NO850771L

NO850771L - Bionedbrytbart polypeptid og dets anvendelse for gradvis frigjoering av legemidler

Info

Publication number: NO850771L
Application number: NO850771A
Authority: NO
Inventors: Daniel Bichon
Original assignee: Battelle Memorial Institute
Priority date: 1983-07-01
Filing date: 1985-02-26
Publication date: 1985-02-26
Also published as: DE3463211D1; EP0130935A1; ATE26584T1; EP0130935B1; DK88385D0; US4675381A; FI850835A0; FI73448C; WO1985000372A1; AU2698684A; JPS60501759A; EP0150184A1; CA1241322A; FI73448B; DK88385A; FI850835L

Abstract

Bionedbrytbart acyloksymetylpolyaspartat og -polyglutamat for bruk som legemiddelbærer i inn-kapslet tilstand eller inkorporert i polymer-grunnmassen. Det således fylte polypeptid nedbrytes enzymatisk i det organ hvori det er anbragt og fri-gjør derved på progressiv måte det legemiddel som det inneholder.

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører et nytt bionedbrytbart forestret polypeptid hvori legemidler kan inkorporeres, idet legemidlene da gravis frigjøres i forhold til den biokjemiske nedbrytning av polymeren.

Det har i flere år vært kjent ikke-toksiske bionedbrytbare polymerer som kan virke som et reservoar for legemidler og som gir anledning for regulert gradvis frigjøring av slike i organismen ved tidspunktet for nedbrytningen av bærerpolymeren. Generell informasjon angående produkter av denne type finnes i arbeidet: "Fundamental Aspects of Biocompatibility" av D. F. Williams, CRC Press (1981) .

Se også US patent 4.093.709.

Av disse polymerer er de som det vises til, spesielt syntetiske polypeptider (polyaminosyrer), hvis struktur er be-slektet ved den til proteiner. Disse polypeptidene er biokompatible og produktene av deres nedbrytning (aminosyrer) kan reabsorberes av orgamismen. Således har Sidman et al. (J. Membr. Sei (1980), 7(3), 277-91 beskrevet et kopolymer av glutaminsyre og etylY~glutamat, hvor nedbrytningshastigheten er en funksjon av kopolymerens sammensetning (molare mengder av de forestrede segmenter i forhold til de ikke-forestrede segmenter) og som kan lagre flere medisinske produkter, mer spesielt steroider, peptider, og anti-malariaprodukter, anti-kreftprodukter og andre produkter. Polymerer av denne type kan anvendes i form av pinneelementer inneholdende, blandet dermed, det ønskede legemiddelet, eller i form av kapsler som omslutter legemiddelet dersom dette ikke kan blandes med polymeren.

Til tross for den interesse som er knyttet til det ovenfor nevnte produkt forskes det fremdeles etter et produkt med forbedrede kvaliteter som spesielt har følgende egenskaper: 1. Utmerket oppløselighet i de fleste konvensjonelle uskadelige oppløsningsmidler som er egnet for legemidler (kjente derivater av polyaminosyrer er faktisk ikke generelt oppløselige i visse spesielle oppløsningsmidler (DMF, pyri-din, F^CCOOH), hvis bruk ikke er egnet for farmasøytiske produkter. 2. Termoformbarhet. De syntetiske polypeptidene som er kjent i dag, kan faktisk ikke generelt blandes med konvensjonelle biokompatible myknere (polyalkylenglykoler) og er følgelig ikke termoplastiske. Nedbrytningsgraden for kjente syntetiske polypeptider er faktisk forbundet, på en måte som er vanskelig å reprodusere, med deres kjemiske struktur, mer spesielt forestringsgraden. I et gitt tilfelle (se Sidman K.R. et al., PB 81-132136 NTIS (1980), s. 42) vil således en variasjon i forestringsgraden av størrelsesorden 10% bevirke at nedbrytningsgradenøker fra 1 til et hundre-fold (se også referansen: Sidman som nevnt ovenfor).

Polymeren ifølge oppfinnelsen bidrar til at disse forbedringer kan realiseres. Den er et forestret polypeptid med form-len:

1 2

hvor R og R er alkylgrupper eller hydrogen, og R er en substituert eller ikke-substituert alifatisk eller aromatisk

2 1

rest, eller R er hydrogen og en alkylgruppe, og R og R forbundet med hverandre er substituerte eller ikke-substituerte metylen- eller metenylgrupper, idet n er 1 eller 2,

og x er slik at molekylvekten er minst 5000 D.

Som det fremgår fra formel I er polymeren ifølge oppfinnelsen et polyaspartat eller polyglutamat forestret med et derivat av acyloksymetanol (HO-CR 1 R 2-00CR) hvor R enten er en hvilken som helst organisk rest, eller er forbundet med R"'" for derved å danne en cyklisk gruppe. Bruken av betegnelsen "en hvilken som helst" betyr at naturen og strukturen til R-gruppen ikke er kritisk, og det har f.eks. ikke vært noe tilfelle hvor dersom R er en del av den konvensjonelle forbindelsen med enRCOO-gruppe, den tilsvarende bestanddel ifølge oppfinnelsen ikke har kunnet oppnås. Det er imidlertid foretrukket å benytte forbindelser hvori R er en substituert eller ikke-substituert alifatisk eller aromatisk gruppe, idet substituentene velges blant de biokompatible organiske grupper. Blant de foretrukne R-grupper er gruppene metyl, etyl, propyl, isopropyl, isobutyl, tert-butyl, fenyl, benzyl og andre lignende grupper. Andre grupper er naturligvis mulig, men det er klart at man ikke har kunnet ta dem alle i betraktning under den begrensede tidsperiode som har vært tilgjengelig.

