FI73448B

FI73448B - Biologiskt soenderfallande polypeptid och dess anvaendning foer en stegvis skeende frigoering av laekemedel.

Info

Publication number: FI73448B
Application number: FI850835A
Authority: FI
Inventors: Daniel Bichon
Original assignee: Battelle Memorial Institute
Priority date: 1983-07-01
Filing date: 1985-02-28
Publication date: 1987-06-30
Also published as: US4675381A; DK88385A; NO850771L; FI850835L; DE3463211D1; EP0130935A1; FI850835A0; FI73448C; EP0130935B1; WO1985000372A1; DK88385D0; AU2698684A; CA1241322A; EP0150184A1; JPS60501759A; ATE26584T1

Description

1 73448

Biologisesti hajoava polypeptidi ja sen käyttö lääkeaineiden vähittäiseen vapauttamiseen Tämän keksinnön kohteena on uusi biologisesti hajoava este-röity polypeptidi, johon voidaan liittää lääkeaineita, jotka sitten vapautuvat vähitellen sitä mukaa kun polymeeri hajoaa biologisesti.

Useita vuosia on tunnettu myrkyttömiä biologisesti hajoavia polymeerejä, joita voidaan käyttää lääkeaineiden kantajina ja jotka mahdollistavat niiden kontrolloidun vähittäisen vapautumisen elimistöön kantajapolymeerin hajotessa. Yleistietoja tällaisista aineista löytyy teoksesta: "Fundamental

Aspects of Biocompatibility", jonka on kirjoittanut D.F. Williams, CRC Press (1981). Kts. myös US-patenttijulkaisu 4 093 709.

Näistä polymeereistä mainitaan tarkemmin synteettiset poly-peptidit (polyaminohapot) , joiden rakenne on samankaltainen kuin proteiinien. Polypeptidit ovat biologisesti käyttökelpoisia ja niiden hajoamistuotteet (aminohapot) pystyvät imeytymään elimistöön. Niinpä Sidman et ai (J. Membr. Sei (1980), 7(3), 277-91) ovat tehneet tunnetuksi glutamiiniha- pon ja etyyli-γ-glutamaatin kopolymeerin, jonka hajoamisno-peus riippuu kopolymeerin koostumuksesta (esteröityneiden osien ja esteröitymättömien osien moolisuhteista) ja joka mahdollistaa lukuisien lääkeaineiden, etenkin steroidien, peptidien, malarialääkkeiden, syöpälääkkeiden ja muiden varastoimisen. Sellaisia polymeerejä voidaan käyttää sauvoina, jotka sisältävät seoksena halutun lääkeaineen, tai kapseleina, joiden sisällä lääkeaine on, jos sitä ei voida sekoittaa polymeeriin.

Huolimatta edellä mainitun aineen eduista on jatkettu laa dultaan paremman tuotteen etsimistä, jolla olisi etenkin seuraavat ominaisuudet: TT- - 2 73448 1. Erinomainen liukenevuus useimpiin tavanomaisiin lääk keisiin soveltuviin syövyttämättorniin liuottimiin (tunnetut polyaminohappojohdannaiset liukenevat nimittäin yleensä vain tiettyihin erityisliuottimiin (DMF, pyridiini, F3CCOOH), joiden käyttö on epämukavaa farmaseuttisissa tuotteissa) .

2. Lämpömuovattavuus. Tällä hetkellä tunnettuja synteettisiä polypeptidejä ei nimittäin yleensä voida sekoittaa tavanomaisiin biologisesti käyttökelpoisiin pehmittimiin (po-lyalkyleeniglykoleihin) eivätkä ne siitä syystä ole lämmös-s ä pehmenev i ä.

3. Parempi hajoamisprosessin kontrolli. Tunnettujen synteettisten polypeptidien hajoamisnopeus on nimittäin sidoksissa vaikeasti toistettavasti niiden kemialliseen rakenteeseen ja varsinkin niiden esteröitymisasteeseen. Niinpä eräässä annetussa tapauksessa (kts. Sidman K.R. et ai., PB 81-132136 NTIS (1980), s. 42) noin 10 %:n muutos esteröity-misasteessa muuttaa hajoamisnopeuden 1:stä satakertaiseksi (kts. myös edellä mainittu viitejulkaisu: Sidman).

Keksinnön mukaisella polymeerillä on saatu aikaan nämä parannukset. Kysymyksessä on kaavan -(NH-CH-CO)χ- (I)

(CH2)n-COO-CR1R2-OOC-R

mukainen esteröity polypeptidi, jossa kaavassa R* ja R2 ovat alkyyliryhmiä tai vety, R:n ollessa jokin substituoitu tai substituoimaton alifaattinen tai aromaattinen jäännös, tai R2 on vety tai jokin alkyyli ja toisiinsa sidotut R* ja R ovat substituoituja tai substituoimattomia metyleeni- tai metenyyliryhmiä, n on 1 tai 2 ja x on sellainen, että mole-kyylipaino on ainakin 5000.

3 73448

Kuten kaavasta I nähdään, keksinnön mukainen polymeeri on polyaspartaatti tai polyglutamaatti, joka on esteröity jollakin asyylioksimetanolijohdannaisella (HO-CR1r2-OOCR), jossa R on joko mikä tahansa orgaaninen jäännös tai liittynyt R-*-:een, jolloin muodostuu rengas. "Mikä tahansa" tarkoittaa, että R-ryhmän laatu tai rakenne ei ole kriittinen ja että tähän mennessä ei ole tavattu tapausta, jossa R :n kuuluessa RCOO-ryhmän Sisältäviin tavanomaisiin yhdisteisiin vastaavaa keksinnön mukaista komponenttia ei olisi saatu. On kuitenkin suositeltavaa käyttää yhdisteitä, joissa R on jokin substituoitu tai substituoimaton alifaattinen tai aromaattinen ryhmä, jolloin substituentit valitaan biologisesti käyttökelpoisista orgaanisista ryhmistä. Hyviksi havaituista R-ryhmistä mainittakoon metyyli-, etyyli-, propyy-li-, isopropyyli-, isobutyyli-, tert-butyyli-, fenyyli-, bentsyyli- ja muut samankaltaiset ryhmät. Muutkin yhdisteet ovat tietysti mahdollisia, mutta on selvää, että keksijä ei käytettävissään olleen ajan puitteissa ole ehtinyt tutkia niitä kaikkia.

