NO863029L - Farmasoeytisk doseringsenhet. - Google Patents

Description

Denne oppfinnelse vedrører fremstilling av en farmasøytisk formulering for parenteraladministrering og nærmere bestemt en farmasøytisk doseringsenhet for trombolytisk terapi.

Menneskelig vevsplasminogenaktivator (tPA) er et glykoprotein på ca. 70.000 dalton og 527 aminosyrer. Det utskilles av en rekke menneskevev og foreligger naturlig i serum. tPA virker i blodkoagullatlysing ved å overføre plasminogen til plasmin. tPA har en affinitet for og er mer aktiv i nærvær av fibrin. Således er tPA anvendelig ved behandling av forstyrrelser i forbindelse med trombidannelse så som dypvenet trombose, akutt myokardialt infarkt og lungeemboli. Se generelt: Rijken et al., Biochem. Biophys. Acta 580:140 (1979), Vetterlein et al., J. Biol. Chem. 254:575 (1979), Rijken et al., J. Biol. Chem. 256:7035 (1981) og Matsuo et al., Nature 291:590 (1981).

tPA overproduseres av visse cellelinjer innbefattet Bowes melanoma cellelinje. Se f.eks.: Wilson et al., Canc. Res.

40:933 (1980). Coilen et al., EP-A-41.766 som beskriver rensing av tPA som stammer fra Bowes melanoma. Wilson EP-A-113.319, beskriver fremstilling og rensing av tPA ved bruk av en serum-uavhengig Bowes melanoma cellelinje.

tPA kan også fremstilles ved rekombinante DNA-teknikker. Isolering av mRNA for tPA er beskrevet av f.eks. Opdenakker et

al., Eur. J. Biochem. 121:269 (1982). Isolering av cDNA for del av tPA er beskrevet av Edlund et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 8_0:349 (1983). Kloning av cDNA for tPA i E_^_ Coli er beskrevet av Pennica et al., Nature 301:214 (1983). Kloning av cDNA for tPA i E. Coli og i kinesiske hamster-eggstokkceller er beskrevet av Goeddel et al., EP-A-93,619 og av Levinson et al., EP-A-117.059.

Brouty-Boye, Bio Technology, Desember 1984, s. 1058 rapporterer produksjon av tPA av menneskelig embryoniske lungeceller.

Robinson, WO84-01786, beskriver et modifisert tPA som

mangler hele eller en del av karbohydratrestene som er tilstede i opprinnelig tPA.

tPA er ikke meget oppløselig i vandig løsning. Dets løselighet i vann ved pH 7,0 er ca. 0,1 mg/ml. Således oppløses tPA normalt med typiske solubiliseringsmidler under rensing. Disse innbefatter kaotropiske denatureringsmidler så som urea og tiocyanat, overflateaktive midler så som detergenser, karbohydrater så som

mannitol og proteiner så som albumin og gelatin. Selv om disse midler tydeligvis forbedrer vannløseligheten av tPA, har resulterende tPA løsninger tendens til å være mindre stabile og anses ikke som egnet for parenteral administrering, eller må anvendes i uakseptable store mengder.

Wilson, EP-A-113.319 foreslår tilsetning av et ikke-ionisk detergens for å forhindre adsorbsjon på beholderoverflater og å forbedre stabilitet. En illustrerende farmasøytisk blanding som er beskrevet av Wilson, inneholder 0,075 mg/ml tPA i 0,3 M natriumklorid og 0,01% "Tween" 80.

Goeddel et al., EP-A-93.619 beskriver at tPA kan formuleres ved standard teknikker og foreslår som et eksempel en glassflaske inneholdende 25.000 internasjonale enheter av tPA, 25 mg mannitol og 45 mg NaCl rekonstituert med 5 ml vann og blandet med 0,9% natriumklorid.

Coilen et al., EP-A-41.766 fastslår at tPA kan formuleres

ved standard-teknikker med eller uten additiver, så som natriumklorid, glukose, mannitol og albumin. En konstruktivt eksemplifisert farmasøytisk blanding inneholder tPA, 0,001% "Tween" 80 og 0,01-

1% albumin eller mannitol i fosfatbuffret saltvann.