Når R og B?~ er knyttet til hverandre for derved å danne

en karbon-karbon-binding som enten er eller ikke er mettet, idet disse karbonatomer enten er eller ikke er substituert med alifatiske eller aromatiske rester. I det nedenstående er angitt noen ikke-begrensende eksempler på disse ester-laktalgrupper som er substituerte eller ikke, tilsvarende den ovenfor angitte definisjon: dimetylengruppe-CH2-CH2;

dimetyletylengruppe -CH (CH.,) -CH (CH-,) - : vinylengruppe -CH=CH-;

1,2-fenylengruppe

cyklopentylengrup]

og andre.

Polymeren ifølge oppfinnelsen kan også være i form av en kopolymer med andre polyaminosyrer. I dette tilfelle ville det være en kopolymer med formelen:

hvor R er en rest av en hvilken som helst aminosyre som enten er eller ikke er forestret, R'-gruppene i enhetene -(NH-CGR'-CO)- kan være like eller forskjellige i kopolymerkjeden, med y + z = x, idet verdien for x alltid er valgt slik at kopolymeren har en gjennomsnittlig molekylmasse på minst 5000 D. Dersom R' er lik gruppen -(CH2)-COO-CR 1 R 2-OOC-R, idet n-gruppene imidlertid er forskjellige (en av dem er 1 og den andre er 2), ville naturligvis en forestret kopolymer av en glutaminsyre og aspartinsyre oppnås. Det er imidlertid generelt foretrukket å ha forskjellige grupper for R<1>, slik som f.eks. metyl (alanin), isopropyl (valin), isobutyl (leucin og isoleucin), benzyl (fenylalanin) osv. Alle andre aminosyrer er i prinsippet mulige, selv om det

av åpenbare grunner ikke har vært mulig å forsøke alle.

R' kan også betegne en rest av glutaminsyre eller aspartinsyre som ikke er forestret eller delvis forestret med en hvilken som helst alkohol, f.eks. MeOH eller EtOH,

det vil si f.eks. -(CH-)- -COOH eller -(CHn) -COOMe.

zn zn

Det er også mulig å ha aminosyrer av L- eller D-serien. Aminosyrene i L-serien (eller naturlige syrer) er de mest interessante fordi polypeptidene som inneholder disse, er nedbrytbare av enzymer (proteaser) i det menneskelige legeme, mens dette ikke er tilfelle med polypeptidene bestående av D-enheter. Denne forskjell kan utnyttes ved bruk av kopolymerer omfattende D- og L-aminosyrer, med det formål å oppnå polymerer hvis nedbrytningshastighet er blitt endret.

Med hensyn til mer generelle betraktninger skal det påpekes at molarforholdet, i kopolymeren II, for den andre frie eller delvis forestrede polyaminosyren, også gir anledning for regulering i betydelig grad av kopolymerens nedbrytningshastighet som en funksjon av de midler som er til stede i organismen ved målstedet for blandingen av kopolymer og legemiddel som skal administreres (det vil si i det organ hvor legemiddelet skal virke). Således, dersom f.eks.

kopolymeren er en kopolymer av polyglutamat I og leucin,

så ville det relative molare preparat av de to bestand-delene som en funksjon av den relative nedbrytningshastigheten velges, ved det angjeldende sted, fra polyglutamat og polyleucin. Generelt kan forholdet z/y variere med fra 1 til 30, men disse grenser kan overskrides om nødvendig. I tilfeller hvor R<1->gruppen ikke betegner en enkel naturlig gruppe i kopolymerkjeden, det vil si f.eks. når en R<1->gruppe betegner en rest av fri aminosyre og en annen R<1->gruppe betegner en rest av forestret aminosyre, kan naturligvis variantene av R<1>for hensikts-messighetens skyld betegnes med R'<1>, R<11>', osv. Den generelle formel for en kopolymer av denne type kan illustreres som følger:

hvor summen av y, z, u, v, ... osv., er lik x; u, v, osv. kan naturligvis være null, dersom resten betegnet med R' er av den naturlige typen. Et typisk tilfelle hvor kopolymeren har forskjellige betydninger for R' og R<1>' er det hvor disse grupper betegner rester av glutaminsyre og/eller aspartinsyre som kan være forestret eller ikke-forestret, idet den skjematiske formel for en polymer av denne type (i det spesielle tilfelle, delvis metylert) er som følger:

R-gruppens natur kan også innvirke på nedbrytningshastigheten for polymeren I. Således, dersom f.eks. R er en stor eller fyldig gruppe (f.eks. tert-butyl), vil nedbrytningen være langsommere enn med en metyl- eller etylgruppe.

Med hensyn til optisk isomeri skal det forstås at polymerene ifølge oppfinnelsen kan omfatte elementer med L- eller D-konfigurasjon eller racemiske blandinger eller endog polymerer hvor en av konfigurasjonene er dominerende. De biokjemiske egenskapene til disse forskjellige kombinasjoner er naturligvis ikke like, idet de polymerer hvori de naturlige former (L) er dominerende, er mer åpne for enzymatisk nedbrytning. Det er således mulig å styre deres nedbrytning ved å måle deres relative mengdeforhold av den ene og den andre formen i kopolymeren.

Polymer I og kopolymer II er uoppløselige i vann og vanligvis oppløselige i ett eller flere konvensjonelle oppløsningsmidler slik som aceton, metyletylketon (MEK), tetrahydrofuran (THF), dioksan, etylacetat, monoglyme, diglyme og andre, som lett kan omdannes til kuler, pellets, fibre, filamenter, mikrokapsler, filmer, osv. Avhengig av deres struktur kan polymerer I og II være uoppløselige eller oppløselige i klorerte oppløsningsmidler, slik som kloroform. I visse tilfeller av uoppløselighet i kloroform kan dette avhjelpes ved tilsetning av en liten mengde aceton til et oppløsningsmiddel av denne type. Denne evne til å oppløses i en rekke oppløsningsmidler som kan være blandbare med vann eller ikke, gjør dem uten videre forenlige med flere væskeformige legemidler eller legemidler som er oppløselige i de samme oppløsningsmidlene. Således, f.eks. for å innkapsle et vannoppløselig produkt

i polymer-mikrokuler, er det mulig å benytte den kjente, veletablerte teknikk med dispergering av en vandig opp-løsning av legemiddelet i en polymeroppløsning, hvor den sistnevnte omfatter et oppløsningsmiddel som ikke kan blandes med vann, og deretter fordampning av dette opp-løsningsmiddel slik at det dannes faste polymerkapsler.

