DE69010000T2 - Expression von menschlichen apolipoproteinen ai-milano in hefe. - Google Patents

Expression von menschlichen apolipoproteinen ai-milano in hefe.

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Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft die Expression von Apolipoprotein Al oder Apolipoprotein AI-Milano (Apo-AI oder Apo-AI-M) in Hefestämmen und pharmazeutische Zusammensetzungen zur Behandlung von Atherosklerose und kardiovaskulären Erkrankungen, die als aktiven Wirkstoff besagte Apolipoproteine enthalten.
  • Die eindeutige Korrelation zwischen erhöhten Mengen an Cholesterin im Serum und der Entwicklung der koronaren Herzerkrankung (coronary heart disease; CHD) ist durch epidemiologische Studien und Langzeitstudien wiederholt bestätigt worden. Die Aufklärung komplexer Mechanismen des Cholesterintransports im Plasma hat es jedoch erlaubt, eine selektive Funktion der zirkulierenden Lipoproteine für die Bestimmung des Risikos, an CHD zu erkranken, zu erkennen.
  • Tatsächlich gibt es vier Hauptklassen zirkulierender Lipoproteine: Chylomicrons (CM), Very-low-density-Lipoproteine (VLDL), Low-density-Lipoproteine (LDL) und High-density-Lipoproteine (HDL). Während CM ein kurzlebiges Produkt der Fettresorption im Darm darstellt, sind VLDL und insbesondere LDL verantwortlich für den Cholesterintransport in Gewebe, insbesondere auch in die Arterienwände. Im Gegensatz dazu sind HDL direkt am Abtransport von Cholesterin aus peripheren Geweben beteiligt, wobei es mittels eines Mechanismus, der als "reverser Cholesterintransport" (RCT) bekannt ist, entweder zurück zur Leber oder zu anderen Lipoproteinen transportiert wird.
  • Die "Schutzfunktion" von HDL wurde in einer Reihe von Studien bestätigt (Miller et al., Lancet, i: 965-968, 1977; Whayne et al., Atherosclerosis 39: 411-41 9, 1981). Nach diesen Studien scheinen es erhöhte Werte für LDL, weniger solche für VLDL, zu sein, die eindeutig mit einem erhöhten kardiovaskulären Risiko in Beziehung stehen.
  • Das gegenwärtige Interesse am Studium der Schutzfunktion/en von HDL hat sich auf Apolipoprotein Al (Apo AI) konzentriert, der Hauptkomponente von HDL. Tatsächlich zeigen auch die Mengen von Apo AI im Plasma eine negative Korrelation mit dem Risiko einer CHD-Erkrankung sowie mit dem Vorhandensein von Koronarläsionen (Maciejko et al., N. Eng. J. Med., 309: 385-389, 1983; Sedlis et al., Circulation, 73. 978-984, 1986).
  • In-vitro-Studien zeigen, daß Komplexe aus Apo AI und Lecithin die Freisetzung von freiem Cholesterin aus kultivierten arteriellen glatten Muskelzellen fördern können (Stein et al., Biochem. Biophys. Acta, 380: 106-118, 1975). Mittels dieses Mechanismus kann HDL auch die Proliferation dieser Zellen reduzieren (Yoshida et al., Exp. Mol. Pathol., 41: 258-266, 1984).
  • Kürzlich wurde gezeigt, daß Infusionen von Apo AI oder von HDL in Versuchstiere signifikante biochemische Veränderungen sowie eine Reduktion der Ausprägung und Heftigkeit atherosklerotischer Läsionen bewirken. Nach einem ursprünglichen Bericht von Maciejko und Mao (Arteriosclerosis, 2: 407a, 1982) haben Badimon et al. in zwei Folgestudien (Cardiovascular Disease, 1983, Abs. 81; Arteriosclerosis, 7: 522a, 1987) eindeutig gezeigt, daß durch Infusion von Apo AI oder HDL (d = 1,063-1,325 g/ml) die Ausprägung atherosklerotischer Läsionen in Kaninchen, die mit Cholesterin gefüttert worden waren, signifikant reduziert werden konnte (-45%), während der Cholesterinestergehalt in den Läsionen um 58,4% reduziert wurde. Es konnte auch gezeigt werden (Esper et al., Arteriosclerosis, 7: 523a, 1987), daß Infusionen von HDL die Plasmalipoproteinzusammensetzung von Watanabe- Kaninchen mit vererbter Hypercholesterinämie, die frühzeitig arterielle Läsionen entwickeln, erheblich verändern können. Bei diesen Tieren können HDL Infusionen das Verhältnis zwischen dem schützenden HDL und dem atherogenen LDL mehr als verdoppeln.