Kun R ja R* ovat sitoutuneet toisiinsa muodostaen tyydyttyneen tai tyydyttymättömän hiili-hiili-sidoksen sen hiiliatomit voidaan substituoida tai jättää substituoimatta alifaat-tisilla tai aromaattisilla ryhmillä. Seuraavassa esitetään joitakin keksintöä rajoittamattomia esimerkkejä sellaisista substituoiduista tai substituoimattomista esterilaktaaliryh-mistä o-cr2-o-co

R1 — R

jotka vastaavat edellä mainittua määritelmää: dimetyleeni- ryhmä -CH2-CH2-; dimetyylietyleeniryhmä -CH(CH3)-CH(CH3)-; vinyleeniryhmä -CH=CH-; 1,2-fenyleeniryhmä <55- ; syklohek-senyleeni Qc ; syklopentenyleeniryhmä CC : syklopenta- dienyyli <> ynnä muut.

τ- 4 73448

Keksinnön mukainen polymeeri voi esiintyä myös kopolymee-rinä muiden polyaminohappojen kanssa. Tällöin saadaan kaavan R' -(NH-CH-CO)y-(NH-CH-CO)z- (II)

(cH2)n-C0°-CR1R2-00C-R

mukainen kopolymeeri, jossa kaavassa R on mikä tahansa esto-röity tai esteröimätön aminohappojäännös, yksikköjen -(NH-CHR1-CO)- ryhmät R' voivat olla samoja tai erilaisia kopolymeerin ketjussa, kun y + z = x, ja x:n arvoksi valitaan aina sellainen, että kopolymeerin keskimääräinen mole-kyylipaino on ainakin 5000. Tietysti jos R' on sama kuin ryhmä -(CH2)-COO-CR1R2-OOC-R, n:ien ollessa kuitenkin erilaiset (yhden ollessa 1 ja toisen 2), saadaan esteröity glu-tamiinihapon ja aspargiinihapon kopolymeeri. Yleensä kuitenkin R' :ksi valitaan mieluiten erilaisia ryhmiä kuten esimerkiksi metyyli (alaniini), isopropyyli (väliini), isobu-tyyli (leusiini ja isoleusiini), bentsyyli (fenyylialanii-ni) jne. Periaatteessa kaikki muutkin aminohapot ovat mahdollisia, vaikkakaan niitä kaikkia ei itsestään selvistä syistä ole voitu kokeilla. R' voi myös tarkoittaa jotakin glutamiinihapon tai aspargiinihapon jäännöstä, jota ei ole esteröity tai joka on esteröity osaksi millä tahansa alkoholilla, esimerkiksi MeOH:lla tai EtOH:lla, eli esimerkiksi -(CH2)-n-C°OH tai -(CH2)n-C00Me.

Yhtä hyvin voitaisiin käyttää myös L- ja D-sarjan aminohappoja. L-sarjan aminohapot (eli luonnolliset) ovat edullisempia, sillä ihmiskehon entsyymit (proteaasit) pystyvät hajoittamaan niitä sisältäviä polypeptidejä, mutta eivät sen sijaan D-yksiköistä muodostuvia polypeptidejä. Tätä eroavuutta voidaan käyttää hyväksi aminohappoja D ja L sisältävien kopolymeerien ansiosta, jolloin saadaan polymeerejä, joiden hajoamisnopeus on erilainen.

5 73448

Yleisempiin seikkoihin palaten huomattakoon, että kaavan II mukaisessa kopolymeerissä toisen vapaan tai osaksi esteröi-dyn polyaminohapon moolisuhde antaa myös mahdollisuuden säädellä huomattavassa määrin kopolymeerin biologista hajoamista riippuen vaikuttavista aineista, joita on läsnä organismissa siinä, mihin kopolymeerin ja nautittavan lääkkeen seoksen on tarkoitus kohdistua (toisin sanoen elimessä, johon lääkkeen on määrä vaikuttaa). Niinpä esimerkiksi jos kopolymeeri on kaavan I polyglutamaatin ja leusiinin kopoly-meeri, on näiden kahden aineosan moolisuhde valittava polyglutamaatin ja polyleusiinin kysymyksessä olevassa paikassa tapahtuvan hajoamisen suhteellisen nopeuden mukaan. Yleensä suhde z/y voi vaihdella 1-30, mutta nämä rajat voidaan tarpeen vaatiessa ylittää. Tietysti jos ryhmä R' ei tarkoita kopolymeeriketjussa yhdenlaatuista ryhmää toisin sanoen esimerkiksi kun yksi R':istä tarkoittaa jotakin vapaata aminohappo jäännöstä ja toinen R’ tarkoittaa jotakin esteröityä aminohappojäännöstä, voidaan mukavuuden vuoksi merkitä R'-variantit merkeillä R' ' , R' ' ' jne. Tällaisen kopolymeerin yleinen kaava voidaan tällöin merkitä seuraavasti: R. R. . R' ' 1

l I I

-(NH-CH-CO)y-(NH-CH-CO)z-(NH-CH-CO)u-(NH-CH-CO)v

(CH2)n-COO-CR1R2-OOCR

jossa y:n, z:n, u:n, v:n jne. summa on yhtä kuin x; u, v jne. voivat olla tietysti myös nolla, jos R':n tarkoittama jäännös on yhtä laatua. Tyypillinen tapaus, jossa kopolymeerin R' ja R' ’ ovat erilaiset, on sellainen, jossa nämä ryhmät tarkoittavat esteröityjä tai esteröimättömiä gluta-miini- ja/tai aspargiinihappojäännöksiä, tällaisen polymeerin kaava (erityistapauksessa, osaksi metyloituna) ollessa seuraavanlainen: (CH2)n-COOH (CH2)n-COOMe -(NH-CH-CO)y-(NH-CH-CO)z ----- (NH-CH-CO)u-

(CH2)n-COO-CRlR2_ooc R

6 73448

Ryhmän R laatu voi sekin vaikuttaa kaavan I mukaisen polymeerin hajoamisnopeuteen. Niinpä esimerkiksi jos R on jokin laaja tai täysinäinen ryhmä (esimerkiksi tert-butyyli), hajoaminen tapahtuu hitaammin kuin jos se on metyyli- tai etyyliryhmä.