Videre, polymer I er ifølge sin struktur ofte fullstendig forenlig med polyalkylenglykoler (polyetylenglykol og polypropylenglykol), hvilket betyr at glykolpolyetere kan anvendes som polymer I-mykningsmidler og for således å tilveiebringe en homogen blanding med et lavt smeltepunkt. Det er lett å inkorporere et helt gram termolabile legemidler i en blanding av denne type (smelting ved temperaturer på omkring 40-60°C) og å oppnå granulater eller mikrokapsler derfra. Videre, tilstedeværelsen av meget hydrofile polyalkylenglykoler betyr at det er mulig å øke polymerens og kopolymerens mottagelighet overfor biologiske vandige væsker og å lette deres enzymatiske nedbrytning in situ.

Det skal bemerkes at kjente syntetiske polypeptider ikke

har disse gunstige egenskapene hva angår oppløselighet og kompatibilitet med PEG-materialer. For således å danne filmer av polyglutaminsyre som har en betydelig mekanisk bestandighet og en viss uoppløselighetsgrad i vann, er det nødvendig å benytte oppløsningsmidler som er relativt vanskelige å håndtere og som ikke er godt likt innen farmasøytiske kretser slik som dimetylformamid (DMF) og dikloreddiksyre og trifluoreddiksyre (DCA og TFA). Filmene av polyglutaminsyre oppnådd fra vandige oppløsninger (ved pH 7,4, dvs. når syren i det minste er delvis salt-dannet) har ikke noen mekanisk bestandighet og oppløses hurtig i vann, hvilket gjør polymeren helt uegnet som en bærer for legemidler med forsinket frigjøring ifølge oppfinnelsen. Det samme gjelder polyglutamin-polyetylen-glykolsyreblandinger som er umiddelbart oppløselige i vann.

Bionedbrytningen av polymer I kan representeres skjematisk som:

Reaksjon (a) følger reaksjon (1) og følgelig øker polymer-bionedbrytningshastigheten ettersom hydrolysehastigheten av laktal- eller acyloksyalkylesteren øker. Hydrolyse-mekanismen for estere av denne type er i og for seg kjent og har blitt demonstrert ved studie av estere av ampicillin (f.eks. pivampicillin), og i denne sammenheng vises det til følgende referanser: "Design of biopharmaceutical properties through Prodrugs and Analogs", B. Roche, ut-giver, American Pharmaceutical Association (ISBN 0-917330-16-1), 2 side 212 og 354 (1977). Det skal påpekes at siden R er hydrogen og R<1>er alkyl (f.eks. metyl), så er forbindelsen som resulterer fra reaksjon (1) et R<1->CH0 aldehyd (f.eks. acetaldehyd), idet disse aldehyder er biologisk mer fordel-1 2

aktige enn metaldehydet oppnådd når R = R = H av toksisitets-grunner. Når det gjelder dette aspekt ved oppfinnelsen,

er produktene som resulterer fra reaksjon (1) hvor R og R"'"

er sammenbundet (de ketoniske syrer eller syrealdehyder)

også mest fordelaktige p.g.a. deres ubetydelige toksisitet. Således, dersom forbindelser R-R"*" tilsvarer etylen- eller 1,2-fenylengruppene, vil nedbrytningsproduktene, henholdsvis 3-formylpropionsyre og 0-formylbenzosyre, langsomt bli eliminert i organismen uten sekundære reaksjoner.

Polymer I kan fremstilles ved direkte forestring av et tilsvarende polyaminosyresalt med et acyloksymetylhalogenid (X-CR 1 R 2-0C0-R (III) ), hvor X kan være klor, brom eller jod. Polyaminosyren er fortrinnsvis et tertiært aminosalt

(f.eks. av tributylamin eller trietylamin). Denne metode-type er kjent fra W. V. Dachne; J. Med. chem. 13, 607-12, 1971). Videre, syntesen av forbindelsene III (X = Cl) er

kjent (se Z.H. Ulich, J.A.C.S. 43, 662 (1921) ) og består av omsetning av syrekloridet RCOC1 med formaldehyd i nær-vær av en katalytisk mengde av vannfritt ZnCl2.

Polyaminosyren eller ko-polyaminosyren av hvilken forestringen gir polymer I eller kopolymer II oppnås lett på konvensjonell måte omfattende forestring av en lavere alkohol av den laterale karboksylgruppen i en syre med formelen:

omdannelse av esteren til det tilsvarende N-karboksyanhydrid (NCA) ved hjelp av fosgen i et medium av dioksan eller THF, polymerisasjon av NCA til forestret polyaminosyre og hydrolyse av den beskyttende estergruppen i et alkal-isk medium eller ved hjelp av trifluoreddiksyre. Disse metodene er i seg selv kjente (se f.eks. Encyclopedia of Polymer Science and Technology; N-karboksyanhydrides, vol. II, s. 837). Dersom det er ønskelig å oppnå en kopolymer hvor R<1>betegner en delvis forestret lateral karboksylgruppe (R<1>= -(CH2)n-COOH og R" = - (CH2) n-COOAlk) må man være nøye med å sikre at hydrolysen av den beskyttende estergruppen bare er delvis. Således vil f.eks. utgangsproduktet som skal forestres med forbindelsen XCR 1 R 2-OCOR være en kopolymer av syren H2N-CH[(CH2)n~C00H]-C00H og av esteren

NH„-CH[(CH„) -COO Alk]-COOH.