  • Die Fähigkeit von HDL, im Tiermodell zur Besserung arterieller Erkrankungen zu führen, wurde darüber hinaus durch die Beobachtung bestätigt, daß Apo AI eine signifikante fibrinolytische Wirkung ausüben kann (Saku et al., Thromb. Res., 39: 1-8, 1985). Ronneberger (Xth Int. Congr. Pharmacol., Sidney, 1987, p. 990) zeigten eindeutig, daß extrahiertes Apo AI bei Beagle-Hunden und Cynomolgus-Affen die Fibrinolyse erhöhen kann. Eine ähnliche Wirkung kann in vitro mit menschlichem Plasma beobachtet werden. Derselbe Autor konnte eine Verminderung der Lipidablagerung und der Bildung arterieller Plaques in Tieren bestätigen, die mit Apo AI behandelt worden waren.
  • Apo AI aus Plasma ist eine einzelne Polypeptidkette von 243 Aminosäuren, deren Primärsequenz bekannt ist (Brewer et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 80: 623-630, 1978). Apo AI wird von der Zelle als ein Vorläufermolekül (Precursor) von 267 Aminosäuren synthetisiert. Dieses Pre-Pro- Apolipoprotein verliert zunächst innerhalb der Zelle die 18 N-terminalen Aminosäuren; die Abspaltung von 6 weiteren Aminosäuren geschieht im Plasma und/oder in der Lymphe durch die Aktivität spezifischer Proteasen.
  • Es wird vermutet, daß die wichtigste strukturelle Voraussetzung für das Apo AI- Molekül das Vorhandensein von Wiederholeinheiten von 11 bis 22 Aminosäuren ist, die vermutlich in der Konformation einer amphipatischen Helix vorliegen (Segrest et al., FEBS Lett., 38: 247-253, 1974). Diese Struktur gewährleistet die hauptsächlichen biologischen Aktivitäten von Apo AI, d.h. Lipidbindung und die Aktivierung von Lecithin/Cholesterinacyltransferase (LCAT). Die weiteren Funktionen von HDL, d.h. Interaktion mit Zellen und Freisetzung von Cholesterin aus ihnen, lassen sich nicht mit eindeutigen Merkmalen des Apolipoproteins assoziieren.
  • Das Apolipoprotein AI-Milano (Apo AI-M) ist die erste beschriebene molekulare Variante von menschlichem Apo AI (Franceschini et al., J. Clin. Invest., 66: 892-900, 1980). Sie ist durch die Substitution von Arg 173 durch Cys gekennzeichnet (Weisgraber et al., J. Biol. Chem., 258: 2508-2513,1983). Das mutierte Apoprotein wird als autosomal dominantes Merkmal vererbt. 8 Generationen von Trägern sind identifiziert worden (Gualandri et al., Am. J. Hum. Genet., 37:1083-1097, 1984).
  • Der Zustand der Träger von Apo AI-M ist durch eine bemerkenswerte Reduktion von HDL-Cholesterin gekennzeichnet. Trotzdem zeigen die betroffenen Individuen offenbar kein erhöhtes Risiko bezüglich arterieller Erkrankung; tatsächlich scheint es nach Überprüfung des Stammbaumes so zu sein, daß diese Individuen dadurch vor Atherosklerose geschützt werden können.
  • Der Mechanismus des möglichen Schutzeffekts von Apo AI-M für die Träger scheint mit einer Modifikation der Struktur des mutierten Apolipoproteins in Verbindung zu stehen, nämlich mit dem Verlust einer α-Helix und einer verstärkten Exposition hydrophober Reste (Franceschini et al., J. Biol. Chem., 260: 1632-1635, 1985). Der Verlust der dichten Struktur der vielen α-Helices führt zu einer erhöhten Flexibilität des Moleküls, das somit im Vergleich zu normalem Apolipoprotein Al besser mit Lipiden assoziiert. Darüber hinaus sind die Apolipoprotein/Lipid-Komplexe leichter zu denaturieren, was darauf hindeutet, daß die Lipidabgabe im Falle der Mutante ebenfalls verbessert ist.
  • Ein weiteres sehr spezifisches Merkmal von Apo AI-M ist seine Fähigkeit, mit sich selbst Dimere zu bilden und mit Apo AIl zu komplexieren, was in beiden Fällen auf dem Vorhandensein des Cys-Restes beruht. Das Vorhandensein von Dimeren und Komplexen im Blutkreislauf ist vermutlich für die verlängerten Abbauhalbwertszeiten dieser Moleküle in den Trägern verantwortlich, die kürzlich in klinischen Studien beschrieben wurden (Gregg et al., NATO ARW on Human Apolipoprotein Mutants: From Gene Structure to Phenotypic Expression, Limone S.G., 1988). Die modifizierten Apolipoproteinpartikel können demnach für sehr lange Zeiträume im Blutkreislauf verbleiben, so daß sie ihre Schutzwirkung auf Arterien im Vergleich zu normalen Al-Partikeln besser ausüben können.
  • Die therapeutische Verwendung von Apolipoprotein Al oder seiner AI-M-Mutante wird gegenwärtig durch das Fehlen eines Verfahrens eingeschränkt, das die Herstellung dieser Apolipoproteine in genügenden Mengen und in geeigneter Form erlaubt.
