JP2004339229A - ヒト・アポリポ蛋白質ａｉおよびａｉ−ミラノを含有する医薬組成物 - Google Patents

ヒト・アポリポ蛋白質ａｉおよびａｉ−ミラノを含有する医薬組成物 Download PDF

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Abstract

【課題】 アポリポ蛋白質ＡＩおよびアポリポ蛋白質ＡＩ−ミラノ（Milano）（Ａｐｏ ＡＩおよびＡｐｏ ＡＩ-Ｍ）を酵母内で生産する方法、その生産方法により得られるＡｐｏ ＡＩおよびＡｐｏ ＡＩ-Ｍ、ならびにそれらを有効成分として含有してなるアテローム性動脈硬化症および心血管疾患治療用の医薬組成物を提供する。
【解決手段】 （１）ある種の形質転換酵母でＡｐｏ ＡＩおよびＡｐｏ ＡＩ−Ｍを発現できる発現ベクター、
（２）プラスミドｐＵＣ８に由来する（１）の発現ベクター、または
（３）プラスミドｐＹＥＳ／ＡＩおよびｐＹＥＳ／ＡＩ−Ｍよりなる（１）または（２）のベクター；
のいずれかの発現ベクターで形質転換した宿主酵母を培養することを特徴とする生産方法によって得られた蛋白質、および医薬上許容される担体を含有する医薬組成物。
【選択図】 なし

Description

本発明は、アポリポ蛋白質ＡＩおよびアポリポ蛋白質ＡＩ−ミラノ（Milano）（Ａｐｏ ＡＩおよびＡｐｏ ＡＩ-Ｍ）を酵母内で生産する方法、その生産方法により得られるＡｐｏ ＡＩおよびＡｐｏ ＡＩ-Ｍ、ならびにそれらを有効成分として含有してなるアテローム性動脈硬化症および心血管疾患用の医薬組成物に関する。
高濃度の血清コレステロールと冠心臓疾患（ＣＨＤ）の発生との間の明確な関係は、疫学的かつある期間にわたる研究に基づき、繰り返し確認されてきた。しかして、血漿中コレステロールの輸送の複雑な機構の明確化により、ＣＨＤの危険性を決定するにおいて、循環リポ蛋白質の選択的機能を認識せしめた。
事実、４種の循環リポ蛋白：キロミクロン（ＣＭ）、超低密度（ＶＬＤＬ）、低密度（ＬＤＬ）および高密度（ＨＤＬ）リポ蛋白質がある。これらのうち、ＣＭは腸管脂肪吸収の短寿命産物を構成する一方、ＶＬＤＬおよび特にＬＤＬはコレステロールの組織への、また動脈壁への輸送を担っている。対照的に、ＨＤＬはコレステロールの末梢組織からの除去に直接関係しており、「逆コレステロール輸送」（ＲＣＴ）として公知の機構によって、それを肝臓または他のリポ蛋白質いずれかに戻す。
ＨＤＬの「保護的」役割は多数の研究で確認されてきた［ミラーら（Miller et al）、ランセット（Lancet），ｉ：９６５−９６８，１９７７；ワイネら（Whayne et al），アテロスクレロシス（Atherosclerosis） ３９：４１１−４１９，１９８１］。これらにおいて、高濃度のＬＤＬ、それよりは低い濃度のＶＬＤＬは心血管の危険性の増大に明らかに関係しているようである。
ＨＤＬの保護的機構の研究のうち最近興味あるものは、アポリポ蛋白質ＡＩ（Apo AI）に、即ちＨＤＬの主要成分に焦点を当ててきた。事実、Ａｐｏ ＡＩの血漿中濃度はＣＨＤの危険および冠損傷の存在とは負の相関性を有する［マチエイコら（Maciejko et al）、ニュー・イングランド・ジャーナル・オブ・メディシン（N.Eng.J.Med.），３０９：３８５−３８９，１９８３；セドリス（Sedlis et al），サーキュレイション（Circulation），７３：９７８−９８４，１９８６］。
in vitro実験は、Ａｐｏ ＡＩとレシチンとの複合体が培養した動脈平滑筋細胞からの遊離コレステロールの流出を促進できることを示している［ステインら（Stein et al），ビオシミカ・エ・ビオフィジカ・アクタ（Biochem.Biophys. Acta.），３８０：１０６〜１１８，１９７５］。この機構により、ＨＤＬはこれらの細胞の増殖を低減化させることもできる［ヨシダら（Yoshida et al），エクスペリメンタル・アンド・モレキュラー・パソロジー（Exp.Mol.Pathol.），４１：２５８−２６６，１９８４］
より最近になって、実験動物中へのＨＤＬのＡｐｏ ＡＩの注入は重要な生化学的変化を起こし、また、アテローム性動脈硬化症損傷の程度および重症度を減少させることが示された。マチエイコおよびマオ（Maciejko and Mao）［アーテリオスクレロシス（Arteriosclerosis），２：４０７ａ，１９８２］、２の連続的研究におけるバディモンら（Badimon et al）［カルディオバスキュラー・ディジーズ（Cardiovascular Disease），１９８３，アブストラクト（Abs.） ８１；アーテリオスクレロシス（Arteriosclerosis），７：５２２ａ，１９８７］は、Ａｐｏ ＡＩまたはＨＤＬいずれかを注射することによって（ｄ＝１.０６３〜１.３２５ｇ／ｍｌ）、アテローム性動脈硬化症損傷におけるコレステロールエステル含有量を５８.４％だけ減少させつつ、コレステロール供与ウサギにおける該損傷の程度を著しく減少させることができる（−４５％）ことを明瞭に示した。また、ＨＤＬの注入は、動脈損傷を早々に生じる遺伝性高コレステロール血症をもつワタナベ（Watanabe）・ウサギの血漿リポ蛋白質組成を顕著に変化させることができるのが示され得た。これらにおいて、ＨＤＬ注入は保護的ＨＤＬおよびアテローム成形性ＬＤＬの間の比を２倍以上とできる。