2.Zn

Polymer I og kopolymer II kan anvendes for oppbevaring

av legemidler på forskjellige måter. Således kan f.eks. foreliggende polymerer I og kopolymerer II anvendes for fremstilling av mikrokapsler inneholdende et legemiddel.

Mikrokapsler av denne type omfatter en polymermembran og inneholder en vandig eller oljeholdig oppløsning hvori legemiddelet er i suspensjon eller i oppløsning. Det er også mulig å fremstille mikrokuler, dvs. faste partikler eller kuler inneholdende legemiddelet i en dispergert tilstand eller i form av en fast oppløsning i polymergrunn-massen. Det er også mulig å fremstille mikroporøse produkter kalt mikrosvamper. Generelt er det mulig å

benytte foreliggende polymerer innen alle metoder for fremstilling av legemidler med forsinket frigjøring, dvs. legemidler som har egenskapen av å frigjøre (utsalte) legemiddelet over lengre tid etter hvert som bæreren nedbrytes. En beskrivelse av disse metoder finnes i følgende arbeider: "Biodegradables and Delivery Systems for Contraception", Mafez E.S.E., MTP Press Limited (1980); "Controlled Released Technologies = Methods, Theory and Applications", Vol. I og II, A.F. Kydonieus, CRC Press

(1980) og "Microencapsulation - New Techniques and Applications" av Tamotsu Kondo, Techno Inc. (1979) Japan. Oppløseligheten av foreliggende polymerer i flere opp-løsningsmidler, som enten kan være blandbare med vann eller ikke, er en fordel for deres anvendelse ifølge de metoder som er beskrevet i ovennevnte referanser. Det er også mulig å fremstille tråder omfattende disse polymerer ved ekstrudering av en oppløsning av sistnevnte i en spinnedyse og ved utfelling av tråden enten ved fordampning eller ved bruk av et bad av ikke-oppløsningsmiddel ifølge konvensjonelle ekstruderingsmetoder. Tråder fremstilt på denne måten kan strikkes, knytes eller veves for dannelse av sting, ligaturer eller rørformede strukturer som kan virke som kunstige arterier, vener, kanaler eller indre organer for midlertidig virkemåte. Polymeren ifølge oppfinnelsen kan også anvendes enten direkte eller blandet med en mykner ved fremstilling av filmer eller kirurgiske proteser f.eks. for reparasjon av benfrakturer, slik som klemmer, nåler, skruer, forsterkningsplater, tamponger osv.; disse materialer kan fremstilles ved opp-løsningsstøping, termoforming eller ved maskinering av faste polymerblokker. Siden proteser av denne type kan reabsorberes, blir de gradvis eliminert i organismen, og det er derfor ikke nødvendig å utføre en ny operasjon slik tilfellet er i dag, for å fjerne det forsterkende eller konsoliderende materiale.

Den nøyaktige sammensetning av benyttet polymer eller kopolymer skal naturligvis reguleres som en funksjon av nedbrytningshastigheter og absorpsjonskarakteristika in vivo, ifølge den type protese som er aktuell.

Følgende eksempler illustrerer oppfinnelsen:

Eksempel 1

Kopolymer av benzoyloksymetylenpolyglutamat, glutaminsyre og metylglutamat.

Delvis metylert polyglutaminsyre ble fremstilt fra metyl-y-glutamat N-karboksyanhydrid oppløst i metylenklorid; trimetylamin anvendes som en polymerisasjonskatalysator (A/l=100). Polymeren ble deretter utfelt ved tilsetning av metanol og deretter vakuumtørket. Det faste stoffet ble gjenoppløst i trifluoreddiksyre (TFA) for derved å danne en 5 vekt-% oppløsning og et volum av destillert vann ble tilsatt dråpevis under kraftig omrøring slik at sluttoppløsningen inneholdt like volumer vann og TFA. Denne ble deretter omrørt i ytterligere 12-15 timer ved romtemperatur (viskøs oppløsning) hvoretter hele innholdet ble helt i en stor mengde destillert vann, hvilket ledet til utfelling av en kopolymer av metylglutamat og polyglutaminsyre, idet hydrolysen av metylesteren hadde nådd omkring 60-70%. Denne kopolymer ble filtrert og tørket. De relative mengder av frie og forestrede COOH- grupper i kopolymeren oppnådd ved NMR-analyse i TFA (integrering av metylesterbindingen -O-CH^ ved 3,95 ppm) ble regulert. En analyse av molekylvekten ble foretatt med GPC (gelpermeasjonskromatografi) i DMF på en bimodal "Dupont Zorbax PDM"-kolonne (polystyrenkalibrering); en antallsmidlere molekylvekt Mn på 226.000; og en dispersjon (Mw/Mn) på 1,75 ble målt.

1,22 g av kopolymeren ble oppløst i 45 ml DMF og 3,5 g tributylamin tilsatt. 3,25 g klormetylbenzoat fremstilt ifølge Ulich, J.A.C.S. 43, 662 (1921) ble deretter tilsatt dråpevis, og omrøring opprettholdt i 4 8 timer ved romtemperatur. 50 ml vann ble deretter tilsatt hvilket forårsaket utfelling av et fargeløst fast stoff som ble filtrert, tørket og renset ved suksessiv oppløsning i aceton og utfelling med eter, og deretter oppløsning i aceton og utfelling med vann. Ved NMR-analyse av produktet i TFA

ble følgende resonnansverdier observert: 6 = 7,8 ppm (4H, aromatisk); 8,4 ppm (1H, amido); 6,5 ppm (2H; 0-CH2-0); 2-3 ppm (kompleks, 4H, &-CH2); y ~ c^ 2) 5 ppm

(1H, a -CH); 3,95 ppm (CH^ ester). Integrering av spekteret viste at forestringen av de frie syrefunksjonene med klormetylbenzoat var omkring 60%, og at i formelen av kopolymeren som vist nedenfor:

har indeksen følgende verdier: y = 0,6; z = 0,33 og u = 0,07.