  • Die Schwierigkeiten, Apolipoprotein Al und insbesondere Apolipoprotein Al- Milano (AI-M) durch Plasmafraktionierung zu gewinnen, sind erheblich (Franceschini et al., J. Biol. Chem., 260: 16321-16325, 1985). Darüberhinaus ist es essentiell, eine Reihe von Risiken zu vermeiden, die mit durch Plasmafraktionierung gewonnenen Produkten assoziiert sind, z. B. Kontamination mit infektiösen Agentien und das Problem der Zugänglichkeit des Ausgangsmaterials.
  • Es wurden mehrere Versuche unternommen, menschliches Apo AI mittels rekombinanter DNA-Technologie herzustellen. In WO 88/03166 ist die Herstellung von Apo AI in E.coli beschrieben. Das beschriebene Verfahren führt zu einem chimären Polypeptid, bei dem der Apo AI-Anteil mit den N-terminalen Aminosäureresten der β-Galactosidase, einer oder mehrerer IgG- Bindungsdomäne/n von Protein A oder der Pro-Sequenz von menschlichem Apo Al fusioniert ist.
  • Die vorstehend genannten Verfahren haben den Nachteil, daß als transformierter Organismus E.coli verwendet wird. Die exprimierten Produkte entsprechen nicht reifem menschlichen Apo AI, sondern enthalten einen erheblichen Anteil an Sequenzen heterologen Ursprungs. Darüber hinaus werden die Produkte von den Zellen nicht sekretiert, sondern akkumulieren intrazellulär im E.coli- Wirtsorganismus, so daß die Gefahr enzymatischen Abbaus des exprimierten Produkts erhöht wird.
  • Ein geeigneteres System zur Expression von Säugerpolypeptiden scheinen eukaryontische Zellen zu sein, und es wurden mehrere Versuche unternommen, Fremdgene in Eukaryonten, insbesondere in Hefe, zu exprimieren. Die Expression von Interferon in Hefe ist in EP-B-0 060 057, und die Expression und Sekretion von Proteinen in Hefe, die zur Hefe heterolog sind, in EP-B-0 088 632, 0 11 6 201 und 0 123 544 beschrieben. WO 87/02062 beschreibt die Expression eines Apolipoproteins in Hefezellen.
  • Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, Apo AI und Apo AI-M bereitzustellen. Sie werden in Hefe in hoher Ausbeute, mit korrekt gefalteter Struktur und mit den Eigenschaften von natürlichem menschlichem Apo AI, d.h. den Strukturmerkmalen, der Lipidbindung und der Aktivierung der Fibrinolyse und der Lecithin/Cholesterinacyltransferase (LCAT; Mahley et al., J. Lipid. Res., 25:1277-1294, 1984), synthetisiert.
  • Die vorliegende Erfindung stellt die Gene bereit, die für Apo AI und Apo AI-M kodieren, zusammen mit den DNA Sequenzen, die für Hefe erkennbare Sekretions- und Prozessierungssignale kodieren und stromaufwärts mit dem Gen für die reifen Proteine fusioniert sind. Insbesondere wird eine modifizierte MFα1- Leadersequenz verwendet, bei der die letzten Reste wie folgt sind: HisGlySerLeuAspLysArg.
  • Bei dieser modifizierten MFα1-Leadersequenz ist das Prozessierungssignal die dibasische Sequenz Lys-Arg, die dann an den 5'-Terminus des Apo AI-Gens fusioniert wird. Es wurde gefunden, daß die Leadersequenz bei allen Konstrukten abgespalten wurde, d.h. die Spaltung erfolgte stromaufwärts von allen Apo AI- und Apo AI-M-Polypeptiden an der dibasischen Sequenz Lys-Arg.
  • Die Erfindung stellt ferner ein Verfahren zur Herstellung von Apo AI oder Apo AI- M in Hefe bereit. Bei diesem Verfahren wird ein Hefestamm, der mit einem Expressionsvektor transformiert ist, der eine für die Apo AI- oder Apo AI-M- Proteine kodierende DNA-Sequenz umfaßt, in einem geeigneten Kulturmedium kultiviert, und die Apo AI- oder Apo AI-M-Moleküle werden aus dem Kulturmedium gewonnen.
  • Bei der Kultivierung solcher transformierter Hefestämme werden Apo AI oder Apo AI-M in hohen Ausbeuten aus dem Kulturmedium isoliert.
  • Die Expressionsprodukte wurden isoliert und Apo AI-immunreaktives Material gereinigt und mittels Mikrosequenzanalyse charakterisiert. Es wurde gefunden, daß dieses Polypeptid dieselben Charakteristika wie natürliches Apo AI aufweist.
  • Die erfindungsgemäßen Expressionsvektoren umfassen ein Replikationssystem zur stabilen Propagierung in einer Hefewirtszelle, DNA-Sequenzen, die für Apo Al oder Apo AI-M kodieren, sowie Promotor- und Terminatorsequenzen.