さらに、動物モデルにおいて動脈疾患を改善するＨＤＬの可能性は、Ａｐｏ ＡＩはかなりのフィブリン溶解活性を呈し得るという観察によってさらに刺激された［サクら（Saku et al），トロンボウシス・リサーチズ（Thromb. Res.），３９：１−８，１９８５］。ロッネンベルゲル（Ronneberger）［（第１０回国際薬理学会議議事録、シドニー，１９８７，９９０頁］は、抽出Ａｐｏ ＡＩはビーグル犬およびマカクザルにおいてフィブリン溶解をかなり増大させることができるのを明瞭に示した。同様の活性はin vitroにてヒト血漿で観察できる。本著者はＡｐｏ ＡＩ処理動物における脂質の沈積および動脈斑形成の減少を確認できた。
血漿Ａｐｏ ＡＩは２４３個のアミノ酸の単一ポリペプチド鎖であり、その一次配列は公知である[ブリューワーら（Brewer et al），バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミューニケイションズ（Biochem.Biophys. Res.Commun.），８０：６２３−６３０，１９７８］。Ａｐｏ ＡＩは細胞中で２６７個のアミノ酸前前駆体として合成される。このプレプロアポリポ蛋白質はまず１８個のＮ−末端残基を細胞内で失い；さらに６個のアミノ酸の喪失が、特異的プロテアーゼの活性によって、血漿および／またはリンパ液中で起こる。
Ａｐｏ ＡＩ分子の主要な構造上の特徴は１１個または２２個のアミノ酸の繰返単位の存在であると信じられ、両親媒性ヘリックス立体配座で存在すると推定されている［セグレストら（Segrest et al），FEBS Lett.，３８：２４７−２５３，１９７４］。この構造により、Ａｐｏ ＡＩの主要な生物学的活性、すなわち脂質結合およびレシチンコレステロールアシルトランスフェラーゼ（LCAT）の活性化が可能となる。ＨＤＬの他の機能、すなわち細胞との相互作用およびこれらからのコレステロールの除去はアポリポ蛋白質の明確な特徴とは関連がない。
アポリポ蛋白質ＡＩ−ミラノ（Ａｐｏ ＡＩ−Ｍ）はヒトＡｐｏ ＡＩの最初に記載された分子変種である［フランチェシニら（Francedshini et al）、ジャーナル・オブ・クリニカル・インベスティゲイション（J.Clin.Invest.），６６：８９２−９００，１９８０］。それはＡｒｇ１７３のＣｙｓでの置換によって特徴付けられる［バァイスグラベールら（Weisgraber et al），ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（J.Biol.Chem.），２５８：２５０８−２５１３，１９８３］。突然変異体アポ蛋白質は常染色体優勢特性として伝達され、８世代のキャリアーが同定されている［グアランドリら（Gualandri et al），アメリカン・ジャーナル・オブ・ヒューマン・ジェネティクス（Am.J.Hum.Genet.），３７：１０８３−１０９７，１９８４］。
Ａｐｏ ＡＩ−Ｍのキャリアー状態はＨＤＬ−コレステロールの顕著な減少によって特徴付けられる。これにも拘わらず、患者は動脈疾患の危険の増大を示さないようであり、事実、系統樹の実験によると、これらの患者はアテローム性動脈硬化症から「保護」されているようである。
キャリアーにおけるＡｐｏ ＡＩ−Ｍの可能な保護効果の機構は、あるα−ヘリックスを喪失しかつ疎水性残基の暴露が増大した、突然変異体アポリポ蛋白質の構造中の修飾のためらしい［フランチェシニら（Franceschini et al）、ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（J.Biol,Chem.），２６０：１６３２−１６３５，１９８５]。多重α−ヘリックスの緻密な構造の喪失は、通常のＡＩと比較して、分子の柔軟性の増大をもたらし、これにより脂質とかなり容易に会合する。さらに、アポリポ蛋白質／脂質複合体はより変性し易く、かくして、脂質の伝達もまた当該突然変異体の場合には改善されることが示唆される。
