメントを得た。このＤＮＡ断片をｐｒｏａｐｏＡＩ５°配列をコードするフラグメントに結合し、Ｍ１３ｍｐ８（Ｍｅｓｓｉｎｇ等、Ｐｒｏｅ、　Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳ＾、７４．３６４２．１９７７）にサブクローニングし配列決定した。

組換えｐｒｏａｐｏ八Ｉを発現へせるために第９図のごとく発現ベクターを構築した０発現シグナルとこれにｍ　＜　ｐｒｏａｐ。

＾Ｉ遺伝子の５゛端とを内包するＥｅｏＲＩ　−Ｎｅｏ　ｌフラグメントを組換えＭ１３＋１ｌｐ８から切除しく第８図参照）、以下の２つのフラグメントに結合した。

（ａ）ＥｃｏＲＩ　−ＢａｍＨｒで切断したプラスミドｐＤｓ２０の大きいフラグメント（Ｄｕｅｓｔｅｒ等、免（ロー、３０．８５５．１９８２）、（ｂ）ａｐｏＡ　ｌ配列の残りの部分を含むｐＭＬｌｌ−２０に由来のＮｅｏ　１−ＢａｍＨｌフラグメント。

得られたプラスミドｐＦＣ３３は、大腸菌Ｂ株（Ｄｅｌｂｒｕｃｋ、１９４６、Ｂａｅｔｅｒｉａｌ　ｖｉｒｕｓｅｓ　ｏｒ　ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅｓ　Ｂｉｏ！、　Ｒｅｖ、、２１：３Ｏ−４０）中のｔｒｐプロモーター下にｐｒｏａｐｏＡ　ｊタンパク質またはより特定的にはＮｅｔ−ｐｒｏａｐｏＡ１を発現させ得た。誘発のために、アンピシリンを加えたＬＢ培地で細胞を１晩増殖させた９次の日に細胞をトリプトファン非添加のＭ９培地に希釈し、３７℃で６時間維持後に採取した。

第１０図はｐｒｏａＤｏ八Ｉのゲルへ気泳動及びイムノプロット分析を示す、細菌培養物のアリコートをベレット化し、標準ヒト分画と平行にゲル電気泳動バッファに再想濁させた。

沸ｍｅ、標本を１２，５％５ＤＳ−ＰＡＧＥＴ電気泳動させた。実施例１と同様にニトロセルロースフィルターにブロッティングした。

表よヒト　で　然に　るａｏＡ　１−交表２　：ＦａｏまたはＪ７７４６　に　る　１２５■−ＨＤＬ　び１２５Ｉ−Ｃｂ二醍ｍｌ目し屈　分子量　結合Ｋｄ　高親和性ｕｈＬ　１　部位／細胞）ＩＤＬ　２８５，０００　８．６　３．Ｏｘ　１０−’　３６２，０００ＣＰＡ−＾１　３１６，０００　１１．０　３．５ｘ　１０−”　２４８，０００こ岨ＨＤＬ　２８５，０００　８．０　２．８ｘ　１０−’　１９０，０００ＣＰ八 −＾１　３１６，０００　１５．５　４．９ｘ　１０−”　２７７．０００ＡｐＬＳ６６　ｐＭＬｌｌ−２０Ｐ↑ｒｐ　ｃｌｌＲＢｓ　５乍ｒｏｏｐ。

イムノフ゛ロフｌ−５ＤＳ−ＰＡＧＥ　１２％補正迄の写しく翻訳文）提出型（特軒法第１８４条の８）平成元年４月２１１特許庁長官　古　１）文　毅　殿１、ｖ５許出願の表示　ＰＣＴ／ＥＰ　８７１００６２１、発明の名称　大腸菌中で発現されるヒトアポリポタンパク質ＡＩ及びその変賃形３、特許出願人住　所　イタリー国、イー２０１５９・ミラン、ヴイア・カル口・インボナテイ・２４名　称　ファルミタリア・カル口・エルバ・エツセ・エルレ・エルレ４、代　理　人　東京都新宿区新宿１丁目１番１４号　山田ビル５、補正書の提出年月日　１９８８年１０月１４日′請求の範囲１、抗ヒトａｐｏＡＩ抗血清を用いたＥＬＩＳ＾によって検出可能であり式（１）％式％（１）〔式中、Ｘは結合、−Ｔｈｒ−Ｍｅｔ−１１ｅ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−＾５ｐ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｎｅｔ−もしくは−Ｔｈｒ−Ｍｅｔｌｌｅ−Ｔｈｒ−＾５ｎ−Ｓｅｒ−＾ｒＨＪ：Ｉｙ−Ｓｅｒ−Ｎｅｔ−１またはヒトａｐｏＡ　ｌのプロ配列を示し、Ｙはヒトａｐｏ＾■もしくは１７３位の＾ｒｇがＣｙｓで置換されたヒトａｐｏＡ　１（ａｐｏＡＩ　−Ｍ　Ｉ　）もしくは６位のＳｅｒがＴｈｒＴ置換されたヒトａｐ。