Denne polymer er uoppløselig i vann, CH2C12, CHCl^ og eter; den ekspanderer uten å oppløses i metanol og etanol;

den oppløses lett i følgende oppløsningsmidler: aceton, metyletylketon; THF, AcOEt DMF, TFA, dikloreddiksyre (DCA). Tynne filmer av polymeren kan fremstilles ved å spre lag av

denne oppløsning på strubstrater og la dem fordampe.

Eksempel 2

Kopolymer av delvis metylert glutaminsyre og pivaloyloksy-etylglutamat.

Ved å følge fremgangsmåten beskrevet i det forutgående eksempel ble det fremstilt en kopolymer av glutaminsyre og metylglutamat ved gradvis hydrolyse av metylpolyglutamat i en vandig oppløsning av TFA. Den oppnådde kopolymer hadde formelen: 2 g av denne kopolymer ble oppløst i 50 ml tørr DMF, og 5,74 g (0,031 mol) tributylamin og 5,09 g (0,031 mol) a-kloretylpivalat (fremstilt ifølge referansen angitt ifølge ovenstående eksempel, ved innvirkning av pivaloylklorid på paraldehyd) ble tilsatt dråpevis. Etter fire dagers omrøring ved normal temperatur ble dette fortynnet med en stor mengde vann, hvilket utfelte polymeren i form av et fargeløst pulver som ble gjenoppløst, etter tørking, i aceton og utfelt på nytt med petroleumeter. To ytterligere rensetrinn ble deretter foretatt ved oppløsning i aceton og utfelling på nytt i petroleumeter, hvilket til slutt ga 1,8 g av produktet. Ved hjelp av NMR-analyse ble det fastslått at kopolymeren hadde følgende formel:

Glu(OMe)n oc-Glu(OH)n ,-Glu (O-CH (CH,,)-OOCt. Bu) n 1C

V,ZdU,b 3 U,lb Resultatene fra analysen var som følger: 6 = 1,35 ppm (s,ter-butyl); = 1,7 - 1,8 ppm (d, -CH(CH3)-)

6 = 6,8 ppm (-CH(CH3)-)

Denne polymeren er oppløselig i de oppløsningsmidler som er nevnt i foregående eksempel med unntagelse for kloroform.

Eksempel 3

Operasjonene beskrevet i forutgående eksempel ble gjentatt, denne gang ved bruk av en kopolymer med formelen Glu(OMe)Q 5-Glu(OH)Q ^ oppnådd som beskrevet ovenfor ved gradvis hydrolyse av poly(metylglutamat) idet tiden for dette var begrenset til seks timer. Det ble funnet at kopolymeren hadde nær tilsvarighet til den ovenfor angitte formel ved sammenligning av integrasjonsverdiene for protonene ved NMR, signalet ved 3,95 ppm (O-CH^) og det ved 5 ppm (a-CH). 1 g av denne polymeren ble omsatt med 2 ekvivalenter av a-kloretylpivalat i tre dager og ble deretter utfelt fra oppløsning i DMF med vann. Etter rensing som beskrevet i fo-egående eksempel ble det bestemt ved NMR-analyse som beskrevet ovenfor at formelen for kopolymeren var følgende:

Glu(OMe)Q 5-Glu(OH)Q 33-Glu(OCH(CH3)-OCO-t.Bu) Q 1?

Denne kopolymer er oppløselig i de ovennevnte oppløsnings-midler og også i CHCl^. Den er uoppløselig i polyetylenglykol 400.

Eksempel 4

3-bromftalid med formelen:

(3-brom-l(3H)isobenzofuran)

ved bromering av ftalid, ble fremstilt ifølge GB-A- 1 364 672, side 5.

2 g polyglutaminsyre og 5,74 g (2 ekvivalenter) av tributylamin oppløst i 35 ml tørr DMF og 16,7 g av ovennevnte bromftalid ble tilsatt til denne blanding. Etter noen minutter oppsto det en betydelig fortykning av opp-løsningen (gel) som ble oppløst ved tilsetning av 5 ml vann. Etter seks dagers omrøring ved romtemperatur ble 500 ml etanol tilsatt, og dette forårsaket utfelling av et fargeløst pulverformig produkt som ble filtrert, drenert, skyllet og tørket. Produktet ble oppløst igjen i 40 ml CHC13og renset ved utfelling med eter. Utbytte 2,77 g

(68%). Ved hjelp av NMR-analyse ble følgende resultater oppnådd: 6=8 ppm (4H, Bz + 1H, peptid.); 6 = 7,7 ppm (CH, laktonisk); a = 5 ppm (a-CH); 6=2-3 ppm (m, -CH2-CH2-).

Ved sammenligning etter integrering av forholdet mellom pro-tonet (a-CH) og de aromatiske protonene, ble det funnet at forestringen var 90%. Formelen for produktet oppnådd på denne måte er:

(NH-CH-CO)nQ-NH-CH-CO)., u , y u , ±

Dette produkt, som er meget oppløselig i CHCl^, er uoppløse-lig i vann, alkohol, glykolpolyetylen og ren aceton. Det er oppløselig i en blanding av aceton -CHCl^.

En tørr film med en tykkelse på flere ym av denne polymer ble fremstilt ved å spre en kloroformoppløsning på en glassplate og fordampe den. Denne film ble anbragt i en beholder inneholdende en 0,1 N oppløsning bufret ved pH 9,5 og det foregikk en langsom nedbrytning av polymeren som ble observert dag etter dag ved økningen i UV-absorpsjonen til oppløsningen (280 mm) som skyldtes tilstedeværelsen av ftalid som gravis ble dannet i bufferoppløsningen.