  • Der Expressionsvektor kann stromaufwärts zu der DNA-Sequenz, die für das gewünschte Produkt kodiert, eine Pre-Region enthalten, die das Einschleusen des exprimierten Produkts in den sekretorischen Stoffwechselweg der Hefe und die Sekretion des exprimierten Produkts in das Nährmedium gewährleistet. Diese Pre-Region, die ein natürlich vorkommendes Signal- oder Leaderpeptid oder eine synthetische, zur Sekretion führende Sequenz sein kann, wird im allgemeinen während der Sekretion vom gewünschten Produkt abgespalten, so daß das reife Produkt in einer zur Isolierung aus dem Kulturmedium geeigneten Form vorliegt. Für Hefezellen ist die MFα1-Leadersequenz aus Hefe gut als Leadersequenz geeignet (Kurjan, J. und Herskowits, I., Cell 30: 933-946, 1982).
  • Der Expressionsvektor kann ein Plasmid sein, das in der Lage ist, im Wirtsmikroorganismus zu replizieren oder in das Wirtsgenom zu integrieren. Der verwendete Vektor kann auch so gestaltet sein, daß mehrere Kopien der gewünschten DNA-Sequenz, jede getrennt durch selektive Schnittstellen, exprimiert werden.
  • Die Expression der gewünschten DNA-Sequenz unterliegt der Kontrolle einer Promotorsequenz, die bezüglich der für das gewünschte Produkt kodierenden DNA-Sequenz in der richtigen Position liegt, so daß das gewünschte Produkt im Wirtsorganismus exprimiert wird. Vorzugsweise wird ein Promotor eines Gens aus der Hefewirtszelle verwendet, z. B. der Promotor des TPI (Triosephosphatisomerase)-Gens oder der MFα1-Promotor.
  • Die DNA-Sequenz für das gewünschte Produkt wird von einer Transkriptionsterminatorsequenzgefolgt, vorzugsweise einer Terminatorsequenz eines Gens aus der Hefewirtszelle, z.B. der Terminatorsequenz des TPI-Gens oder des MFα1-Gens.
  • Die vorliegende Erfindung beschreibt weiterhin die Manipulation der zuvor klonierten Apo AI- und Apo AI-M-Sequenzen (Sharpe CR, Sidoli A, Shelley CS, Lucero MA, Shoulders CC und Baralle FE, Nucl. Acids Res., 12: 3917-3932, 1984) mittels eines chemisch synthetisierten Adaptors von 46 Nukleotiden, der in die nur einmal vorkommende Ncol-Schnittstelle von Apo AI kloniert wird, um sie zur Sekretion in Hefezellen zu befähigen.
  • Die Apo AI-M-Mutation wurde durch partielle Klonierung des mutierten Apo AI- M-Gens von einem Träger und durch Einsetzen eines Teils davon in die Wildtypsequenz hergestellt.
  • Zeichnungen:
  • - Abbildung 1 zeigt die Sequenz des Adaptors von 46 Nukleotiden, der das Ende der MFα1-Leadersequenz und die amino-terminale Sequenz von reifem Apo AI enthält.
  • - Abbildung 2 zeigt die Konstruktion des Plasmids pUC/AF-AI ausgehend von pUC8.
  • - Abbildung 3 zeigt die Konstruktion von pUC/AF-AI-M ausgehend von dem Plasmid von Abb. 2.
  • - Abbildung 4 zeigt die Herstellung der Expressionsvektoren pYES/Al und pYES/AI-M ausgehend von pYES und den Plasmiden von Abb. 2 und 3.
    • Konstruktion der Sequenzen von Apo AI und Apo AI-M
  • Die Apo AI-Sequenzen wurden aus unserem zuvor beschriebenen cDNA-Klon (Sharpe et al., Nucl. Acids Res., 1984) gewonnen, von dem die für das Signalpeptid und das Pro-Peptid kodierende Sequenz entfernt wurde, und nach folgender Strategie modifiziert.
  • Das NcoI/BamHI-Fragment aus der ursprünglichen cDNA-Sequenz (Plasmid pAIA) wurde gleichzeitig mit einem chemisch synthetisierten HindIII/NcoI-Fragment, das das Ende der MFα1-Leadersequenz und die amino-terminale Sequenz des reifen Apo AI (Abb. 1) enthielt, und einem HindIII/BamHI-verdauten pUC8 ligiert (siehe Abb. 2). Dieser Klon wurde pUC/AF-AI genannt.
  • Die Apo AI-M-Sequenz wurde erhalten, indem ein Teil des Gens von einem Apo AI-M-Träger kloniert wurde. Das verwendete Verfahren war wie folgt:
  • a) Mittels Standardverfahren (Kunkel L.M., Smith K.D., Boyer S.H., Borgaonkar D.S., Watchel S.S., Miller B.J., Berg W.R., Jones H.W. und Rary J.M., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1245-1249, 1977) wurde aus peripheren weißen Blutzellen DNA präpariert.
