CZ761587A3 - Process for preparing protein which may be detected by applying elisa test with anti-serum anti-human apoai - Google Patents

Description

Tento vynález se týká produkce lidského apolipoproteinu AI (apoAI) a jeho variant technologii rekombinantní DNA.

ším zdravotním problémem na světě* S rozvojem onemocnění je spojeno obrovské množství rizikových faktorů. Jedním z nej-

důležitějších jsou zvýšené hladiny plasmového cholesterolu (CHL). StWxu. metabolismu u člověka je proto věnována velká pozornost.

Lipoproteinový transportní systém je klíčem k porozumění mechanismů, s jejichž pomocí geny, strava a hormony působí na regulaci hladin plasmového cholesterolu a triglyceridů (TG) u člověka. Hlavní funkcí lipoproteinů v plasmě je transport lipidů z jednoho orgánu do druhého. Nedávno bylo zjištěno, že mají nejen funkci spočívající v rozpouštění hy-drofobních lipidů, ale mohou také udávat místo v těle, do kterého je každá třída lipidů dodávána. Sxistují čtyři hlavní třídy lipoproteinů: ^hylomikrainy (CM), lipoproteiny o velmi nízké hustotě (VLDL), lipoproteiny o nízké hustotě (LDL) a lipoproteiny o vysoké hustotě (HDL). Při transportu v plasmě se. triglyceridy a estery cholesterolu (CELE) obalí lipoproteinovými částicemi. Vytvoří se tak hydrofobní kůra obklopená povrchovou monovrstvou polárních" fosfolipidů (PL) · Povrchový povlak obsahuje taká nee-sterifi-kovaný cholesterol v relativně malých množstvích spolu s proteiny, které se nazývají apolipoproteiny (apo). Bylo identifikováno alespoň devět apolipoproteinů: AI, AII, AIV, 3 (48-100), Cl, Cil, Clil, D a E.

Zvláště zajímavý je výzkum vzájemných vztahů mezi hladi-jajnjmi plasmového lipoproteinu a risikem rozvoje koronárního cévního onemocněni· Jak HPL tak i DDL jsou nosiči CHL a CHIiS· Existují však náznaky, že zatímco hladiny LDL-CHL znamenají positivní risikový faktor ÍKannel a spol·: Ann. Intern·

Med* ^0, 85 až 91 (1979) *3, H3L znamenají důležitý negativní risikový faktor ÍYaari a spol·: Lancet, i.: 1011 až 1015 (1981)·]· Ačkoliv přesné funkci a způsobu působení těchto li-poproteinů se ještě zcela úplně nerozumí, zdá se, že HDL slouží zvláště k odstraňování cholesterolu z perfierních tkání a ke zpětnému transportu do jater mechanismem, který se nazývá zpětný cholesteniLový transport (HCT).

Hlavním apolipoproteinem z HDL je apoAI. V několika studiích bylo ukázáno inversní spojení mezi hladinami plasmového apoAI a CHD podobně jako to bylo dokumentováno pro hladiny HDL-CHL a CHD ÍIshikawa a «spol.: Eur· J. Clin. Invest. 8, 179 až 182 (1973)«]. Navíc, jak hladiny HDL-CEL tak - 3 - hladiny apoAI jsou inversně korelovatelné s intensitou angio-grafičky demonstrovatelných koronárnicli arteriosklerotických poraněni iPearson a spol·: Amer. J. Epidem· 109. 285 až 295 (1979).3iMaciejko a spol·: New Sng. J. Med· 309« 385 až 389 (1983).3. Lze se tedy přit o to, zda vysoké koncentrace HDL v plasmě ovlivňuji CHD zabráněním atherogenese a/nebo podporou * regrese existujících poranění. .«e

Komplexy HDL apolipoproteinů, zvláště apoAI, a lecithinu podporují výtok volného cholesterolu z buněk in vitro, včetně kultivovaných buněk arteriálních hladkých svalů. ÍStein a spol.: Biochem. Biophys. Acta 380. 106 až 118 (1975)*3· Iň-travenosní infuse fosfolidů živočichům s experimentálně indiu, kovaným atheroma příznivě ovlivňuje tento výtok ÍAdams a spol.: J. Path, Bact. 24, 77 až 87 (1967)»3 a apoAI/lecithinové kom-plexy vgoou· vy o fotony oéj plasmy podobnou rychlostí jako nativní HDL částice ÍMalmendier a spol.: Glin. Chem. Acta 131. 201 až 210 (1983).3.

Intravenosní infuse apoAI v cholesterolem krmených krá- -

lících redukují plochy poškození o 50 %· znamená, že apoAI *6 * má ochranný účinek na tvorbu atherosklerotického poškození, možná tím, že snižuje příjem cholesterolu stěnou aorty iMac-lejko a Mao: Artherosclerosis 2# 407a (1982), Mao a spol.:

Fed. Proč. (USA) 42(7). 357 (1983)» Badimon a spol.: Cardio- - 4 - vascular diseases '86, 1936 abstrakt 81.J.

ApoAI je hlavním proteinem HDL (asi 70 %). Vyskytuje se relativně hojně v plasmě v koncentraci 1,0 až 1,2 mg/ml ÍSchonfield a spol.: J. Clin. Invest. 6£, 1072 (1982).J. Plasmový ApoAI je jednoduchý polypegtidový řetězec 243 aminokyselin, jehož primární sekvence je známa [Brewer a spol,: Biochem. Biophys. Hes. Commun. 80, 623 až 630 (1978),]* Ve své vnitrobuněnčné formě je apoAI přítomen jako prekursor o délce 267 aminokyselin. Prvních 19 zbytků na N-konci tohoto dlouhého proteinu se intracelulárně štěpí signální peptiaasou se· surového endoplasmového retikula. Hově exkretovaný apoAI ještě obsahuje prodloužení na H-konci o délce 6 aminokyselin, _v „ , . , ^ Převedeni na jeno maturovanou formu se provádí plasmpvo^ a/ne-bo lymfatickou specifickou proteasou ÍZannis a Breslow v "Advances in Human Genetics", ed. Karris a Hirschhorn, Plenům, 125 až 215 (1935) J.

Bylo zjištěno, že C—koncová část molekuly apoAI sestává z opakujících se jednotek o 11 nebo 22 aminokyselinách LMcLachlan: Hature 267> 465 až 466 (1979)·3. Tandemově seřazené segmenty nejsou přímými duplikacemi, avšak aminokyselinové Μ substituce obvykle zachovávají che^cký typ zbytků v odpovídajících polohách opakování, 0 těehto opakujících se segmentech se předpokládá, že existují v amfipatické helikální konformaci - 5 - ÍSegrest a spol.: PEBs Lett. j58, dV7 až 2?5 (.1974-).], o níz. se předpokládá, že znamena hlavni strukturní požadavek pro hlavni biologické účinnosti apoAI, tj. lipid-vazebné a lecithin GEL acyltransferasové (LCAT) aktivity. Dvě další funkce apoAI, tj. působící jako ligand při rozeznávání HDL částic receptorem a odstraňování cholesterolu z periferních tkání, dosud nebyly dány do souvislosti se specifickými sekvencemi nebo doménami v molekule apoAI.

První popsanou molekulární variací lidského apoAI je mutant Milano (apoAI-ΜΙ) ÍFranceschini a spol.: J. Glin.

Invest· 66, 892 až 900 (1980).]. Je charakterisován substitucí Arg 173—Cys IWeisgraber a spol.: J. Biol. Chem. 238, 2508 až 2513 (1983).J a byl isolován ve 33 subjektech stejného druhu. Všechny byly heterozygotní pro mutovaný apoprotein, který je transmitován jako autosomální dominantní rys. Vykazovaly značně snížené koncentrace HDL-CHL a hypertriglyceridemii různého stupně negativně korelované s hladinami HDL. Nebyla zjištěna žádná souvislost mezi mutantem a specifickými stavy § ovlivjšhé subjekty byly zřetelgln chráněny před rozvojem časné atherosklerosy ÍGualandri a spol.: Am. J* Hum. Gen. Í98&. v tisku}.

Aminokyselinové substituce v apoAI-ΜΙ modifikuje strukturu mutovaného apoproteinu, což vede k redukci alfa-helikální struktury a ke zvýšenému vystavení hydrofóbních zbytků ÍPran— ceschini a spol.s J. Biol. Chem. 260, 16321 až Í6325 (1985) Přemodelováni mutovanéhcyápopřoteinu podstatně mění vazebné vlastnosti lipidů s molekulou, která asociuje snadněji než normální apoAI s lipidy. Komplexy apoprotein/lipid jsou podobné jako komplexy tvořené normálnímapoAI, ale snadněji se rozpadají účinkem děna tura ční ch činidel. -Přítomnost cystei-

Jk · nové/zbytku ve variantu umožňuje tvorbu komplexů s apoAI a také tvorbu apoAI dimerů. iýto proteinové komplexy jsou pravděpodobně zodpovědné za tvorbu anomálních HDL částic, které byly pozorovány u "ovlivňovaných subjektů". ‘Všechny tyto rysy - ^ -Λ apoAI-ΜΙ mohou přispívat ke zrychlenému kata bolismu a také kg ďfek^ivníy příjmové kapacit^ tkáňových lipidů.

Do dnešní doby byly popsány i některé další genetické va rianty apoAI ÍBreslow: Ann. Rev. Biochemi. 699 až 727 (1985). J, ale žádná z těchto varéj^nt není spojena s jakýmkoliv pathologickým stavem nebo, obecně, s významnými změnami metabolismu lipoproteinu v nosičích (tabulka 1 níže).