E ksempel 5

10 g av en 1/1 kopolymer av poly(y-metyl-L-glutamat) og poly(pivaloyloksymetyl-L-glutamat) fremstilt ifølge eksempel 2, ble oppløst i 75 ml kloroform og 5 g indometacin ("Sigma") ble tilsatt. En viskøs gul oppløsning ble derved oppnådd, og denne ble helt dråpevis under kraftig omrøring

i 1 liter destillert vann inneholdende 0,1% natriumdodecyl-sulfat (SDS). Denne oppløsning ble omrørt ved 40°C inntil kloroformen hadde fordampet fullstendig, hvilket ledet til en dispersjon av mikrosfærer. Disse ble filtrert og separert i porsjoner av forskjellige størrelser under anvendelse av kalibrerte sikter. Disse mikrosfærer lar seg oppløse i et isotermisk medium (pH 7,5) og frigjør over et langt tidsrom legemiddelet som de inneholder, idet fri-gjøringshastigheten varierer i overensstemmelse med deres gjennomsnittlige størrelse. Når en suspensjon av denne typen injiseres i et vev som er inflammatorisk infisert, er virkningen av legemiddelet mye lenger enn den til et konvensjonelt legemiddel med et indometacinbasert legemiddel .

Eksempel 6

Poly(pivaloyloksymetylglutamat)

Polyglutaminsyre ble fremstilt,fra metyl y-glutamat-N-karboksyanhydrid oppløst i metylenklorid; trietylamin

ble benyttet som en polymerisasjonskatalysator (A/T=100). Polymeren ble deretter utfelt ved tilsetning av metanol

og deretter vakuumtørket. Det faste stoffet ble oppløst igjen i trifluoreddiksyre (TFA) for derved å danne en 5 vekt-% opp-

løsning og et volum destillert vann ble tilsatt dråpevis under kraftig omrøring, idet dette volum var tilstrekkelig til at sluttoppløsningen inneholdt like volumdeler og TFA. Omrøring ble opprettholdt i ytterligere 24 timer ved romtemperatur (viskøs oppløsning), hvoretter hele innholdet ble helt i en stor mengde destillert vann, hvilket ledet til utfelling av polyglutaminsyren. Denne syren ble filtrert og tørket. Renheten til den således oppnådde syre ble kon-trollert ved NMR-analyse i TFA (fravær av metylesterbindingen -O-CH^ved 4,5 ppm). En analyse av molekylvekten ble foretatt ved hjelp av GPC (gelpermeasjonskromatografi)

i DMF på en bimodal "Dupont Zorbax PSM"-kolonne (polystyrenkalibrering) og følgende verdier ble målt: Mn= 226.000;

Mw = 397.000; Mz= 723.000; dispersivitet = 1,75.

Polysyren ble oppløst i DMF i en mengde på 5 vekt-% og

ved 50 ml av denne oppløsning ble 4 ml vann og 4,04 (0,04 mol) trietylamin tilsatt. Man fikk først en utfelling av tri-etylaminpolyglutamat, idet saltet deretter oppløste seg ved omrøring når vann ble tilsatt. Når alt var oppløst, ble 6,02 g klormetylpivalat (Fluka AG) tilsatt dråpevis og omrøring ble fortsatt i 4 8 timer ved romtemperatur. 50 ml vann ble deretter tilsatt, og dette forårsaket utfelling av et fargeløst fast stoff som ble filtrert, tørket og renset suksessivt ved oppløsning i aceton og utfelling med vann. Ved hjelp av NMR-analyse av produktet i TFA ble tilstedeværelsen av en terbutyl-topp ved 1,35 ppm observert. Integrering av spekteret viste at. forestringen av polyglutaminsyren var total.

Molekylvekten ble bestemt som ovenfor og ga følgende resultater: Mn= 30.480; Mw = 708.000; Mz= 297.000; dispersivitet = 3,54 (relativ viskositet n = 1,57, C = 0,2 g/dl i DMF). Sluttutbytte 51%.

Denne polymer er uoppløselig i vann, CH2C12, CHC13og eter; den utvider seg uten å oppløses i metanol og etanol; den oppløses lett i følgende oppløsningsmidler: aceton, metyletylketon; THF, AcOEt/DMF, TFA, dikloreddiksyre (DCA).

Tynne filmer av polymer kan fremstilles ved utspredning

av lag av disse oppløsninger på substrater og la dem fordampe. IR-spekteret bekrefter også den foreslåtte struktur (bredt bånd ved 1740 cm<-1>).

Eksempel 7

En tynn film av polymer oppnådd ifølge eksempel 6 ble fremstilt ved å spre et lag av 10% oppløsning i aceton og la det tørke i flere timer ved vanlig temperatur i luft. Flere prøver av filmen ble deretter neddyppet i en opp-løsning av 1% pancreatin i 0,1 M fosfatbuffet (pH 7,5),

og prøvene ble hensatt ved romtemperatur i 1-8 dager.

Etter første dag ble et merkbart tap i mekanisk motstandsevne (omtrent 50%) observert, og etter to dager hadde denne motstandsevne nesten forsvunnet totalt (prøven brakk i stykker). Etter 8 dager var prøven fullstendig dekomponert, og var ikke lenger synlig. Lignende resultater ble observert ved bruk av esterase eller leucinaminopeptidase.

Eksempel 8

Fremstilling av en kopolymer av pivaloyloksymetylglutamin-syreester og leucin.

Fremgangsmåten var som i eksempel' 6, men med utgangspunkt

i en 85/15 kopolymer av polyglutaminsyre og leucin og en 85/15 kopolymer av pivaloyloksymetylglutamat/leucin ble oppnådd. Polymerens NMR-spektrum i oppløsning i TFA viser at 100% av de laterale karboksylgruppene til polyglutaminsyre er forestret ved klormetylpivalat. Polymeren er også oppløselig i aceton, MEK, DMF, THF. Den ekspanderer i alkohol uten å oppløses. NMR-sprektrum: 6 = 1,35 ppm, 9 ter-butylprotoner, 6=1, 0, 6-isobutylprotoner. Integrering: forhold for grupper 85:15.