On selvää, että optisen isomerian kannalta katsottuna keksinnön mukaiset polymeerit voivat sisältää L- tai D-konfigu-raation osia tai raseem.isia seoksia tai vielä polymeerejä, joissa toinen konfiguraatioista on hallitsevana. Näiden eri yhdistelmien biokemialliset ominaisuudet eivät tietenkään ole samanlaisia, sillä polymeereihin, joissa luonnolliset muodot (L) ovat vallitsevina, entsyymien hajotustoimin-ta pääsee paremmin käsiksi. Niiden hajoavuutta voidaan siis hallita annostelemalla kopolymeerissä näiden kahden muodon määräsuhdetta.

Kaavan I mukaiset polymeerit ja kaavan II mukaiset kopoly-meerit ovat veteen liukenemattomia ja yleensä liukenevia johonkin tai useisiin tavallisista liuottimista kuten asetoniin, metyylietyyliketoniin (MEK), tetrahydrofuraaniin (THF), dioksaaniin, etyyliasetaattiin, monoglykolidimetyyli-eetteriin, diglykolidimetyylieetteriin ja muihin, jolloin voidaan helposti muuttaa palloiksi, sauvoiksi, kuiduiksi, filamenteiksi, mikrokapseleiksi, kalvoiksi jne. Kaavojen I ja II mukaiset polymeerit voivat rakenteeestaan riippuen olla kloorattuihin liuottimiin, kuten esimerkiksi kloroformiin, liukenevia tai liukenemattomia. Eräissä tapauksissa, kun ne eivät liukene kloroformiin, asiaan saadaan parannusta lisäämällä tällaiseen liuottimeen hieman asetonia. Tämä seikka, että ne liukenevat useisiin veteen sekoittuviin tai sekoittumattomiin liuottimiin, tekee ne myös ilman muuta sopiviksi moniin nestemäisiin tai samoihin liuottimiin liukeneviin lääkkeisiin. Niinpä esimerkiksi kun halutaan panna jokin veteenliukeneva aine polymeerimikropallon sisään, voidaan käyttää tunnettua tekniikkaa, jossa lääkkeen vesiliuos dispergoidaan polymeeriliuokseen, joka sisältää jotakin ve 7 73448 teen sekoittumatonta liuotinta, ja sitten haihdutetaan tämä liuotin, jolloin muodostuu kiinteitä polymeerikapseleita.

Lisäksi rakenteestaan riippuen kaavan I mukainen polymeeri sopii usein erittäin hyvin polyalkyleeniglykoleihin (poly-etyleeniglykoliin ja polypropyleeniglykoliin), jolloin näitä polyeetteriglykoleita voidaan käyttää kaavan I raukaisen polymeerin pehmentiminä, jolloin saadaan homogeeninen seos, jonka sulamispiste on alhainen. Tällaiseen seokseen voidaan yhdistää koko joukko erilaisia termolabiileja lääkeaineita (sulamispiste noin 40-60°C) ja tehdä niistä rakeita tai mikrokapseleita. Lisäksi erittäin hydrofiilisten poly-alkyleeniglykolien läsnäololla voidaan vielä lisätä polymeerin tai kopolymeerin herkkyyttä biologisille vettä sisältäville nesteille ja helpottaa niiden entsymaattista hajoamista in situ. Huomattakoon, että tunnetuilla synteettisillä polypeptideillä ei ole suotuisia liukenevuusominaisuuksia eivätkä ne sovi polyetyleeniglykolien kanssa. Niinpä esimerkiksi kun halutaan valmistaa polyglutamiinihappokalvoja, joilla on hyvä mekaaninen kestävyys ja tietty liukoisuus veteen, joudutaan käyttämään liuoksia, joissa on käytetty suhteellisen hankalasti käsiteltäviä ja lääkkeiden valmistuksessa vähän arvostettuja liuottimia kuten dimetyyliformami-dia (DMF), dikloorietikkahappoa (DCA) ja trifluoretikkahap-poa (TFA). Polyglutamiinihappokalvoilla, jotka on valmistettu vesiliuoksista (joiden pH on 7,4 eli joissa happo on ainakin osaksi suolana), ei ole minkäänlaista mekaanista lujuutta ja ne liukenevat nopeasti veteen, mikä tekee polymeerin täysin sopimattomaksi hitaasti vapautuvan lääkeaineen kantajaksi keksinnön tarkoittamassa mielessä. Samoin on muuten asianlaita polyglutami inihapon ja polyetyleenicj]Lyk:0-lin seosten kohdalla, jotka liukenevat hetkessä veteen.

Kaavan I mukaisen polymeerin biologinen hajoaminen voidaan esittää kaavamaisesti seuraavalla tavalla: 8 73448 -(NH-CH-CO) -(NH-CH-CO)- + r1r2c=0

I h2° I

(CH2)n~C00~CRlR2-0°CR ---9 (CH2)n-COOH + RCOOH

h2o.

(D . .

peptidaasi

HoN-CH-COOH

(CH2)n-COOH

Reaktio (5) seuraa reaktiota Q} ja tästä syystä polymeeri hajoaa biologisesti sitä nopeammin, mitä suurempi on laktaa-li- tai asyylioksialkyyliesterin hydrolyysinopeus. Tämäntyyppisten estereiden hydrolyysimekanismi on sinänsä tunnettu ja sitä on selvitetty amp.isilliinin estereiden (esimerkiksi pivampisilliinin) tutkimuksen yhteydessä, kts. tästä asiasta seuraavaa viitejulkaisua: "Design of biopharmaceuti- cal Properties through Prodrugs and Analogs", B. Roche, toim., American Pharmaceutical Association (ISBN 0-917330-16-1), sivut 212 ja 354 (1977). Huomattakoon, että kun r2 on vety ja Ri on jokin alkyyli (esimerkiksi metyyli), reaktiossa 0 syntyvä yhdiste on jokin aldehydi R-*--CH0 (esimerkiksi asetaldehydi), tällaisten aldehydien ollessa myrkyllisyyssyistä biologisesti edullisempia kuin jos Ri = R2 = H. Mitä tulee keksinnön tähän piirteeseen, tuotteet, joita saadaan reaktiosta (i) silloin, kun R ja R1 ovat sitoutuneet toisiinsa (ketohappoja tai aldehydihappo-ja), ovat nekin erittäin edullisia vähäisen myrkyllisyytensä vuoksi. Niinpä jos sidos R-Ri on etyleeni- tai 1,2-feny-leeniryhmä, hajoamistuotteet ovat vastaavasti 3-formyyli-propioni- ja O-formyyli-bentsoehappoja, jotka poistuvat hitaasti elimistöstä ilman sivureaktioita.