  • b) Das Fragment zwischen den Nukleotiden 1792 und 2240 (siehe Abb. 3; Shoulders CC, Kronblihtt AR, Munro BS und F.E. Baralle, Nucl. Acids Res., 11: 2827-2837, 1 983) wurde mittels des als Polymerase- Kettenreaktion bekannten Amplifikationsverfahrens (polymerase chain reaction; PCR; Saiki R.K., Gelfand D.H., Stoffel S., Scharf S., Higuchi R. und Horn G.T., Science 239: 487-491, 1988) mittels zweier synthetischer Oligonukleotide mit den Sequenzen
  • 5'-CTGAGGCAAGAGATGAGCAA-3'(5'-Ende bei 1792) und
  • 5'-CTCAGGAAGCTGACCTTGAA-3' (5'-Ende bei 2240)
  • als Primer für die enzymatische Reaktion an genomischer Apo AI-M-DNA hergestellt, die von einem Träger gewonnen worden war.
  • c) Dieses Fragment wurde mit XhoII und StuI verdaut und das entstandene Produkt mit den HindIII/XhoII- und StuI/BamHI-Fragmenten von pUC/AF- Al in einen BamHI/HindIII-linearisierten pUC8-Vektor ligiert.
  • Der so erhaltene Klon wurde pUC/AI-M genannt.
    • Plasmidkonstruktion
  • Für humanes Apo AI und Apo AI-M kodierende Gene wurden mit DNA- Fragmenten kombiniert, die für den TPI-Promotor (TPIp; T. Alber und G. Kawasaki, J. Mol. Applied Genet. I: 419-434, 1982), die MFα1-Leadersequenz (J. Kurkian und I. Herskowitz, Cell 30: 933-943, 1982) und die TPI- Transkriptionsterminationssequenz des S.cerevisiae TPIt kodieren.
  • Diese DNA-Fragmente liefern Sequenzen, die eine hohe Transkriptionsrate bezüglich des für Apo AI kodierenden Gens gewährleisten und darüber hinaus eine Pre-Sequenz bereitstellen, die die Lokalisierung von Apo AI- und Apo AI-M- Polypeptiden im sekretorischen Stoffwechselweg und ihre eventuelle Exkretion in das Nährmedium bewirken.
  • Die Expressionsplasmide umfassen ferner den Replikationsursprung (origin of replication) 2u der Hefe und den Selektionsmarker LEU2.
  • Während der Reifung von α-Faktor in Hefe in vivo werden die letzten (C- terminalen) 6 Aminosäuren des MFα1-Leaderpeptids (Lys-Arg-Glu-Ala-Glu-Ala) vom α-Faktor Precursormolekül durch die aufeinander folgende Einwirkung einer Endopeptidase, die die Sequenz Lys-Arg erkennt, und einer Aminodipeptidase, die die Glu-Ala-Reste entfernt, abgetrennt (Julius D., Blair L., Brake A., Sprangue G. und Thorner J., Cell 32: 839-852, 1983). Um die Notwendigkeit für die Aminodipeptidase der Hefe zu eliminieren, wurde die Sequenz mittels in vitro-Mutagenese entfernt, die für die C-terminalen Aminosäuren Glu-Ala-Glu-Ala des MFα1-Leaderpeptids kodiert.
  • Die HindIII/BamHI-Fragmente von pUC/AF-AI und pUC/AF-AI-M wurden, wie in Abb. 4 gezeigt, in HindIII/BamHI-linearisierte pYES-Vektoren kloniert. Die entstandenen Plasmide zur Transformation von Hefezellen und Expression von Apo AI- und Apo AI-M-Genen wurden mit pYES/Al bzw. pYES/AI-M bezeichnet.
    • Transformation
  • Nach vorstehend beschriebenen Verfahren hergestellte Plasmide wurden in S.cerevisiae-Stämme mit Deletionen im TPI-Gen transformiert. Es folgte Selektion auf Wachstum auf Glucose. Solche Stämme sind normalerweise nicht in der Lage, mit Glucose als einziger Kohlenstoffquelle zu wachsen, und wachsen sehr langsam in Galactose-Lactat-Medium. Dieser Defekt beruht auf einer Mutation im Triosephosphatisomerasegen, die durch Deletion und Ersetzen eines großen Teils dieses Gens durch das S.cerevisiae-LEU2-Gen erhalten wurde. Aufgrund dieser Wachstumsdefizienz ergibt sich eine starke Selektion auf ein Plasmid, das ein für TPI kodierendes Gen enthält.
    • Expression der Apo AI- und Apo AI-M- Precursormoleküle in Hefe
  • Die Hefestämme, die für Apolipoproteine kodierende Plasmide enthielten, wurden in YPD-Medium kultiviert (Sherman, F. et al., Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory 1981). Von jedem Stamm wurden jeweils zwei Kulturen zu 1 Liter in jeweils einer 2-Liter-Flasche mit Schikane bei 30ºC geschüttelt, bis die Kulturen eine OD600nm von etwa 15 erreichten (ungefähr nach 48 Stunden). Nach Zentrifugation wurde der Überstand zur vveiteren Analyse abgenommen.