Eksempel 9

Fremstilling av isobutyloksymetylglutamatester-polymer.

Syntesen ble utført ved å starte med polyglutaminsyre fremstilt som beskrevet i eksempel 6; denne polymer ble oppløst i DMF som på forhånd var tørket på en molekylarsikt for derved å oppnå en 3,2% oppløsning. Til 20 g av denne oppløsning ble det tilsatt 1,83 g tributylamin (2 ekvivalenter) . I motsetning til det som ble observert med trietylamin, er det ikke nødvendig å tilsette vann for oppløsning. 1,36 g av klormetylesteren av isosmørsyre (fremstilt ifølge Ulich, J.A.C.S. 43, 662 (a92a) (kp 65°C/ 48 Torr) tilsettes deretter dråpevis til oppløsningen av tributylaminpolyglutamat og hensettes i tre dager under rysting, ved romtemperatur. Reaksjonsblandingen ut-

felles deretter med vann, oppløses igjen i aceton,

utfelles igjen med heksan, oppløses igjen i aceton og utfelles igjen med vann. NMR-analyse av den tørkede polymeren viser tilstedeværelsen av isobutyltopper (6 = 1,15 ppm, dublett) som er karakteristisk for det ønskede produkt,

og viste ved integrering 90% substitusjon (oppnådd 1,03 g 90%). Polymeren er også oppløselig i aceton, MEK, THF,

DMF. Både det infrarøde spektrum av en film støpt fra en oppløsning av TFA og elementæranalysen, tilsvarer den foreslåtte struktur.

Eksempel 10

Farmasøytisk preparat basert på poly(pivaloyloksymetyl-glutamat)-myknet PEG

5 g poly(pivaloyloksymetylglutamat) og 5 g polyetylenglykol 600 (Fluka, AG) og 2 g indometacin (Sigma) oppløses i 100 ml aceton. En film støpes fra denne oppløsning på en glassplate og oppløsningsmiddelet får fordampe. Den oppnådde film, oppvarmet til 50°C, smelter og kan støpes for dannelse av kapsler som, når de først er avkjølt og neddyppet i en isotomisk vandig oppløsning, tillater diffusjon av indometacin inn i mediet.

Eksempel 11

Syntese av poly(acetoksymetylglutamat)

Syntesen ble utført som i eksempel 9, men ved å starte med klormetylacetat.

Den oppnådde polymer er også oppløselig i aceton. Dens

NMR-spektrum viser tilstedeværelsen av en topp ved 3,2 ppm, som er karakteristisk for acetylgruppen (3 protoner). Polymeren oppløses i vandig kastisk soda N/100, idet den hydro-lyseres i løpet av noen minutter.

Eksempel 12

In vitrobionedbrytning av poly(pivaloyloksymetylglutamat)

Poly(pivaloyloksymetylglutamat), hvis metylgruppe er merket

14

med C, ble fremstilt ifølge eksempel 6. For dette formål ble klormetylpivalat syntetisert ved å la pivaloylklorid

14

reagere med paraformaldehyd merket med C, ifølge tek-nikken beskrevet i J.A.C.S., 89 (21), 5442 (1967).

Polymerens spesifikke aktivitet, målt ved forbrenning, er

3 yCie/g. 3 x 3 cm filmer ble fremstilt fra denne polymer fra oppløsninger i aceton eller i TFA. De oppnådde filmene bløtlegges enten i enzymatiske oppløsninger av leucinaminopeptidase fra svinenyre (Sigma, 3,7 enheter/ml.

0,1 tris-buffer, 5 mM MgCl2, pH 8,4), eller esterase fra svinelever (Sigma, 11,6 enheter/ml, 0,1 M tris-buffer,

pH 7,5). Nedbrytningshastigheten måles ved observasjon dels av polymerens tilsynekomst og dels ved å telle radio-

aktivitetsgraden hos oppløsningen. De enzymatiske opp-løsningene ble fornyet hver dag. Følgende resultater ble oppnådd:

Eksempel 13

Poly(pivaloyloksymetylglutamat) oppløses i aceton og

10 vekt-% polyetylenglykolpolymer 600 tilsettes. Oppløsningen heller på en "Teflon"-plate, og oppløsningsmiddelet får fordampe. Den oppnådde film er gjennomskinnelig og kan sveises termisk ved omtrent 120°C.

Eksempel 14

En polymer av aspartinsyre og leucin (se Polymer 16, 735

(1975) ) ble fremstilt ved kopolymerisasjon av |3-benzyl-aspartat NCA og leucin NCA (N-karboksyanhydrider) i ekvi-molekylare mengdeforhold. Benzylestergrupper transforestres med metanol for å oppnå kopolymeren poly-(3-metylaspartat/ leucin). Metylestergruppene blir deretter forsåpet med N/10 soda i metanol for å oppnå syren poly-(ASP(OH)/leu). Analyse av aminosyrene viser en leucinandel på 56% og en aspartinsyreandel på 44%. Molekylvekten Mner 35.000

(målt ved GPC).

1 g poly-(Asp(OH)/leu) oppløses i 20 g tørr DMF. 3,25 g tributylamin (4 ekvivalenter i forhold til ASP (OH)-gruppene) og 2,64 g klormetylpivalat (4 ekvivalenter). Dette hensettes i tre dager under omrøring ved romtemperatur. Polymeren utfelles i destillert H2O, oppløses igjen i aceton, utfelles i petroleumeter, oppløses igjen i aceton og utfelles igjen med H20. Den blir deretter tørket.

NMR-analyse viser at poly-(pivaloyloksymetylaspartat/leucin) virkelig er oppnådd, idet forestringshastigheten er omtrent 20%: 6 = 7,5 benzyliske protoner; 6=8 ppm, NH-protoner;

6 = 5,4 og 4,8, alfa-CH-protoner; 6 = 3,95, 0-CH3ikke-forsåpede protoner; 6 = 3,3 og 2, -CH2-protoner, 6 =

1,35 ppm,.t-butylprotoner). Til tross for relativ lav for-estringshastighet er kopolymeren oppløselig i aceton.