Il 9 73448

Kaavan I mukainen polymeeri voidaan valmistaa esteröimällä suoraan jokin vastaava polyaminohapon suola jollakin asyyli-oksimetyylihalogenidi1la (X-CR^R^-OCO-R (III)), jossa X on kloori-, bromi- tai jodiatomi. Polyaminohapposuola on mieluiten jokin tertiäärisen amiinin (esimerkiksi tributyyli-amiinin tai trietyyliamiinin) suola. Tällaisen tekniikan on tehnyt tunnetuksi W.V. Dachne; J. Med. chem. 1_3, 607-12, 1971). Lisäksi kaavan III mukaisten yhdisteiden (X = Cl) synteesi tunnetaan (kts. Z.H. Urich, J.A.C.S. 43, 662, (1921)) ja siinä annetaan happokloridin RC0C1 reagoida formaldehydin kanssa ZnCl2-anhydridin ollessa läsnä katalyyttisenä määränä.

Polyaminohappo tai kopolyaminohappo, jota esteröimällä saadaan kaavan I mukainen polymeeri tai kaavan II mukainen ko-polymeeri, saadaan helposti tavanomaisella menetelmällä, jossa kaavan

H2N-CH-C00H

(cH2)n-COOH

mukaisen hapon sivuhaaran karboksyyli esteröidään jollakin alemmalla alkoholilla, esteri muutetaan vastaavaksi N-kar-boksianhydridiksi (NCA) fosgeenilla dioksaani- tai THF-väli-aineessa, NCA polymeroidaan esteröityneeksi polyaminohapoksi ja suojaesteriryhmä hydrolysoidaan alkalisessa väliaineessa tai trifluoretikkahapolla. Tällaiset menetelmät ovat sinänsä tunnettuja (kts. esimerkiksi Encyclopedia of Polymer Science and Technology; N-carboksyanhydrides, voi. II, sivu 837). Kun halutaan saada kopolymeeri, jossa R' tarkoittaa jotakin osaksi esteröityä sivuhaaran karboksyy-liä ( R' * - (CH2)n-C00H ja R" = - (CH2 )n-COOAlk), on huolehdittava siitä, että suojaesteriryhmän hydrolysoituminen tapahtuu vain osaksi. Niinpä esimerkiksi lähtöaineena, joka on määrä esteröidä yhdisteellä XCR^R^-OCOR, tulee olla H2N-CH/7CH2)n-COOH/-COOH -hapon ja m^-CH/TCHj)n~C00 Alk/-C00H- esterin kopolymeeri.

10 73448

Kaavan I mukaista polymeeriä ja kaavan II mukaista kopo-lymeeriä voidaan käyttää lääkeaineiden kantajina eri tavoin. Niinpä esimerkiksi näitä polymeerejä I ja kopolymee-rejä II voidaan käyttää jotakin lääkeainetta sisältävien mikrokapseleiden valmistamiseen. Tällaisissa rnikrokapse-leissa on polymeerikalvo ja ne sisältävät vesi- tai öljyliu-oksen, johon lääke on suspendoitu tai liuotettu. Samoin voidaan valmistaa mikropalloja, toisin sanoen kiinteitä rakeita tai palloja, jotka sisältävät lääkeaineen dispergoitu-na tai jähmeänä liuoksena polymeeripohjassa. Voidaan val mistaa myös mikrohuokoisia tuotteita, joita nimitetään mik-rosieniksi. Yleensä näitä polymeerejä voidaan käyttää kaikenlaisiin hitaasti vapautuvien lääkkeiden valmistukseen, toisin sanoen sellaisten lääkkeiden valmistukseen, jotka vapauttavat lääkeaineen pitkän ajan kuluessa sitä mukaa kun kantaja-aine hajoaa. Eräs tällaisten menetelmien kuvaus löytyy seuraavista teoksista: "Biodegradables and Delivery

Systems for Contraception", Mafez E.S.E., MTP Press Limited (1980); "Controlled Release Technologies = Methods, Theory and Applications", Voi. 1 ja 11, A.F. Kydonieus, CRC Press (1980) ja "Microencapsulation - New Techniques and Applications", Tamotsu Kondo, Techno Inc. (1979) Japan. Näiden polymeerien liukenevuus moniin liuottimiin, olivatpa ne sitten veteen sekoittuvia tai sekoittumattomia, on etu niiden käytön kannalta näissä viite julkaisuissa selitetyissä menetelmissä. Näistä polymeereistä voidaan myös valmistaa lankoja puristamalla niiden liuosta kehruusuuttimen läpi ja saostamalla lanka joko haihduttamalla tai ei-liuottavalla kylvyllä tavanomaisin kehruumenetelmin. Tällä tavoin valmistettuja lankoja voidaan neuloa, solmia tai kutoa kankaaksi ompeleiden, siteiden tai putkimaisten rakenteiden valmistamiseksi, joita voidaan käyttää keinotekoisina valtimoina, verisuonina, kanavina tai sisäeliminä väliaikaista käyttöä varten. Keksinnön mukaisia polymeerejä voidaan käyttää myös joko sellaisenaan tai johonkin pehmittimeen sekoittui-na kalvojen tai kirurgisten proteesien valmistukseen, joita voidaan käyttää esimerkiksi murtuneiden luiden vahvistami-

II

11 73448 seen, klipseinä, nauloina, ruuveina, vahvikelevyinä, tamponeina jne., jolloin näitä tarvikkeita voidaan valmistaa valamalla tai puristamalla liuoksesta, lämpömuo vaarna l la tai työstämällä kiinteistä polymeerikappaleista. Koska tällaiset proteesit imeytyvät elimistöön, elimistö eliminoi ne vähitellen eikä tällöin tarvitse suorittaa uutta leikkausta vahvike- tai tukiosan poistamiseksi, kuten tällä hetkellä tehdään.