    • Reinigung von Apo AI- und Apo AI-M-Kulturmedium
  • Das Kulturmedium wurde für 30 Min. bei 15.000 U/min zentrifugiert und der Überstand gegen 0,15M NaCl/0,05 M Kaliumphosphatpuffer/0,05% EDTA, pH 7,4 (Puffer A) dialysiert. Aus technischen Phospholipid/Triglycerid-Emulsionen wurden durch Ultrazentrifugation und Waschen bei 4ºC (ultracentrifugal washing at 4ºC) Triglycerid-reiche Partikel (TGRP) gewonnen und in Puffer A resuspendiert. Der Überstand des Kulturmediums wurde unter leichtem Schütteln für 60 min bei 37ºC mit TGRP inkubiert und die Inkubation durch Eintauchen in ein Eiswasserbad beendet. TGRP wurden erneut durch Ultrazentrifugation bei 40ºC für 35 min bei 27.000 U/min isoliert und die Lipide mittels Diethylether/Ethanol im Verhältnis 3:1 entfernt. Das präzipitierte Protein wurde durch Zentrifugation bei niedriger Geschwindigkeit abgetrennt und über eine Sephacryl S-200-Säule und/oder eine anti-Apo AI-Sepharosesäule gegeben.
    • Strukturelle Charakterisierung des rekombinanten Apolipoproteins
  • Die strukturellen Merkmale des rekombinanten Apo AI und Apo AI-M wurden durch Aminosäureanalyse und Proteinmikrosequenzierung untersucht, wobei die Reinheit der Apolipoproteinpräparationen bestätigt wurde. Die Sekundärstruktur wurde mittels Zirkulardichroismus analysiert, wobei eine korrekte Faltung des rekombinanten Apolipoproteins angezeigt wurde. Bezüglich des α-Helix-Gehalts wurden 52% bzw. 43% für rekombinantes Apo AI und Apo AI-M berechnet, während ein Gehalt von 49% für extrahiertes Apo AI gefunden wurde. Somit hat rekombinantes AI-M, wie extrahiertes AI-M (Franceschini et al., J. Biol. Chem., 260: 16321-16325, 1985), im Vergleich zu normalem Al einen niedrigeren α-Helix-Gehalt.
    • Bestimmung der biologischen Wirkung von rekombinantem Apo AI-M vs. Apo AI
  • Alle hier aufgeführten Experimente wurden durch Vergleich von Apo AI und Apo AI-M aus S.cerevisiae mit menschlichem Apo AI durchgeführt, das aus Plasma extrahiert worden war. Menschliches Apo AI wurde aus menschlichem HDL gewonnen, das durch präparative Ultrazentrifugation aufgereinigt worden war. Nach Entfernung der Lipide aus der abgetrennten HDL-Fraktion wurde Apo AI durch Gelfiltration und lonenaustauschchromatographie isoliert (Baker et al., Biochemistry, 12: 3866-3871, 1983).
    • In vitro-Studien Aktivierung der Fibrinolyse
  • Agentien, die die Umwandlung von Plasminogen in Plasmin fördern und auf diese Weise die Fibrinolyse initiieren, gewinnen mehr und mehr Interesse für die Behandlung bei Herzmuskelinfarkt (Laffell und Braunwald, N. Engl. J. Med., 311: 710-717, 1984). Frühere Daten haben gezeigt, daß Apo AI die Fibrinolyse inn vitro aktivieren kann (Saku et al., Thromb. Res., 39:1-8, 1985).
  • Die Experimente zur Bestimmung der Erhöhung oder Inhibition der Urokinaseaktivität wurden nach dem Fibrinplatten-Verfahren (fibrin plate method; Glas-Greenwalt et al., J. Lab. Clin. Med., 104: 962-976, 1984) durchgeführt.
  • Eine Lösung von Rinderfibrinogen (plasminogenreich) in einer Endkonzentration von 0,1% in einem Volumen von 6 ml wurde mit 0,2 ml einer Lösung von Rinderthrombin (20 NIH units/ml) koaguliert. Rekombinantes Apo AI und Apo AI- M (Konzentrationen zwischen 10 und 500 u/g) verdünnt in Trispuffer wurden schnell mit Urokinase (f.c. 3,3 CAT U/ml) gemischt und auf die Fibrinplatten aufgetragen. Diese wurden dann für 17 Stunden bei 37ºC inkubiert. Die Messung der Größe des lysierten Bereichs zeigte, daß beide Proteine bei den höchsten Versuchsdosen, die Größe des durch Urokinase lysierten Bereichs signifikant erhöhten, nämlich um 64,0% bzw. 67,9% im Falle von Apo AI (vs. 59,7% und 66,2% im Falle von extrahiertem Apo AI; Saku et al., Thromb. Res., 39:1-8, 1985) und um 96,7% bzw. 112,1% im Falle von Apo AI-M (Tabelle 1). In diesem System scheint Apo AI-M folglich deutlich wirksamer zu sein als Apo Al.