＾１　（ａｐｏＡＩ−Ｔ６）もしくは双方の置換を含むヒトａｐｏＡ　Ｉ　（ａｐ。

＾１−Ｔ６／Ｍ　Ｉ　）の配列を示す〕で示されるタンパク質の産生方法であって、（ｉ）当該宿主中で前記タンパク質を発現させ得る発現ベクターで形質転換させた宿主を培養し、タンパク質Ｍｅｔ−ａｐｏ＾Ｉの場合には天然の翻訳開始コドンの直後に配置されたａｐｏＡ　Ｉ遺伝子ともつプラスミドｐＦＣＥ４＋を発現ベクターとして使用し、（ｉｉ）得られたタンパク質を回収することを特徴とする前記方法。

２、天然翻訳開始コドンの直後に配置されたａｐｏＡｌ　−７６、ａｐｏＡ　Ｉ　−Ｍ　ＩまたはａｐｏＡｌ　−７６７Ｍ　ｌを夫々コードする遺伝子を有するプラスミドｐＦＣＥ４◆で形質転換させた宿主を培養することによってＭｅｔ− ａｐｏＡ　１−Ｔ６、Ｎｅｔ−ａｐｏＡｌ−ＭｌまたはＮｅｔ−ａｐｏＡｌ　− ７６７Ｍ　Ｉを得ることを特徴とする請求項１に記載の方法。

３、当該プラスミドのβ−ガラクトシダーゼ遺伝子のα−ペプチドの９番目のアミノ酸のコドンの直後のＢａｍ１ｌ　１部位にａｐｏＡ　ｌ　、ａｐｏＡ　１− Ｔ６、ａｐｏＡｌ−ＭｌまたはａｐｏＡ　Ｉ　−７６７Ｍ　Ｉをコードする遺伝子をもつプラスミドｐＵｃ８で形質転換された宿主を培養することによって式中のＸが−Ｔｈｒ−Ｎｅｔ−１１ｅ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−３ｅｒ−Ｐｈｅ−＾５ｐ− Ｇ　Ｉｙ−Ｓｅｒ−Ｎｅｔ−を示す式（１）のタンパク質が得られることを特徴とする請求項１に記載の方法。

４、当該プラスミドの翻訳開始コドンの直後の配列−Ｔｈｒ−Ｍｅｔ−１１ｅ− Ｔｈｒ−＾５ｎ−Ｓｅｒ−ＡｒＦｉ−［：Ｉｙ−Ｓｅｒ−Ｎｅｔ−のコドンの直後にａｐｏＡｌ　、ａｐｏＡｌ−Ｔ６、ａｐｏＡ　ｌ　−Ｍ　ｌまたはａｐｏＡ　Ｔ　−７６７Ｍ　Ｉをコードする遺伝子をもつプラスミドｐＵｃ９で形質転換された宿主を培養することによって式中のＸが−Ｔｈｒ−Ｍｅｔｉｌｅ−Ｔｈｒ −＾５ｎ−Ｓｅｒ−＾ｒｇ−（＋ｌｙ−Ｓｅｒ−Ｍｅｔ−’ｚ示す式（１）のタンパク質が得られることを特徴とする請求項１に記載の方法。