Yoshizaki et al., EP-A-112.940 beskriver bruk av albumin som en stabilisator for tPA.

Murakami et al., EP-A-123.304 beskriver stabilisering av tPA ved tilsetning av gelatin.

Kruithof et al., Biochem, J. 226:631-636 (1985) beskriver et renseskjema for tPA produsert av serumuavhengige Bowes melanoma-celler som inneholdt trinnene sentrifugering av kondisjonert medium, tilsetning av "Tween" 80 og NaN3til supernatanten, justering av pH til 4,5 med 6 M HC1, passasje av løsningen gjennom en SP-"Sephadex"-kolonne og eluering av tPA med NaCl i en natriumacetatbuffer ved pH 4,5 (0,1 M natriumacetat, 0,25 M NaCl, 0,01% "Tween" 80, 0,05% NaN3). Eluatfraksjoner ble slått sammen, konsentrert til 0,93 mg/ml tPA (42.800 enheter/ml), ført over en kolonne av "Sephadex" G-100 i en natriumacetatbuffer (50 mM natriumacetat, 0,5 M NaCl, 0,01% "Tween" 80, 0,05% NaN3 , pH 4,5). Produktet ble konsentrert til 0,38 mg/ml tPA (35.000 enheter/ml)

og lagret ved -70°C.

American Diagnostica, Inc. selger frysetørket tPA. Selgerens instruksjoner for rekonstituering er "Bruk 0,1 M eddiksyre/- natriumacetatbuffer, pH 3,9, bring så opp til den ønskede pH.

Albumin, 1 mg/ml, kan tilsettes for å unngå utfelling."

Det er et mål for foreliggende oppfinnelse å fremstille en farmasøytisk formulering for bruk ved fremstilling av en steril, farmasøytisk doseringsenhet av tPA som ikke krever typiske solubiliserings/stabiliseringsmidler så som kaotropiske midler, overflateaktive midler, proteinaktige midler og karbohydrater for å oppnå høy løselighet, d.v.s. større enn løseligheten i vann,

0,1 mg/ml.

Det er et videre mål for foreliggende oppfinnelse å fremstille en farmasøytisk formulering av tPA hvori tPA er relativt stabilt ved omgivelsestemperatur.

Det er et videre mål for foreliggende oppfinnelse å fremstille en farmasøytisk formulering av tPA som er egnet for parenteral administrering.

Oppnåelse av disse og andre mål for oppfinnelsen er fullstendig beskrevet i det følgende nedenunder.

Et aspekt av oppfinnelsen er frembringelse av en steril farmasøytisk doseringsenhet av tPA for parenteral administrering som omfatter tPA i et buffret, farmasøytisk akseptabelt løsnings-middel ved pH 3,5 - 5,5.

Et annet aspekt av oppfinnelsen er et sett som omfatter en eller flere sterile beholdere av tPA i frysetørket form og en eller flere andre sterile beholdere med løsning for rekonstituering, hvori en buffer foreligger i en eller begge beholdere og bufferen, løsningen for rekonstituering og mengdene av tPA'et og av løsningen for rekonstituering velges slik at man etter kombinering av beholdernes innhold, får et rekonstituert produkt som er en farmasøytisk doseringsenhet for parenteral administrering omfattende 0,1 til 15 mg/ml tPA i et buffret, farmasøytisk akseptabelt løsningsmiddel ved pH 3,5 - 5,5.

Figuren er en grafisk illustrering av opprinnelige spalt-ningshastigheter for tPA (tap av aktivitet), 0,35 mg/ml, med mindre annet er angitt, i urea eller eddiksyre/ammoniumacetat-løsninger.

Det er nå oppdaget at tPA er meget løselig i buffret tilstand ved pH 3,5-5,5 uten solubiliserings/stabiliseringsmidler. Ved for eksempel pH 4,0 (0,1 M ammoniumacetat) er løseligheten av tPA større enn ca. 15 mg/ml; ved pH 5,0 (0,1 M ammoniumacetat)

er løseligheten av tPA ca. 3 mg/ml. Som tidligere angitt er løseligheten av tPA i vann ved pH 7,0 ca. 0,1 mg/ml.

