JP3082941B2 - ヒト・アポリポ蛋白質ａｉおよびａｉ―ミラノの酵母での発現 - Google Patents
ヒト・アポリポ蛋白質ａｉおよびａｉ―ミラノの酵母での発現Info
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Description
【発明の詳細な説明】 本発明は、アポリポ蛋白質A Iおよびアポリポ蛋白質A
I−ミラノ（Milano）（Apo−A IおよびApo−A I−Ｍ）
の酵母株での発現、および該アポリポ蛋白質を有効成分
として含有してなるアテローム性動脈硬化症および心血
管疾患用の医薬組成物に関する。
I−ミラノ（Milano）（Apo−A IおよびApo−A I−Ｍ）
の酵母株での発現、および該アポリポ蛋白質を有効成分
として含有してなるアテローム性動脈硬化症および心血
管疾患用の医薬組成物に関する。
高濃度の血清コレステロールと冠心臓疾患（CHD）の
発生との間の明確な関係は、疫学的かつある期間にわた
る研究に基づき、繰り返し確認されてきた。しかして、
血漿中コレステロールの輸送の複雑な機構の明確化によ
り、CHDの危険性を決定するにおいて、循環リポ蛋白質
の選択的機能を認識せしめた。
発生との間の明確な関係は、疫学的かつある期間にわた
る研究に基づき、繰り返し確認されてきた。しかして、
血漿中コレステロールの輸送の複雑な機構の明確化によ
り、CHDの危険性を決定するにおいて、循環リポ蛋白質
の選択的機能を認識せしめた。
事実、４種の循環リポ蛋白：キロミクロン（CM）、超
低密度（VLDL）、低密度（LDL）および高密度（HLD）リ
ポ蛋白質がある。これらのうち、CMは腸管脂肪吸収の短
寿命産物を構成する一方、VLDLおよび特にLDLはコレス
テロールの組織への、また動脈壁への輸送を担ってい
る。対照的に、HDLはコレステロールの末梢組織からの
除去に直接関係しており、「逆コレステロール輸送」
（RCT）として公知の機構によって、それを肝臓または
他のリポ蛋白質いずれかに戻す。
低密度（VLDL）、低密度（LDL）および高密度（HLD）リ
ポ蛋白質がある。これらのうち、CMは腸管脂肪吸収の短
寿命産物を構成する一方、VLDLおよび特にLDLはコレス
テロールの組織への、また動脈壁への輸送を担ってい
る。対照的に、HDLはコレステロールの末梢組織からの
除去に直接関係しており、「逆コレステロール輸送」
（RCT）として公知の機構によって、それを肝臓または
他のリポ蛋白質いずれかに戻す。
HDLの「保護的」役割は多数の研究で確認されてきた
［ミラーら（Miller et al）、ランセット（Lancet），
ｉ:965−968,1977;ワイネら（Whayne et al），アテロ
スクレロシス（Atherosclerosis）39:411−419,198
1］。これらにおいて、高濃度のLDL、それよりは低い濃
度のVLDLは心血管の危険性の増大に明らかに関係してい
るようである。
［ミラーら（Miller et al）、ランセット（Lancet），
ｉ:965−968,1977;ワイネら（Whayne et al），アテロ
スクレロシス（Atherosclerosis）39:411−419,198
1］。これらにおいて、高濃度のLDL、それよりは低い濃
度のVLDLは心血管の危険性の増大に明らかに関係してい
るようである。
HDLの保護的機構の研究のうち最近興味あるものは、
アポリポ蛋白質A I（Apo A I）に、即ちHDLの主要成分
に焦点を当ててきた。事実、Apo A Iの血漿中濃度はCHD
の危険および冠損傷の存在とは負の相関性を有する［マ
チエイコら（Maciejko et al）、ニュー・イングランド
・ジャーナル・オブ・メディシン（N.Eng.J.Med.）,30
9:385−389,1983;セドリス（Sedlis et al），サーキュ
レイション（Circulation）,73:978−984,1986］。
アポリポ蛋白質A I（Apo A I）に、即ちHDLの主要成分
に焦点を当ててきた。事実、Apo A Iの血漿中濃度はCHD
の危険および冠損傷の存在とは負の相関性を有する［マ
チエイコら（Maciejko et al）、ニュー・イングランド
・ジャーナル・オブ・メディシン（N.Eng.J.Med.）,30
9:385−389,1983;セドリス（Sedlis et al），サーキュ
レイション（Circulation）,73:978−984,1986］。
in vitro実験は、Apo A Iとレシチンとの複合体が培
養した動脈平滑筋細胞からの遊離コレステロールの流出
を促進できることを示している［ステインら（Stein et
al），ビオシミカ・エ・ビオフィジカ・アクタ（Bioch
em.Biophys.Acta.）,380:106〜118,1975］。この機構に
より、HDLはこれらの細胞の増殖を低減化させることも
できる［ヨシダら（Yoshida et al），エクスペリメン
タル・アンド・モレキュラー・パソロジー（Exp.Mol.Pa
thol.）,41:258−266,1984］ より最近になって、実験動物中へのHDLのApo A Iの注
入は重要な生化学的変化を起こし、また、アテローム性
動脈硬化症損傷の程度および重症度を減少させることが
示された。マチエイコおよびマオ（Maciejko and Mao）
［アーテリオスクレロシス（Arteriosclerosis）,2:407
a,1982］、２の連続的研究におけるバディモンら（Badi
mon et al）［カルディオバスキュラー・ディジーズ（C
ardiovascular Disease）,1983,アブストラクト（Ab
s.）81;アーテリオスクレロシス（Arteriosclerosis）,
7:522a,1987］は、Apo A IまたはHLDいずれかを注射す
ることによって（ｄ＝1.063〜1.325g/ml）、アテローム
性動脈硬化症損傷におけるコレステロールエステル含有
量を58.4％だけ減少させつつ、コレステロール供与ウサ
ギにおける該損傷の程度を著しく減少させることができ
る（−45％）ことを明瞭に示した。また、HDLの注入
は、動脈損傷を早々に生じる遺伝性高コレステロール血
症をもつワタナベ（Watanabe）・ウサギの血漿リポ蛋白
質組成を顕著に変化させることができるのが示され得
た。これらにおいて、HDL注入は保護的HDLおよびアテロ
ーム成形性LDLの間の比を２倍以上とできる。
養した動脈平滑筋細胞からの遊離コレステロールの流出
を促進できることを示している［ステインら（Stein et
al），ビオシミカ・エ・ビオフィジカ・アクタ（Bioch
em.Biophys.Acta.）,380:106〜118,1975］。この機構に
より、HDLはこれらの細胞の増殖を低減化させることも
できる［ヨシダら（Yoshida et al），エクスペリメン
タル・アンド・モレキュラー・パソロジー（Exp.Mol.Pa
thol.）,41:258−266,1984］ より最近になって、実験動物中へのHDLのApo A Iの注
入は重要な生化学的変化を起こし、また、アテローム性
動脈硬化症損傷の程度および重症度を減少させることが
示された。マチエイコおよびマオ（Maciejko and Mao）
［アーテリオスクレロシス（Arteriosclerosis）,2:407
a,1982］、２の連続的研究におけるバディモンら（Badi
mon et al）［カルディオバスキュラー・ディジーズ（C
ardiovascular Disease）,1983,アブストラクト（Ab
s.）81;アーテリオスクレロシス（Arteriosclerosis）,
7:522a,1987］は、Apo A IまたはHLDいずれかを注射す
ることによって（ｄ＝1.063〜1.325g/ml）、アテローム
性動脈硬化症損傷におけるコレステロールエステル含有
量を58.4％だけ減少させつつ、コレステロール供与ウサ
ギにおける該損傷の程度を著しく減少させることができ
る（−45％）ことを明瞭に示した。また、HDLの注入
は、動脈損傷を早々に生じる遺伝性高コレステロール血
症をもつワタナベ（Watanabe）・ウサギの血漿リポ蛋白
質組成を顕著に変化させることができるのが示され得
た。これらにおいて、HDL注入は保護的HDLおよびアテロ
ーム成形性LDLの間の比を２倍以上とできる。
さらに、動物モデルにおいて動脈疾患を改善するHDL
の可能性は、Apo A Iはかなりのフィブリン溶解活性を
呈し得るという観察によってさらに刺激された［サクら
（Saku et al），トロンボウシス・リサーチズ（Throm
b.Res.）,39:1−8,1985］。ロッネンベルゲル（Ronnebe
rger）［（第10回国際薬理学会議議事録、シドニー,198
7,990頁］は、抽出Apo A Iはビーグル犬およびマカクザ
ルにおいてフィブリン溶解をかなり増大させることがで
きるのを明瞭に示した。同様の活性はin vitroにてヒト