Eksempel 15

For sammenligningsformål studerte man hydrolysehastighetene

i et alkalisk medium av en kopolymer ifølge foreliggende oppfinnelse, merket som beskrevet i eksempel 7 (pivaloyloksy-metylleucinglutamat-kopolymer 85-15 ifølge eksempel 8) og metylleucinglutamatpolymer 85/15 ifølge tidligere teknikk fremstilt ved bruk av de vanlige kjente teknikkene ved

14

hjelp av metanol merket med C. Polymeren ifølge oppfinnelsen (A) ble omdannet til en film på omkring 0,25 mm ved anbringelse av et lag av acetonoppløsning på en glassplate som deretter ble utsatt for fordampning i luft. Den samme metoden ble fulgt for kontrollfilmen (B) med utgangspunkt i en oppløsning i TFA-syre. Denne filmen ble vasket forsiktig i vann for å eliminere eventuelle spor av TFA.

Filmene (A) og (B) ble neddyppet i pH 9,5 vandige oppløsnin-ger (fosfatbuffer) , under langsom omrøring og radioaktiviteten til produktene oppløst i oppløsningene ble målt ved inter-valler, og på denne basis ble hydrolysehastigheten til de testede polymerene beregnet.

Følgende resultater ble oppnådd, uttrykt som vekt-% hydroly-sert materiale etter en gitt tid (timer).

Det fremgår fra de ovenstående resultater at kopolymeren (A) dekomponerer i slik grad i løpet av 8-10 timer at et eventuelt innhold av legemiddel ville ha blitt oppløst fullstendig under slike betingelser, mens den tidligere kjente kopolymeren bare dekomponeres i liten graf etter 112 timer under de samme betingelsene.

Ved å variere leucinandelen i kopolymer (A) kan hydrolysetiden varieres; for en økning ved å øke nevnte andel og for en misking ved å redusere nevnte andel.

Claims

1. Polypeptid, karakterisert ved at det innbefatter bionedbrytbart acyloksymetyl- eller aroyloksymetyl-polyaspartat eller -polyglutamat med formelen:

hvor R 1 og R 2 er alkyl eller hydrogen, R er en substituert eller ikke-substituert alifatisk eller aromatisk rest; eller 2 1 R er alkyl eller hydrogen og R og R er sammenbundet for dannelse av en substituert eller ikke-substituert etylen-eller vinylenbro; og dets kopolymerer med andre aminosyrer med formelen:

1 2 hvor gruppene R, R og R har den ovenfor angitte betydning, og hvor R <1> er en fri eller delvis eller fullstendig forestret aminosyrerest; n er 1 eller' 2, og x som er lik y + z er valgt slik at den molekylære masse til polypeptidet ikke er mindre enn 5000 D.

2. Polypeptid ifølge krav 1, karakterisert ved at R er valgt fra metyl-, etyl-, isopropyl-, isobutyl-, tert-butyl-, fenyl- og benzylrester.

3. Polypeptid ifølge krav 1, karakterisert ved at når R og R1 er sammenbundet, er bindings- kjeden dannet av disse grupper valgt fra de med følgende formler: -CH2 -CH2 -; -CH= CH-; -CH(CH3 )-CH(CH3 ); -C(CH3 )=C(CH3 )-; 1,2-fenylen; cykloheksenylen; cyklopentenylen, cyklopenta-dienylen.

4. Polypeptid ifølge krav 1, karakterisert ved at forbindelse I er valgt fra acyl- og aryloksymetylglutamater og -aspartater, og at forbindelse II er valgt fra acyl- og aryloksymetylglutamat- eller -aspartat kopolymerer med en eller flere andre aminosyrer valgt fra alanin, leucin, valin og fenylalanin.

5. Polypeptid ifølge krav 1, karakterisert ved at kopolymer II er valgt fra glutamat-eller aspartat-kopolymer I med, tilsvarende, glutaminsyre og/eller laverealkylglutamater og aspartinsyre og/eller laverealkylaspartater.

6. Polypeptid ifølge krav 4, karakterisert ved at acylgruppen er valgt fra acetyl, propionyl, butyryl, isobutyryl, pivaloyl, benzoyl og fenyl-acetyl.

7. Anvendelse av polypeptid I og dets kopolymerer II ifølge krav 1, som et legemiddelreservoar med forsinket effekt i organismen, idet legemiddelet frigjøres progressivt til sitt bestemmelsessted som en følge av bionedbrytning av bærerpolymeren.

8. Anvendelse ifølge krav 7, karakterisert ved at legemiddelet og polymeren blandes på homogen måte, og at blandingen formes til en farmasøytisk akseptabel form.

9. Anvendelse ifølge krav 8, karakterisert ved at en polyalkylenglykol innblandes i poly meren for å mykgjøre den, et legemiddel tilsettes dertil, hvoretter det således oppnådde termoplastiske produkt varme-støpes for dannelse av granulater, staver, kapsler eller andre partikler som er egnet for administrasjon på vanlig måte.

10. Anvendelse av polymerer I og kopolymerer II ifølge krav 1, for fremstilling av. bionedbrytbare implanterin-ger og proteser som kan anvendes innen kirurgi.

11. Fremgangsmåte for fremstilling av et polypeptid med formel I, karakterisert ved at den tilsvarende polyaminosyren omsettes i form av dens tertiære aminsalt med halogenmetylesteren

1 2 hvor X = Cl, Br eller I, og R og R har den ovenfor angitte betydning, idet forbindelsen I dannes under samtidig elimine-ring av det tilsvarende aminsalt av hydrohalogensyren.

12. Fremgangsmåte for fremstilling av kopolymeren med formel II, karakterisert ved at den utføres som angitt i krav 11 ved å begynne med den tilsvarende kopolyaminosyren.