Tietysti käytettävän polymeerin tai kopolymeerin tarkkaa koostumusta voidaan säädellä hajoamisnopeuden ja absorptio-ominaisuuksien in vivo mukaan riippuen kysymyksessä olevan proteesin laadusta.

Seuraavat esimerkit valaisevat keksintöä.

Esimerkki 1

Bentsoyylioksimetyylipolyglutamaatin, glutamiinihapon ja me-tyyliglutamaatin kopolymeeri.

Osaksi metyloitu polyglutamiinihappo valmistettiin metylee-nikloridiin liuotetusta metyyli- y-glutamaatti-N-karboksian-hydridistä; trietyyliamiinia käytettiin polymerisaation käynnistäjänä (A/l=100). Sitten polymeeri saostettiin lisäämällä metanolia, minkä jälkeen se tyhjökuivattiin. Kiinteä aine liuotettiin uudelleen trifluoretikkahappoon (TFA) 5-painoprosenttisen liuoksen aikaansaamiseksi ja lisättiin pisaroittaan voimakkaasti sekoittaen tislattua vettä tarpeellinen määrä, jotta lopulliseen liuokseen tuli samat t.i-lavuusmäärät vettä ja TFA:a. Liuosta pidettiin vielä 12-15 tuntia sekoittaen huoneenlämpötilassa (viskoosi liuos), minkä jälkeen se kaadettiin suureen ylimäärään tislattua vettä, mikä aiheuttaa metyyliglutamaatin ja polyglutamiini-hapon kopolymeerin saostumisen, metyyliesterin hydrolysortumisen ollessa tapahtunut noin 60-70-prosenttisesti. Tämä kopolymeeri suodatettiin ja kuivattiin. Näin saadun kopolymeerin vapaitten ja esteröityneiden COOH-ryhmien suhteelli 73448 12 set määrät kontrolloitiin NMR-analyysillä TFA:ssa (inetyy-liesteri-kaistan -0-CH3 integraatio 3,95 ppm:ssa). Molekyy-lipainoanalyysi suoritettiin GPCrllä (geelisuodatuskromato-grafialla) DMF:ssä bimodaalisella DUPORT ZORBAX PSM -kolonnilla (vertailu polystyreenillä); mitattiin keskimääräinen molekyylipaino Mn 226 000 ja dispersio (Mw/Mn) 1,75.

1,22 g kopolymeeriä liuotettiin 45 ml:aan DMF:a ja lisättiin 3,5 g tributyyliamiinia. Sitten lisättiin pisaroittaan 3,25 g julkaisun Ulich, J.A.C.S. 4_3, 662 (1921) mukaan valmistettua kloorimetyylibentsoaattia ja jatkettiin sekoittamista 48 tuntia huoneenlämpötilassa. Sitten lisättiin 50 ml vettä, jolloin saostui väritön kiinteä faasi, joka suodatettiin, kuivattiin ja puhdistettiin liuottamalla peräjälkeen asetoniin ja seostamalla eetterillä, sitten liuottamalla asetoniin ja saostamalla vedellä. Kun tuote analysoitiin NMR-menetelmällä TFA:ssa, todettiin seuraavat resonanssit: S = 7,8 ppm (4H, aromaattisia); 8,4 ppm (1H, amido) ; 6,5 ppm (2H; O-CH2-O) ; 2-3 ppm (kompleksi, 4H, ^-CF^); -CH2) 5 ppm (1H, cx-CH); 3,95 ppm (CH3 esteri). Spektri-in tegraatio osoitti, että vapaiden happoryhmien esteröitymi-nen kloorimetyylibentsoaatilla oli tapahtunut 60-prosentti-sesti ja että alla olevassa kopolymeerin kaavassa: (CH2)2-COO-CH3 (CH2)2“COOh -(NH-CH-CO)y-(NH-CH-CO)z-(NH-CH-CO)u-(CH2)2-COO-CH2-OOCPh indeksien arvot ovat seuraavat: y = 0,6; z = 0,33 ja u = 0,07.

Tämä polymeeri ei liukene veteen, CH2Cl2:iin, CHCl3:iin eikä eetteriin; se turpoaa liukenematta metanolissa ja etanolissa; se liukenee helposti seuraaviin liuottimiin: aseto ni, metyylietyyliketoni; THF, AcOEt, DMF, TFA, dikloorietik-kahappo (DCA). Voidaan valmistaa ohuita polymeerikalvoja levittämällä substraateille näiden liuosten kerroksia ja an- 13 7 3 4 4 8 tamalla niiden haihtua.

Esimerkki 2

Osittain metyloidun glutamiinihapon ja pivaloyylioksietyyli-glutamaatin kopolymeeri.

Edellä selitetyn esimerkin mukaisella menetelmällä valmistettiin glutamiinihapon ja metyyliglutamaatin kopoly^eeri hydrolysoimalla asteittain metyylipolyglutamaattia TFArn vesiliuoksessa. Saadulla polymeerillä oli kaava

Glu (OMe) g, 25-^u (GH) 0,75 2 g tätä kopolymeeriä liuotettiin 50 ml:aan kuivaa DMF:a ja tähän liuokseen lisättiin tipoittain 5,74 g (0,031 moolia) tributyyliamiinia ja 5,09 g (0,031 moolia) oc-kloorietyyli-pivalaattia (valmistettu edellisessä esimerkissä mainitun viitejulkaisun mukaan antamalla pivaloyylikloridin vaikuttaa paraldehydiin). Kun liuosta oli sekoitettu 4 vuorokauden ajan huoneenlämpötilassa, se laimennettiin ylimäärällä vettä, jolloin polymeeri saostui värittömänä jauheena, joka liuotettiin uudelleen kuivatuksen jälkeen asetoniin ja seostettiin uudelleen petrolieetterillä. Suoritettiin vielä kaksi puhdistusvaihetta liuottamalla asetoniin ja seostamalla uudelleen petrolieetterillä, jolloin lopuksi saatiin 1,8 g tuotetta. NMR-analyysillä voitiin todeta, että kopolymeeri vastasi seuraavaa kaavaa:

Glu(OMe)0# 25-Glu(OH)0f6~G1u(0-CH(CH3)-OOCt.Bu)o,15

Analyysitulokset olivat seuraavat: S = 1,35 ppm (s, tert-bu tyyli); S - 1,7 - 1,8 ppm (d, -CH(CH3)-) S= 6,8 ppm (-CH(CH3)-) 73448 14 Tämä polymeeri liukenee edellisessä esimerkissä mainittuihin liuottimiin kloroformia lukuunottamatta.

Esimerkki 3

Toistettiin edellisessä esimerkissä selitetyt vaiheet käyttämällä tällä kertaa kaavan Glu(OMe)q 5-Glu(OH)q,5 mukaista kopolymeeriä, joka saatiin kuten edellä selitettiin hydrolysoimalla asteittain metyylipolyglutamaattia, hydrolyysiajän rajoittuessa 6 tuntiin. Todettiin kopolymeerin vastaavan todella edellä mainittua kaavaa vertaamalla protonien inte-graatioarvoja NMR:ssä, signaali 3,95 ppmrssä (0-CH3) ja 5 ppm:ssa ( cVCH).

1 g:n tätä kopolymeeriä annettiin reagoida 2 ex -kloorietyy-lipivalaatti-ekvivalentin kanssa 3 vuorokauden ajan ja sitten sen liuos DMF:ssa saostettiin vedellä Edellisessä esimerkissä selitetyn puhdistamisen jälkeen NMR-analyysillä, kuten edellä, todettiin, että kopolymeerin kaava oli seuraa-va:

Glu(OMe)0,5-Glu(OH)0/33-Glu(OCH(CH3)-OCO-t.Bu)0,17- Tämä kopolymeeri liukenee edellä mainittuihin liuottimiin ja myös CHCl3:iin. Se ei liukene polyetyleeniglykoli 400:aan.

Esimerkki 4 Valmistettiin kaavan

Br

>v .CH

/Y \ , o 0 (3-bromo-l(3H)isobentsofuraani)

W

73448 15 3-bromoftalidi bromioimalla ftalidia GB-patenttijulkaisun A 1 364 672 s. 5 mukaan.

Liuotettiin 2 g polyglutamiinihappoa ja 5,74 g (2 ekvivalenttia) tributyyliamiinia 35 ml saan kuivaa DMF:a ja tähän seokseen lisättiin 16,7 g edellä mainittua bromoftali-dia. Muutaman minuutin kuluttua todettiin liuoksen (geeli) voimakasta paksuuntumista ja se liuotettiin uudelleen lisäämällä 5 ml vettä. Kun sitä oli sekoitettu 6 vuorokautta huoneenlämpötilassa, lisättiin 500 ml etanolia, jolloin saostui väritön jauhemainen aine, joka suodattiin, kuivattiin linkoamalla, huuhdeltiin ja kuivattiin. Tuote liuotettiin uudelleen 40 ml:aan CHCl3:a ja se puhdistettiin seostamalla eetterillä. Saanto 2,77 g (68 %). NMR-analyysillä saatiin seuraavat tulokset: <5 = 8 ppm (4H, Bz + 1H, peptidinen); <Γ*7,7 ppm (laktoninen CH); OC = 5 ppm ( CX.-CH): <£ = 2-3 ppm (m, -CH2~CH2“).

Vertaamalla integraation jälkeen ( o<*-CH) protonin ja aromaattisten protonien suhdetta todettiin, että esteröitymis-saanto oli 90 %. Saadun tuotteen kaava on näin ollen:

(CH2)2"C00H

(NH-CH-CO)o,9-NH-CH-CO)0 #i (CH2)2-C00-CH

O§> Tämä tuote, joka liukenee erittäin hyvin CHCL3:iin, ei liukene veteen, alkoholiin, polyetyleeniglykoliin eikä puhtaaseen asetoniin. Se liukenee asetonin ja CHCl3:n seokseen.

Tästä polymeeristä valmistettiin muutaman jam:n kuiva kalvo levittämällä kloroformiliuosta lasilevylle ja haihduttamalla. Tämä kalvo asetettiin astiaan, jossa oli 0,1 N -puskuriliuosta, jonka pH oli 9,5, ja todettiin polymeerin hidas hajoaminen, joka havaittiin vuorokauden kuluttua liuoksen 16 73448 υν-absorption kasvamisesta (280 nm), mikä aiheutui puskuriliuoksessa vähitellen muodostuvan ftalidin läsnäolosta.

Esimerkki 5

Liuotetaan 10 g poly( Y*-metyyli-L-glutamaatin ja poly(piva-loyylioksimetyyli-L-glutamaatin) l/l kopolymeeriä, joka on valmistettu esimerkin 2 mukaan 75 mitään kloroformia ja lisätään 5 g indometasiinia (Sigma). Tällöin saadaan väriltään keltainen viskoosi liuos ja se kaadetaan tipoittain voimakkaasti sekoittaen 1 litraan tislattua vettä, joka sisältää 0,1 % natriumdodekyylisulfaattia (SDS). Tämän liuoksen sekoittamista jatketaan 40°C:ssa, kunnes kloroformi on täydellisesti haihtunut, joilloin saadaan mikropalloista muodostuva dispersio. Ne suodatetaan ja erotetaan erikokoisten eriksi kalibroiduilla seuloilla. Nämä mikropallot liukenevat isotermiseen väliaineeseen (pH 7,5) ja pitkän ajan kuluessa vapauttavat sisältämänsä lääkeaineen, vapau-tumisnopeuden vaihdellessa niiden keskimääräisen koon mukaan. Kun tällainen suspensio injusoidaan kudokseen, jossa on tulehdustartunta, lääkkeen vaikutus jatkuu paljon pitempään kuin tavanomaisen indometasiiniperustaisen lääkkeen.