Løseligheten av tPA i formuleringen av denne oppfinnelse ved pH 4,0 er sammenlignbar med løseligheten man får ved å bruke 2 M

urea ved pH 7,5. I formuleringen i oppfinnelsen kreves imidlertid ikke nærvær av et slikt solubiliseringsmiddel, som er et osmotisk diuretikum og kan forårsake uønskede bivirkninger gitt sammen med tPA, for å oppnå den høye løselighet.

En annen manifestasjon av oppfinnelsen som er beskrevet og krevet her, er at i det angitte pH-området, er tPA meget stabilt. Slik øket stabilitet er tydelig både ved lave og høye konsentra-sjoner av tPA i den farmasøytiske doseringsenhet fremstilt ifølge oppfinnelsen. For eksempel angir tabellen som følger prosent aktivitet av tPA ved lav konsentrasjon (0.39 mg/ml, med mindre annet er angitt), ved 40°C i urea (12 M urea, 0,3 M NaCl, 20 mM tris-HCl og 0,01% "Tween" 80, pH 7,5) eller 100 mM ammoniumacetat ved pH 3,5 - 5,5 i S-2251-målingen. S-2251-målingen er beskrevet av Weinberg et al., J. Immunol. Meth. 75: 289 (1984). En høy temperatur ble anvendt for å påskynde tap av aktivitet ifølge standard praksis.

Resultatene ovenfor er illustrert grafisk på figuren. Resultatene er overensstemmende med elektroforese-analyse av tPA lagret i 100 mM acetatløsningen. Over et tidsrom på 3 uker ved 40° C ble ingen nedbrytning av tPA i 100 mM ammoniumacetatløsningen påvist ved pH 4,0, 4,5, 5,0 og 5,5 ved polyakrylamidgel-elektroforese, små bånd tilsvarende 12, 16 og 21 kilodalton syntes etter 3 uker ved 40°C ved pH 3,5.

Et annet aspekt av denne oppfinnelse er at selv om tPA er vesentlig inaktiv under ca. pH 7, har man funnet at aktiviteten gjenopprettes etter gjenopprettelse av ca. pH 7. Etter administrering til en pasient som trenger trombolytisk terapi, forandres således miljøet til tPA'et i doseringsenheten fremstilt ifølge oppfinnelsen til pH 7 og tPA'et blir aktivt.

Stabiliteten til den farmasøytiske doseringsenhet økes ved lav temperatur. Således foretrekkes det ikke å lagre over romtemperatur, ca. 20 - 25°C. Selv om tPA'et i formuleringen er mer stabilt ved lav temperatur, f.eks. 0 til 15°C, er en fordel ved den farmasøytiske doseringsenhet den stabilitet ved høyere temperatur, for eksempel større enn 20°C, som man ser av de ovenfor angitte resultater. Ved 4,0°C bibeholdt tPA i en 2M urealøsning (pH 7,5) og tPA i en 100 mM ammoniumacetatløsning (pH 4,0) i begge tilfeller vesentlig hele aktiviteten etter flere uker. Ved romtemperatur (ca. 22°C) vil tPA i formuleringen være stabilt i flere uker. Hvis lengre lagringsperioderønskes, kan tPA i en tilsvarende bærer frysetørkes for lagring og deretter rekonstitueres til en farmasøytisk doseringsenhet for umiddelbar bruk eller for korttidslagring.