ApoAI cDNA klony byly získány v několika laboratořích ÍBreslow: Ann. Rev. Biochem. 699 až 727 (1935)·» Sharpe a spol.í Nucl. Acids Res. 12, 3917 až 3932 (1984).3. mRNA je dlouhá asi 890 párů nukleotidů (bp, párů basí). Sestává z 5* netransJ$vané l(neprekládaiié)Tsekvence o 35 párech nukleotidů, kódující sekvence o 3<?1 páru nukleotidů (267 amino-

kyselin)i terminačního kodonu translace (TGA) a 3 'netransl ováné % sekvence o 54 párech nukleotidů, po níž následuje polyA konec· Úplná nukleotidová sekvence cDNA je uvedena na obrázku 1 připojených výkresů·

Bylo zjištěno, že technologie řekómbinathí DNA může být úspěšně použita pra produkci proteinů obsahujících apoAI nebo jeho genetické varianty· Variantou může být apoAI, v němž 6-Ser je nahrazen Thr (apoAI-76), apoAI-ΜΙ nebo varianty, v níž jsou zkombinovány mutace jak apoAl-T6 tak apoAI-ΜΙ (apoAI-T6/MI)· Protei- &b ny se mohou stanovovat testem ELISA (enzyme-linked immundsorbent assay) s antiserem anti-apoAX· Produkované proteiny monou být ve formě napojených proteinů, v nichž jsou napojeny apoAI nebo jeho genetické varianty na N-koncl k nosnému peptidu· Předložený vynález se tedy týká způsobu přípravy proteinu,

který je možno detegovat pomocí testu ELISA a antihumánním apoAI antiserem transformaci E«colí expresním vektorem schopným exprese ^transformovaného proteinu v E»coli, kultivací takto získanéndTS* coli a izolací takto připraveného proteinu, vyznačujícího se tím, že se E· coli transformuje uvedeným expresním vektorem schopným exprese proteinu obecného vzorce I Met - X - Γ (I) kde X vazbu, sekvenci nosného peptidu zahrnující

Thr-Met-Ile—Thr—Pro—Ser—Phe—Asp—Gly—Ser—Met,

Thr-Met-Ile-Thr-Asn-Ser-Arg-Gly-Ser-Met nebo zbytky 23 až 270 staphylokokového proteinu A, nebo prosekvenci * ·

Arg-His-Phe-Trp-GlneGln humánního apoAI, -7a- a Y znamená sekvenci humánního apoAI, apoAl-Τβ, apoAI-MI nebo apoAI-T6/toI a že expresní vektor je odvozen od plasmidu pFCEé+ jestliže X znamená vazbu, od plasmidu pUC8 nebo pUC9 jestliže X T.namftwá sekvenci nosného peptidu, která zahrnuje Thr-Met-Ile-Thr-Pro-Ser-Phe-Asp-Gly-Ser-Met neb o Thr-Met-Ile^hr-Asn-Ser-Arg=Gly-Ser-Met, od plasmidu pLM3 jestliže X znamená sekvenci nosného peptidu zahrnující zbytky 23 až 270 staphylokokového proteinu A a od plasmidu pDS20 jestliže X znamená prosekvenci Arg-His-Phe-Trp-Gln-Gln humánního apoAIo ♦ - 8 - jící se tímyže obsahuje jednu nebo více IgG-vazebných domén proteinu/A/nebo pro-sekvenci lidského apoAI, a yznamená sekvenci lidského apoAI nebo jeho genetickou va-riarj/tui—----

Met zbytek lze přisoudit translačnímu iniciačnímu kodonu. Hostitelé,, kteří jsou takovým vektorem transformováni a kteří jsou schopni expresí poskytovat shora uvedený protein, se mohou používat pro přípravu proteinu obecného vzorce I. Transformovaný hostitel se kultivuje a takto získaný protein obecného vzorce I se isoluje.j-Pru LSlilý uDuuiiého· w.uuicu. I".také—ΙνσίX · část -Toho to"1 vy nále zu gj

Ve výhodných uspořádáních se tento vynález týká: A) konstrukce rekombinantních plasmidů, které nesou geny pro: 1 - apoAI (viz obrázek 1), 2 - apoAI-T6, 3 - 2apoAI-MI, 4 - - apoAI-T6/MI,. 5 - apoAI s následující extensí náhone i : Thr-Met-Ile-Thr-Pro-Ser-Phe-Asp-Gly-Sar-Met (apoAI-HP5), 6 - - apoAI s následující extensí na N-konci: Thr-Met-Ile-Thr-

Asn-Ser-Arg-Gly-Ser-Met (apoAI-IP1), 7 - protein, který spojuje apoAI-T6 a apoAl-RP5 (apoAI-EP5/T6), 8 - protein, který spojuje apoAI-T6 a apoAI-IP1 (apoAI-IPI/T6), 9 - protein, který spojuje AI- apoMI- a apoAI-HP5 (apoAI-RP5/MI), 10- protein, který spojuje apoAI-ΜΙ a apoAI-IPl (apoAI-IglAlI), 11 - protein, který spojuje apoAI-T6/MI a apoAI-RP5 (apoAI-HP5/T6/MI), 12 - protein, který spouje apoAI-TS/MI a apoAI-IPl (apoAI-IP1/T6/MI), 13 - - 9 - apoAI s následující extensí na N-konci: Arg-His-Phe-Trp-Glu-Gln (proapoAI), 14 - protein, který spojuje proapoAI a apoAI-MI (proapoAI-MI) 15 - proteiny zbytků 541 aminokyseliny s rozšířením (extensí) na N-konci poskytované stafylokokovým proteinem A a které se. od svého N-konce skládají z: (prvních 11 aminokyselin CRO proteinu fágu lambda) - (248 aminokyselin stafylokokového proteinu A) (zbytky 23 až 270) - (Pro-Gly-Asp-Ser-Thr)-(posledních 17 aminokyselin, beta-galaktosidasy)-(17 aminokyselin, které obsahují rozeznávací sekvenci proteolytického enzymu enterokinasy: 'Gly-Asp-Pro*Glu-Phe-Val-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys-3er-3er-Arg-Gly-Ser-Met)-(apoAI, apoAI-T6, apoAI-ΜΙ nebo ApoAI-T6/MI) , a . B) exS^se těchto genů v Escherichia coli (Ξ. coli) kmenech. Expresí těchto genů se získávají následující proteiny: '- apolipoprotein, který je vybrán ze skupiny sestávající z Met-apoAI^Met-apoAI-Tó, Met-apoAI-MI a Met-apoAI-T6/MI, - ngípc^ny^protein, v němž aminokyselinová sekvence Met-Thr-Met-Ile-Thr-Pro-Ser-Phe-Asp-Gly-Ser-Met- je napojena pa· apolipo-proteirgj^který je vybrán ze skupiny sestávající z apoAI, apoAI-T6v apoAI-ΜΙ a apoAI-T6/MI, y protein, v němž aminokyselinová sekvence Met-Thr-Met-Ile-Thr-Asn-Ser-Arg-Gly-Ser-Met je napojena τβ apolipoprotein^a<.^ který je vybrán ze skupiny sestávající z apoAI, apoAI-T6, apoAI-ΜΙ a apoAI-T6/MI, ♦ - proapoliopprotein proapoAI nebo proapoAI-ΜΙ a jQjtíofcwsj - sapaj^n^ protein, který sestává z: (prvních 11 aminokyselin 10 CRO proteinu fágu lambda)-(248 aminokyselin stafylokokového proteinu A) (Zbytky 23 až 270) - (Pro-Gly-Asp-Ser-Thr)-(posledních 17 aminokyselin beta-galaktosidasy)-(17 aminokyselin, které obsahují rozeznávací sekvenci proteolytického enzymu enterokinasy: Gly-Asp-Pro-Glu-Phe-Val-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys-Ser-Ser-Arg-Qly-Ser- ^

Met)-(apoAI, apoAI-Τβ* apoAI-MI nebo apoAI-T6/MI. V následujících výkresech:

Obrázek 1 ukazuje uplnou nukleotidovou sekvenci odpovíidající maturované formě lidského apoAI. Sekvence je uvedena ve smyslu mSNA ve směru od 5 * do 3 Na spodní řádce je uvedena sekvence aminokyselin.

Obrázek 2 ukazuje rekonstrukci 5' konce genu kódujícího maturovaný lidský apoAI. DNA fragment z plasmidu pAI/A, počínající v prvéipl· restrikčním místě Sau 3AI,. se ligu je k synthetickému oligo-nukleotidovému adapteru anelací a ligací jednovláknových prekur-sorů 1 až 4. Výsledný fragment o 790 párech nukleotidů, obklopený dvěma restrikčníml místy BamHl, kóduje maturovanou molekulu apoAI.

Obrázek 3 se týká nukleotidové sekvence pLS66 pMLll-20.

Sekvence vykazují napojení mezi ATG iniciačním kodonem plasmidu ' pFCE4+ a začátkem genu apoAI před (pLS66, A) a po deleci (pMLll-20, B).

Obrázek 4 se týká nukleotidové sekvence pIL8-6 a. pIL8-I. ♦

Sekvence vjrkazují přítomnost mutace apoAI-ΜΙ (C na T) a mutace apoAI~T6 (G na 0) v pIL8-6 (B). 11

Obrázek 5 ukazuje immunoblotovou analysu plasmidu pMLll-20. části materiálu eluovaného z afinitní kolony a standardní frakce lidského HDL se povaří a dvakrát se elektroforesují na 12,5% SDS-PAGE. Blotace na nitrocelulosovém filtru se provádí způsobem, který je popsán v textu. Sáaky: 1- standard HDL,. 2 - eluát z afinitní kolony, 3 - standardy.

Obrázek 6 ukazuje imunoblotovou analysu pKP5 a pUC9· Části bakteriálních kultur, které nesou plasmid přírodního typu pUC9 nebo rekombinantní plasmid pRP5, indukované IPTG,, se peletu jí a resuspendují v. příslušném pufru pro ge-lov.ou elektroforesu v paralelním uspořádání s frakcí standardního lidského HDL. Po povaření se vzorky elektroforesu jí na 12,5% SDS-PAGE. Blotace na nitrocelulosovém filtru se provádí způsobem jak je to popsáno v. textu. Sádky: 1 - standardy, 2 - standard HDL, 3 - pUC9,· 4 -pRP5·

Obrázek 7 ukazuje konstrukci plasmidu pLM8, v němž políčka mají následující významy: PROT A, AMP, LAC Z a APOAI: geny kódující protein A, beta-laktamasur beta-ga-laktosidasu a lidský maturovaný apoAI; CRO: sekvence kódující prvních 11 aminokyselin proteinu lambda cro; T: sekvenci terminace transkripce proteinu A; Fl: pakážovací (vbalovací) sekvence fágu fl; ORI: počátek replikace;

Ek.AD: sekvence proteolytického místa rozeznávaná entero-kinasou. Místa EcoRI a Cla I v plasmidu pLMs nejsou jedinečná. 12

Obrázek 8 ukazuje rekonstrukci 5 'proapoAI sekvence.