Ａｐｏ ＡＩ−Ｍのもう１つの非常に特別な特徴は、両方の場合において、Ｃｙｓ残基の存在のため、それ自身でダイマーを形成し、Ａｐｏ ＡIIと複合体を形成するその能力である。ダイマーおよび複合体の循環系における存在は、おそらくキャリアーにおけるこれらの排泄半減期の遅延の原因となるものであり、最近臨床的研究で記載されている［グレッグら（Gregg et al），ヒト・アポリポ蛋白質突然変異体についてのＮＡＴＯ ＡＲＷ：表現型発現に対する遺伝子構造から（NATO ARW on Human Apolipoprotein Mutants:From Gene Structure to Phenotypic Expression），リモネン・エス・ジィ（Limone S.G.），１９８８］。修飾されたアポリポ蛋白質粒子はかくして循環系に非常に長時間残存し、かくして、通常のＡＩ粒子に比し、良好なその動脈保護活性を呈する。
アポリポ蛋白質およびそのＡＩ−Ｍ突然変異体の治療への使用は、該アポリポ蛋白質を十分量かつ適当な剤型で調製できる方法がないため限定されている。
血漿分別物からアポリポ蛋白質ＡＩおよび特にＡＩミラノ（ＡＩ−Ｍ）を生産する困難はかなりのものである［フランチェシニら（Franceschini et al）、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（J.Biol.Chem.），２６０：１６３２１−１６３２５，１９８５］。さらに、回避するのが必須である感染病原での汚染および出発物質の入手可能性のごとく、血漿分別産物に伴う一連の危険がある。
ＤＮＡ組換え技術よりヒトＡｐｏ ＡＩを産生しようとするいくつかの試みがなされてきた。欧州特許出願公開０２６７７０３号には、イー・コリ（E.coli）からのＡｐｏ ＡＩの調製が記載されている。該プロセスはキメラポリペプチドを記載しており、そこでは、該Ａｐｏ ＡＩ部位がベータガラクトシダーゼのＮ−末端アミノ酸残基、蛋白質Ａの１またはそれ以上のＩｇＧ結合ドメイン、またはヒトＡｐｏ ＡＩのｐｒｏ配列に結合している。
前記方法は、イー・コリ（E.coli）は形質転換生物として用いられているという事実により欠点がある。発現された産物は成熟ヒトＡｐｏ ＡＩではなく、異種起源の実質的配列を含む。さらに、産物は細胞から分泌されず、イー・コリ（E.coli）宿主生物の細胞内に蓄積し、かくして、発現産物の酵素的分解の危険性が高まる。
哺乳動物ポリペプチドの発現についてのより便利な系は真核生物細胞らしく、真核生物、特に酵母で外来性遺伝子を発現させようとするいつくかの試みがなされている。インターフェロンの酵母での発現は欧州特許出願公開００６００５７号に記載されており、酵母には異種の蛋白質の酵母での発現および分泌は欧州特許出願公開００８８６３２、０１１６２０１および０１２３５４４号に記載されている。
本発明の目的は、正確な折りたたみ構造と天然のヒト・アポＡＩの性質、すなわち、構造的特徴、脂質結合性、ならびにフィブリン溶解およびレシチン：コレステロールアシルトランスフェラーゼ（ＬＣＡＴ）の活性化［マーレイ（Mahley）ら、ジャーナル・オブ・リピッド・リサーチ（J.Lipid.Res.）、２５巻、１２７７〜１２９４頁、１９８４年］を有し、酵母内において高収率で生成されるアポＡＩおよびアポＡＩ-Ｍを含むアテローム性動脈硬化症および心血管疾患治療用の医薬組成物を提供することにある。
本発明では、Ａｐｏ ＡＩおよびＡｐｏ ＡＩ-Ｍをコードする遺伝子に、成熟タンパクについての遺伝子の上流側に融合させた酵母が認識可能な分泌およびプロセッシングシグナルをコードするＤＮＡ配列を設けた。特に、最後の残基がHis Gly Ser Leu Asp Lys Arg（配列番号：１）である修飾ＭＦα１リーダー配列を用いた。
この修飾ＭＦα１リーダーにおいて、プロセッシングシグナルは二塩基配列Ｌｙｓ-Ａｒｇであったが、この配列を次いでＡｐｏ ＡＩ遺伝子の５'末端に融合する。リーダー配列がすべての構築物において切断される、即ち、すべてのＡｐｏ ＡＩおよびＡｐｏ ＡＩ-Ｍポリペプチドの上流側にある二塩基配列Ｌｙｓ-Ａｒｇで切断が起こることが判明した。
本発明により、Ａｐｏ ＡＩおよびＡｐｏ ＡＩ-Ｍを酵母内で生産する方法、その生産方法により得られＡｐｏ ＡＩおよびＡｐｏ ＡＩ-Ｍ、ならびにそれらを有効成分として含有してなるアテローム性動脈硬化症および心血管疾患治療用の医薬組成物が提供される。
本明細書には、Ａｐｏ ＡＩおよびＡｐｏ ＡＩ-Ｍを酵母内で生産する方法を記載する。この方法によれば、Ａｐｏ ＡＩおよびＡｐｏ ＡＩ-ＭタンパクをコードするＤＮＡ配列よりなる発現ベクターで形質転換された酵母株が適切な培地中で培養され、この培地からＡｐｏ ＡＩおよびＡｐｏ ＡＩ-Ｍ分子が回収される。
かかる形質転換酵母株を培養すると、高収率のＡｐｏ ＡＩおよびＡｐｏ ＡＩ-Ｍが培養ブロスから単離される。
発現産物を単離し、Ａｐｏ ＡＩ免疫応答物質を精製し、微少配列分析法により特徴付けを行った。このポリペプチドは天然Ａｐｏ ＡＩと同じ特性を有することが判明した。