Resultatene som er nevnt ovenfor, ble oppnådd ved å bruke

tPA produsert av rekombinante kinesiske hamster-eggstokkceller (CHO) dyrket i nærvær av serum. Oppfinnelsen innbefatter imidlertid andre farmasøytiske doseringsformer omfattende tPA fra andre kilder innbefattet serum, melanoma celler, serum-uavhengige pattedyrceller, bakterier, gjær, insektceller, planteceller og andre pattedyrceller, rekombinante eller opprinnelige. Oppfinnelsen vedrører også andre former for tPA, f.eks. innbefattende enkelt-kjedet tPA, variant tPA, d.v.s. tPA hvori en eller noe få aminosyrer er forandret uten nevneverdig å påvirke aktiviteten,

løseligheten og stabiliteten til slik variant tPA, og tPA hvori glykosylrester er blitt modifisert.

I tillegg til ammoniumacetat kan andre farmasøytisk akseptable buffermidler anvendes i den farmasøytiske doseringsenheten. Blant anvendelige buffere finnes blandinger av de følgende syrer og deres salter: eddiksyre, adipinsyre, sitronsyre, melkesyre, vinsyre, aspartinsyre og glutaminsyre. Andre syrer som buffrer i det ønskede område og som er anvendelige i oppfinnelsen er blant andre glutarsyre, maleinsyre, fumarsyre, ravsyre, pimelinsyre, beta-alanin og enolpyrodruesyre. Det foretrukne anion er acetat. Foretrukne kationer er natrium og ammonium.

Konsentrasjonen av buffer i den farmasøytiske doseringsenhet velges for å holde pH ved 3,5-5,5, fortrinnsvis 4,0-5,0 og helst 4,4-4,8. Typisk er bufferkonsentrasjonen ca. 10 til 200 mM, fortrinnsvis 20 til 100 mM, av et natrium- eller ammoniumsalt av en egnet syre. Buffrene fremstilles ved standardteknikker, f.eks. ved å tilsette NaOH til 100 mM eddiksyre i vann til et valgt pH innenfor området som er anvendelig i oppfinnelsen for bruk ved fremstilling av en farmasøytisk doseringsenhet, hvori bufferen er 100 mM natriumacetat.

Fortrinnsvis er den farmasøytiske formulering en vandig løsning. Imidlertid kan visse polare, vann-blandbare, ikke-

vandige løsningsmidler brukes for parenterale formuleringer. Slike løsningsmidler kan brukes i den foreliggende oppfinnelse,

forutsatt at aktiviteten og stabiliteten til tPA'et ikke påvirkes nevneverdig uheldig. Hvilke slike løsningsmidler som er anvendelige, kan bestemmes ved rutinemessig eksperimentering.

I tillegg til tPA og buffer kan den farmasøytiske doseringsenhet inneholde små mengder av andre egnede midler for parenteral administrering, f.eks. et preserveringsmiddel så som timerosal, klorobutanol eller metylparaben, eller et middel for å justere tonisiteten så som natriumklorid, dekstrose eller mannitol. Den farmasøytiske doseringsenhet er fortrinnsvis isotonisk (250 til 310 mOSM/kg). Wang et al., J. Parenteral Drug Assoc. 34:452)1980), rapporterer fyllmidler som har vært brukt i parenterale formuleringer. I tillegg kan den farmasøytiske doseringsenhet inneholde ytterligere farmasøytiske aktive reagenser så som fibrinolytiske, kardiotoniske, antiarytmiske eller hypotensive midler.

Den farmasøytiske stabiliteten av tPA'et i den farmasøytiske doseringsenhet kanøkes videre ved å innta et hydrofilt polymert kryobeskyttende middel, så som hydroksyalkylcellelose, gelatin, akasiegummi, polyvinylpyrrolidon (f.eks. molekylvekt 10.000 til 60.000) og polyalkylenglykoler så som polyetylenglykol (f.eks. molekylvekt 4.000 til 40.000). Bruk av et slikt middeløker stabiliteten (d.v.s. minimaliserer aktivitetstap og proteinned-bryting) i løsning etter frysetørking og ved rekonstituering etter frysetørking. Et slikt foretrukket middel er polyvinylpyrrolidon (PVP) med en molekylvekt fra 20.000 til 50.000.