Obrázek 9 ukazuje konstrukci vektoru pFC33, který je schopen expresí poskytovat proapoAI.

Obrázek 10 ukazuje gelovou elektroforesu a immunoblo-tovou analysu proapoAI získaného expíesí plasmidem pFC33. fíádky 1 : HDL standardy řádky 2 : nerekombinantní kmen, řádky 3 J proapoAI a řádek 4í standard molekulové hmotnosti.

Expresní )£aktcy podle tohoto vynálezu je vektor, kte.rý je schopen expresí poskytovat DNA sekvence a zvláště sekvence strukturních genů, které vektor obsahuje. DNA sekvence^ Aált jtsan, expreecrvany^ve čtecí formě vzhledem k protiproudým sekvencím, které regulujme jich expresi. Lze použít jakýkoliv vhodný promotorovy systém,, při Čemž je třeba vzít v úvahu typ proteinu, který má být expresí získán, povahu hostitele atd.

Lze tedy použít promotor, který je vybrán ze skupiny sestávající z promotorů P^, lac, tac a trp. V tomto případě jsou 5regulační sekvence heterologní vzhledem k apoAI nebo k jeho genetické variantě,, která má být expresí získána. Jako regulační sekvence mohou posloužit)lac nebo trp operonu. Jinými slovy - expresní vektor podle tohoto vynálezu je schopný expresí poskytovat heterologní protein, kde heterologním proteinem je apo’AI nebo jeho genetická varianta. Výhodnými genetickými variantami jsou apoÁI-T6, apoAI-ΜΙ a apoAI-ΤβAU*

% (ψ η Li1 ? *Ř'· · mi

Expresními vektory podle předloženého vynálezu, které obsahuji sekvenci kódující protein obecného vzorce I jsou plasmidy. Tyto plasmidy mohou být jednovláknové* Každý vektor je replikovatelný a každý obsahuje počátek replikace. Expresní vektory jsou odvozeny od plasmidu pFCEA+ v případě exprese apoAI, apoAI-T6, apoAI-MI nebo apoAI-T6-MI, pTJC8 nebo pOC9 v případě exprese napojeného " proteinu, kde nosná sekvence zahrnuje Thr-Met-IIe-Thr-Pro-3 er-Phe-Asp-Gly-Ser-Met nebo Thr-Met-Ile-Thr-Asn-Ser-Arg-Gly-Ser-Met, pIM3 kde nosná sekvence zahrnuje zbytky 23 až 270 staphylokokového proteinu A a pDS20 v případě exprese proapoAI, proapoAI-Τβ, proapo-AI-MI nebo proapoAI-T6/MI. V případě exprese proteinu obecného vzorce I se transformuje kmen E.coll. Hostitel má být zvolen tak, aby požadovaný protein nebyl degradován celulárními proteázami. Obecně může být tedy protein obecného vzorce I získán následujícími postupy: 1* Zvolí se klonovaná apoAI cDNA. 2. cDNA se upraví tak, aby se získal apoAI gen s restrikěními * místy na obou koncích, tento gen se tak stává mobilně jš£.Je tak možno odstranit sekvence, které kódují signální peptid a propeptid. 3. apoAI gen se vloží do expresního vektoru ve správné čtecí fázi. Lze zavést mutace T6 a/nebo MI. apoAI gen nebo varianta genu mohou být jediným strukturním genem v oper onu. Alternativně se a také může provést napojeni na 5 -konci k DNA sekvenci kóduji-cí nosný peptid*jestliže je žádoucí, aby docházelo k expresi apoAI nebo jeho genetické varianty jako napojeného proteinu. -14- 4o B.coli, v němž lze uskutečnit expresi apoAI nebo Jeho genetické varianty, se transformuje expresním vektorem* 5* Transformovaný hostitel se kultivuje a takto získaný požadovaný protein se izoluje*

Jestliže gen kódující apoAI nebo Jeho genetická varianta Jsou dostupné bez jednoho nebo více intronú, může se vložit ve čtecí fázi do vektoru za transkripční kontroly promotoru vektoru*

Tento gen může být vložen ihned za sekvenci kódující nosnou ρβρ-tidovou sekvenci* Mezi kodopyy které- iniciují a zastavují translaci ve vektoru ve čtecí fázi vzhledem k promotoru, se tak může získat LHA sekvence kódující protein obecného vzorce I* Podobně se může vložit do vektoru gen kódující proapoAI nebo jeho genetickou variantu* Kultivace hostitele, který je transformován výsledným expresní vektorem - 15 - tremj (vede k produkci žádaného proteinu. jUlOOtoiuCf' Část nosného peptiau jae*euagsJ34ha proteinu může být odvozena od aminokyselinových zbytků na N-konci beta-galaktosid#2i^. Může být odvozena, například, od prvních až patnácti aminokyselinových zbytků na N-konci oets-galaktosidij^. Těmito zbyt-ky jsou s výhodou zbytky 5 až 15, výhodnější jsou zbytky 3 až 12. Výhodné nosné peptidy, které byly tímto způsobem získány, obsahují sekvence: Thr-Met-Ile-Thr-Pro-Ser-Phe-Asp--Gly-Ser-Met nebo Thr-Met-Ile-Thr-Asn-Ser-Arg-Gly-Ser-Met.

Jestliže dochází k expresi napoj-enýeh proteinů, kt.eré jsou zahrnuty jako nosné peptidy,. jsou tyto přicházeny skupinou Met. To platí i tehdy, jestliže se používá alternativní nosný peptid, který obsahuje jednu nebo více IgG vazebných domén proteinu A. Taková nosná sekvence může zahrnovat úplnou sekvenci Stafylokokového proteinu A nebo zbytky 23 až 270 tohoto proteinu. Aminokyselinová sekvence včetně rozeznáv.acího místa pro protaolytický enzym,, jako je například enterokinasa, faktor X nebo kolagenasa,. může bezprostředně předcházet sekvenci pro apoAI nebo jeho variantu. Vhodnou sekvencí je: Gly-Asp-Pro-Glu-Phe-Val-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys-Ser-Ser-Arg-Gly-Ser-Met. - 16 -

Tato sekvence je rozeznávscí sekvencí pro enterokinasu* V nosné sekvenci mohou být přítomny další aminokyseliny. Například, mezi sekvencí proteinu A a sekvencí rozeznávacího místa proteolytického en2ymu může existovat sekvence až 30 zbytků. N-terminální část nosné sekvence může obsahovat první zbytky, například až 20 zbytků,, strukturního genu přirozené regulovaného promotorem v expresním, vektoru. Napojené proteiny, které obsahují IgG-vazebnou doménu proteinu A, jsou rozpustné ve vodě, jsou v rozumné míře: stálé ve vodném prostředí a snadno se čistí do homogenity afinitní chromátografií, například! na IgG-Sepharose.

Rekombinantní proteiny obecného vzorce I se typicky získávají v. podstatě bez dalších proteinů lidského původu, a to aí s nebo bez N-terminálfe^ rozšíření nosným, peptidem. Jinými slovy - tímto způsobem se získává protein v podstatě v čistém stavu, který není znečištěn proteiny, které .ho obvykle doprovázejí.

Protein, který obsahuje apoAI nebo jeho genetickou variantu, se může používat při therapii lidí nebo zvířat. Konkrétně se muže používat pro sniž; ování hladin plasmového cholesterolu a/nebo triglyceridu. Protein se tedy může pou-žívat pro boj s atherosklerosou a s kardiovaskulárními onemocněními, jako je například onemocnění srdečního oběhu. - 17 -

Protein se může podávat preventivně nebo pro zlepšení/léčbu existujících stavů.

Protein připravený podle tohoto vynálezu se tedy může používat jako farmaceutický prostředek, který obsahuje far* maceuticky účinný nosič nebo ředidlo· Takové prostředky lze formulovat známým; způsobem. Protein může být podáván paren-terálně, například, intravenosně. Následující příklady ilustrují tento vynález. Příklad 1

Nejdříve jsou v tomto příkladu uvedeny materiály a ma-tody, které jsou zde používány.

Kmeny a media používaná v tomto příkladu: jako kmeny se používají: E.coli K12 JM101 /Messing a spol.: Nátuře 314. 309 až 321 (1981)./, MC 1061 /Casadaban a Cohen: J. Mol. Biol. 138. 179 až 207 (1980)./, 71/18cI857 /Lorenzetti a spol.: Gene 39. 85 až 87 (1985)·/, RL841 /Kenkel: Proč, k

Nati. Acad. USA 82, 488 až 492 (1985)./, CAG629 (rpoH165, Ion-; C.A.Gross, Madison, Wisconsin, USA). Media používaná v. tomto příkladu: všechny kmeny se kultivují na mediu LB s 50 ^ug/ml ampicilinu, pokud je ho zapotřebí (medium LA). Pro derepresi lac: promotoru, pokud je to zapotřebí, se mediu přidává lmM IPTG. - 18 -

Enzymy, enzymatické reakce a čištění DNA: Lysozom byl od firmy Sigma (St. Louis, Mo., USA), testrikční endonukleasy od firmy Boehringer (Mannheim, De., USA), BRL lne. (Gaithes-burg, Md., USA) nebo New England Biolabs (Beverly, Ma., USA), T4 ligasa a všechny další enzymy byly od firmy Boehringer. Všechny enzymatické reakce: byly prováděn^iodle návodů dodavatelů, pokud není jinak uvedeno. DNA fragmenty, které byly získány štěpením restrikčními endonukleasami, byly rozdělovány elektroforesou v agarosových horizontálnech gelech nebo v polyakrylamidových vertikálních gelech a extrahovány z gelové matrice modifikací elektroeiuční metody za použití koncentrátoru ISCO Mod. 1750 (ISCO. Co., Lincoln, Ne., USA) a dále vyčištěny na kolonách Elutip-d (ScHeicher and Schuell, Keene, Nh., USA).