本発明における発現ベクターは、酵母宿主内で安定に維持するための複製系と、Ａｐｏ ＡＩまたはＡｐｏ ＡＩ-ＭをコードするＤＮＡ配列と、プロモーターおよびターミネーター配列よりなる。
発現ベクターは、所望の産物をコードするＤＮＡ配列の上流側に、発現産物を酵母の分泌経路へ向かわせ、この発現産物を増殖培地中に分泌することを確実にするプレ領域を含んでいてもよい。このプレ領域は、天然に存在するシグナルまたはリーダーペプチドあるいは分泌を与える合成配列でありうるが、一般的には、分泌の間に所望の産物から切断され、成熟産物を培養ブロスから単離されるよう準備できた状態とする。
酵母に良く適合するリーダー配列は酵母ＭＦα１リーダー配列である［クルジャン・ジェイ（Kurjan,j.）およびヘルスコビッツ・アイ（Herskowits,I.）、セル（Cell）、３０巻、９３３〜９４６頁、１９８２年］。
発現ベクターは、宿主微生物内で複製し得るまたは宿主染色体内に組み込まれ得るプラスミドであってもよい。使用するベクターは、各々が選択的な切断部位により分離される、所望ＤＮＡ配列の反復コピーの発現をコードし得るものでよい。
所望ＤＮＡ配列の発現は、宿主生物内において所望産物の発現をもたらすように、所望産物をコードするＤＮＡ配列に対して正確に位置付けられているプロモーター配列の制御下にある。好ましくは、酵母宿主に固有の遺伝子に由来するプロモーター、例えばＴＰＩ（トリオーゼホスフェートイソメラーゼ）遺伝子のプロモーターまたはＭＦα１-プロモーターが用いられる。
所望産物についてのＤＮＡ配列には、転写ターミネーター配列、好ましくは酵母宿主に固有の遺伝子に由来するターミネーター配列、例えばＴＰＩ遺伝子またはＭＦα１遺伝子のターミネーターが続く。
本明細書では、以前にクローン化されたＡｐｏ ＡＩおよびＡｐｏ ＡＩ-Ｍ配列［シャープ・シー・アール（Sharpe CR）、シドリ・エイ（Sidoli A）、シェリー・シー・エス（Shelley CS）、ルセロ・エム・エイ（Lucero MA）、ショルダース・シー・シー（ShouldersCC）およびバラル・エフ・イー（Baralle FE）、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Nucl.Acids Res.）、１２巻、３９１７〜３９３２頁、（１９８４年）］を、Ａｐｏ ＡＩの唯一のＮｃｏＩ部位にクローン化された４６ヌクレオチドの化学的に合成されたアダプターを用いて酵母での分泌向きにする操作についても述べる。
Ａｐｏ ＡＩ-Ｍ突然変異は、キャリアー由来の突然変異Ａｐｏ ＡＩ-Ｍ遺伝子を部分的にクローン化し、その一部を野性型配列に置き換えることにより生じさせた。
Ａｐｏ ＡＩおよびＡｐｏ ＡＩ-Ｍ配列の構築
Ａｐｏ ＡＩ配列は我々が以前に述べたｃＤＮＡクローン［シャープ（Sharpe）ら、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Nucl.Acids Res.）、１９８４年］から得たが、このクローンから、以下の戦略を用いて、シグナルペプチドおよびプロペプチドをコードする配列を取り出し、修飾した。
元のｃＤＮＡ配列（プラスミドｐＡＩＡ）由来のＮｃｏＩ-ＢａｍＨＩ断片を、ＭＦα１リーダー配列の末端部および成熟アポＡＩのアミノ末端配列を含む化学合成断片ＨｉｎｄIII−ＮｃｏＩ（図１）、およびＨｉｎｄIII-ＢａｍＨＩ消化ｐＵＣ８（図２を参照）で同時に結んだ。このクローンをｐＵＣ/ＡＦ-ＡＩと名付ける。
Ａｐｏ ＡＩ-Ｍ配列は、Ａｐｏ ＡＩ-Ｍキャリアー由来の遺伝子の一部をクローン化することにより得た。使用した方法は以下の通りであった：
ａ）標準的な方法［クンケル・エル・エム（Kunkel LM）、スミス・ケイ・ディー（Smith KD）、ボイヤー・エス・エイチ（Boyer SH）、ボルガオンカール・ディー・エス（Borgaonkar DS）、ウォッチェル・エス・エス（Watchel SS）、ミラー・ビー・ジェイ（Miller BJ）、ベルグ・ダブリュー・アール（Berg WR）、ジョーンズ・エイチ・ダブリュー（Jones HW）およびラリー・ジェイ・エム（Rary JM）、プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・オブ・ジ・ユナイテッド・ステイツ・オブ・アメリカ（Proc.Natl.Acad.Sci.USA）、１２４５〜１２４９頁、１９７７年］に従って、末梢血白血球細胞からＤＮＡを調製した。