Esimerkki 6

Pivaloyylioksimetyylipolyglutamaatti

Polyglutamiinihappo valmistettiin lähtien metyyli- y-glutamaatin N-karboksianhydridistä, joka on liuotettu metyleeni-kloridiin; trietyyliamiinia käytettiin polymeraation käynnistäjänä (A/I=100). Sitten polymeeri saostettiin lisäämällä metanolia, minkä jälkeen se tyhjökuivattiin. Kiinteä aine liuotettiin uudelleen trifluoretikkahappoon (TFA), jolloin saatiin 5-painoprosenttinen liuos, ja lisättiin tipoittain voimakkaasti sekoittaen riittävä määrä tislattua vettä, jotta lopullinen liuos sisälsi yhtä suuret määrät vettä ja TFA:a. Sekoittamista jatkettiin vielä 24 tuntia huoneenlämpötilassa (viskoosi liuos), minkä jälkeen koko määrä kaadettiin suureen ylimäärään tislattua vettä, jolloin polyglutamiinihappo saostui. Tämä happo suodatettiin ja kuivat 73448 17 tiin. Näin saadun hapon puhtaus kontrolloitiin NMR-analyv-sillä TFA;ssa (metyyliesteri-kaista -0-CH3 puuttuu 4,5 ppmtssa). Molekyylipainoanalyysi suoritettiin GPCrllä (geelikromatografia) DMF:ssa bimodaalisella DUPONT ZORBAX PSM -kolonnilla (vertailu polyetyreenillä) ja mitattiin seuraavat arvot: Mn = 226 000; Mw = 397 000; Mz = 723 000; dispergoitavuus = 1,75.

Polyhappo liuotettiin DMFriin 5-painoprosentt.iseksi liuokseksi ja 50 ml: aan tätä liuosta lisättiin 4 ml vettä ja 4,04 g (0,04 moolia) trietyyliamiinia. Ensiksi havaitaan trietyyliamiinin polyglutamaatin saostumista, tämän suolan liuetessa sitten uudelleen sekoitettaessa, kun vettä lisätään. Kun koko määrä oli liuennut, lisättiin tipoittain 6,02 g kloorimetyylipivalaattia (Fluka AG) ja jatkettiin sekoittamista 48 tunnin ajan huoneenlämpötilassa. Sitten lisättiin 50 ml vettä, mikä aiheutti värittömän kiinteän aineen saostumisen, joka sitten suodatettiin, kuivattiin ja puhdistettiin liuottamalla peräkkäin asetoniin ja saostamal-la eetterillä, sitten liuottamalla asetoniin ja saostamalla veden avulla. Analysoimalla tuotetta TFA:ssa NMR-analyysil-lä todettiin tert-butyyli-huipun läsnäolo 1,35 ppm:ssa. Spektri-integraatio osoitti, että polyglutamiinihappo oli esteröitynyt kloorimetyylipivalaatilla täydellisesti.

Molekyylipaino määritettiin kuten edellä ja saatiin seuraa-vat tulokset: Mn = 30 480; Mw * 708 000; Mz = 297 000; dis pergoitavuus = 3,54 (suhteellinen viskositeetti = 1,57, C =0,2 g/dl DMF:ssa). Lopullinen saanto 51 %.

Tämä polymeeri ei liukene veteen, CH2Cl2tiin, CHCL3:iin ja eetteriin; se turpoaa liukenematta metanolissa ja etanolissa; se liukenee helposti seuraaviin liuottimiin: asetoni, metyylietyyliketoni, THF, AcOEt/DMF, TFA, dikloorietikkahap-po (DCA). Voidaan valmistaa ohuita polymeerikalvoja levittämällä substraateille kerroksia näitä liuoksia ja antamalla niiden haihtua. IR-spektr.i vahvistaa sekin ehdotetun ra- 73448 ___ - π..

18 . * fiS3 ) kenteen (voimakas kaista 1740 cm-1'

Esimerkki 7

Valmistettiin ohut kalvo esimerkin 6 mukaan valmistetusta polymeeristä levittämällä kerros sen 10-prosenttista aseto-niliuosta ja antamalla sen kuivua joitakin tunteja huoneenlämpötilassa ilmassa.

Sitten upotettiin useita koekappaleita tätä kalvoa 1-pro-senttiseen pankreatiiniliuokseen 0,1 M -fosfaattipuskuri-liuoksessa (pH 7,5) ja nämä koekapaleet jätettiin huoneenlämpötilaan 1-8 vuorokaudeksi. Todettiin 1 vuorokauden jälkeen huomattava mekaanisen kestävyyden aleneminen (noin 50 %) ja 2 vuorokauden kuluttua tämän kestävyyden häviäminen lähes täysin (koekappale hajosi palasiksi) 8 vuorokauden kuluttua koekappale oli täysin hajonnut eikä se ollut enää nähtävissä. Samanlaisia tuloksia havaittiin käyttämällä es-teraasia tai leusiiniaminopeptidaasia.

Esimerkki 8

Pivaloyylioksimetyyliglutamiinihapon esterin ja leusiinin kopolymeerin valmistus

Meneteltiin kuten esimerkissä 6, mutta lähdettiin polygluta-miinihapon ja leusiinin 85/15 kopolymeeristä ja saatiin pi-valoyylioksimetyyliglutamaatin ja leusiinin 85/15-kopolymee-ri. TFA:oon liuotetun polymeerin NMR-spektri osoittaa, että 100 % polyglutamiinihapon sivukarboksyyliryhmistä on esteröitynyt kloorimetyylipivalaatilla. Polymeeri liukenee myös asetoniin, MEK:iin, DMFriin, THF:iin. Se turpoaa alkoholeissa liukenematta niihin. NMR-spektri: S = 1,35 ppm, 9 tert-butyyliprotonia? S ~ 1,0 6 -isobutyyliprotonia. Inte graatio: ryhmien suhde 85:15.