Enzymový imunotest pro rozeznávání apoAI v bakteriálních extraktech (ELISA) se provádí následujícím způsobem: Peleto- vané buňky se resuspendují v pufru (50mM Tris-Cl,. pH 7,0, 30mM NaCl, 0,1% NaN^, 10 mg/1 fenylmethyl-sulfonyl-fluoriau) . Připraví se roztok 1 ing/ml lysoz^mu. Roztok se míchá třicet minut při teplotě 4 °C. Po pětinásobném cyklu ro zmraz ení-zmra· zení se extrakty testují erzymovým: imunotestem následujícím způsobem. Standardní mikrotestovací deska o 96 jamkách se •

pokryje příslušnými zředěními antisera antilidského apoAI - 19 - z ovcí (Boehringer, Mannheim, De. , USA) při 4 °C přes noc.

Po 3 promytích lOmM Tris-Cl, pH = 8,0, obsahujícím 0,05 % Tweenu 20 a 0,01 % Merthiolátu se přidá po 50 ^ul seriadrovýtrh zředění standardu apoAI (TÁGO Corp., Burlingame, Ca., USA) nebo bakteriálního extraktu. Následuje .inkubace při teplotě 37 °C po dobu 1 hodiny. Po třech promytích stejným pufrem se přidá 50 ^ul příslušně zředěného antisera králičího anti-lidského apoAI (Immuno Etd., Dunton Green, Nr. Sevenoaks,

Kent,. Velká Británie) dále vyčištěného srážením síranem amonným. Po jedné hodině při 37 °C a dalších 3 promytích se jamky obarví podle pokynů výrobce soustavou "protein A-horseradish peroxidase kit", kterou dodává firma New England Nuclear (Boston, Ma., USA).

Navázání ovčího protilidského apoAI na Affigel 10 se provádí následujícím, způsobem. Příprava anti-apoAI protilátky (Boehringer, Mannheim, De*, USA): 20 ml nezředěného roztoku protilátky se dialysuje proti O^LM fosforečnanovému pufru (o pH = 7) přes noc při 4 °C za nepřetržitého míchání. Potom se všechny zbytky odstředí a supernatant se zachová.

Affigel 10 (Bio-Rad, Richmond,.. Ca., USA) se připraví takto: 40 ml se ekvilibruje' za teploty místnosti před promytím polovičním objemem isopropylakoholu a dvojnásobným promytím - 20 - destilovanou vodou. Toto promování se 3 až 4 krát zopakuje. Sel se vysuší odfiltrováním, přenese se do 50ml zkumavky (prnt t. a přidá se dialyzovaná ^řátka. Zkumavka se pak za nepřetržitého míchání ekvilibruje a inkubuje se při 4 °C po dobu 8 hodin. Přidá se jedepMlilitr 1M ethylesteru glycinu.. V inkubaci se pokračuje přes noc. Gel se pak intensivně promyje následujícími roztoky: ^00 ml PBS s 0,1 % azidu sodného, 100 ml 1M kyseliny octovér 100 ml 0,1M fosforečnanového pufru o pH =7 s 0,5M NaCl a konečně 100 ml PBS s 0,1 %

Szidu sodného. Gel se pak nanese na kolonu a ekvilibruje se pufrem (PBS + 10 mg/1 PMSF + 10 mg/1 Pepstatinu A).

Imunoblotová analysa se provádí podle následujícího postupu. Vzorky se nechají projítypolyakrylamiáovya^Miaska»· výmúj gel ji/(v. příslušné koncentraci) způsobem podle Laenír· mliho. Gely se pak přenášejí na nitrocelulosové filtry transblotovou aparaturou (Bio-Rad) při 0,2 mA 4 hodiny při teplotě 4 °C ve 25mM Tris-Base,. 192 mM glycinu a 20% methanolu. Po přenosu se filtry promyjí destilovanou vodou.

Potom se jednu hodinu inkubují s PBS + 3 % BSA za mírného třepání. Filtry se opět promyjí destilovanou vodou, inkubují . s první protilátkou (tatáž je použita v testu ELISA jako druhá protilátka) zředěnou PBS v poměru 1 : 250 jednu hodinu za teploty místnosti. Po dvou promytích PBS a P3S s 0,05 % 21

Tweenu 20 se filtry inkubují druhou protilátkou (protikrá-ličí IgG z koz konjugovené s křenovou peroxidasou; 3io-Rad) ve zředění 1 : 7500 po dobu jedné hodiny za teploty místnosti. Po dvou dalších promytích se filtry obarví 4-chlor-1-nsítalenem. '

Rekonstrukce genu apoAI ns 5' konci se provádí následujícím způsobem. cDNA klon o plné délce kódující apoAI (pAI/A), která se získá z b? nky cDNA (z lidských jater), má kódující sekvence signálního peptidu, propeptidu a celého maturovaného apoAI proteinu /Sharpe a spol.: Nucl. Acids Res. 12. 3917 až 3932.). Konec genu (5*) jsme rekonstruovali tak, že se odstraní všechny sekvence proti směru vlákna od prvního kodonu maturovaného apoAI. Pro to se plasmid pAI/A působením EcoRI a Bsm HI rozštěpí. Isoluje se fragment o 890 párech nukleotidů obsahující cDNA insert. Tento fragment se isoluje z 1% agarosového gelu. Tento fragment se rozštěpí působením Sau 3AI za podmínek, které vedou k částečnému rozštěpení. Směs se liguje s fosforylovaným synthetickým adapterem, který byl navržen pro rekonstrukci sekvence kódující prvních devět aminokyselin maturovaného proteinu. Sekvence se optimalizuje podle kodonu použitého v E.coli. Adapter se připraví následujícím způsobem: Posfotriesterovou methodou /Crea a Hcrn: Nucl. Acids. Res. 8, 2231 až 2348 (1980)·/ se synthetisují Čtyři oligonulšleotidy: 22 1. 5 '-GATCCATGGACGAGCC - 3' , 2. 5 '-ACCGCAGAGTCCATGG - 3' , 3. 5 '-CGGŤGGCTCGTCCATG - 3' a 4. 5'-GATcccATGGACTCTG - 3' . Všechny čtyři oligonukleotidy se spolu ligují v ekvimolát-ních množstvích. Ligační směs se nechá zreagovat se Sau 3AI. Adapter se eluuje a vyčistí na polyakrylamidovém gelu. Výsledná sekvence adapteru je ilustrována na obrázku 2.

Ligační směs, která obsahuje vyčištěný adapter a. působením Sau 3AI částečně rozštěpený apoAI fragment, se působením Bam HI rozštěpí. Fragment o velikosti 790 párů nukleotidů se vyčistí na polyakrylamidovém gelu a liguje se s Bam HI rozštěpeným pAT153-PvuII8 zpracovaným s telecí střevní fos-fatasou. Po transformaci MC 1061 se rekombinanty testují hybridizací fosforylovaným oligonukleótidem 3 jako sondou. Isolují se positivní klony, které se dále charakterizují štěpením restrikčními enzymy a sekvenací částečnou chemickou degradací Maxama a Gilberta /Methods Enzymol. 6^, 499 až 560 (1980)./. Plasmid, jehož adapter má správnou orientaci, se označí pAI/12.

Takto zrekonstruovaný 5'konec genu apoAI následuje po ATG inic)ačním kodonu a lam HI kohesivním konci. Podle této - 23 - strategie lze sekvenci kódující maturovaný apoAI přestěhovat k jakémukoliv expresnímu vektoru, který má po Shine-Dalgar-novýc.h sekvencích místo 3am HI.

Konstrukce rekombinantních vektorů za použití pPC4+ se provádí následujícím způsobem: Bam HI fragment, který obsahuje modifikovaný gen ApoAI;se vyčistí a subklonuje se do místa BamHI plasmidu pFC4+ (Lorenzetti a spol., 1985). Výsledná konstrukce se správnou orientací insertu se ověří diďeoxysekvenací (obrázek 3A)· Plasmid se pojmenuje pLS66.

Použitím této strategie se gen apoAI vloží mimo čtecí oblast vzhledem kAEG iniciačnímu kodonu, který je již ve vektoru přítomen. Následujícím způsobem je tedy restaurována čtecí oblast umístěním genu apoAI bezprostředně za tento ATG kodon.

Za použiti systému p?CE4 využitím "můstkových" oligo-nukleotidů, které mají sekvence doplňkové k' prodloužením basí obklopujících oblast, která má být deletována na té či oné straně, může dojít k posunutí do správné fáze čtení klonovaného genu /Sollazo a spol.: Gene 199 až 206 (1985)./. Γ7 Li tohoto 'důvodu jsme íosfotriesterovou metodou syn- - 24 - thetisovali jednovláknový oligonukleotid s následující sekvencí: 5^-CTTACATATGGACGAGCC-3*· Tento oligonukleotid by se měl 5' koncem navázat na oblast bezprostředně předcházející a zahrnující ATG vektoru (nukleotidy 1 až 10). Sv3hn 3*koncem by se měl navázat k prvním S nukleotidům genu apoAI. Vytvoří se tak smyčka 8 nukleotidů přítomných v plasmidu pL366 (obr. 2). Popsaným, způsobem /Kunkel: Proč. Nati. Acad. Sci., USA 82, 488 až 492 (1985)./ s E. coli jako hostitelem se připraví ssDNA plasmid pLS66. Uvedený bakteriální kmen je derivátem E. coli RZ1032 obsahujícím plasmid pCI857 (H. Zabeau), který produkuje na teplotu citlivý represor pro PÍ promotor přítomný v PFCE4.