ｂ）ヌクレオチド１７９２および２２４０間の断片（図３を参照）［ショルダース・シー・シー（Shoulders CC）、ロンブリット・エイ・アール（Kronblihtt AR）、ムンロー・ビー・エス（Munro BS）およびエフ・イー・バラル（F.E.Baralle）、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Nucl.Acids Res.）、１１巻、２８２７〜２８３７頁、１９８３年］を、キャリアーから調製されたＡｐｏ ＡＩ-ＭゲノムＤＮＡに関する酵素反応において、以下の配列：
５'-ＣＴＧＡＧＧＣＡＡＧＡＧＡＴＧＡＧＣＡＡ-３'；ヌクレオチド１７９２の５'末端部（配列番号：２）、
５'-ＣＴＣＡＧＧＡＡＧＣＴＧＡＣＣＴＴＧＡＡ-３'；ヌクレオチド２２４０の５'末端部（配列番号：３）
を有する２つの合成オリゴヌクレオチドをプライマーとして用いるポリメラーゼ鎖反応法［ＰＣＲ、サイキ・アール・ケイ（Saiki RK）、ゲルファンド・ディー・エイチ（Gelfand DH）、ストッフェル・エス（Stoffel S）、シャルフ・エス（Scharf S）、ヒグチ・アール（Higuchi R）およびホーン・ジー・ティー（Horn GT）、サイエンス（Science）、２３９巻、４８７〜４９１頁、１９８８年］として知られている増幅法により生成させた。
ｃ）この断片をＸｈｏIIおよびＳｔｕＩ消化に付し、得られた産物をｐＵＣ/ＡＦ-ＡＩ由来のＨｉｎｄIII-ＸｈｏIIおよびＳｔｕ Ｉ-ＢａｍＨＩ断片で結んで、ｐＵＣ-８ ＢａｍＨＩ-ＨｉｎｄIII線状化ベクターとした。
得られたクローンをｐＵＣ/ＡＩ-Ｍと名付ける。
プラスミドの構築
ヒト・Ａｐｏ ＡＩおよびＡｐｏ ＡＩ-Ｍをコードする遺伝子を、ＴＰＩプロモーター（ＴＰＩp）[ティー・アルバー（T.Alber）およびジー・カワサキ（G.Kawasaki）、ジャーナル・オブ・モレキュラー・アンド・アプライド・ジェネティックス（J.Mol.Applied Genet.）、Ｉ巻、４１９〜４３４頁、１９８２年］をコードする断片、ＭＦα１リーダー配列［ジェイ・クルキアン（J.Kurkian）およびアイ・ヘルスコビッツ（I.Herskowitz）、セル（Cell）、３０巻、９３３〜９４３頁、１９８２年]、およびエス・セレビシエ（S.cerevisiae）のＴＰＩに由来する転写終結配列ＴＰＩtと結合させた。
これらの断片は、Ａｐｏ ＡＩをコードする遺伝子の高い転写率を確実にする配列を提供し、また、Ａｐｏ ＡＩおよびＡｐｏ ＡＩ-Ｍポリペプチドの分泌経路への局在化およびその結果としての増殖培地への分泌を行うことができるプレ配列を提供する。
さらに、発現プラスミドは、酵母の２μ複製起点および選択可能なマーカーＬＥＵ２を有する。
酵母におけるα因子のin vivo成熟化の間に、ＭＦα１リーダーペプチドの最後（Ｃ末端）の６個のアミノ酸（Ｌｙｓ-Ａｒｇ-Ｇｌｕ-Ａｌａ-Ｇｌｕ-Ａｌａ（配列番号：４））が、Ｌｙｓ-Ａｒｇ配列を認識するエンドペプチダーゼおよびＧｌｕ-Ａｌａ残基を除去するアミノジペプチダーゼ［ジュリアス・ディー（Julius D）、ブレアー・エル（Blair L）、ブレイク・エイ（Brake A）、スプランギュー・ジー（Sprangue G）およびトーナー・ジェイ（Thorner J）、セル（Cell）、３２巻、８３９〜８５２頁、１９８３年］を引き続いて作用させることにより、α因子の前駆体から除去される。酵母アミノジペプチダーゼの必要性をなくすために、ＭＦα１リーダーのＣ末端Ｇｌｕ-Ａｌａ-Ｇｌｕ-Ａｌａ（配列番号：５）をコードする配列を、in vitro突然変異誘発法により除去した。
図４に示す如く、ｐＵＣ/ＡＦ-ＡＩおよびｐＵＣ/ＡＦ-ＡＩ-Ｍに由来するＨｉｎｄIII-ＢａｍＨＩ断片をＨｉｎｄIII-ＢａｍＨＩ線状化ｐＹＥＳベクターにクローン化した。酵母を形質転換し、Ａｐｏ ＡＩおよびＡｐｏ ＡＩ-Ｍ遺伝子を発現させるために得たプラスミドを各々ｐＹＥＳ/ＡＩおよびｐＹＥＳ/ＡＩ-Ｍと呼ぶ。
形質転換
前記のごとく調製したプラスミドを、グルコース上での増殖について選択することにより、ＴＰＩ遺伝子に欠失を有するエス・セレビシエ（S.cerevisiae）株に形質転換した。かかる株は、通常、単独炭素源としてのグルコース上では増殖できず、ガラクトースラクテート培地上では非常にゆっくり増殖する。この欠陥はトリオースホスフェートイソメラーゼ遺伝子の変異に起因し、この変異はこの遺伝子の主要部分の欠失およびエス・セレビシエ（S.cerevisiae）ＬＥＵ２遺伝子との置換により得られる。この増殖欠陥のため、ＴＰＩについてコードする遺伝子を含むプラスミドが厳密に選択される。
Ａｐｏ ＡＩおよびＡｐｏ ＡＩ-Ｍ前駆体の酵母での発現