血漿で観察できる。本著者はApo A I処理動物における
脂質の沈積および動脈斑形成の減少を確認できた。
の可能性は、Apo A Iはかなりのフィブリン溶解活性を
呈し得るという観察によってさらに刺激された［サクら
（Saku et al），トロンボウシス・リサーチズ（Throm
b.Res.）,39:1−8,1985］。ロッネンベルゲル（Ronnebe
rger）［（第10回国際薬理学会議議事録、シドニー,198
7,990頁］は、抽出Apo A Iはビーグル犬およびマカクザ
ルにおいてフィブリン溶解をかなり増大させることがで
きるのを明瞭に示した。同様の活性はin vitroにてヒト
血漿で観察できる。本著者はApo A I処理動物における
脂質の沈積および動脈斑形成の減少を確認できた。
血漿Apo A Iは243個のアミノ酸の単一ポリペプチド鎖
であり、その一次配列は公知である［ブリューワーら
（Brewer et al），バイオケミカル・アンド・バイオフ
ィジカル・リサーチ・コミューニケイションズ（Bioche
m.Biophys.Res.Commun.）,80:623−630,1978］。Apo A
Iは細胞中で267個のアミノ酸前前駆体として合成され
る。このプレプロアポリポ蛋白質はまず18個のＮ−末端
残基を細胞内で失い；さらに６個のアミノ酸の喪失が、
特異的プロテアーゼの活性によって、血漿および／また
はリンパ液中で起こる。
であり、その一次配列は公知である［ブリューワーら
（Brewer et al），バイオケミカル・アンド・バイオフ
ィジカル・リサーチ・コミューニケイションズ（Bioche
m.Biophys.Res.Commun.）,80:623−630,1978］。Apo A
Iは細胞中で267個のアミノ酸前前駆体として合成され
る。このプレプロアポリポ蛋白質はまず18個のＮ−末端
残基を細胞内で失い；さらに６個のアミノ酸の喪失が、
特異的プロテアーゼの活性によって、血漿および／また
はリンパ液中で起こる。
Apo A I分子の主要な構造上の特徴は11個または22個
のアミノ酸の繰返単位の存在であると信じられ、両親媒
性ヘリックス立体配座で存在すると推定されている［セ
グレストら（Segrest et al）,FEBS Lett.,38:247−25
3,1974］。この構造により、Apo A Iの主要な生物学的
活性、すなわち脂質結合およびレシチンコレステロール
アシルトランスフェラーゼ（LCAT）の活性化が可能とな
る。HDLの他の機能、すなわち細胞との相互作用および
これらからのコレステロールの除去はアポリポ蛋白質の
明確な特徴とは関連がない。
のアミノ酸の繰返単位の存在であると信じられ、両親媒
性ヘリックス立体配座で存在すると推定されている［セ
グレストら（Segrest et al）,FEBS Lett.,38:247−25
3,1974］。この構造により、Apo A Iの主要な生物学的
活性、すなわち脂質結合およびレシチンコレステロール
アシルトランスフェラーゼ（LCAT）の活性化が可能とな
る。HDLの他の機能、すなわち細胞との相互作用および
これらからのコレステロールの除去はアポリポ蛋白質の
明確な特徴とは関連がない。
アポリポ蛋白質A I−ミラノ（Apo A I−Ｍ）はヒトAp
o A Iの最初に記載された分子変種である［フランチェ
シニら（Francedshini et al）、ジャーナル・オブ・ク
リニカル・インベスゲイション（J.Clin.Invest.）,66:
892−900,1980］。それはArg173のCysでの置換によって
特徴付けられる［バァイスグラベールら（Weisgraber e
t al），ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケコスト
リー（J.Biol.Chem.）,258:2508−2513,1983］。突然変
異体アポ蛋白質は常染色体優勢特性として伝達され、８
世代のキャリアーが同定されている［グアランドリら
（Gualandri et al），アメリカン・ジャーナル・オブ
・ヒューマン・ジェネティクス（Am.J.Hum.Genet.）,3
7:1083−1097,1984］。
o A Iの最初に記載された分子変種である［フランチェ
シニら（Francedshini et al）、ジャーナル・オブ・ク
リニカル・インベスゲイション（J.Clin.Invest.）,66:
892−900,1980］。それはArg173のCysでの置換によって
特徴付けられる［バァイスグラベールら（Weisgraber e
t al），ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケコスト
リー（J.Biol.Chem.）,258:2508−2513,1983］。突然変
異体アポ蛋白質は常染色体優勢特性として伝達され、８
世代のキャリアーが同定されている［グアランドリら
（Gualandri et al），アメリカン・ジャーナル・オブ
・ヒューマン・ジェネティクス（Am.J.Hum.Genet.）,3
7:1083−1097,1984］。
Apo A I−Ｍのキャリアー状態はHDL−コレステロール
の顕著な減少によって特徴付けられる。これにも拘わら
ず、患者は動脈疾患の危険の増大を示さないようであ
り、事実、系統樹の実験によると、これらの患者はアテ
ローム性動脈硬化症から「保護」されているようであ
る。
の顕著な減少によって特徴付けられる。これにも拘わら
ず、患者は動脈疾患の危険の増大を示さないようであ
り、事実、系統樹の実験によると、これらの患者はアテ
ローム性動脈硬化症から「保護」されているようであ
る。
キャリアーにおけるApo A I−Ｍの可能な保護効果の
機構は、あるα−ヘリックスを喪失しかつ疎水性残基の
暴露が増大した、突然変異体アポリポ蛋白質の構造中の
修飾のためらしい［フランチェシニら（Franceschini e
t al）、ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（J.Bi
ol,Chem.）,260:1632−1635,1985］。多重α−ヘリック
スの緻密な構造の喪失は、通常のA Iと比較して、分子
の柔軟性の増大をもたらし、これにより脂質とかなり容
易に会合する。さらに、アポリポ蛋白質／脂質複合体は
より変性し易く、かくして、脂質の伝達もまた当該突然
変異体の場合には改善されることが示唆される。
機構は、あるα−ヘリックスを喪失しかつ疎水性残基の
暴露が増大した、突然変異体アポリポ蛋白質の構造中の
修飾のためらしい［フランチェシニら（Franceschini e
t al）、ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（J.Bi
ol,Chem.）,260:1632−1635,1985］。多重α−ヘリック
スの緻密な構造の喪失は、通常のA Iと比較して、分子
の柔軟性の増大をもたらし、これにより脂質とかなり容
易に会合する。さらに、アポリポ蛋白質／脂質複合体は
より変性し易く、かくして、脂質の伝達もまた当該突然
変異体の場合には改善されることが示唆される。
Apo A I−Ｍのもう１つの非常に特別な特徴は、両方
の場合において、Cys残基の存在のため、それ自身でダ
イマーを形成し、Apo A IIと複合体を形成するその能力
である。ダイマーおよび複合体の循環系における存在
は、おそらくキャリアーにおけるこれらの排泄半減期の
遅延の原因となるものであり、最近臨床的研究で記載さ
れている［グレッグら（Gregg et al），ヒト・アポリ
ポ蛋白質突然変異体についてのNATO ARW:表現型発現に
対する遺伝子構造から（NATO ARW on Human Apolipopro
tein Mutants:From Gene Structure to Phenotypic Exp
ression），リモネン・エス・ジィ（Limone S.G.）,198
8］。修飾されたアポリポ蛋白質粒子はかくして循環系
に非常に長時間残存し、かくして、通常のA I粒子に比
し、良好なその動脈保護活性を呈する。
の場合において、Cys残基の存在のため、それ自身でダ
イマーを形成し、Apo A IIと複合体を形成するその能力
である。ダイマーおよび複合体の循環系における存在
は、おそらくキャリアーにおけるこれらの排泄半減期の
遅延の原因となるものであり、最近臨床的研究で記載さ
れている［グレッグら（Gregg et al），ヒト・アポリ
ポ蛋白質突然変異体についてのNATO ARW:表現型発現に
対する遺伝子構造から（NATO ARW on Human Apolipopro
tein Mutants:From Gene Structure to Phenotypic Exp
ression），リモネン・エス・ジィ（Limone S.G.）,198
8］。修飾されたアポリポ蛋白質粒子はかくして循環系