Podle tohoto protokolu ssDNA produkovaná tímto kmenem obsahuje místo thj/minu několik ursc.ilových zbytků. Působí tedy jako normální funkční templát "in vitro", ale není biologicky aktivní pro transformaci da (ung+) E. coli 71 yřl8cI857^ kmenu divokého typu, který je ngjomálním hostitelem pro tyto plasmidy.

0,1 pikomolu pJ.S66 ssDN^ se aneluje ee 2 pikomoly kinasovaného mutovaného oligcnukleotidu (dvacetinásobný přebytek) při 56 °C 30 minut v 15mM Tris-Cl, pH = 8,5, a 15mM •

MgCl^· £0 ochlazení na teplotu místnosti se přidá elongační - 25 - - ligační směs* V reakci se pokračuje přes noc při teplotě 15 °C. Pro prodloužení se používá následující reakční směs (konečné koncentrace): lOmM Tris-Cl, pH = 8,5, lOmM MgC^» 0,5mM ATP, 0,05mM dtf|1?-ásy, 5mM DTT, 1 jednotka DNA polyme-rasy, Klenowův fragment a 1,5 jednotky T4 DNA ligasy.

Po inklbaci se reakční směs extrahuje fenolem a vysráží iso-propanolem a ethanolem. Buňky 71/18aI1857 byly transformovány a vysety na selektivní medium LA. Pro identifikaci klonů, které obsahují žádanou deleci, se vybere 150 kolonií, nechají se růst na seřazených deskách a přenesou se na nitrocelulosové filtry. Hybridisace se provádí za teploty místnosti v 6 x SSC a 10 x Denhardtovi. Jako so^jnia je používán mutagenní oligo-nukleotid. Filtry se promyjí v 6 x SSC a 0,1% SDS za dvou různých teplot: po prvé za teploty místnosti, aby se zkontrolo vala účinnost hybridisace, potom při teplotě 50 °C, tj. 4 °C pod teoretickou teplotou tání. ?a byla vypočtena podle následujícího vzorce: Tt = 4 x GC + 2 x AT, kde GC a AT znamenají počty párů, které jsou tvořeny oligonukleotidem a mutovaným templářem /Borrander a spol·.: Gene 26, 101 až 106 (1983)·/. Po každém, promytí se filtry exponují na film, který je citlivý na X-paprsky. Mutované kolonie, které poskytují positivní signály také za zvýšené teploty, byly dideoxy-sekv.enací (obr. 3B) potvrzeny. Účinnost tohoto pos-tupu je dost vysoká, asi 50'%. Plasmid ρΡ0Ξ4+ se správně umístěným genem apoAI byl pojmenován plasmid pMLll-20. - 26 - - 26 - •n

Varianty T6 a MI apolipoproteinu AI (apoAI)se konstruu následujícím způsobem: Jako templáty pro konstrukci dvou variant apoAI-T6 a apoAl-MI byl použit jak plasmid pLS66 tak plasmid pMLll-20. Hozhodli jsme se použít oba templáty ve stejnou dobu pro získání varajintních genů správně umístěných ve čtecí formě a v transponovatelném BamHI fragmentu.

Pro tento účel byly podle obvyklého postupu synthetisovány dva jednoduché oligonuyeotidy: 1) 5 *-CACCGCAGACTCCATGG-3·* pro Τβ mutaci a 2) 5'-GCGCCAGTGCTTGGC-3'pro MI mutaci.

První oligonuk-leotid by měl anelovat do zbytků 8 až 24 s chybným fázováním v poloze 17 CG na C), druhý oligonukleotid by měl anelovat od zbytku 510 do 524 s chybným fázováním v poloze 517 (C na T) /číslo 1 prvého nukleotidu znamená první kodon maturovaného apoAI/.

Mutagenní pokusy se provádějí stejným způsobem jako shora popsáno (obrázek 4A a B). Dvojnásobné mutanty se připravují tak, že se nejdříve získá mutace T6 a potom se přidá mutace MI. Výsledné plasmidy byly nazvány takto: pIL5-6 znamená apoAI-T6 mezi dvěma místy Bam HI, pIL5-I znamená apoAI-ΜΙ mezi dvěma místy Bam HI, p 11.5-61 znamená apoAI-T6/MI mezi dvěma místy Bam HI, pIL8-6 znamená apoAI-Τβ v čtecí oblasti, + pIL8-I znamená apoAI-MI v čtecí oblasti a pIL8-6I znamená apoAI-T6/MI v čtecí oblasti. v - 27 -

Konstrukce variant apoAI-BP5 a IPi se provádí následujícím způsobem. DNA fragmenty, které obsahují gen apoAI a jeho varia nty T6 a MI, se vyštěpí. z plasmidů oLS66, pIL5-6, oIL5-I a pIL5-SI štěpením; působením Bam HI a vyčistí se popsa ným způsobem na 1% agarosovém gelu.-Tyto fragmenty se pak..... ligují s pUC8 a pUC9 /Vleira a Messing: Gene 1^, 259 až 268 (1982)./, ob^inearizovsné působením Bam-HI. Po transformaci příslušných buněk J1/I101 se plasmidy identifikují způsobem •rychlého zničení. Verifikují se rozštěpením, isolátů působením Bam HI. Dvě opačné orientace insertu se rozliší štěpením působením Hind III a Xho I.

Konstrukce s pUC8 již měly gen apoAI v čtecí oblasti bezprostředně po methioninovém. zbytku a prvních 9 aminokyselinách alfa-peptidu z bakteriálního beta-galaktosidavého genu To má za důsledek rozšíření o 10 aminokyselin ^n N-konci molekuly apoAI bets-galaktosiaasy. geny tomu, poAI se správnou orientací, vyžadovaly více práce k aby gen apoAI byl vložen do čtecí oblasti. Nejdříve I a se rozštěpí působením restrikčních enzymů Hind III a Sal to mezi počátkem translace ATG a genem apoAI. Kohesivní konce, generované rozštěpením, se doplní DNA polyrnerasou (Klenowův fragment) a potom se opět ligují T4 DNA ligasou.

To vede k prodloužení (deleci) o 10 nukleotidů na vícenásobném klonovacím místě pUC9, v cele genu apoAI. Restauruje se tak správná čtecí oblast.

Rekombinantní plasmidy byly pojmenovány: a) serie pUC8

- pIPI znamená plasmid s apoAI-IPI plPl-β znamená plasmid s apoAI-ΙΡΙ/Τβ pIPI-Ι znamená plasmid s apoAI-IPI/MI plPI-6I znamená plasmid s apoAI-IPI/T6/MI b) serie pUC9 pRP5 znamená plasmid s apoAI-RP5 pHP5-6 znamená plasmid s apoAI-RP5/T6 pRP5-I znamená plasmid s apoAI-RP5/MI pRP5-6I znamená plasmid' s apoAI-R?5/T6/MI·

Exprese v kmenech E.coli se provádí následujícím způsobem: 1) všechny rekombinantní deriváty pFCE4 se transformují v bakteriálním hostiteli CAG629* který nese plasmid pCI856 (již popsaný v odstavci "posunutí do správné fáze čtení").

Kultura se napěstuje přes noc při teplotě 32 °C, zředí se v poměru 1 : 10 v LA a nechá se růst v kultivačních baňkách do optické hustoty ODg^Q = 0,5 až 0,6.- Potom se teplota zvýší na 42 °C a v inkubaci se pokračuje 1 až 2 hodiny. Po - 29 - indukci se buňky 10 minut chladí v ledu, načež se centrifugací zpeletují. P@iety se zpracují stejným způsobem jako je shora popsáno v. odstavci "ELISA" tak, aby se buňky rozbily. Bu-něčné extrakty se odstřeňují třicet minut při 16 ^otáčkách za minutu při teplotě 4 °C. Supernatant se nanese na afinitní kolonu, která je popsána v odstavci "materiály a methody".

Po intensivním promývání se zachycené proteiny eluují 1M kyselinou octovou. Eluovane frakce se testují imunoblotovou analysou (obrázek 5) a testem ELISA. Předběžné výsledky, které byly získány s plasmidem pMLll-20, se pohybují kolem 0,2 mg apoAI na jeden litr kultury. Podobné výsledky byly získány se všemi dalšími konstrukcemi,. které nesou mutace apoAI-T6, apoAI-MI, respektive apoAI-T6/MI. 2) Všechny rekombinsntní deriváty pUC8/9 byly transformovány do bakteriálního hostitele MC1061. Kultura, která se napěstovala přes noc, při teplotě 37 ° G, se zředí v poměru 1 : 100 v LA. Tato ku^/ura se nechá růst v kultivačních baňkách jednu hodinu před přidáním ImM IPTG. Potom se v inkubaci pokračuje dalších 4 ež 6 hodin. Po této době se buňky deset minut chladí v; ledu. Odstřeňováním se zpeletují. Dále se od tohoto stupně postupuje podle stejných extrakčních postupů jako je shora popsáno u derivátů pFCE4. Surové ex- ♦ trakty buněk obsahují pIPI a pKP5 a testují se imunoblotovou analysou (obrázek 6) a testem ELISA. Předběžné výsledky - 30 - uvádějí průměrně asi 10 miligramů apoAI na jeden litr kultury.