アポリポ蛋白質についてコードするプラスミドを含む酵母株を、ＹＰＤ培地［シェルマン・エフ（Sherman,F.）ら、「酵母遺伝学における方法（Methods in Yeast Genetics）」、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリ（Cold Spring Harbor Laboratory）、１９８１年］上で増殖させた。各株に対して、２つの、それぞれ２リットルのバッフル付きフラスコ中、１リットル培養物を、６００ｎｍにおけるＯＤが約１５に達するまで（約４８時間）、３０℃にて振盪した。遠心分離した後、さらに分析するために、上清を取り出した。
Ａｐｏ ＡＩおよびＡｐｏ ＡＩ-Ｍ培養液の精製
培養液を１５,０００ｒｐｍで３０分間遠心分離し、上清を０.１５Ｍ ＮａＣｌ、０.０５Ｍ リン酸カリウム緩衝液、０.０５％ＥＤＴＡ、ｐＨ７.４（緩衝液Ａ）に対して透析した。
トリグリセリドに富む粒子（ＴＧＲＰ）を、４℃での超遠心分離洗浄により、市販のリン脂質-トリグリセリド乳化液から単離し、緩衝液Ａに再懸濁した。培養液からの上清をＴＧＲＰと共に、３７℃にて６０分間、穏やかに撹拌しながらインキュベートし、氷-水浴中に浸漬することにより、インキュベーションを停止した。２７,０００ｒｐｍ、３５分間、４０℃の超遠心分離により、ＴＧＲＰを再び単離し、ジエチルエーテル：エタノール３：１で脱脂質化した。沈澱した蛋白質を低速遠心分離により集め、セファクリル（Sephacryl）Ｓ-２００カラムおよび／または抗アポＡＩ-セファロース（Sepharose）カラムに通した。
組換えアポリポ蛋白質の構造的特徴付け
組換えＡｐｏ ＡＩおよびＡｐｏ ＡＩ-Ｍの構造的特徴は、アミノ酸分析法および蛋白質微少配列決定法により試験し、アポリポ蛋白質調製物の純度を確認した。二次構造は円偏光二色性により分析し、組換えアポリポ蛋白質が正確に折りたたまれていることが示された：α'ヘリックス含量は、抽出アポＡＩに対する４９％含量と同様に、組換えＡｐｏ ＡＩおよびＡｐｏ ＡＩ-Ｍについて、それぞれ５２％および４３％と計算された。かくして、組換えＡＩ-Ｍは、抽出Ａｐｏ ＡＩ［フランセスチーニ（Franceschini）ら、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリ（J.Biol.Chem.）、２６０巻、１６３２１〜１６３２５頁、１９８５年］と同様に、正常ＡＩに比べてαヘリックス含量が低い。
組換えＡｐｏ ＡＩ−Ｍ対Ａｐｏ ＡＩの生物学的評価
すべての実験報告は、エス・セレビシエ（S.cerevisiae）から得たＡｐｏ ＡＩおよびＡｐｏ ＡＩ−Ｍを、血漿から抽出したヒトＡｐｏ ＡＩと比較することにより行った。ヒトＡｐｏ ＡＩはヒトＨＤＬより調製し、分取用超遠心分離により分離した。単離したＨＤＬ画分の脱脂化後、Ａｐｏ ＡＩをゲル濾過およびイオン交換クロマトグラフィーにより分離した［ベーカー（Ｂaker）ら、バイオケミストリー（Ｂiochemistry），１２：３８６６−３８７１，１９８３］。
In vitro 実験
フィブリン溶解の活性化
プラスミノーゲンのプラスミンへの変換を促進する、すなわち、フィブリン溶解を開始させる試薬が、心筋梗塞の治療において増大する関心を獲得しつつある［ラッフェルおよびブラウンワルド（Laffell andBraunwald）、ニューイングランド・ジャーナル・オブ・メディスン（N.Engl.J.Med.）,３１１：７１０−７１７,１９８４]。以前のデータは、Ａｐｏ ＡＩがin vitro にてフィブリン溶解を活性化し得ることを示している［サク（Ｓaku）ら、トロンボシス・リサーチ（Ｔhromb.Ｒes.），３９：１−８，１９８５］。
ウロキナーゼ活性の増強または抑制を測定するために、実験は、フィブリン平板法により実施した［グラス−グリーンワルト（Ｇlas−Ｇreenwalt）ら、ジャーナル・オブ・ラボラトリー・アンド・クリニカル・メディスン（Ｊ.Ｌab.Ｃlin.Ｍed.），１０４：９６２−９７６，１９８４］。
６ｍｌ容量中、終濃度０.１％のウシ（プラスミノーゲンに富む）フィブリノゲン溶液を、ウシ・トロンビン溶液（２０ＮＩＨユニット／ｍｌ）０.２ｍｌで凝固させた。トリス緩衝液で希釈した組換えＡｐｏ ＡＩおよびＡｐｏ ＡＩ−Ｍ（１０および５００μ／ｇの間の濃度）を速やかにウロキナーゼ（ｆ.ｃ.３.３ＣＡＴ Ｕ／ｍｌ）と混合し、フィブリン平板に適用した。これらを３７℃にて１７時間インキュベートした。溶解領域の測定により、両蛋白質が、最高試験用量で、Ａｐｏ ＡＩの場合（抽出Ａｐｏ ＡＩでは、５９.７％と６６.２％であるのに対して；サクら、トロンボシス・リサーチ，３９：１−８，１９８５）、各々、６４.０％および６７.９％までの、Ａｐｏ ＡＩ−Ｍの場合、９６.７％および１１２.１％までのウロキナーゼ溶解領域を有意に増加させることが示された（表１）。従って、この系において、Ａｐｏ ＡＩ−ＭはＡｐｏ ＡＩよりも有意に優れているようである。
培養マクロファージからのコレステロールの除去