に非常に長時間残存し、かくして、通常のA I粒子に比
し、良好なその動脈保護活性を呈する。
アポリポ蛋白質およびそのA I−Ｍ突然変異体の治療
への使用は、該アポリポ蛋白質を十分量かつ適当な剤型
で調製できる方法がないため限定されている。
への使用は、該アポリポ蛋白質を十分量かつ適当な剤型
で調製できる方法がないため限定されている。
血漿分別物からアポリポ蛋白質A Iおよび特にA Iミラ
ノ（A I−Ｍ）を生産する困難はかなりのものである
［フランチェシニら（Franceschini et al）、ジャーナ
ル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（J.Biol.Che
m.）,260:16321−16325,1985］。さらに、回避するのが
必須である感染病原での汚染および出発物質の入手可能
性のごとく、血漿分別産物に伴う一連の危険がある。
ノ（A I−Ｍ）を生産する困難はかなりのものである
［フランチェシニら（Franceschini et al）、ジャーナ
ル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（J.Biol.Che
m.）,260:16321−16325,1985］。さらに、回避するのが
必須である感染病原での汚染および出発物質の入手可能
性のごとく、血漿分別産物に伴う一連の危険がある。
DNA組換え技術よりヒトApo A Iを産生しようとするい
くつかの試みがなされてきた。欧州特許出願公開026770
3号には、イー・コリ（E.cpli）からのApo A Iの調製が
記載されている。該プロセスはキメラポリペプチドを記
載しており、そこでは、該Apo A I部位がベータガラク
トシダーゼのＮ−末端アミノ酸残基、蛋白質Ａの１また
はそれ以上のIgG結合ドメイン、またはヒトApo A Iのpr
o配列に結合している。
くつかの試みがなされてきた。欧州特許出願公開026770
3号には、イー・コリ（E.cpli）からのApo A Iの調製が
記載されている。該プロセスはキメラポリペプチドを記
載しており、そこでは、該Apo A I部位がベータガラク
トシダーゼのＮ−末端アミノ酸残基、蛋白質Ａの１また
はそれ以上のIgG結合ドメイン、またはヒトApo A Iのpr
o配列に結合している。
前記方法は、イー・コリ（E.cpli）は形質転換生物と
して用いられているという事実により欠点がある。発現
された産物は成熟ヒトApo A Iではなく、異種起源の実
質的配列を含む。さらに、産物は細胞から分泌されず、
イー・コリ（E.cpli）宿主生物の細胞内に蓄積し、かく
して、発現産物の酵素的分解の危険性が高まる。
して用いられているという事実により欠点がある。発現
された産物は成熟ヒトApo A Iではなく、異種起源の実
質的配列を含む。さらに、産物は細胞から分泌されず、
イー・コリ（E.cpli）宿主生物の細胞内に蓄積し、かく
して、発現産物の酵素的分解の危険性が高まる。
哺乳動物ポリペプチドの発現についてのより便利な系
は真核生物細胞らしく、真核生物、特に酵母で外来性遺
伝子を発現させようとするいつくかの試みがなされてい
る。インターフェロンの酵母での発現は欧州特許出願公
開0060057号に記載されており、酵母には異種の蛋白質
の酵母での発現および分泌は欧州特許出願公開008863
2、0116201および0123544号に記載されている。
は真核生物細胞らしく、真核生物、特に酵母で外来性遺
伝子を発現させようとするいつくかの試みがなされてい
る。インターフェロンの酵母での発現は欧州特許出願公
開0060057号に記載されており、酵母には異種の蛋白質
の酵母での発現および分泌は欧州特許出願公開008863
2、0116201および0123544号に記載されている。
本発明の目的は、正確な折りたたみ構造と天然のヒト
・アポA Iの性質、すなわち、構造的特徴、脂質結合
性、ならびにフィブリン溶解およびレシチン：コレステ
ロールアシルトランスフェラーゼ（LCAT）の活性化［マ
ーレイ（Mahley）ら、ジャーナル・オブ・リピッド・リ
サーチ（J.Lipid.Res.）、25巻、1277〜1294頁、1984
年］を有し、酵母内において高収率で生成されるアポA
IおよびアポA I−Ｍを提供することにある。
・アポA Iの性質、すなわち、構造的特徴、脂質結合
性、ならびにフィブリン溶解およびレシチン：コレステ
ロールアシルトランスフェラーゼ（LCAT）の活性化［マ
ーレイ（Mahley）ら、ジャーナル・オブ・リピッド・リ
サーチ（J.Lipid.Res.）、25巻、1277〜1294頁、1984
年］を有し、酵母内において高収率で生成されるアポA
IおよびアポA I−Ｍを提供することにある。
本発明では、Apo A IおよびApo A I−Ｍをコードする
遺伝子に、成熟タンパクについての遺伝子の上流側に融
合させた酵母が認識可能な分泌およびプロセッシングシ
グナルをコードするDNA配列を設けた。特に、最後の残
基がHisGlySerLeuAspLysArgである修飾MFα１リーダー
配列を用いた。
遺伝子に、成熟タンパクについての遺伝子の上流側に融
合させた酵母が認識可能な分泌およびプロセッシングシ
グナルをコードするDNA配列を設けた。特に、最後の残
基がHisGlySerLeuAspLysArgである修飾MFα１リーダー
配列を用いた。
この修飾MFα１リーダーにおいて、プロセッシングシ
グナルは二塩基配列Lys−Argであったが、この配列を次
いでApo A I遺伝子の５′末端に融合する。リーダー配
列がすべての構築物において切断される、即ち、すべて
のApo A IおよびApo A I−Ｍポリペプチドの上流側に
ある二塩基配列Lys−Argで切断が起こることが判明し
た。
グナルは二塩基配列Lys−Argであったが、この配列を次
いでApo A I遺伝子の５′末端に融合する。リーダー配
列がすべての構築物において切断される、即ち、すべて
のApo A IおよびApo A I−Ｍポリペプチドの上流側に
ある二塩基配列Lys−Argで切断が起こることが判明し
た。
本発明は、Apo A IおよびApo A I−Ｍを酵母内で生産
する方法を提供する。この方法によれば、Apo A Iおよ
びApo A I−ＭタンパクをコードするDNA配列よりなる発
現ベクターで形質転換された酵母株が適切な培地中で培
養され、この培地からApo A IおよびApo A I−Ｍ分子が
回収される。
する方法を提供する。この方法によれば、Apo A Iおよ
びApo A I−ＭタンパクをコードするDNA配列よりなる発
現ベクターで形質転換された酵母株が適切な培地中で培
養され、この培地からApo A IおよびApo A I−Ｍ分子が
回収される。
かかる形質転換酵母株を培養すると、高収率のApo A
IおよびApo A I−Ｍが培養ブロスから単離される。
IおよびApo A I−Ｍが培養ブロスから単離される。
発現産物を単離し、Apo A I免疫応答物質を精製し、
微少配列分析法により特徴付けを行った。このポリペプ
チドは天然Apo A Iと同じ特性を有することが判明し
た。
微少配列分析法により特徴付けを行った。このポリペプ
チドは天然Apo A Iと同じ特性を有することが判明し
た。
本発明の発現ベクターは、酵母宿主内で安定に維持す
るための複製系と、Apo A IまたはApo A I−Ｍをコード
するDNA配列と、プロモーターおよびターミネーター配
列よりなる。
るための複製系と、Apo A IまたはApo A I−Ｍをコード
するDNA配列と、プロモーターおよびターミネーター配
列よりなる。
発現ベクターは、所望の産物をコードするDNA配列の
上流側に、発現産物を酵母の分泌経路へ向かわせ、この
発現産物を増殖培地中に分泌することを確実にするプレ
領域を含んでいてもよい。このプレ領域は、天然に存在
するシグナルまたはリーダーペプチドあるいは分泌を与
える合成配列でありうるが、一般的には、分泌の間に所
望の産物から切断され、成熟産物を培養ブロスから単離
されるよう準備できた状態とする。
上流側に、発現産物を酵母の分泌経路へ向かわせ、この
発現産物を増殖培地中に分泌することを確実にするプレ
領域を含んでいてもよい。このプレ領域は、天然に存在
するシグナルまたはリーダーペプチドあるいは分泌を与
える合成配列でありうるが、一般的には、分泌の間に所
望の産物から切断され、成熟産物を培養ブロスから単離
されるよう準備できた状態とする。
酵母に良く適合するリーダー配列は酵母MFα１リーダ
ー配列である［クルジャン・ジェイ（Kurjan,j.）およ
びヘルスコビッツ・アイ（Herskowits,I.）、セル（Cel
l）、30巻、933〜946頁、1982年］。
ー配列である［クルジャン・ジェイ（Kurjan,j.）およ
びヘルスコビッツ・アイ（Herskowits,I.）、セル（Cel
l）、30巻、933〜946頁、1982年］。
発現ベクターは、宿主微生物内で複製し得るまたは宿