Et slikt middel kan settes til en tPA-formulering i løsning eller i pulverisert form. Fortrinnsvis settes et slikt middel til en tPA-formulering fremstilt ifølge oppfinnelsen før frysetørking, slik at etter rekonstituering er mengden av midlet i den ferdige rekonstituerte doseringsenhet en sikker og virksom mengde. En slik mengde er i tilfelle polyvinylpyrrolidon, molekylvekt 40.000 (Plasdone C-30), ca. 1 til 15 mg PVP, fortrinnsvis 4 til 10 mg, pr. mg tPA. I tilfelle gelatin kan større mengder foretrekkes for å oppnå øket stabilitet, f.eks. 10 til 1000 mg gelatin pr. 1 mg tPA.

Den farmasøytiske doseringsenhet inneholder 0,1 til 15 mg/ml tPA, fortrinnsvis 0,5 til 10 mg/ml. Den fremstilles ved standard-teknikker fra en farmasøytisk kjemiker. For eksempel kan frysetørket tPA rekonstitueres med en tilsvarende buffer, tPA i løsning kan dialyseres mot en slik tilsvarende buffer, eller pH i en tPA-løsning kan justeres med syre, salt eller buffer. Således innbefatter den farmasøytiske doseringsenhet en slik dosering som er blitt frysetørket, slik at en farmasøytisk doseringsenhet i løsningsform oppnås etter rekonstituering med et vandig løsnings-middel. Slutt-trinnene av tPA-rensingen kan gjerne utføres i en hensiktsmessig, buffret vandig løsning ved pH 3,5 - 5,5.

Den farmasøytiske doseenhet fremstilles slik at den gir en pasient, spesielt en menneskepasient med behov for trombolytisk terapi en effektiv mengde av tPA parenteralt, spesielt intravenøst, intrakoronart og muligens intraarterielt. Den nøyaktige tPA-konsentrasjonen i doseringsenheten samt det nøyaktige volum av en gitt farmasøytisk doseringsenhet vil avhenge av indikasjonen og tilstandsskaden. Optimalisering av en gitt doseenhet kan utføres ifølge standard farmasøytisk og medisinsk praksis. For akutt myokardialt infarkt (akutt MI) vil en pasient gjerne få en totaldose på 25 til 200 mg, fortrinnsvis ca. 70 til 150 mg, over et tidsrom på 10 til 180 minutter, fortrinnsvis ca. 30 til 90 minutter. For eksempel rapporterer Coilen et al. Circulation, Volume 70, s. 1012 (1984), behandling av pasienter som lider av

MI ved intravenøs infusjon av 0,5 til 0,75 mg/kg (eller 35-

53 mg/70 kg person) over 30 til 120 minutter. Den rapporterte formulering fra Coilen et al. befant seg i 10 ml glass som hvert inneholdt 0,5 mg/ml tPA. Sobel et al., Circulation, Volume 69,

s. 983 (1984) rapporterer infusjon av 200-400 x IO<3>internasjonale enheter (IU) tPA til pasienter som lider av MI. Van de Werf et al., N. Engl. J. Med., Volume 310, s. 609 (1984) rapporterer intravenøs (i.v.) og intrakoronar (i.c.) administrering av doser av tPA som varierer fra ca. 3 x 10s IU/15 min i.c. til ca.

1,4 x IO<6>IU/35 minutter i.v. til MI pasienter. Robinson, W084-01786 beskriver behandling for en middels stor trombose ved administrering av 0,10 til 1,0 mg/kg av et modifisert tPA som mangler i det minste en del av karbohydratdelen av det opprinnelige molekyl ved infusjon av opptil 8 doser.

Således er en foretrukket farmasøytisk doseringsenhet en pilleform som kan lagres i et glass, liten pose, ampulle eller sprøyte, klar for bruk i nødsfall. En slik doseenhet inneholder fortrinnsvis ca. 1 til 10 ml, enda heller 2 til 6 ml av 1

til 10 mg/ml, helst 2 til 6 mg/ml tPA. Slike pilleform-enhetsdoser formuleres så de inneholder 2 til 50 mg, fortrinnsvis 5-30 mg og helst 10 til 20 mg tPA for administrering i en enkel injeksjon.