いわゆる、「逆コレステロール輸送」（ＲＣＴ）、すなわち、コレステロールの組織からの血漿への輸送は、受容体リポ蛋白質として作用するＨＤＬによって調節されると考えられている（グロムセット・ジェイ（Ｇlomset Ｊ.）、アドブ・イント・メド（Ａdv.Ｉnt.Ｍed.），２５：９１−１１６，１９８０）。Ａｐｏ ＡＩがＨＤＬの除去能の原因と考えられているので、実験は3Ｈ−コレステロールで平衡化したＪ−７７４マウス・マクロファージで実施した。単層を、「最小必須培地」、溶媒抽出脱脂子ウシ血清タンパク質、卵ホスファチジルコリン（ＰＣ）およびエステル化コレステロールと共にインキュベートした［ロスブラト（Ｒothblat）ら、イン・ビトロ（Ｉn vitro），１２：５５４−５５７，１９７６］。3Ｈコレステロールで４８時間平衡化させ、その後、放射能活性培地を除去し、細胞を十分に洗浄し、５ｍｇ／ｍｌの脱脂子ウシ血清タンパク質を補足した新鮮な培地を加えた。一夜インキュベートした後、該細胞を再度十分に洗浄し、３５ｍｍの平坦な皿中、各受容体粒子２ｍｌを加えた、ＨＥＰＥＳ−緩衝ウイリアムス培地Ｅ（Ｗilliams Ｍedium Ｅ）と共にインキュベートした。最初の６時間においては９０分毎に、次いで３時間毎に、合計２４時間の間、インキュベート培地０.１ｍｌ部を採取し、計数して細胞によって放出された標識コレステロール量を測定した［ロスブラトおよびフィリップス（ＲothblatおよびＰhillips）、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ.Ｂiol.Ｃhem.），２５０：４７７５−４７８２，１９８２］。
組換えＡｐｏ ＡＩまたはＡｐｏ ＡＩ−Ｍを含有するプロテオリポソームを、マットスおよびジョナス（ＭatsおよびＪonas）［ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー，２５７：４５３５−４５４０，１９８２］により記載されているごとく、コール酸塩（cholate）透析方法に従って、卵ＰＣで調製した。混合物は、一般に、１０ｍＭトリス／１ｍＭ ＥＤＴＡ／１ｍＭ ＮaＮ3／１５０ｍＭ ＮaＣｌ（pＨ８.０）中、アポリポ蛋白質／リン脂質／コール酸塩（質量比率１／２.５／１.５−２.５）よりなるものであった。アポリポ蛋白質／リン脂質粒子をサイズ分けするために、０.１５Ｍ ＮaＣｌ／０.０２％ＥＤＴＡ，pＨ７で溶出するセファロース（Ｓepharose）ＣＬ／４Ｂ（１.５×８０ｃｍカラム）上のゲル濾過を行った。ピーク画分を超濾過セル（アミコン・モデル５２
（Ａmicon model ５２）上にて濃縮した。Ａｐｏ ＡＩまたはＡｐｏ ＡＩ−Ｍ含有の粒子の化学組成および分子の顕微鏡特性を測定することによっては、有意な差異を見い出せなかった。細胞コレステロールの除去能を評価するために、２種の異なる濃度のアポリポ蛋白質成分（５０および１００μｇ／ｍｌ、すなわち、１５０および３００μｇのＰＣ／ｍｌ培地の濃度に相当する）を該細胞に加えた。これらの実験条件下、コレステロールの一方向性流動（flux）は無細胞コレステロール濃度に関して１次的であるため、種々の条件においてコレステロール流出（efflux）の半減期（ｔl/2）を算出することができる。
表２に示すごとく、アポリポ蛋白質のリポソーム中両濃度にて、Ｊ−７７４細胞からの遊離コレステロールの流出は、Ａｐｏ ＡＩに比較し、Ａｐｏ ＡＩ−Ｍではかなり速かった。再度、組換えおよび抽出Ａｐｏ ＡＩ（ｔl/2：１７.９±３.２）の間で差異を検出することはできなかった。
アテローム性動脈硬化症退行の in vivo 研究
本実験では、抽出Ａｐｏ ＡＩおよび組換えＡｐｏ ＡＩ−Ｍの４週間連続注入が、２カ月間の０.５％富コレステロール飼料で確立したウサギでの動脈障害を減少させる能力を評価した。２５匹のニュージランド系（Ｎew Ｚealand）雄のウサギ（初期体重２.２−２.５ｋｇ）に０.５％富コレステロール飼料を２カ月間与えた。この時点で４匹の動物を殺した。その大動脈は、４５.３±７.６％のアテローム性動脈硬化症障害を包含することを示した。この時点で、動物を各群７匹の３群に分けた。群１には無処理の標準無コレステロール飼料を与えた。群２には、耳の静脈に連結し、皮下注入するアルゼットR製のミニポンプ（ＡlzetR Ｍinipump）を用い、Ａｐｏ ＡＩを連続的に注入した。群３は、Ａｐｏ ＡＩ−Ｍで同様に処理した。合計日蛋白質用量は、２種のアポリポ蛋白質の各々につき７ｍｇ／ウサギであった。
処理の４週間後、大動脈の脂肪障害の程度および大動脈の脂質含量を共に３群で評価した。データ（表３）により、Ａｐｏ ＡＩで３０％以上の障害の退行、およびＡｐｏ ＡＩ−Ｍで６０％以上の退行が示され、これは両群における動脈コレステロールおよびコレステリルエステル合計の非常に有意な減少に対応し、Ａｐｏ ＡＩ−Ｍは通常のＡｐｏ ＡＩに比べてかなり効果的である。