５、式中のＸがヒト５ｔｐｏ＾Ｉのプロ配列を示す式（１）のタンパク質が、ロ上プ白モーターのコントロール下に発現されることを特徴とする請求項１に記載の方法。

６、宿主が大腸菌株であることを特徴とする請求項１に記載の方法。

７、形質転換宿主中で前記式（１）のタンパク質を発現し得ることを特徴とする請求項１に記載の発現ベクター。

８、当該プラスミドの天然翻訳開始コドンの直後に配置されたａｐｏＡ　Ｉ　、ＪＬｐＯＡ　Ｔ−Ｔ６、ａｐｏＡ　Ｉ　−Ｍ　ＩまたはａｐｏＡ　Ｉ　−７６７Ｍ　１をコードする遺伝子をもつプラスミドｐＦＣＥＪ＋であることを特徴とする請求項７に記載の発現ベクター。

９、当該プラスミドのβ−ガラクトシダーゼ遺伝子のα−ペプチドの９番目のアミノ酸のコドンの直後のＢａｍ８１部位にａｐｏＡ１．ａｐｏＡ　１−Ｔ６、ａｐｏＡｌ−ＭＩまたはａｐｏＡｌ　−７６７Ｍ　）をコードする遺伝子をもつプラスミドｐＵＣ８であることを特徴とする請求項７に記載の発現ベクター。

１０、当該プラスミドの翻訳開始コドンの直後の配列−Ｔｈｒ−Ｍｅｔｌｌｅ− Ｔｈｒ−＾５ｎ−５ｅｒ−＾ｒｇ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｎｅｔ−のコドンの直後にａｐｏＡｌ　、ａｐｏＡ　Ｉ−Ｔ６、ａｐｏＡｌ−ＭｌまたはａｐｏＡ　Ｉ　− ７６７Ｍ　ｌをコードする遺伝子をもつプラスミドｐｕｃ９であることを特徴とする請求項７に記載の発現ベクター。

１１、式中のＸがヒトａｐｏ＾Ｉのプロ配列を示す式（１）の前記タンパク質をｍプロモーターのコントロール下に発現させ得るプラスミドであることを特徴とする請求項７に記載の発現ベクター。

１２、請求項７に記載の発現ベクターで形質転換され式（１）のタンパク質を発現させ得ることを特徴とする宿主。

１３、宿主が大腸菌であることを特徴とする請求項１２に記載の宿主。

１４、抗ヒトａｐｏＡ　ｌを用いたＥＬＩＳ＾によって検出可能であり式（１）％式％（１）〔式中、Ｘは結合、−Ｔｈｒ−Ｍｅｔ−１１ｅ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−＾ｓｐ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｍｅｔ−もしくは−Ｔｈｒ−Ｍｅｔ−１ｉｅ−Ｔｈｒ−八５ｎ−Ｓｅｒ−＾ｒｇ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｎｅｔ−１またはヒトａｐｏＡ　ｌのプロ配列を示し、Ｙはヒトａｐ。

八ｌ　、　ａｐｏＡ　ｌ　−Ｍ　ｌ　、　ａｐｏＡ　ｌ　−Ｔ６またはａｐｏＡｌ　−７６７Ｍ　Ｉの配列を示す〕で示されることを特徴とするタンパク質。

１５、Ｍｅｔ−ａｐｏＡ　Ｉ　、　Ｍｅｔ−ａｐｏＡ　Ｉ　−Ｔ６、　Ｍｅｔ− ａｐｏＡ　ｌ　−Ｍ　Ｔ　及びＮｅｔ−ａｐｏＡｌ　−７６７Ｍ　Ｉから選択されることを特徴とする請求項１４に記載のタンパク質。

］６．アミノ酸配列Ｍｅｔ−Ｔｈｒ−Ｍｅｔ−１１ｅ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−５ｅｒ −Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−ＭｅｔがａｐｏＡ　］　、　ｔｐｏＡ　ｌ　”Ｔ６、ａｐｏＡｌ−Ｍｌ及びａｐｏＡｌ−７６７Ｍ　Ｉから選択されたアポリポタンパク質に融合していることを特徴とする請求項１４に記載のタンパク質。