En annen foretrukket farmasøytisk doseringsenhet er en intravenøs infusjonsform som kan lagres i en stor (100 til 1000 ml) beholder. En slik enhet inneholder fortrinnsvis ca. 0,1 til 10 mg/ml, enda heller 0,5 til 5 mg/ml tPA, slik at 10-500 mg, fortrinnsvis 50 -

200 mg tPA kan foreligge i en enkelt infusjonsbeholder. En

tredje foretrukket utførelsesform kombinerer begge trekk, for eksempel et glass, en sprøyte eller annen pilletype beholder forbundet som en leder til en infusjonsform.

Frysetørket tPA kan inneholde en farmasøytisk akseptabel buffer i frysetørket form for eventuell rekonstituering i ikke-buffret løsning, eller som når frysetørkingsbæreren er ammoniumacetat, kan det frysetørkede produkt rekonstitueres i buffret løsning. I alle tilfeller kan det frysetørkede produkt lagres i en steril ampulle eller annen beholder for avgivelse med en steril beholder av en løsning for rekonstituering og eventuelt for øyeblikkelig intravenøs administrering ved injeksjon eller infusjon. I en fjerde foretrukket utførelsesform av oppfinnelsen tilveiebringes således et sett omfattende en eller flere sterile beholdere av tPA i frysetørket form og en eller flere adskilte sterile beholdere av løsning for rekonstituering. Løsningen for rekonstituering, mengden av tPA og mengden av løsning for rekonstituering i et enkelt sett velges slik at man får et ferdig rekonstituert produkt med 0,1 til 15 mg/ml ved en pH valgt ifølge oppfinnelsen. En foretrukket løsning for rekonstituering er en 5% løsning av dekstrose i vann. Mengdene av tPA og løsning for rekonstituering velges fortrinnsvis så man får et ferdig rekonstituert produkt eller doseringsenhet som er den samme som den foretrukne injiserbare væske eller infiserbare former som er beskrevet ovenfor. Således omfatter et sett for fremstilling av en foretrukket pilleform i en eller flere sterile beholdere 2 til 50 mg, fortrinnsvis 5 til 30 mg tPA, og i en eller flere andre beholdere, 1 til 10 ml, fortrinnsvis 2 til 6 ml av løsningen for rekonstituering, slik at etter kombinasjonen av innholdene i de to beholdere, omfatter det resulterende produkt tPA i en konsentrasjon på 1 til 10 mg/ml, fortrinnsvis 2-6 mg/ml. Et sett for fremstilling av den foretrukne infusjonsform omfatter i en eller flere sterile beholdere 10 til 500 mg, fortrinnsvis 50 til 200 mg tPA, og i en eller flere andre sterile beholdere 100 til 1000 ml løsning for rekonstituering, slik at etter kombinasjonen av beholdernes innhold, omfatter det resulterende produkt tPA i en konsentrasjon på 0,1 til 10 mg/ml, fortrinnsvis 0,5 til 5 mg/ml. Fortrinnsvis foreligger alt tPA for en doseringsenhet i en enkel beholder, og all løsning for rekonstituering for en slik doseringsenhet inneholdes av en andre enkelt-beholder. Et sett for fremstilling av en farmasøytisk doseringsenhet kan omfatte en steril flerromsbeholder, f.eks. en to-romsbeholder, hvori et rom inneholder frysetørket tPA og et andre rom inneholder løsningen for rekonstituering, idet de to rom er adskilt av en brytbar barriere, slik at innholdene av hver kan blandes aseptisk ved å bryte barrieren. Slike sett er eksemplifisert ved "Univial" sterilt to-romsglass (Abbot Laboratories, North Chicago, Illinois) og ved Hypak Liqui/Dry sprøyte (Becton Dickinson, Rutherford, New Jersey). Merkelapp eller insatte instruksjoner viser mengden av tPA og løsning for rekonstituering og en forskrift for administrering kan følge med.

EKSEMPLER

De følgende eksempler 1-9 illustrerer eksempler på farma-søytiske doseenheter.