Podobné výsledky byly získány se_ všemi ostatními konstrukcemi, které nesou mutace. apoAI-Tó, apoAI-ΜΙ a apoAI-T6/MI jak v kombinaci s apoAI-HP5 tak v kombinaci s apoAI-IPl. Příklad 2

Byly zkonstruovány další varianty za použití vektoru pRIT2T (Pharmacia, Švédsko), v němž fragment o 949 párech .nukleotidů, nesoucí gen apoAI, byl vložen do místa Srna 1 tohoto vektoru. Tento plasmid expresí poskytuje ple-saríů sestávající z 541 aminokyseliny. Těmito aminokyselinami jsou (z N-konce)ϊ prvních 11 aminokyselin CRO proteinu fágu lambda, následuje 248 aminokyselin sekvence stafylokokového proteinu A (od zbytku 23 do zbytku 270), 5 neobvyklých aminokyselin (Pro-Gly-Asp-Ser-Thr) díky spojení s posledními 1T aminokyselinami beta-galaktosidasy E.coli a 17 aminoky-kyselin, které obsahují rozeznávací sekvenci proteolytického enzymu enterokinasy (Gly-Asp»Pro-Glu-Phe-Val—ásp-Asp-Asp-Asp-Lys-Ser-Ser-Arg-Gly-Ser-Met), které bezprostředně předcházejí sekvenci maturovaného lidského apoAI (nazývaného CPA-AI) nebo jeho varianty apoAI-T6, apoAI-ΜΙ a apoAI-T6/HI. Tyto chimerní proteiny jsou stálé a jsou rozpustné ve vodných roztocích. - 31 -

Byly studovány interakce CPA-AI s krysími hepatocyty a s myšími makrofágy v kultuře. Inkubace CPA-AI značeného I s kultivovanými buňkami při teplotě 4 °C ukazuje, že hybridní protein se váže na buněčný povrch s vazebnými vlastnostmi, které ,jsou podobné jako u-HDL. Hybridní protein si buňky‘berou při 37 °C. Ukazuje se, že je internalizován. Toto chování připomíná chování přirozeného apoAI, jestliže je asociován s lipidy za tvorby částic HDL. V tomto příkladu se používají následující materiály a me-thcdy: HDL (1,09 < d <1,2L g/ml) se připravují z lidské plasmy na diskontinuálním gradientu KBr.HDL se intensivně dialysuje proti PBS, lmM EDTA, aby se odstranil bromid draselný. Skladuje se při teplotě 4 °C. Lidský transferrin (Sigma) se naplní železem způsobem podle Klausnera a spol. /J. Biol. Chem. 258. 4715 až 4724 (1983)./. BSa v podstatě neobsahuje IgG (Sigma A 7638). Steohvlococcus aureus protein A byl od firmy Pharmacia. Hanksův rovnovážný solný roztok s fenolovou červení byl od firmy Gibco.

Buňky a buněčná kultura: Buňky Fao,: krysí hepatomová buněčná linie stanovená a charakterisovaná Descl^rettem a

Weissem /Biochemie £6, 1603 až 1611 (1974)/, se kultivují ♦ v monovrstvě v Coonem modifikovaném Samově mediu P12 (Seromed) doplněném 5% plodovým telecím (fetálním) šerem (FCS), 100 jed- - 32 - notkami/ml penicilinu, ICO ^ug/rnl streptomycinu, 2mM glut-aminem a lOmM HEPES pufrem, pH = 7,4· Buňky J774, myší makro-fágová buněčná linie /Ralph a spol. J. Iramunol. 114. 893-905 (1975)·/, se uchovávají v míchané suspensní kultuře v mediu D-MEM, která obsahuje 4,5¾ FCS, penicilín, streptomycin, glutamin a pufr HEPES, pH = 7,4, o shora uvedených koncentracích. Jako bakteriální kmeny a plasmidy se používají následující kmeny a plasmidy. Jako bakteriální hostitelé se používají: Ξ. coli kmeny HB101 /Boyer a Roulland-Dussoix: J. Mol. Biol. 4i,..459 až 472 (1962)*/ a RR1 Ml5 /Lsngley a spol.: Proč. Nati. Acad. Sci. USA 22, 1254 až 1257 (1975)./. Jako plasmidy se používají: pNF2690 /Nilsson. a spol.: ΞΜΒΟ J. 4» 1075 až 1080 (1985)./ a pLM3 /Monaco a spol.: Atti Convegno congiunto A.G.I.-S.I.B.B.M., 195 až 196 (1985)j plasmid pRIT2T je prodáván firmou Pharmacia, Švédsko.

Restrikční enzymy, Klenowova DNA polymerasa a T4 DNA ligasa pro konstrukce DNA byly získány od firmy Boehringer Mannheim a byly používány podle návodů dodavatele. E,: coli transformována působením podle Morrisona /Methods Enzymol. 68, 326 až 331 (1979)·/·

Hybridní gen, za regulace promotorem, se získává expresí v podstatě podle Zabeaua a Stanleyho /EMBC J. 1, 1217 - 33 - al 1224 (1982)./. Bakterie se pěstují při teplotě 30 °C do optické hustoty (OD^qq) - 0,9. Teplota se rychle zvýší na 42 °C přidáním stejného objemu kultivačního media předem zahřátého na 54 C. Kultury se inkubují 90 minut při teplotě 42 °C. Celkové buněčné lysáty-se nanesou na gely způsobem podle Zabeaua a Stanleyho (1982).

Pro čištění hybridního proteinu se používá způsob podle Marstona a spol. /Biotechnology 2, SOO až 804 (1984)./. Bakteriální pelety se resuspendují ve třech objemech (hmotnostní díly k objemovým dílům) puf.ru’A (50mM Tris/HCl, ρΗ = = 8,0, 50mM NaCl, lmM EDTA) a sónikují se 5krát 20 sekund v ledu. Po odstředění (10 000 otáček za minutu, 10 minut při teplotě 4 °C, v odstředivce Sorvall SS34 rotor) se pelety resuspendují v 9 objemech (Hmotnostní díly k objemovým dílům) pufru A, kterjr obsahuje 0,5% Tritonu X-100 a lGmM 3BTA, a nechá se pět minut za teploty místnosti . Susoense se odstřeluje jak shora uvedeno. Pelety se resuspendují v 9 objemech (hmotnostní díly k objemovým dílům) pufru A, který obsahuje 8M močovinu a inkubují se jednu hodinu při/teplotě místnosti.

Eo^evino-v-e

Suspense/se přidá k 9 objemům (hmotnostní díly k obj plí -- 10,7, emovým dílům) 50mM pufru 50mM NaCl, lmM SÍTA a m fosforečnanu draselného, íchá se 30 minut za-teploty

34 - místnosti, při čemž se přidáváním hydroxidu draselného udržuje pH na 10,7. Susp^ise se pak zneutralizuje a dial.ysuje s,e proti puřru A při teplotě 4 °C. Dialyscvsná -suspense - se v ^ shora uveden, r: způsobem odstřelí. Hybridní protein čirém supernatsntu byl piz v podstatě čists'-. Průměrný výtěžek hybridního proteinu v tomto stupni byl 50 až 60 mg na litr bakteriální kultury. Dalšího vyčistění se dosáhne afinitní chromátografií na IgG-Sepharose 6PF (Pharmacia). Vzorek se nanese na kolonu a kolona se postupně promývá PBS obsahujícím 0,5% Tween 20, PBS a 5mM octan amonný, pH = 5, a eluuje se 1M octanem amonným v kyselině octové o pH = 2,8. Vyčištěný protein se dialysuje proti pufru A. V tomto odstavci je popsána kalibrace za použití gelové filtrační kolony s Biogelem 1.5A. Kolona s Biogelem 1.5A od firmy Bio-Rad (40 cm krát 1. cm) se ekvilibruje v 50mM Tris/HCl, pH = 8,0, 50mM NaCl a lmM EDTA. Vzorek se eluuje tychlostí tři mililitry za hodinu. Odebírají se frakďe o objemu 250 ^ul. Kolona se kalibruje dextranovou modří (molekulová hmotnost 2 000 000), thyroglobulinem (699 0C0), ferritinem (440 000), HDL (285 000) a aldolasou (158 000). Hodnota Mr hybridního proteinu se stanoví pomocí 1,25 yUg /^^/-CPA-AI nebo 800 ^ug neznačeného CPA-AI.

Proteiny se jodují činidlem Iodo-Gen (Pierce Chemical Co.). 35 - Při jodační reakci se použije 100 yUg Iodo-Genu, 1 mg proteinu ve 200 mikrolitrech PBS a ImCi Na/^^I/ bez nosiče, 16,5 mCi/^ug ílmershara International). Po 10 minutách při teplotě 4 °C se volný jod oddělí od proteinu na koloně s 10 ml Sephadexu G50. Kolona se eluuje PBS (0,2% BSA) (HDL, trans-ferrin a IgG) a 50mM Tris/HCl, pH = 8,0,. 0,15M NaCl, ImM EDTA, 0,2% BSA (hybridní protein). Hybr,djiní protein, IgG a transferrin se používají bez dialysy. HDL bylo nutno intensivně. aialysovat proti PBS, 0,5mM EDTA, dokud se v 10% (Hmotnostní díly k objemovým dílům) kyseliny trichloroctové nerozpouštělo méně než 5 % značené sloučeniny. Méně než 5 % značené sloučeniny se asociuje, s lipidem, jak bylo stanoveno po ex trakci lioidu směsí chloroformu s methanoLem. Byla zís-kána specifická aktivita 200 až 400 cpm(impulsů za minutu) na nanogram proteinu.

Vazebné testy na suspensní buňky se prováděly dvě hodiny při teplotě 4 °C. Aby se získala suspense buněk FAO, inkubují se monovrstvy třicet minut při 37 °C s PBS, ImM EDTA. Tyto buňky nebo suspense vyrostlých makrofágů J774 se pak třikrát promyjí peletací při 1000G po dobu pěti minut a při teplotě 4 °G a resuspendují se ve 3 ml Hanks/BSA. g

Každý vazebný test ohsahoval 1*10 buněk v 1 ml. Hanks/BSA a označené množství /1^I/-apoAI-PA nebo /^^1/-HDL. Po

O V dvou hodinách při.teplotě 4 G se buňky čtyřikrát promyjí - 36 v Hanks/BSA, přenesou se do Eppendorfových zkumavek a na gama počítači se změří radioaktivita. Při kompetičních pokusech se k buňkám při teplotě 4 °C třicet minut před přidáním jodovaných ligandů přidáno až 800 mikrogramů značeného HDL, CPA-AI, proteinu A nebo transferrinu (při těchto pokusech se používá 10 mikrogramů značených ligandů).