１７、アミノ酸配列Ｎｅｔ−Ｔｈｒ−Ｎｅｔ−１１ｅ−Ｔｈｒ−八５ｎ−Ｓｅｒ −＾ｒｇ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−ＭｅｔがａｐｏＡ　１．ａｐｏＡ　１−Ｔ６、ａｐｏＡ　ｌ　−Ｍ　Ｉ及びａｐｏＡｌ　−Ｔ６／とを特徴とする請求項１４に記載のタンパク質。

１８、　Ｎｅｔ−ｐｒｏａｐｏＡ　ｌであることを特徴とする請求項１４ニ記載のタンパク質。

１９、請求項１４に記載のタンパク質を活性成分として薬剤として許容される担体または希釈剤と共に含むことを特徴とする薬剤組成物。

２０、抗ヒトミルｏへＩ抗血清を用いたＥＬＩＳ八によって検出可能であり式（２）％式％（２）〔式中、Ｘは結合、−Ｔｈｒ−Ｎｅｔ−１１ｅ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−３ｅｒ−Ｐｈｅ−＾５ｐ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｎｅｔ−１−Ｔｈｒ−Ｎｅｔ−］　］１ｅ−Ｔｈｒ−＾ｓｎ−Ｓｅｔ−Ａｒｇ（：ｌｙ−Ｓｅｒ−Ｍｅｔ−、プロティン＾の１つ以上の１００結合ドメインを含む配列またはヒトａｐｏ＾■のプロ配列を示し、Ｙはヒトａｐｏ＾Ｉ・、ａｐｏＡｌ−Ｍ　Ｉ　、ａｐｏＡ　ｌ　−Ｔ６またはａｐｏＡｌ　−７６７Ｍ　（の配列を示す〕で示されるタンパク質を形質転換宿主中で発現させ得る発現ベクター。

２１、請求項２０に記載の発現ベクターで形質転換され請求項２０に記載の式（２）のタンパク質を発現させ得ることを特徴とする宿主。

２２、抗ヒトａｐｏΔ■抗血清を用いたＥＬＩＳＡによって検出可能なタンパク質の産生方法において、請求項２１に記載のごとく形質転換された宿主を培養し、得られた前記タンパク質を回収することを特徴とする方法。