EKSEMPEL 1

En steril sprøyte fylles med en steril løsning av

EKSEMPEL 2

En steril sprøyte fylles med en steril løsning av

EKSEMPEL 3

En steril sprøyte fylles med en steril løsning av

EKSEMPEL 4

En steril sprøyte fylles med en steril løsning av

EKSEMPEL 5

En steril beholder anvendelig for intravenøs infusjon fylles med en steril løsning av

EKSEMPEL 6

En steril beholder anvendelig for intravenøs infusjon fylles med en steril løsning av

EKSEMPEL 7

En steril beholder anvendelig for intravenøs infusjon fylles med en steril løsning av

EKSEMPEL 8

Et sett pakkes omfattende (1) et sterilt glass inneholdende 10 mg tPA som er blitt frysetørket i en bærer omfattende tPA

(10 mg/ml) i 100 mM ammoniumacetat (pH 4) og 30% mannitol og (2) et sterilt glass inneholdende en løsning for rekonstituering som er 100 mM ammoniumacetat, 10 ml, pH 4,0.

EKSEMPEL 9

Et sett pakkes omfattende (1) et sterilt glass inneholdende 1000 mg tPA som er blitt frysetørket i en bærer omfattende tPA (15 mg/ml) i 100 mM ammoniumacetat (pH 4) og 19% glysin og (2) en steril flaske inneholdende en løsning for rekonstituering som er 100 mM ammoniumacetat, 1000 ml, pH 4,0.

EKSEMPEL 10

1 ml av en løsning inneholdende 10 mg/ml tPA i 0,1 M ammoniumacetat ble satt i et 20 ml frysetørkingsglass til 4 ml av hver av to eksipientløsninger for å fremstille formulering A og B som følger.

Formuleringene ble frysetørket som følger. Glassene ble frosset natten over på en -50°hylle. Tørkecyklene var: (1) -

25°C, 100 um Hg (13 MPa), 84 t, (2) 0°C, 100 pm Hg (13 MPs), 8 t, og (3) 25°C, 10-30 pm Hg (1,3 - 3,9 MPa), 24 t.

En kontroll-løsning av tPA (1,0 mg/ml i 0,1 M ammoniumacetat) ble lagret ved 5°C. En første eksperimentell prøve (I) ble lagret i frysetørket form i 23 dager ved -15°C og ble så rekonstituert og målt med S-2251 måling etter 24 timer ved 5°C, 25°C

og 40°C. Lagring av den frysetørkede klump ved -15°C og av den rekonstituerte løsning ved 5°C simulerer dag 0 betingelser,

d.v.s. rekonstituering og måling umiddelbart etter frysetørking.

En annen eksperimentprøve (II) ble lagret i frysetørket form i

23 dager ved 40°C og ble så rekonstituert og målt med S-2251

måling etter 24 timer ved 4°C og 25°C. En tredje eksperimentell prøve (III) ble lagret i frysetørket form i 3 måneder ved 40°C og ble så rekonstituert og målt med S-2251 måling etter rekonstituering og etter 24 timer ved 4°C og 25°C. Alle eksperimentelle prøver ble rekonstituert til 1,0 mg/ml med 5% dekstrose. pH av den 23.dags (40°C) rekonstituerte formulering var A: pH 4,5 og B: pH 4,3. Osmolaliteten til disse formuleringer var A:298 mOsm

og B:274 mOsm. Aktivitet av prøvene som en prosentdel av kontrollen er angitt i den følgende tabell.