主染色体内に組み込まれ得るプラスミドであってもよ
い。使用するベクターは、各々が選択的な切断部位によ
り分離される、所望DNA配列の反復コピーの発現をコー
ドし得るものでよい。
主染色体内に組み込まれ得るプラスミドであってもよ
い。使用するベクターは、各々が選択的な切断部位によ
り分離される、所望DNA配列の反復コピーの発現をコー
ドし得るものでよい。
所望DNA配列の発現は、宿主生物内において所望産物
の発現をもたらすように、所望産物をコードするDNA配
列に対して正確に位置付けられているプロモーター配列
の制御下にある。好ましくは、酵母宿主に固有の遺伝子
に由来するプロモーター、例えばTPI（トリオーゼホス
フェートイソメラーゼ）遺伝子のプロモーターまたはMF
α１−プロモーターが用いられる。
の発現をもたらすように、所望産物をコードするDNA配
列に対して正確に位置付けられているプロモーター配列
の制御下にある。好ましくは、酵母宿主に固有の遺伝子
に由来するプロモーター、例えばTPI（トリオーゼホス
フェートイソメラーゼ）遺伝子のプロモーターまたはMF
α１−プロモーターが用いられる。
所望産物についてのDNA配列には、転写ターミネータ
ー配列、好ましくは酵母宿主に固有の遺伝子に由来する
ターミネーター配列、例えばTPI遺伝子またはMFα１遺
伝子のターミネーターが続く。
ー配列、好ましくは酵母宿主に固有の遺伝子に由来する
ターミネーター配列、例えばTPI遺伝子またはMFα１遺
伝子のターミネーターが続く。
本発明は、以前にクローン化されたApo A IおよびApo
A I−Ｍ配列［シャープ・シー・アール（Sharpe C
R）、シドリ・エイ（Sidoli A）、シェリー・シー・エ
ス（Shelley CS）、ルセロ・エム・エイ（Lucero M
A）、ショルダース・シー・シー（Shoulders CC）およ
びバラル・エフ・イー（Baralle FE）、ヌクレイック・
アシッズ・リサーチ（Nucl.Acids Res.）、12巻、3917
〜3932頁、（1984年）］を、Apo A Iの唯一のNco I部位
にクローン化された46ヌクレオチドの化学的に合成され
たアダプターを用いて酵母での分泌向きにする操作につ
いても述べる。
A I−Ｍ配列［シャープ・シー・アール（Sharpe C
R）、シドリ・エイ（Sidoli A）、シェリー・シー・エ
ス（Shelley CS）、ルセロ・エム・エイ（Lucero M
A）、ショルダース・シー・シー（Shoulders CC）およ
びバラル・エフ・イー（Baralle FE）、ヌクレイック・
アシッズ・リサーチ（Nucl.Acids Res.）、12巻、3917
〜3932頁、（1984年）］を、Apo A Iの唯一のNco I部位
にクローン化された46ヌクレオチドの化学的に合成され
たアダプターを用いて酵母での分泌向きにする操作につ
いても述べる。
Apo A I−Ｍ突然変異は、キャリアー由来の突然変異A
po A I−Ｍ遺伝子を部分的にクローン化し、その一部を
野性型配列に置き換えることにより生じさせた。
po A I−Ｍ遺伝子を部分的にクローン化し、その一部を
野性型配列に置き換えることにより生じさせた。
図面において： −図１はMFα１リーダー配列末端部および成熟Apo A I
アミノ末端配列を含む46ヌクレオチド・アダプターの配
列を示す。
アミノ末端配列を含む46ヌクレオチド・アダプターの配
列を示す。
−図２はpUC8からのプラスミドpUC/AF−A Iの構築を示
す。
す。
−図３は図２のプラスミドから出発するpUC/AF−A I−
Ｍの構築を示す。
Ｍの構築を示す。
−図４はpYESから、および図２と図３のプラスミドから
出発する発現ベクターpYES/A IおよびpYES/A I−Ｍの調
製を示す。
出発する発現ベクターpYES/A IおよびpYES/A I−Ｍの調
製を示す。
Apo A IおよびApo A I−Ｍ配列の構築 Apo A I配列は我々が以前に述べたcDNAクローン［シ
ャープ（Sharpe）ら、ヌクレイック・アシッズ・リサー
チ（Nucl.Acids Res.）、1984年］から得たが、このク
ローンから、以下の戦略を用いて、シグナルペプチドお
よびプロペプチドをコードする配列を取り出し、修飾し
た。
ャープ（Sharpe）ら、ヌクレイック・アシッズ・リサー
チ（Nucl.Acids Res.）、1984年］から得たが、このク
ローンから、以下の戦略を用いて、シグナルペプチドお
よびプロペプチドをコードする配列を取り出し、修飾し
た。
元のcDNA配列（プラスミドpAIA）由来のNco I−BamH
I断片を、MFα１リーダー配列の末端部および成熟アポA
Iのアミノ末端配列を含む化学合成断片Hind III−Nco
I（図１）、およびHind III−BamH I消化pUC8（図２を
参照）で同時に結んだ。このクローンをpUC/AF−A Iと
名付ける。
I断片を、MFα１リーダー配列の末端部および成熟アポA
Iのアミノ末端配列を含む化学合成断片Hind III−Nco
I（図１）、およびHind III−BamH I消化pUC8（図２を
参照）で同時に結んだ。このクローンをpUC/AF−A Iと
名付ける。
Apo A I−Ｍ配列は、Apo A I−Ｍキャリアー由来の遺
伝子の一部をクローン化することにより得た。使用した
方法は以下の通りであった： ａ）標準的な方法［クンケル・エル・エム（Kunkel L
M）、スミス・ケイ・ディー（Smith KD）、ボイヤー・
エス・エイチ（Boyer SH）、ボルガオンカール・ディー
・エス（Borgaonkar DS）、ウォッチェル・エス・エス
（Watchel SS）、ミラー・ビー・ジェイ（Miller B
J）、ベルグ・ダブリュー・アール（Berg WR）、ジョー
ンズ・エイチ・ダブリュー（Jones HW）およびラリー・
ジェイ・エム（Rary JM）、プロシーディング・オブ・
ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・オブ・ジ
・ユナイテッド・ステイツ・オブ・アメリカ（Proc.Nat
l.Acad.Sci.USA）、1245〜1249頁、1977年］に従って、
末梢血白血球細胞からDNAを調製した。
伝子の一部をクローン化することにより得た。使用した
方法は以下の通りであった： ａ）標準的な方法［クンケル・エル・エム（Kunkel L
M）、スミス・ケイ・ディー（Smith KD）、ボイヤー・
エス・エイチ（Boyer SH）、ボルガオンカール・ディー
・エス（Borgaonkar DS）、ウォッチェル・エス・エス
（Watchel SS）、ミラー・ビー・ジェイ（Miller B
J）、ベルグ・ダブリュー・アール（Berg WR）、ジョー
ンズ・エイチ・ダブリュー（Jones HW）およびラリー・
ジェイ・エム（Rary JM）、プロシーディング・オブ・
ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・オブ・ジ
・ユナイテッド・ステイツ・オブ・アメリカ（Proc.Nat
l.Acad.Sci.USA）、1245〜1249頁、1977年］に従って、
末梢血白血球細胞からDNAを調製した。
ｂ）ヌクレオチド1792および2240間の断片（図３を参
照）［ショルダース・シー・シー（Shoulders CC）、ロ
ンブリット・エイ・アール（Kronblihtt AR）、ムンロ
ー・ビー・エス（Munro BS）およびエフ・イー・バラル
（F.E.Baralle）、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ
（Nucl.Acids Res.）、11巻、2827〜2837頁、1983年］
を、キャリアーから調製されたApo A I−ＭゲノムDNAに
関する酵素反応において、以下の配列： ５′−CTGAGGCAAGAGATGAGCAA−３′；ヌクレオチド17
92の５′末端部、 ５′−CTCAGGAAGCTGACCTTGAA−３′；ヌクレオチド22
40の５′末端部 を有する２つの合成オリゴヌクレオチドをプライマーと
して用いるポリメラーゼ鎖反応法［PCR、サイキ・アー
ル・ケイ（Saiki RK）、ゲルファンド・ディー・エイチ
（Gelfand DH）、ストッフェル・エス（Stoffel S）、
シャルフ・エス（Scharf S）、ヒグチ・アール（Higuch
i R）およびホーン・ジー・ティー（Horn GT）、サイエ
ンス（Science）、239巻、487〜491頁、1988年］として
知られている増幅法により生成させた。
照）［ショルダース・シー・シー（Shoulders CC）、ロ
ンブリット・エイ・アール（Kronblihtt AR）、ムンロ
ー・ビー・エス（Munro BS）およびエフ・イー・バラル
（F.E.Baralle）、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ
（Nucl.Acids Res.）、11巻、2827〜2837頁、1983年］
を、キャリアーから調製されたApo A I−ＭゲノムDNAに
関する酵素反応において、以下の配列： ５′−CTGAGGCAAGAGATGAGCAA−３′；ヌクレオチド17
92の５′末端部、 ５′−CTCAGGAAGCTGACCTTGAA−３′；ヌクレオチド22
40の５′末端部 を有する２つの合成オリゴヌクレオチドをプライマーと
して用いるポリメラーゼ鎖反応法［PCR、サイキ・アー
ル・ケイ（Saiki RK）、ゲルファンド・ディー・エイチ
（Gelfand DH）、ストッフェル・エス（Stoffel S）、
シャルフ・エス（Scharf S）、ヒグチ・アール（Higuch
i R）およびホーン・ジー・ティー（Horn GT）、サイエ
ンス（Science）、239巻、487〜491頁、1988年］として
知られている増幅法により生成させた。
ｃ）この断片をXho IIおよびStu I消化に付し、得られ
た産物をpUC/AF−A I由来のHind III−Xho IIおよびStu
I−BamH I断片で結んで、pUC−8 BamH I−Hind III線
状化ベクターとした。
た産物をpUC/AF−A I由来のHind III−Xho IIおよびStu
I−BamH I断片で結んで、pUC−8 BamH I−Hind III線
状化ベクターとした。
得られたクローンをpUC/A I−Ｍと名付ける。
プラスミドの構築 ヒト・Apo A IおよびApo A I−Ｍをコードする遺伝子
を、TPIプロモーター（TPIp）［ティー・アルバー（T.A
lber）およびジー・カワサキ（Ｇ・Kawasaki）、ジャー
ナル・オブ・モレキュラー・アンド・アプライド・ジェ
ネティックス（J.Mol.Applied Genet.）、Ｉ巻、419〜4
34頁、1982年］をコードする断片、MFα１リーダー配列
［ジェイ・クルキアン（J.Kurkian）およびアイ・ヘル
スコビッツ（I.Herskowitz）、セル（Cell）、30巻、93
3〜943頁、1982年］、およびエス・セレビシアエ（S.ce
revisiae）のTPIに由来する転写終結配列TPItと結合さ
せた。
を、TPIプロモーター（TPIp）［ティー・アルバー（T.A
lber）およびジー・カワサキ（Ｇ・Kawasaki）、ジャー
ナル・オブ・モレキュラー・アンド・アプライド・ジェ
ネティックス（J.Mol.Applied Genet.）、Ｉ巻、419〜4
34頁、1982年］をコードする断片、MFα１リーダー配列
［ジェイ・クルキアン（J.Kurkian）およびアイ・ヘル
スコビッツ（I.Herskowitz）、セル（Cell）、30巻、93
3〜943頁、1982年］、およびエス・セレビシアエ（S.ce
revisiae）のTPIに由来する転写終結配列TPItと結合さ
せた。
これらの断片は、Apo A Iをコードする遺伝子の高い
転写率を確実にする配列を提供し、また、Apo A Iおよ
びApo A I−Ｍポリペプチドの分泌経路への局在化およ
びその結果としての増殖培地への分泌を行うことができ
るプレ配列を提供する。
転写率を確実にする配列を提供し、また、Apo A Iおよ
びApo A I−Ｍポリペプチドの分泌経路への局在化およ
びその結果としての増殖培地への分泌を行うことができ
るプレ配列を提供する。
さらに、発現プラスミドは、酵母の２μ複製起点およ
び選択可能なマーカーLEU2を有する。
び選択可能なマーカーLEU2を有する。
酵母におけるα因子のin vivo成熟化の間に、MFα１
リーダーペプチドの最後（Ｃ末端）の６個のアミノ酸
（Lys−Arg−Glu−Ala−Glu−Ala）が、Lys−Arg配列を
認識するエンドペプチダーゼおよびGlu−Ala残基を除去
するアミノジペプチダーゼ［ジュリアス・ディー（Juli
us D）、ブレアー・エル（Blair L）、ブレイク・エイ
（Brake A）、スプランギュー・ジー（Sprangue G）お
よびトーナー・ジェイ（Thorner J）、セル（Cell）、3
2巻、839〜852頁、1983年］を引き続いて作用させるこ
とにより、α因子の前駆体から除去される。酵母アミノ
ジペプチダーゼの必要性をなくすために、MFα１リーダ
ーのＣ末端Glu−Ala−Glu−Alaをコードする配列を、in
vitro突然変異誘発法により除去した。
リーダーペプチドの最後（Ｃ末端）の６個のアミノ酸
（Lys−Arg−Glu−Ala−Glu−Ala）が、Lys−Arg配列を
認識するエンドペプチダーゼおよびGlu−Ala残基を除去
するアミノジペプチダーゼ［ジュリアス・ディー（Juli
us D）、ブレアー・エル（Blair L）、ブレイク・エイ
（Brake A）、スプランギュー・ジー（Sprangue G）お
よびトーナー・ジェイ（Thorner J）、セル（Cell）、3
2巻、839〜852頁、1983年］を引き続いて作用させるこ
とにより、α因子の前駆体から除去される。酵母アミノ
ジペプチダーゼの必要性をなくすために、MFα１リーダ
ーのＣ末端Glu−Ala−Glu−Alaをコードする配列を、in
vitro突然変異誘発法により除去した。
図４に示す如く、pUC/AF−A IおよびpUC−AF/A I−Ｍ
に由来するHind III−BamH I断片をHind III−BamH I線
状化pYESベクターにクローン化した。酵母を形質転換
し、Apo A IおよびApo A I−Ｍ遺伝子を発現させるため
に得たプラスミドを各々pYES/A IおよびpYES/A I−Ｍと
呼ぶ。
に由来するHind III−BamH I断片をHind III−BamH I線
状化pYESベクターにクローン化した。酵母を形質転換
し、Apo A IおよびApo A I−Ｍ遺伝子を発現させるため
に得たプラスミドを各々pYES/A IおよびpYES/A I−Ｍと
呼ぶ。
形質転換 前記のごとく調製したプラスミドを、グルコース上で
の増殖について選択することにより、TPI遺伝子に欠失
を有するエス・セレビシアエ（S.cerevisiae）株に形質
転換した。かかる株は、通常、単独炭素源としてのグル
コース上では増殖できず、ガラクトースラクテート培地
上では非常にゆっくり増殖する。この欠陥はトリオース
ホスフェートイソメラーゼ遺伝子の変異に起因し、この
変異はこの遺伝子の主要部分の欠失およびエス・セレビ
シアエ（S.cerevisiae）LEU2遺伝子との置換により得ら
れる。この増殖欠陥のため、TPIについてコードする遺
伝子を含むプラスミドが厳密に選択される。
の増殖について選択することにより、TPI遺伝子に欠失
を有するエス・セレビシアエ（S.cerevisiae）株に形質
転換した。かかる株は、通常、単独炭素源としてのグル
コース上では増殖できず、ガラクトースラクテート培地
上では非常にゆっくり増殖する。この欠陥はトリオース
ホスフェートイソメラーゼ遺伝子の変異に起因し、この
変異はこの遺伝子の主要部分の欠失およびエス・セレビ
シアエ（S.cerevisiae）LEU2遺伝子との置換により得ら
れる。この増殖欠陥のため、TPIについてコードする遺
伝子を含むプラスミドが厳密に選択される。
Apo A IおよびApo A I−Ｍ前駆体の酵母での発現 アポリポ蛋白質についてコードするプラスミドを含む
酵母株を、YPD培地［シェルマン・エフ（Sherman,F.）
ら、「酵母遺伝学における方法（Methods in Yeast Gen
etics）」、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラ
トリ（Cold Spring Harbor Laboratory）、1981年］上
で増殖させた。各株に対して、２つの、それぞれ２リッ
トルのバッフル付きフラスコ中、１リットル培養物を、
600nmにおけるODが約15に達するまで（約48時間）、30
℃にて振盪した。遠心分離した後、さらに分析するため
に、上清を取り出した。
酵母株を、YPD培地［シェルマン・エフ（Sherman,F.）
ら、「酵母遺伝学における方法（Methods in Yeast Gen
etics）」、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラ
トリ（Cold Spring Harbor Laboratory）、1981年］上
で増殖させた。各株に対して、２つの、それぞれ２リッ
トルのバッフル付きフラスコ中、１リットル培養物を、
600nmにおけるODが約15に達するまで（約48時間）、30
℃にて振盪した。遠心分離した後、さらに分析するため
に、上清を取り出した。
Apo A IおよびApo A I−Ｍ培養液の精製 培養液を15,000rpmで30分間遠心分離し、上清を0.15M
NaCl、0.05Mリン酸カリウム緩衝液、0.05％EDTA、pH7.