Buňky J774 (2.108) se dvakrát promyjí v PBS. Homogeni-sují se v lOmM Tris_HCl, pH = 7,4, 0,lmM EDTA. Postnukleární supernatant (PNS) se připraví odstřelováním při 2000 G po dobu deseti minut. PNS se extrahuje jednoprocentním (objemová procenta) Tritonem X-114 /Bordier: J. Biol. Chem. 256, 1604 až 1607 (1981)./. Detergentní fáze se smíchá se stejným objemem dithiothreitolu s pufrovaným vzorkem, povafí se a pak se alkyluje jodacetamidem. Na pruh 5 až 15% SDS polyakryl-amidového gelu se aplikuje přibližně jeden mikrogram proteinu. Gel se blotuje na nitrocelulosu a pásy se zviditelní barvivém Ponceau S. Nitrocelulosové pruhy se pak máčí šest hodin v Hanksovt/obsahujícím lCp (hmotnostní díly k objemovjhn noc dílům) nízkotučného mléčného prásku. Ligandy, bucT / ?I/-

CPA-AI nebo /12^I/-HDL (12,5 migrogramu na mililitr) se navazují v Hanks/mléku po dobu 16 hodin. Buňkyée pak 4x promyjí Hanks/mlékem. Ligandy se detegují králičím antiserem proti lidskému HDL, CPA-AI nebo proteinu A (v"sérovém zředění 1 i 50), promyjí a inkubují za přítomnosti protikráličí IgG - 37 - peroxidasy. Odkrytí se provádí diaminobenzidmovou reakcí /Burnette: Anal. Biochem. 112, 195 až 203 (1981)./. Vyznačené bloty se pak exponují na X.ray film.

Amino-terminální sekvenace se prováděla Sdmanovou degradací v mikrosekvenátoru (GL) zkonstruovaném podle Franka a Trosina /editor H. Tscřiesce: "Modern Methods in Protein Chemistry", Walter de Gruyter and Co., Berlin, 287 až 302 (1985)./ a podle Lottspeicha /Hoppf Seylerife/ Z. Physiol. Chem. 261, 1829 as 1834 (1980)./. Pro karboxy-terminální sekvenaci hybridního proteinu se používají karboxypeptidasy epsilon, A a/nebo B podle Tadrose a spol./Eur. J. Biochem, 138. 209 až 212 (1983)·/· Piro aminokyselinovou analysu se protein hydrolysuje podle Tadrose a spol./Eur. J. Biochem. 127. 315 až 318 (1982)./. Složení aminokyselin se stanoví automatickým aminokyselinovým analysátorem (Durrum D-500). Nebyl stanovován tryptofan a Gystein.

Pro mikroskopické studium.se vzorky HDL a CPA-AI negativně obarví 2% fosfowolfrámovou kyselinou. Koncentrace proteinu se stanoví způsobem podle Bradforda /Anal. Biochem. 22, 248 až 254 A976)./.

Plssmid pLMS, který nese gen kódující hybridní protein CPA-AI, se zkonstruuje následujícím, způsobem. Vektor pR!T2T - 38 - je derivátem plasmidu pRCET2 /Nilsson a spol., 1985), který je určen pro teplotně indukovanou expresi intracelulárních hybridních proteinů v E.coli. Konstrukce obsahuje IgG-vazeb-né domény stafylokokového proteinu A, které jsou pod kontrolou promotoru P^. Vícenásobné klonovací místo usnadňuje inserci cizích genů na 3' konec proteinu A. Terminační sekvence transkripce proteinu A je vložena po směru vlákna bezprostřed-dně za vícenásobným klonovacím místem· Plasmid pLM3 obsahuje E.coli lacZ gen napojený ve čtecí oblasti na maturovaný gen lidského apoAI (Monaco a spol., 1985).

Plasmid pLM8, který nese napojení mezi PA a apoAIt se zkonstruuje tak, jak je to popsáno na obrázku 7. Fragment o 949 párech nukleotidů, obklopený restrikčními místy EcoRI a Cla I, se isoluje z plasmidu pLM3. Přečnívající konce se doplní Klenowovou DNA polymerasou. Tento fragment se liguje s pRIT2T, který je zlinearizován působením Sma 1. Výsledný plasmid pLM8 nese otevřenou čtecí oblast kódující napojení proteinu 541 aminokyseliny, složené z genu proteinu A na 5' konci a genu maturovaného lidského apoAI na 3' konci, oddělené jpjseciífckou sekvencí proteolytického štěpení.

Exprese hybridního proteinu, jeho isolace a čistění • · / U/ v se provádí následujícím zr^sobem. Buňky E.coli nesoucí plasmid pLM8 za přítomnosti plasmidu pNF2690, slučitelného plasmidu - 39 - kódujícího teplotní citlivost represorového mutantu Cl 857 lambda, jsou schopné expresí poskytovat velká množství hybridního proteinu. Jestliže kultivace probíhá při teplotě 42 °C, p^§ř množství indukovaného CPA-AI představuje asi 20 % z celku, fzřelylxl^ Mr (relativní molekulová hmotnost) hybridního proteinu je (jak bylo očekáváno) 62 000 (tj. 62 kD) na SDS-PAGE. Standardní způsoby extrakce (sonikace, střídavé rozmrazování a zmrazování, lysozym Triton X-100) byly neúspěšné. Proto byl použit denaturační postup, který zahrnuje inkubaci sonikovaných bakterií v 3M močovině s následným přidáním alkalického pufru. Po renaturaci neutralizací a di-alysou se suspense odstřeauje. Jasný, čirý supernatant obsahoval napojený protein v čistotě větší než 90 %. Dalšího vyčištění lze dosáhnout afinitní chromátografií na IgG Sepharose,

Identita hybridního proteinu byla potvrzena rozpoznáním specifickou apoAI protilátkou připravenou v ovcích. Protein A nerozpoznává ovčí protilátky.

Sekvence prvních 8 aminokyselin na aminovém konci a sek^vence posledních tří aminokyselin na karboxylovém konci byly v souhlasu se známou sekvencí apoAI a proteinu A. očeká-

Také analysa složení aminokyselin byla v souhlasu s váným složením. - 40 -

Pro kvantitativní stanovení vazebnosti hybridního proteinu na povrch buňky (viz níže) bylo nutné stanovit .jeho původní Ivlr. To se provádí gelovou filtrací na Biogelu 1.5A. Elucí z kolonv bvla získána frakce o mol. hmotnosti 316 OOOi v «/ / což odpovídá pětinásobku monomeru o molekulové hmotnosti 62 000. Široký profil eluce hybridního proteinu ukazuje, že jsou přítomny také jiné multimery, stejně jako malé množství agregovaného materiálu. Průměrná velikost 316 000 (tj. 316 kD) byla ve všech pokusech použita jako přirozená molekulová hmotnost. Tato hodnota je srovnatelná se 285 000 pro HDL, který byl použit jako standard na stejné koloně. Eluční profil jodovaného hybridního proteinu byl podobný jako eluční profil získaný pro neznačený hybridní protein. částice HDL a částice hybridního proteinu byly studovány elektonovým mikroskopem po negativním vybarvení. Mikrografy ukázaly homogenní populaci částic s průměry v rozmezí od 9 do 12 run. částice hybridního proteinu mají nepatrně větší velikost než HDL. To potvrzují výsledky získané gelovou filtrací.

Pro studium vazebné kapacity na receptory buněčného po vrchu se nezávisle na sobě používají hybridní protein vyčištěný z E.coli a HDL vycišieny z lidské plasmy.· Bylo studováno několik typů buněk: myší mskrofágové (J774) a krysí - 41 - hepatocytové buněčné linie (FAO). Existuje důkaz, že se tyto dva typy buněk chovají rozdílně vzhledem k HEL. V makrofágách dochází k výměně cholesterolu,Vhepatocytech k degradaci.

Jodované ligandy byly nechány navázat se na buňky-dvě hodiny při teplotě 4 °G. Rovnováhy v nevázanosti bylo dosaženo po 30 minutách. Pro vyhodnocení množství, které bylo nespecifické, byla použita kompetice s 500 mikrogramy neznačeného ligandu. Tato hodnota byla odečtena od celkové vazebné kapacity. Získá se tak hodnota specifické vazebnosti. Hodnoty specifické vazebnosti byly použity pro výpočet afinity Scatchardovou analysou /Scatchard: Ann. N. Y. Acad. Sci. 5λ, 660 až 672 (1949) ·/. Jak u HDL tak u hybridního proteinu byla vazebnost specifická a vykazovala vysokou afinitu.

O

Vysokoafinitní vazebnost má Kd 2,8 až 3,0 . 10 M pro

Q HDL a 3,5 až 4,9 .10~ M pro hybridní protein a to jak u buněk J774 tak u buněk Fao. Výsledky jsou uvedeny níže v tabulce 2. Vedle toho existuje nízkoafinitní složka, která není zcela vytěsňována naznačeným ligandem, a to jak u HDL tak u hybridního proteinu.

Složka s vysokoafinitní vazebností u obou typů buněk dává maximální vazebnost 90 ež 155 ng/1.10^ buněk. To znamená K v · v 1,9 až 3,6 .10 míst na buňku. Počet vazebných míst na buňku a vazebné áfinity jsou pozoruhodně podobné při srovnávání 42 HDL a hybridního proteinu. Z toho lze odvodit, že existuje jediný receptor a dále, že samotná apoAI složka může vysvg^lit receptorem zprostředkovanou vazebnost HDL.

Další průkaz specifická vazebnosti apoAI vyplývá z kom-petitivních studií. HDL a hybridní protein spolu efektivně soutěží o vazebnost na buňky J774 a na buňky Fao. Kompetice byla efektivní dokud se nedosáhlo nespecifické složky.

Protein A není schopen soutěžit o vazebnost s hybridním proteinem nebo s HDL» Jako nezávislá kontrola se v kompeti-tivních studiích používá transferrin* I když se transferrin váže na buněčný povrch prostřednictvím transferrinového re-ceptoru, nemohl soutěžit s vazebností HDL nebo s vazebností hybridního proteinu.