報告した知見により、in vivo 条件［バジモン（Ｂadimon）ら、アーテリオスクレロシス（Ａrteriosclerosis），７：５２２ａ，１９８７］でＡｐｏ ＡＩの顕著な活性が確認され、恐らくはその物理化学特性のため、Ａｐｏ ＡＩ−Ｍが、通常のヒトＡＩに比し、アテローム性動脈硬化症障害の退行を誘発するのに効果的であることが示される。
Figure 2004339229
Figure 2004339229
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図１は、ＭＦα１リーダー配列末端部および成熟Ａｐｏ ＡＩアミノ末端配列を含む４６ヌクレオチド・アダプターの配列を示す配列図である。 図２は、ｐＵＣ８からのプラスミドｐＵＣ/ＡＦ-ＡＩの構築を示すための制限地図である。 図３は、図２のプラスミドから出発するｐＵＣ/ＡＦ-ＡＩ-Ｍの構築を示すための制限地図である。 図４は、ｐＹＥＳから、および図２と図３のプラスミドから出発する発現ベクターｐＹＥＳ/ＡＩおよびｐＹＥＳ/ＡＩ-Ｍの調製を示すための制限地図である。
配列番号１
<223> 人工配列の記載：修飾ＭＦα１リーダー配列残基
配列番号２
<223> 人工配列の記載：オリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３
<223> 人工配列の記載：オリゴヌクレオチドプライマー
配列番号４
<223> 人工配列の記載：ＭＦα１リーダーペプチド残基
配列番号５
<223> 人工配列の記載：ＭＦα１リーダーペプチド残基
配列番号６
<223> 人工配列の記載：発現ベクターフラグメント
配列番号７
<223> 人工配列の記載：配列番号：６の発現ベクターフラグメントに対応する合成アミノ酸配列

Claims (8)

  1. アポリポ蛋白質ＡＩ（Ａｐｏ ＡＩ）の生産方法であって、
    （１）形質転換すべき酵母の自己由来プロモーター配列、Ａｐｏ ＡＩをコードするＤＮＡ配列、His Gly Ser Leu Asp Lys Arg残基（配列番号：１）をコードする修飾されたＭＦα１リーダー配列であるリーダーをコードする配列、形質転換すべき酵母の自己由来転写ターミネーター配列よりなる、形質転換酵母でＡｐｏ ＡＩを発現できる発現ベクター、
    （２）プラスミドｐＵＣ８に由来するものである、Ａｐｏ ＡＩを発現できる（１）記載の発現ベクター、または
    （３）プラスミドｐＹＥＳ／ＡＩよりなる（１）または（２）記載のベクター；
    のいずれかの発現ベクターで形質転換した宿主酵母を培養することを特徴する該生産方法。
  2. 宿主酵母がサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）であることを特徴とする請求項１記載の生産方法。
  3. アポリポ蛋白質ＡＩ−ミラノ（Ａｐｏ ＡＩ−Ｍ）の生産方法であって、
    （１）形質転換すべき酵母の自己由来プロモーター配列、Ａｐｏ ＡＩ−ＭをコードするＤＮＡ配列、His Gly Ser Leu Asp Lys Arg残基（配列番号：１）をコードする修飾されたＭＦα１リーダー配列であるリーダーをコードする配列、形質転換すべき酵母の自己由来転写ターミネーター配列よりなる、形質転換酵母でＡｐｏ ＡＩ-Ｍを発現できる発現ベクター、
    （２）プラスミドｐＵＣ８に由来するものである、Ａｐｏ ＡＩ−Ｍを発現できる（１）記載の発現ベクター、または
    （３）プラスミドｐＹＥＳ／ＡＩ−Ｍよりなる（１）または（２）記載のベクター；
    のいずれかの発現ベクターで形質転換した宿主酵母を培養することを特徴する該生産方法。
  4. 宿主酵母がサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）であることを特徴とする請求項３記載の生産方法。
  5. 請求項１または２に記載の方法により得られたアポリポ蛋白質ＡＩ（Ａｐｏ ＡＩ）。
  6. 請求項３または４に記載の方法により得られたアポリポ蛋白質ＡＩ−ミラノ（Ａｐｏ ＡＩ−Ｍ）。
  7. 有効成分として請求項５記載のアポリポ蛋白質ＡＩ（Ａｐｏ ＡＩ）、および医薬上許容される担体を含む、それを必要とする患者におけるアテローム性動脈硬化症および心血管疾患を治療ための医薬組成物。
  8. 有効成分として請求項６記載のアポリポ蛋白質ＡＩ−ミラノ（Ａｐｏ ＡＩ−Ｍ）、および医薬上許容される担体を含む、それを必要とする患者におけるアテローム性動脈硬化症および心血管疾患を治療ための医薬組成物。
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