２３、請求項２０に記載の式（２）のタンパク質。

国際調査報告国際調査報告ＥＰ　８７００６２１

Claims

【特許請求の範囲】

１．抗ヒトａｐｏＡＩ抗血清を用いたＥＬＩＳＡによって検出可能であり式（１）Ｈｅｔ−Ｘ−Ｙ（１）〔式中、Ｘは結合、β−ガラクトシダーゼのＮ−末端アミノ酸残基に由来の配列もしくはプロテインＡの１つ以上のＩｇＧ結合ドメインを含む配列を含む担体ペプチド配列、またはヒトａｐｏＡＩのブロ配列を示し、ＹはヒトａｐｏＡＩまたはその遺伝変異体の配列を示す〕で示されるタンパク質を形質転換宿主中で発現させ得る発現ベクター。
２．前記タンパク質がＨｅｔ−ａｐｏＡＩ、Ｈｅｔ−ａｐｏＡＩ−Ｔ６、Ｈｅｔ −ａｐｏＡＩ−ＨＩまたはＨｅｔ−ａｐｏＡＩ−Ｔ６／ＭＩであることを特徴とする請求項１に記載の発現ベクター。
３．アラスミドｐＦＣＥ４＋に由来することを特徴とする請求項２に記載の発現ベクター。
４．プラスミドｐＭＬ１１−２０、ｐＩＬ８−６、ｐＩＬ８−ＩまたはｐＩＬ８ −６Ｉであることを特徴とする請求項３に記載の発現ベクター。
５．担体ペプチド配列がβ−ガラクトシダーゼの最初の１５個以内のＮ−末端アミノ酸残基に由来の配列を含むことを特徴とする請求項１に記載の発現ベクター。
６．担体ペプチドが配列【配列があります】または【配列があります】を含むことを特徴とする請求項５に記載の発現ベクター。
７．プラスミドｐＵＣ８またはｐＨＣ９に由来することを特徴とする請求項６に記載の発現ベクター。
８．プラスミド【配列があります】またはｐＲＰ５−６Ｉであることを特徴とする請求項６に記載の発現ベクター。
９．担体ペプチドがブドウ球菌プロテインＡまたはその残基２３〜２７０を含むことを特徴とする請求項１に記載の発現ベクター。
１０．プロテインＡの１つ以上のＩｇＧ結合ドメインを含む担体配列がタンパク質分解酵素の認識配列を介してヒトａＰｏＡＩまたはその遺伝変異体の配列に融合していることを特徴とする請求項１に記載の発現ベクター。
１１．担体ペプチド配列が、（λファージのＣＲＯタンパク質の最初の１１個のアミノ酸）−（ブドウ球菌プロテインＡの２４８個のアミノ酸（残基２３〜２７０））−（Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ）−（β−ガラクトシダーゼの最終１７個のアミノ酸）−（タンパク質分解酵素エンテロキナーゼの認識配列を含む【配列があります】で示される１７個のアミノ酸）から構成されていることを特徴とする請求項１０に記載の発現ベクター。
１２．担体ペプチド配列がアロテインＡの１つ以上のｉｇＧ結合ドメインを含みプラスミドｐＬＭ３に由来の配列であることを特徴とする請求項１に記載の発現ベクター。
１３．プラスミドｐＬＭ８であることを特徴とする請求項１２に記載の発現ベクター。
１４．ヒトａｐｏＡＩのブロ配列がアラスミドｐＤＳ２０に由来のヒトａＰｏＡＩまたはその遺伝変異体の配列に融合していることを特徴とする請求項１に記載の発現ベクター。
１５．プラスミドｐＦＣ３３であることを特徴とする請求項１４に記載の発現ベクター。
１６．請求項１に記載の発現ベクターで形質転換され請求項１に記載の式（１）のタンパク質を発現させ得ることを特徴とする宿主。
１７．宿主が大腸菌株であることを特徴とする請求項１６に記載の宿主。
１８．抗ヒトａｐｏＡＩ抗血清を用いたＥＬＩＳＡによって検出可能であるタンパク質の産生方法であって、請求項１６に記載の形質転換宿主を培養し、得られた前記タンパク質を回収することを特徴とする前記産生方法。
１９．抗ヒトａｐｏＡＩを用いたＥＬＩＳＡによって検出可能であり式（１）Ｍｅｔ−Ｘ−Ｙ（１）〔式中、Ｘは結合、β−ガラクトシダーゼのＮ−末端アミノ酸残基に由来の配列もしくはアロティンＡの１つ以上のＩｇＧ結合ドメインを含む配列を含む担体ペプチド配列、またはヒトａｐｏＡＩのブロ配列を示し、ＹはヒトａｐｏＡＩまたはその遺伝変異体の配列を示す〕で示されることを特徴とするタンパク質。
２０．【配列があります】及びＭｅｔ −ａｐｏＡＩ−Ｔ６／ＭＩから選択されることを特徴とする請求項１９に記載のクンバク質。
２１．アミノ酸配列【配列があります】及びａｐｏＡＩ −Ｔ６／ＭＩから選択されたアポリボタンパク質に融合していることを特徴とする請求項１９に記載のタンパク質。
２２．アミノ酸配列【配列があります】が【配列があります】及びａｐｏＡＩ− Ｔ６／ＨＩから選択されたアポリボタンパク質に融合していることを特徴とする請求項１９に記載のタンパク質。
２３．（λファージのＣＲＯタンパク質の最初の１１個のアミノ酸）−（ブドウ球菌プロテインＡの２４８個のアミノ酸（残基２３〜２７０））−（Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ）−（β−ガラクトシダーゼの最終１７個のアミノ酸）−（タンパク質分解酵素エンテロキナーゼの認識配列を含むω【配列があります】で示される１７個のアミノ酸）−（ａｐｏＡＩ、ａｐｏＡＩ−Ｔ６、ａｐｏＡＩ−ＭＩまたはａｐｏＡＩ−Ｔ６／ＮＩ）から構成される請求項１９に記載のタンパク質。
２４．Ｍｅｔ−ｐｒｏａｐｏＡＩである請求項１９に記載のタンパク質。
２５．請求項１９に記載のタンパク質を活性成分として薬剤として許容される担体または希釈剤と共に含むことを特徴とする薬剤組成物。