    • Freisetzung von Cholesterin aus kultivierten Makrophagen
  • Es wird angenommen, daß der sogenannte "reverse Cholesterintransport" (RCT), d.h. der Transport von Cholesterin aus dem Gewebe in das Plasma, durch HDL reguliert wird, das als Akzeptorlipoprotein fungiert (Glomset J., Adv. Int. Med., 25: 91-116, 1980). Da man annimmt, daß Apo AI für die Fähigkeit von HDL verantwortlich ist, Cholesterin abzutransportieren, wurden Experimente mit J- 774 Mausmakrophagen durchgeführt, die mit 3H-Cholesterin äquilibriert worden waren. Die Monolayer wurden mit "minimum essential medium", Lösungsmittelextrahiertem und von Lipiden befreitem Kalbsserumprotein, Ei-Phosphatidylcholin (egg PC) und verestertem Cholesterin (Rothblat et al., In vitro, 12: 554-557, 1976) inkubiert. Äquilibrierung mit ³H-Cholesterin erfolgte für 48 Stunden Danach wurde das radioaktive Medium entfernt, die Zellen ausgiebig gewaschen und mit frischem Medium versehen, das mit 5 mg/ml von Lipiden befreitem Kalbsserumprotein angereichert worden war. Nach Inkubation über Nacht wurden die Zellen erneut ausgiebig gewaschen und mit HEPES-gepuffertem Williams-Medium E unter Zugabe von 2 ml von jedem der Akzeptorpartikeln in 35 mm Flachschalen inkubiert. Aliquots von 0,1 ml des Inkubationsmediums wurden über einen Gesamtzeitraum von 24 Stunden abgenommen, in den ersten 6 Stunden jeweils alle 90 Minuten und dann alle drei Stunden, und dann zur Bestimmung der Menge an markiertem Cholesterin, das von den Zellen freigesetzt wurde, gezählt (Rothblat und Phillips, J. Biol. Chem., 250: 4775- 4782, 1982).
  • Proteoliposomen mit rekombinantem Apo AI oder Apo AI-M wurden nach dem Cholatdialyseverfahren mit Ei-PC hergestellt, wie bei Mats und Jonas beschrieben (J. Biol. Chem., 257: 4535-4540, 1982). Die Gemische bestanden im allgemeinen aus Apolipoprotein/Phospholipid/Cholat (Massenverhältnis von 1/2,5/1,5-2,5) in 10 mM Tris/1 mM EDTA/1 mM NaN&sub3;/1 50mM NaCl, pH 8,0. Zur Einstellung der Partikelgröße der Apolipoprotein/Phospholipidpartikel wurde eine Gelfiltration an Sepharose CL/4B (1,5 x 80 cm-Säule) und Elution mit 0,15 M NaCl/0,02% EDTA, pH 7 durchgeführt. Die Peak-Fraktionen wurden in Ultrafiltrationskammern (Amicon Modell 52) konzentriert. Mittels Bestimmung der chemischen Zusammensetzung und der molekular-mikroskopischen Eigenschaften (molecular microscopic features) der Partikel, die Apo AI oder Apo AI-M enthielten, konnten keine signifikanten Unterschiede gefunden werden. Um die Fähigkeit zu bestimmen, zellgebundenes Cholesterin zu entfernen, wurden zwei verschiedene Konzentrationen der Apolipoproteinkomponente (50 und 100 ug/ml, d.h. Mengen, die Konzentrationen von PC/ml-Medium von 150 und 300 ug entsprechen) zu den Zellen gegeben. Da unter diesen experimentellen Bedingungen der unidirektionale Fluß von Cholesterin in bezug auf die von den Zellen freigesetzten Cholesterinkonzentrationen einer Kinetik erster Ordnung folgt, ist es möglich, für die verschiedenen Bedingungen eine Halbwertszeit für die Cholesterinfreisetzung (t½) zu berechnen.
  • Wie in Tabelle 2 gezeigt, war bei beiden Konzentrationen von Apolipoprotein in den Liposomen die Freisetzung von freiem Cholesterin aus J-774 Zellen mit Apo AI-M deutlich schneller im Vergleich zu Apo AI. Wiederum konnten keine Unterschiede zwischen rekombinantem und extrahiertem Apo AI gemessen werden (t½:17,9 ± 3,2).
    • In vivo-Studien zur Rückbildung arterieller Atherosklerose
  • Dieses Experiment diente zur Bestimmung der Fähigkeit von Dauerinfusionen mit extrahiertem Apo AI und rekombinantem Apo AI-M über einen Zeitraum von 4 Wochen, arterielle Läsionen zurückzubilden, die in Kaninchen durch Verabreichung von mit 0,5% Cholesterin angereicherter Nahrung über einen Zeitraum von 2 Monaten erzeugt worden waren. 25 männliche Neuseelandkaninchen (Anfangsgewicht 2,2-2,5 kg) erhielten für 2 Monate mit 0,5% Cholesterin angereicherte Nahrung. Zu diesem Zeitpunkt wurden vier Tiere getötet. Ihre Aorten wiesen 45,3 ± 7,6% Bildung atherosklerotischer Läsionen auf. Ab diesem Zeitpunkt wurden die Tiere in drei Gruppen zu je 7 Tieren aufgeteilt. Gruppe 1 wurde auf eine Cholesterin-freie Standardernährung ohne weitere Behandlung gesetzt. Gruppe 2 erhielt mittels einer subkutan implantierten Alzet -Minipumpe, die Verbindung zur Ohrvene hatte, Dauerinfusionen mit Apo AI. Gruppe 3 wurde in derselben Weise mit Apo AI-M behandelt. Die tägliche Gesamtdosis an Protein betrug 7 mg/Kaninchen für beide Apolipoproteine.