4（緩衝液Ａ）に対して透析した。
NaCl、0.05Mリン酸カリウム緩衝液、0.05％EDTA、pH7.
4（緩衝液Ａ）に対して透析した。
トリグリセリドに富む粒子（TGRP）を、４℃での超遠
心分離洗浄により、市販のリン脂質−トリグリセリド乳
化液から単離し、緩衝液Ａに再懸濁した。培養液からの
上清をTGRPと共に、37℃にて60分間、穏やかに撹拌しな
がらインキュベートし、氷−水浴中に浸漬することによ
り、インキュベーションを停止した。27,000rpm、35分
間、40℃の超遠心分離により、TGRPを再び単離し、ジエ
チルエーテル：エタノール3:1で脱脂質化した。沈澱し
た蛋白質を低速遠心分離により集め、セファクリル（Se
phacryl）Ｓ−200カラムおよび／または抗アポA I−セ
ファロース（Sepharose）カラムに通した。
心分離洗浄により、市販のリン脂質−トリグリセリド乳
化液から単離し、緩衝液Ａに再懸濁した。培養液からの
上清をTGRPと共に、37℃にて60分間、穏やかに撹拌しな
がらインキュベートし、氷−水浴中に浸漬することによ
り、インキュベーションを停止した。27,000rpm、35分
間、40℃の超遠心分離により、TGRPを再び単離し、ジエ
チルエーテル：エタノール3:1で脱脂質化した。沈澱し
た蛋白質を低速遠心分離により集め、セファクリル（Se
phacryl）Ｓ−200カラムおよび／または抗アポA I−セ
ファロース（Sepharose）カラムに通した。
組換えアポリポ蛋白質の構造的特徴付け 組換えApo A IおよびApo A I−Ｍの構造的特徴は、ア
ミノ酸分析法および蛋白質微少配列決定法により試験
し、アポリポ蛋白質調製物の純度を確認した。二次構造
は円偏光二色性により分析し、組換えアポリポ蛋白質が
正確に折りたたまれていることが示された：α′ヘリッ
クス含量は、抽出アポA Iに対する49％含量と同様に、
組換えApo A IおよびApo A I−Ｍについて、それぞれ52
％および43％と計算された。かくして、組換えA I−Ｍ
は、抽出Apo A I［フランセスチーニ（Franceschini）
ら、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリ
（J.Biol.Chem.）、260巻、16321〜16325頁、1985年］
と同様に、正常A Iに比べてαヘリックス含量が低い。
ミノ酸分析法および蛋白質微少配列決定法により試験
し、アポリポ蛋白質調製物の純度を確認した。二次構造
は円偏光二色性により分析し、組換えアポリポ蛋白質が
正確に折りたたまれていることが示された：α′ヘリッ
クス含量は、抽出アポA Iに対する49％含量と同様に、
組換えApo A IおよびApo A I−Ｍについて、それぞれ52
％および43％と計算された。かくして、組換えA I−Ｍ
は、抽出Apo A I［フランセスチーニ（Franceschini）
ら、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリ
（J.Biol.Chem.）、260巻、16321〜16325頁、1985年］
と同様に、正常A Iに比べてαヘリックス含量が低い。
組換えApo A I−Ｍ対Apo A Iの生物学的評価 すべての実験報告は、エス・セレヴィジアエ（S.cere
visiae）から得たApo A IおよびApo A I−Ｍを、血漿か
ら抽出したヒトApo A Iと比較することにより行った。
ヒトApo A IはヒトHDLより調製し、分取用超遠心分離に
より分離した。単離したHDL画分の脱脂化後、Apo A Iを
ゲル濾過およびイオン交換クロマトグラフィーにより分
離した［ベーカー（Baker）ら、バイオケミストリー（B
iochemistry）,12:3866−3871,1983］。
visiae）から得たApo A IおよびApo A I−Ｍを、血漿か
ら抽出したヒトApo A Iと比較することにより行った。
ヒトApo A IはヒトHDLより調製し、分取用超遠心分離に
より分離した。単離したHDL画分の脱脂化後、Apo A Iを
ゲル濾過およびイオン交換クロマトグラフィーにより分
離した［ベーカー（Baker）ら、バイオケミストリー（B
iochemistry）,12:3866−3871,1983］。
In vitro実験 フィブリン溶解の活性化 プラスミノーゲンのプラスミンへの変換を促進する、
すなわち、フィブリン溶解を開始させる試薬が、心筋梗
塞の治療において増大する関心を獲得しつつある［ラッ
フェルおよびブラウンワルド（Laffell andBraunwal
d）、ニューイングランド・ジャーナル・オブ・メディ
スン（N.Engl.J.Med.）,311:710−717,1984］。以前の
データは、Apo A Iがin vitroにてフィブリン溶解を活
性化し得ることを示している［サク（Saku）ら、トロン
ボシス・リサーチ（Thromb.Res.）,39:1−8,1985］。
すなわち、フィブリン溶解を開始させる試薬が、心筋梗
塞の治療において増大する関心を獲得しつつある［ラッ
フェルおよびブラウンワルド（Laffell andBraunwal
d）、ニューイングランド・ジャーナル・オブ・メディ
スン（N.Engl.J.Med.）,311:710−717,1984］。以前の
データは、Apo A Iがin vitroにてフィブリン溶解を活
性化し得ることを示している［サク（Saku）ら、トロン
ボシス・リサーチ（Thromb.Res.）,39:1−8,1985］。
ウロキナーゼ活性の増強または抑制を測定するため
に、実験は、フィブリン平板法により実施した［グラス
−グリーンワルト（Glas−Greenwalt）ら、ジャーナル
・オブ・ラボラトリー・アンド・クリニカル・メディス
ン（J.Lab.Clin.Med.）,104:962−976,1984］。
に、実験は、フィブリン平板法により実施した［グラス
−グリーンワルト（Glas−Greenwalt）ら、ジャーナル
・オブ・ラボラトリー・アンド・クリニカル・メディス
ン（J.Lab.Clin.Med.）,104:962−976,1984］。
6ml容量中、終濃度0.1％のウシ（プラスミノーゲンに
富む）フィブリノゲン溶液を、ウシ・トロンビン溶液
（20NIHユニット/ml）0.2mlで凝固させた。トリス緩衝
液で希釈した組換えApo A IおよびApo A I−Ｍ（10およ
び500μ/gの間の濃度）を速やかにウロキナーゼ（f.c.