Jelikož hybridní protein obsahuje také protein A, bylo důležité zjistit, zda by se protein A sám mohl navázat na buňky. Protein A se najoduje na podobnou specifickou aktivitu a testuje se na vazebnost jak k buňkám J774 tak k buňkám Pao. Specifická vazebnost nebyla detegována ani při vysokých koncentracích proteinu A (100 ^ug/ml). Množství radioaktivity asociované v buňkách bylo menší než nespecifická vazebnost hybridního proteinu. Při provádění těchto pokusů s hybridním proteinem je třeba zachovávat jistou obezřetnost nebox buňky J774 expresí poskytují. Fc receptory pro IgG. To znamená, že / I/-kra-

Ličí IgG se na buněčný povrch Fc receptorů váže s vysokou afinitou (Kd = l.lCf8 M). Jestliže se /12^I/-C?A-AI navazuje za přítomnosti králičího IgG, pak se množství navázaného hybridního proteinu zvýší 2,7 krát. A naopak, jestliže 125 / I/-králičí IgG se váže za přítomnosti hybridního proteinu, vazebnost je také zvýšena (1,6 krát). Komplex mezi IgG a CPA-1I se zřejmě může navázat buň ns Fc receptor nebo na HDL receptor. Aby bylo možné studovat pouze HDL rec^etory, byly všechny vazebné experimenty prováděnjr v prostředí bez volného IgG. Buňky byly promyty třikrát v Hanksově pufru doplněném o BSA (v podstatě bez IgG), aby se odstranil IgG přítomný v kultivačním mediu. Před tím, než se testuje vazebnost HDL, hybridního proteinu nebo transferrinu, nechá se na buňky J774 působit trypsin při 4 °G. Působením trypsinu se nesnižuje vazebnost 12 5 HDL nebo hybridního proteinu. Vazebnost / I/-transferrinu se však snižuje na 38 % vzhledem ke kontrole. HDL receptor je relativně resistentní na trypsin ve srovnání s transferri-novým receptorem.

Pro identifikaci receptorů, který se účastní vazebnosti HDL a hybridního proteinu, se připraví ligandový blot. 44 -

Extrakt (Tritonem)(X-114) PNS z buněk J774 se podrobí SDS-PAGE za redukčních podmínek a přenese se na nitrocelulosu. Na pás 125 o molekulové hmotnosti asi 110 Ó0O se naváže / hARDIj a /^^1/-CPA-AI. Tento pás se identifikuje buó přímo visuali-125 žací / "^/-značených ligandů na autoradiografu filtru nebo nepřímo detekcí protilátkou za použití králičího antisera proti HDL a visualizací ovčí protikráličí IgG peroxidasou. U HDL bylo na nitrocelulose pozorováno velmi vysoké pozadí jodovaného labelu, což znesnadnilo detekci specifického pásu na autoradiografu. Příklad. 3

Lidský apoAI se synthetisuje jako prekursorový protein, 7> proapoAI o 267 aminokyselinách. Během sekrece se odštěpí propeptid o 18 aminokyselinách. Zůstane tak proprotein o-značený proapoAI. ProapoAI sestává tedy z rozšíření na N--konci o 6 aminokyselin, Arg-His-Phe-Trp-Glu-Glu, po němž následuje maturovaný protein.

Aby došlo k expresi proapoAI, rekonstruuje se syntheticky 5' konec genu apoAI, jak ukazuje obrázek 8. Synthetisuje se Nde I - Bam HI oligonukleotid, který kóduje prvních 15 aminokyselin proapoAI včetně 6 aminokyselin propeptidu. Synthetic-ká DNA zahrnuje místo Nco 1 bezprostředně před místem Bam HI. Eco HI - Sal I fragment, který nese trp promotor z plasmidu 45 PDR720 /Pharmacia, Švédsko; Russel a Bennet: Gene 20, 231 (1982)./, se liguje se synthetickým. 3al I - Nde I fragmentem, který kóduje lambda cil Shine-Dalgarnovu sekvenci. Získá se tak Eco RI - Nde I fragment o 107 párech nukleotidů ilustro-va ný na obrázku. Tento“kus DNA se liguje s fragmentem, který kóduje proapoAI 5' sekvenci, a subklonuje se do Ml3mp8 /Messing a spol.i Proč. Nati. Acaa. Sci. USA 74. 3642 (1977)./, aby se mohl sekvenovat.

Aby mohla probíhat exprese rekombinontního apoAI, zkonstruuje se expresní vektor tak, jak je to ilustrováno na obrázku 9. Eco RI - Nco I fragment, který nese expresní signály, následovaný 5' koncem proapoAI genu, se odštěpí od rekombinantnu M13mp8 (viz obrázek 8) a liguje se na dva následující fragmenty# a) velký fragment plasmidu pD320 /Duester a spol.:

Cell 30, 855 (1982)/ rozštěpený působením Eco RI - Bam HI a b) Nco I - Bam HI fragment z plasmidu pIvILll-20, který obsahuje zbytek sekvence apoAI. Výsledný plasmid pFC33 může expresí poskytovat proapoAI protein, nebo specifičtěji Met-proapoAI, pod trp promotorem v B kmenu Ξ. coli /Delbruck: "Bapterial viruses or bacterio-phages" v Biol. Rev. 21, 30 až 40 (1946)./. Po indukci se buňky kultivovaly pres noc v mediu LB s ampicilinem. Další den - 46 - byly tyto buňky zředěny mediem M9 bez tryptofanu. Buňky byly isolovány po 6 hodinách při teplotě 37 °C. . Obrázek 10 ukazuje gelovou elektroforesu a immunoblo-tovou analysu prospoAI. Části bakteriálních kultur se zpele-tují a resuspendují v pufru pro gelovou elektroforesu paralelně se standardní lidskou frakcí. Po povaření se vzorky elektroforesují na 12,5% SDS-PAGE. B&otace na nitrocelulo-sovém filtru se provede tak, jak je to popsáno v příkladu 1.

Tabulka 1

ApoAI genetické varianty přirozeně ae. vysky tu j íc í v lidské populaci zygosetA název modifikace biochemické změny heterozygot Mil a no Arg173-* Cys H Giessen Pro143~* Arg t! Marburg (Munster 2) Lys107

plexy s apoAI 60 až 70% normální LCAT aktivační schopnost 40 až 60% normální LCAT aktivační schopnost

Munster 35 • rod. A Aspic£* Asn rod 3 Pro^ -*· Ar- žádná rod G Pro^ —* His

47 -

Vazebnost /125 na buňky J774 I/-HDL a /125I/-CLA-AI bud na buňky Fao nebo lír vazebnost Kd ^ug/ml M vysoká afinita míst/buňku Fao: HOL 285 000 8,6 3.10"8 362 eoo CPA-1I 316 000 11,0 3,5.10'8 248 000 J774: HDL 285 000 8,0 2,8.10-8 190 000 CPA-AI 316 000 15,5 4,9.10-8 277 000

Claims (1)

1. 1β Způsob přípravy proteinu, který lze detegovat pomocí testu ELEA antiserea aatihumánního apoAl transformací E.coli expresním vektorem schopným exprese proteinu v E.coli, kultivací takto transformovaného E«coli a izolací získaného proteinu, vyznačující se tím, že se E.coli transformuje uvedeným expresním vektorem schopným exprese proteinu majícího vzorec I Met - X - T (I) kde X znamená vazbu, sekvenci nosného peptidu zahrnující Thr-Met-Ile-Thr-Pro-Ser-Phe-Asp-GIy-Ser-Met, Thr-Met-Ile-Thr-Asn-Ser-Arg-Gly-Ser-Met neb© zbytky 23 až 270 staphylokokového proteinu A nebo prosekvenci Arg-His-Phe-Trp-Gln-Gln humánního apoAl, a 7 znamená sekvenci humánního apoAl, apoAI-T6f apoAl-ΜΙ nebo apoAI-T6/Ml, přičemž expresní vektor je odvozen od plasmidu pPCE4+ jestliže X znamená vazbu, od plasmidu pUC8 nebo pUC9 jestliže X znamená sekvenci nosného peptidu zahrnující Thr-Met—Ile-Φhr—Pro—Ser—Pho—Asp—Gly—Ser^Met neb © Thr-Met-Ile-Thr-Asn-Ser-Arg-Gly-Ser-Met, od plasmidu pU03 jestliže X znamená sekvenci nosného peptidu, která zahrnuje zbytky ^ až 270 staphylokokového proteinu A a od plasmidu pDS20 jestliže X znamená prosekvenci Arg-His-Phe-Trp-Gln-Gln humánního apoAl. /droh^ a Λ Způsob podle bodu 1» vyznačující se tím, že uvedeným expresním vektorem je plasmid pMUl—20, pIL8-6, ρΐΐβ—I nebo pIIB—61·

   /M 3o Způsob podle -bedu-l, vyznačující se tím, že uvedeným expres-* ním vektorem je plasmid pIPI, pIPI-6, pIPI-I, pXPI-61, pRP5, pRP5-6, pRP5-I nebo pRP6-6I0 4· Způsob podle exodu· !, vyznačující se tím, že sekvence nosného peptidu je tvořena následovně /prvních 11 aminokyselin CRO proteinu fágu lambda/-/248 aminokyselin staphylokokového proteinu A/zbytky 23 až 270//-/Pro-Gly-Asp-Ser-Thr/-/posledních 17 aminokyselin beta-galaktoáidasy/—/17aminokyselin, obsahujících rozpoznávací sekvenci pro proteolytický enzym enterokinasu, kterými jsou Gly-Asp-Pro-Glu-Phe-Val-Asp-Asp-Asp-Asp-Iye-Ser— Ser-Arg-Gly-Ser-Met/*·

   5e Způsob podle bodů 1 nebo 4, vyznačující se tím, že uvedeným expresním vektorem je plasmid pIAB·

   6« Způsob podle bodu 1, vyznačující se tím, že uvedeném expresním vektorem je plasmid pFC33·