  • Nach 4 Wochen Behandlung wurden sowohl das Ausmaß der Fettläsionen der Aorta (aortic fatty lesions) als auch der Lipidgehalt der Aorta bei den 3 Gruppen ausgewertet. Die Daten (Tabelle 3) zeigen eine mehr als 30%ige Rückbildung der Läsionen mit Apo AI und eine mehr als 60%ige Rückbildung mit Apo AI-M und damit einhergehend eine hochsignifikante Reduktion des Gesamtgehalts an Cholesterin und Cholesterylestern der Aorta bei beiden Gruppen, wobei Apo AI- M im Vergleich zu normalem Apo AI deutlich wirksamer war.
  • Diese Ergebnisse bestätigen die bemerkenswerte Wirksamkeit von Apo AI unter ln vivo-Bedingungen (Badimon et al., Arteriosclerosis, 7: 522a, 1987) und zeigen, daß Apo AI-M, vermutlich aufgrund seiner physiko-chemischen Eigenschaften, bei der Induktion der Rückbildung von atherosklerotischen Läsionen im Vergleich zu normalem menschlichem Al wirksamer ist. Tabelle 1: Wirkung der Zugabe von Apo AI oder Apo AI-M auf die durch Urokinase aktivierte Fibrinolyse (X ± SD; n = 4 pro zugesetzter Dosis) Gesamtmenge zugesetztes Protein (ug) Größe des lysierten Bereichs (mm²) *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001 vs. Kontrolle .p < 0.05; ..p < 0.01; ...p < 0.001 vs. Apo AI Tabelle 2: Vergleich der Halbwertszeiten für die Cholesterinfreisetzung aus J-774-Zellen (X ± SD) Apo AI: Ei-PC Akzeptor Apo AI-M: Ei-PC Akzeptor Halbwertszeit (t ½ h) *p < 0.01 Ausmaß von Aortaläsionen und Gehalt an Cholesterylestern der Aorta bei Kaninchen nach Apo AI- und Apo AI-M-Infusionen (n = 7 pro Gruppe, X ± SD) % Aortaläsionen Cholesterin Cholesterylester Gruppe 1 (Kontrolle) Gruppe 2 (Apo AI) Gruppe 3 (Apo AI-M) ** p < 0,01 vs. Gruppe 1; ººp < 0,01 vs. Gruppe 2

Claims (7)

1. Expressionsvektor, der in der Lage ist, in transformierter Hefe Apolipoprotein AI oder Apolipoprotein AI-M (Milano) zu exprimieren, umfassend eine bezüglich der Hefe, die transformiert werden soll, autologe Promotorsequenz, eine DNA-Sequenz, die für Apo AI oder Apo AI-M kodiert, eine Sequenz, die für eine Leadersequenz kodiert, bei der es sich um die modifizierte MF&alpha;1 Leadersequenz handelt, die für die Aminosäurereste His Gly Ser Leu Asp Lys Arg kodiert, und eine bezüglich der Hefe, die transformiert werden soll, autologe Transkriptionsterminator-Sequenz.
2. Expressionsvektor nach Anspruch 1, der in der Lage ist, Apo AI oder Apo AI-M zu exprimieren und der von dem Plasmid pUC8 abgeleitet ist.
3. Expressionsvektor nach einem der vorstehenden Ansprüche, der ein Hind III/Nco I-Fragment der Sequenz
enthält, gefolgt in dieser Reihenfolge vom Nco I/Bam HI-Fragment der Apo AI cDNA oder vom Xho II/Stu I-Fragment der Apo AI-M cDNA, der TPI-Transkriptionsterminations-Sequenz von S.cerevisiae TPIt, dem Hind III/Bam HI-Fragment von pUC8, das das Ampicillin-Resistenzgen enthält, den LEU2-Marker des 2u-Plasmids von S. cerevisiae, den TPI-Promotor und die MF&alpha;I-Leadersequenz.
4. Synthetische DNA, die für die Aminosäurereste His Gly Ser Leu Asp Lys Arg Asp Glu Pro Pro Gln Ser Pro Trp kodiert und die folgende Sequenz hat:
5. Hefewirtszelle, die mit dem Expressionsvektor nach den Ansprüchen 1 bis 4 transformiert wurden.
6. Hefewirtszelle nach Anspruch 5, bei der es sich um einen Stamm von Saccharomyces cerevisiae handelt.
7. Verfahren zur Herstellung von rekombinantem Apolipoprotein AI oder Apolipoprotein AI-M, umfassend die Kultivierung einer Hefewirtszelle nach Anspruch 5 und die Isolierung des gewünschten Apolipoproteins aus der Kulturflüssigkeit.
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