3.3CAT U/ml）と混合し、フィブリン平板に適用した。
これらを37℃にて17時間インキュベートした。溶解領域
の測定により、両蛋白質が、最高試験用量で、Apo A I
の場合（抽出Apo A Iでは、59.7％と66.2％であるのに
対して；サクら、トロンボシス・リサーチ,39:1−8,198
5）、各々、64.0％および67.9％までの、Apo A I−Ｍの
場合、96.7％および112.1％までのウロキナーゼ溶解領
域を有意に増加させることが示された（表１）。従っ
て、この系において、Apo A I−ＭはApo A Iよりも有意
に優れているようである。
富む）フィブリノゲン溶液を、ウシ・トロンビン溶液
（20NIHユニット/ml）0.2mlで凝固させた。トリス緩衝
液で希釈した組換えApo A IおよびApo A I−Ｍ（10およ
び500μ/gの間の濃度）を速やかにウロキナーゼ（f.c.
3.3CAT U/ml）と混合し、フィブリン平板に適用した。
これらを37℃にて17時間インキュベートした。溶解領域
の測定により、両蛋白質が、最高試験用量で、Apo A I
の場合（抽出Apo A Iでは、59.7％と66.2％であるのに
対して；サクら、トロンボシス・リサーチ,39:1−8,198
5）、各々、64.0％および67.9％までの、Apo A I−Ｍの
場合、96.7％および112.1％までのウロキナーゼ溶解領
域を有意に増加させることが示された（表１）。従っ
て、この系において、Apo A I−ＭはApo A Iよりも有意
に優れているようである。
培養マクロファージからのコレステロールの除去 いわゆる、「逆コレステロール輸送」（RCT）、すな
わち、コレステロールの組織からの血漿への輸送は、受
容体リポ蛋白質として作用するHDLによって調節される
と考えられている（グロムセット・ジェイ（Glomset
J.）、アドブ・イント・メド（Adv.Int.Med.）,25:91−
116,1980）。Apo A IがHDLの除去能の原因と考えられて
いるので、実験は3H−コレステロールで平衡化したＪ−
774マウス・マクロファージで実施した。単層を、「最
小必須培地」、溶媒抽出脱脂子ウシ血清タンパク質、卵
ホスファチジルコリン（PC）およびエステル化コレステ
ロールと共にインキュベートした［ロスブラト（Rothbl
at）ら、イン・ビトロ（In vitro）,12:554−557,197
6］。3Hコレステロールで48時間平衡化させ、その後、
放射能活性培地を除去し、細胞を十分に洗浄し、5mg/ml
の脱脂子ウシ血清タンパク質を補足した新鮮な培地を加
えた。一夜インキュベートした後、該細胞を再度十分に
洗浄し、35mmの平坦な皿中、各受容体粒子2mlを加え
た、HEPES−緩衝ウイリアムス培地Ｅ（Williams Medium
E）と共にインキュベートした。最初の６時間において
は90分毎に、次いで３時間毎に、合計24時間の間、イン
キュベート培地0.1ml部を採取し、計数して細胞によっ
て放出された標識コレステロール量を測定した［ロスブ
ラトおよびフィリップス（RothblatおよびPhillips）、
ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（J.
Biol.Chem.）,250:4775−4782,1982］。
わち、コレステロールの組織からの血漿への輸送は、受
容体リポ蛋白質として作用するHDLによって調節される
と考えられている（グロムセット・ジェイ（Glomset
J.）、アドブ・イント・メド（Adv.Int.Med.）,25:91−
116,1980）。Apo A IがHDLの除去能の原因と考えられて
いるので、実験は3H−コレステロールで平衡化したＪ−
774マウス・マクロファージで実施した。単層を、「最
小必須培地」、溶媒抽出脱脂子ウシ血清タンパク質、卵
ホスファチジルコリン（PC）およびエステル化コレステ
ロールと共にインキュベートした［ロスブラト（Rothbl
at）ら、イン・ビトロ（In vitro）,12:554−557,197
6］。3Hコレステロールで48時間平衡化させ、その後、
放射能活性培地を除去し、細胞を十分に洗浄し、5mg/ml
の脱脂子ウシ血清タンパク質を補足した新鮮な培地を加
えた。一夜インキュベートした後、該細胞を再度十分に
洗浄し、35mmの平坦な皿中、各受容体粒子2mlを加え
た、HEPES−緩衝ウイリアムス培地Ｅ（Williams Medium
E）と共にインキュベートした。最初の６時間において
は90分毎に、次いで３時間毎に、合計24時間の間、イン
キュベート培地0.1ml部を採取し、計数して細胞によっ
て放出された標識コレステロール量を測定した［ロスブ
ラトおよびフィリップス（RothblatおよびPhillips）、
ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（J.
Biol.Chem.）,250:4775−4782,1982］。
組換えApo A IまたはApo A I−Ｍを含有するプロテオ
リポソームを、マットスおよびジョナス（MatsおよびJo
nas）［ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミスト
リー,257:4535−4540,1982］により記載されているごと
く、コール酸塩（cholate）透析方法に従って、卵PCで
調製した。混合物は、一般に、10mMトリス/1mM EDTA/1m
M NaN3/150mM NaCl（pH8.0）中、アポリポ蛋白質／リン
脂質／コール酸塩（質量比率1/2.5/1.5−2.5）よりなる
ものであった。アポリポ蛋白質／リン脂質粒子をサイズ
分けするために、0.15M NaCl/0.02％EDTA,pH7で溶出す
るセファロース（Sepharose）CL/4B（1.5×80cmカラ
ム）上のゲル濾過を行った。ピーク画分を超濾過セル
（アミコン・モデル52（Amicon model 52）上にて濃縮
した。Apo A IまたはApo A I−Ｍ含有の粒子の化学組成
および分子の顕微鏡特性を測定することによっては、有
意な差異を見い出せなかった。細胞コレステロールの除
去能を評価するために、２種の異なる濃度のアポリポ蛋
白質成分（50および100μg/ml、すなわち、150および30
0μｇのPC/ml培地の濃度に相当する）を該細胞に加え
た。これらの実験条件下、コレステロールの一方向性流
動（flux）は無細胞コレステロール濃度に関して１次的
であるため、種々の条件においてコレステロール流出
（efflux）の半減期（ｔ1/2）を算出することができ
る。
リポソームを、マットスおよびジョナス（MatsおよびJo
nas）［ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミスト
リー,257:4535−4540,1982］により記載されているごと
く、コール酸塩（cholate）透析方法に従って、卵PCで
調製した。混合物は、一般に、10mMトリス/1mM EDTA/1m
M NaN3/150mM NaCl（pH8.0）中、アポリポ蛋白質／リン
脂質／コール酸塩（質量比率1/2.5/1.5−2.5）よりなる
ものであった。アポリポ蛋白質／リン脂質粒子をサイズ
分けするために、0.15M NaCl/0.02％EDTA,pH7で溶出す
るセファロース（Sepharose）CL/4B（1.5×80cmカラ
ム）上のゲル濾過を行った。ピーク画分を超濾過セル
（アミコン・モデル52（Amicon model 52）上にて濃縮
した。Apo A IまたはApo A I−Ｍ含有の粒子の化学組成
および分子の顕微鏡特性を測定することによっては、有
意な差異を見い出せなかった。細胞コレステロールの除
去能を評価するために、２種の異なる濃度のアポリポ蛋
白質成分（50および100μg/ml、すなわち、150および30
0μｇのPC/ml培地の濃度に相当する）を該細胞に加え
た。これらの実験条件下、コレステロールの一方向性流
動（flux）は無細胞コレステロール濃度に関して１次的
であるため、種々の条件においてコレステロール流出
（efflux）の半減期（ｔ1/2）を算出することができ
る。
表２に示すごとく、アポリポ蛋白質のリポソーム中両
濃度にて、Ｊ−774細胞からの遊離コレステロールの流
出は、Apo A Iに比較し、Apo A I−Ｍではかなり速かっ
た。再度、組換えおよび抽出Apo A I（ｔ1/2:17.9±3.