EKSEMPEL 11

Alikvoter av to tPA-formuleringer, A og B, fremstilt i det vesentlige som beskrevet ovenfor, ble brakt i 5 ml glass slik at hvert glass inneholdt:

Glassene ble frysetørket i det vesentlige som beskrevet ovenfor. Et sett ble så lagret ved -15°C inntil 7 dager etter frysetørking for å simulere dag O-betingelser, d.v.s. rekonstituering og måling umiddelbart etter frysetørking, og målt etter rekonstituering og 24 timer etter rekonstituering ved romtemperatur (20 - 25°C) (dag 0). Ytterligere sett av glass ble lagret ved 40°C og ble så på lignende måte rekonstituert og målt 7 dager etter frysetørking (dag 7), 3 uker etter frysetørking (uke 3) og en måned etter frysetørking (måned 1). Alle frysetørkede klumper ble rekonstituert med vann til ca. pH 4,2 - 4,6. Aktiviteten ved hvert punkt ble sammenlignet med sådan av en kontrollformulering som inneholdt 1 mg/ml tPA i 0,1 M ammoniumacetatbuffer, pH 4,0, lagret ved 5°C. Resultatene er gjengitt nedenunder som prosentdel av kontrollen.

EKSEMPEL 12

I det vesentlige som beskrevet i eksempel 10 og 11 ovenfor, ble 10 ml glass fremstilt, som inneholdt:

Glassene ble frysetørket og ble rekonstituert med 1,0 ml

1,0 M ammoniumacetat (pH 4), og målt på dag 0 (simulert).

Glassene lagret ved 40°C, ble målt på dag 10, dag 16 og måned 1. Aktiviteten ble sammenlignet med en kontrollformulering (0,1 mg/ml tPA i 0,1 M ammoniumacetatbuffer, pH 4, 5°C) og er rapportert nedenunder som en prosentdel av kontrollens aktivitet.

EKSEMPEL 13

I det vesentlige som beskrevet i eksempel 10 og 11 ovenfor, fremstiltes 5 ml glass inneholdende:

Glassene ble frysetørket og ble så rekonstituert med 1,0 ml 0,1 M ammoniumacetat (pH 4) og målt på dag 0 (simulert). Glassene lagret ved 40°C, ble målt på dag 8 og måned 1. Aktivitet ble sammenlignet med en kontrollformulering (1 mg/ml tPA i 0,1 M ammoniumacetatbuffer, pH 4,0, 5°C) og er rapportert nedenunder som en prosentdel av kontrollens aktivitet.

Eksempel 10, 11, 12 og 13 ovenfor viser øket stabilitet under frysetørking og etter rekonstituering av en tPA-formulering inneholdende et polymert kryobeskyttelsesmiddel, spesielt polyvinylpyrrolidon og gelatin.

Beskrivelsen og eksemplene ovenfor beskriver oppfinnelsen og foretrukne eksempler derav fullstendig. Imidlertid er oppfinnelsen ikke begrenset til de spesielle konstruksjoner som her er illustrert, men omfatter istedet alle modifikasjoner som faller innenfor omfanget av de følgende krav.

Claims (5)

1. Fremgangsmåte ved fremstilling av en steril farmasøytisk doseringsenhet av tPA for parenteral administrering, karakterisert ved at man oppløser tPA i et farmasøytisk akseptabelt vandig lø sningsmiddel ved pH 3,5 - 5,5 til en konsentrasjon på 0,1 til 15 mg tPA pr. ml løsning.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at et kuldebeskyttende middel tilsettes tPA-løsningen.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 2, karakterisert ved at man frysetørker en vandig formulering inneholdende 0,1 til 15 mg/ml tPA, buffret til pH 3,5-5,5 med en organisk syre og salt derav, og som inneholder et kuldebeskyttende middel, og deretter rekonstituerer den frysetø rkede formulering med et vandig lø sningsmiddel som er akseptabelt for parenteral administrering, hvorunder formuleringens pH forblir i området 3,5 - 5,5.

4. Fremgangsmåte ifølge krav 1, 2 eller 3, karakterisert ved at doseringsenheten buffres til pH 4,0 - 5,0 med en eller flere av adipinsyre, glutaminsyre, sitronsyre, eddiksyre, ravsyre, melkesyre, vinsyre og aspartinsyre og et salt derav, og at det som kuldebeskyttende middel anvendes polyvinylpyrrolidon eller gelatin.

5. Fremgangsmåte ifølge krav 4, karakterisert ved at doseringsenheten buffres med adipinsyre, ravsyre eller eddiksyre og et salt derav.