2）の間で差異を検出することはできなかった。
濃度にて、Ｊ−774細胞からの遊離コレステロールの流
出は、Apo A Iに比較し、Apo A I−Ｍではかなり速かっ
た。再度、組換えおよび抽出Apo A I（ｔ1/2:17.9±3.
2）の間で差異を検出することはできなかった。
アテローム性動脈硬化症退行のin vivo研究 本実験では、抽出Apo A Iおよび組換えApo A I−Ｍの
４週間連続注入が、２カ月間の0.5％富コレステロール
飼料で確立したウサギでの動脈障害を減少させる能力を
評価した。25匹のニュージランド系（New Zealand）雄
のウサギ（初期体重2.2−2.5kg）に0.5％富コレステロ
ール飼料を２カ月間与えた。この時点で４匹の動物を殺
した。その大動脈は、45.3±7.6％のアテローム性動脈
硬化症障害を包含することを示した。この時点で、動物
を各群７匹の３群に分けた。群１には無処理の標準無コ
レステロール飼料を与えた。群２には、耳の静脈に連結
し、皮下注入するアルゼットＲ製のミニポンプ（AlzetR
Minipump）を用い、Apo A Iを連続的に注入した。群３
は、Apo A I−Ｍで同様に処理した。合計日蛋白質用量
は、２種のアポリポ蛋白質の各々につき7mg/ウサギであ
った。
４週間連続注入が、２カ月間の0.5％富コレステロール
飼料で確立したウサギでの動脈障害を減少させる能力を
評価した。25匹のニュージランド系（New Zealand）雄
のウサギ（初期体重2.2−2.5kg）に0.5％富コレステロ
ール飼料を２カ月間与えた。この時点で４匹の動物を殺
した。その大動脈は、45.3±7.6％のアテローム性動脈
硬化症障害を包含することを示した。この時点で、動物
を各群７匹の３群に分けた。群１には無処理の標準無コ
レステロール飼料を与えた。群２には、耳の静脈に連結
し、皮下注入するアルゼットＲ製のミニポンプ（AlzetR
Minipump）を用い、Apo A Iを連続的に注入した。群３
は、Apo A I−Ｍで同様に処理した。合計日蛋白質用量
は、２種のアポリポ蛋白質の各々につき7mg/ウサギであ
った。
処理の４週間後、大動脈の脂肪障害の程度および大動
脈の脂質含量を共に３群で評価した。データ（表３）に
より、Apo A Iで30％以上の障害の退行、およびApo A I
−Ｍで60％以上の退行が示され、これは両群における動
脈コレステロールおよびコレステリルエステル合計の非
常に有意な減少に対応し、Apo A I−Ｍは通常のApo A I
に比べてかなり効果的である。
脈の脂質含量を共に３群で評価した。データ（表３）に
より、Apo A Iで30％以上の障害の退行、およびApo A I
−Ｍで60％以上の退行が示され、これは両群における動
脈コレステロールおよびコレステリルエステル合計の非
常に有意な減少に対応し、Apo A I−Ｍは通常のApo A I
に比べてかなり効果的である。
報告した知見により、in vivo条件［バジモン（Badim
on）ら、アーテリオスクレロシス（Arteriosclerosi
s）,7:522a,1987］でApo A Iの顕著な活性が確認され、
恐らくはその物理化学特性のため、Apo A I−Ｍが、通
常のヒトA Iに比し、アテローム性動脈硬化症障害の退
行を誘発するのに効果的であることが示される。
on）ら、アーテリオスクレロシス（Arteriosclerosi
s）,7:522a,1987］でApo A Iの顕著な活性が確認され、
恐らくはその物理化学特性のため、Apo A I−Ｍが、通
常のヒトA Iに比し、アテローム性動脈硬化症障害の退
行を誘発するのに効果的であることが示される。
フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ｃ０７Ｋ 14/775 Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ // Ｃ１２Ｐ 21/02 Ａ６１Ｋ 37/02 (72)発明者 フランチェスキーニ，グイドー イタリア国 ミラノ 20100、ヴィア・ パンカルド12番 (72)発明者 バラリー，フランチスコ イタリア国ミラノ３―バジリオ、レジデ ンツァ・アカシエ112番 (56)参考文献 特表 昭63−501764（ＪＰ，Ａ) Ｃｅｌｌ，30（３）（1982），ｐ. 933−943 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 15/00 - 15/90 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＣＡ（ＳＴＮ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (6)
- 【請求項１】形質転換すべき酵母の自己由来プロモータ
ー配列、アポリポ蛋白質A I（Apo A I）またはアポリ
ポ蛋白質A I−Ｍ（ミラノ（Milano））（Apo A I−
Ｍ）をコードするDNA配列、His Gly Ser Leu Asp Lys A
rg残基をコードする修飾されたMFα１リーダー配列であ
るリーダーをコードする配列、形質転換すべき酵母の自
己由来転写ターミネーター配列よりなることを特徴とす
る、形質転換酵母でApo A IおよびApo A I−Ｍを発現
できる発現ベクター。 - 【請求項２】プラスミドpUC8に由来するものである、Ap
o A IまたはApo A I−Ｍを発現できる請求項１記載の発
現ベクター。 - 【請求項３】プラスミドpYES/A IおよびpYES/A I−Ｍよ
りなる請求項または２記載の発現ベクター。 - 【請求項４】以下の配列： を有するHis Gly Ser Leu Asp Lys Arg Asp Glu Pro Pr
o Gln Ser Pro Trp残基をコードする合成DNA。 - 【請求項５】請求項１〜３いずれか１項記載の発現ベク
ターで形質転換した宿主酵母。 - 【請求項６】菌株サッカロミセス・セレビシエ（Saccha
romyces cerevisiae）である請求項５記載の宿主酵母。
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|---|---|---|---|
| IT20226A189 | 1989-04-20 | ||
| IT8920226A IT1229996B (it) | 1989-04-20 | 1989-04-20 | Espressione di apolipoproteina ai e apolipoproteina ai-milano in lievito e composizioni farmaceutiche che contengono dette apolipoproteine. |
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| JP2004192803A Expired - Fee Related JP3845101B2 (ja) | 1989-04-20 | 2004-06-30 | ヒト・アポリポ蛋白質ａｉおよびａｉ−ミラノを含有する医薬組成物 |
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| SE9203753D0 (sv) * | 1992-12-11 | 1992-12-11 | Kabi Pharmacia Ab | Expression system for producing apolipoprotein ai-m |
| SE9500778D0 (sv) | 1995-03-03 | 1995-03-03 | Pharmacia Ab | Process for producing a protein |
| SE9603068D0 (sv) | 1996-08-23 | 1996-08-23 | Pharmacia & Upjohn Ab | Process for purifying a protein |
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| SE9603304D0 (sv) | 1996-09-11 | 1996-09-11 | Pharmacia & Upjohn Ab | Process for purifying a compound |
| EP0954524B1 (en) * | 1996-09-11 | 2003-04-09 | Pharmacia Aktiebolag | Process for purifying apolipoproteins |
| SE9603303D0 (sv) | 1996-09-11 | 1996-09-11 | Pharmacia & Upjohn Ab | Process for purifying a protein |
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| WO2005051413A2 (en) * | 2003-11-26 | 2005-06-09 | Novartis Ag | Disease associated genes |
| WO2005097206A2 (en) | 2004-04-06 | 2005-10-20 | Cedars-Sinai Medical Center | Prevention and treatment of vascular disease with recombinant adeno-associated virus vectors encoding apolipoprotein a-i and apolipoprotein a-i milano |
| KR100560102B1 (ko) | 2004-06-25 | 2006-03-13 | 한국생명공학연구원 | 프로아포리포단백질 ａ－ⅰ 변이체와, 이를 포함하는고지혈증 또는 동맥경화증 예방 및 치료제 |
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