Esimerkki 9

Isobutyylioksimetyyliglutamaattiesteripolymeerin valmistus Synteesi suoritettiin lähtemällä polyglutamiinihaposta, joka valmistettiin esimerkissä 6 selitetyllä tavalla; tämä 73448 19 polymeeri liuotettiin DMF:.iin, joka oli etukäteen kuivattu molekyyliseulalla, jolloin saatiin 3,2-prosenttinen liuos. 20 g:aan tätä liuosta lisättiin 1,83 g tributyyliamiinia (2 ekvivalenttia). Päinvastoin kuin mikä havaittiin trietyyli-amiinia käytettäessä, liukenemisen aikaansaamiseksi ei tarvitse lisätä vettä. Sitten lisätään tipoittain 1,36 g iso-butyyrihapon kloorimetyyliesteriä (valmistettu julkaisun ULICH, J.A.C.S. 43, 662, (1921) mukaan) (kiehumispiste 65°C/48 torria) tributyyliamiinipolyglutamaattilluokseen ja jätetään 3 vuorokaudeksi sekoittaen huoneenlämpötilaan. Reaktioseos saostetaan sitten vedellä, liuotetaan uudelleen asetoniin, saostetaan uudelleen heksaanilla, liuotetaan taas asetoniin ja saostetaan uudestaan vedellä. Kuivatun polymeerin NMR-analyysi osoittaa tavoitellulle tuotteen ominaisten isobutyyli-huippujen läsnäolon (¾ =1,15 ppm, kak-soisviiva) ja integraation avulla 90-prosenttisen subst.it.u-oitumisen (saanto 1,03 g, 90 %). Polymeeri liukenee myös asetoniin, MEK:iin, THFtiin, DMFriin. TFA:oon liuotetusta polymeeristä valetun kalvon infrapunaspektri samoin kuin alkuaineanalyysi vastaavat ehdotettua rakennetta.

Esimerkki 10 Lääkkeen valmistus PEG:11a pehmennetyn pivaloyylioksimetyy-lipolyglutamaatin pohjalta

Liuotetaan 5 g poly(pivaloyylioksimetyyliglutamaattia) ja 5 g polyetyleeniglykoli 600:a (Fluka AG) ja 2 g indometasii-nia (Sigma) 100 ml:aan asetonia. Tästä liuoksesta valetaan kalvo lasilevylle ja liuotinaineen annetaan haihtua. 50°C:een kuumennettuna tämä kalvo sulaa ja se voidaan puristaa kapseleiksi, jotka jäähdytettyinä ja upotettuina isotoniseen vesiliuokseen vapauttavat indometasiinin väliaineeseen.

Esimerkki 11

Poly(asetoksimetyyliglutamaatin) synteesi 20 7 344 8

Synteesi suoritettiin kuten esimerkissä 9, mutta lähtien kloorimetyyliasetaatista.

Saatu polymeeri liukenee myös asetoniin. Sen NMR-spektri osoittaa asetyyliryhmälle (3 protonia) tunnusomaisen huipun 3,2 ppm:ssa. Polymeeri liukenee emäksiseen natriumvesi-liuokseen N/100 hydrolysoituen muutamassa minuutissa.

Esimerkki 12

Poly(pivaloyylioksimetyyliglutamaatin) biologinen hajoaminen in vitro

Valmistettiin esimerkin 6 mukaisella menetelmällä poly(piva-loyylioksimetyyliglutamaattia) , jonka metyyliryhmä on merkattu 14C : ssa. Tätä varten syntetisoitiin kloorimetyylipiva-laattia antamalla pivaloyylikloridin reagoida 14C:ssa merkatun paraformaldehydin kanssa julkaisussa J.A.C.S., 89 (21), 5442, (1967) selitetyllä tekniikalla.

Polymeerin ominaisaktiivisuus on polttoanalyysillä mitattuna 3 uCie/g. Tästä polymeeristä valmistettiin 3x3 cm:n kalvoja lähtien sen asetoni- ja TFA-liuoksista. Saadut kalvot imeytettiin entsymaattisessa joko sian munuaisesta saadussa leusiiniaminopeptidaasiliuoksessa (Sigma, 3,7 yksik-köä/ml, puskuriaste 0,1, 5 ml MgCl2> pH 8,4) tai sianmaksa-esteraasiliuoksessa (Sigma, 11,6 yksikköä/ml, puskuriaste 0,1M, pH 7,5). Hajoamisnopeus mitattiin tarkkailemalla yhtäältä polymeerin ulkonäköä ja toisaalta laskemalla liuoksen radioaktiivisuusaste. Entsymaattiset liuokset uusittiin päivittäin. Saatiin seuraavat tulokset: 21 734 48

Inkuboin- Esteraasi (pH 7,5) (pH 8,4) Leusiiniaminopeptidaasi tiaika

kalvo valettu seoksesta, jossa: Asetoni Asetoni TFA

1 vrk kalvo himmeä kalvo himmeä kalvo himmeä hydrolyysi 3,5 % hydrolyysi 13,6 % hydrolyysi 12,6 % 2 vrk kalvo vaikeahko kalvo himmeä kalvo erittäin paisunut deformoitunut hydrolyysi 9 % hydrolyysi 29 % hydrolyysi 46,8 % 4 vrk kalvo vaikeahko kalvo himmeä kalvo hajonnut, paisunut paisunut 1luonnut, vähän kiint- jäänteitä hydrolyysi 17 % hydrolyysi 52 % hydrolyysi 85 % 5 vrk kalvo turvonnut kalvo alkaa ha jota hydrolyysi 24 % hydrolyysi 71 % 7 vrk kalvo hyytelömäinen kalvo täysin ha jonnut hydrolyysi 37 % hydrolyysi 85 %

Esimerkki 13

Poly(pivaloyylioksimetyyliglutamaattia) liuotetaan asetoniin ja lisätään 10 %:a polymeerin painosta polyetyleeniglykoli 600:a. Liuos valutetaan teflon-levylle ja annetaan liuottimen haihtua. Saatu kalvo on läpikuultava ja se voidaan kuumasaumata noin 120°C:ssa.

22 7 3 4 4 8

Esimerkki 14

Valmistettiin aspargiinihapon ja leusiinin polymeeri (kts. Polymer L6, 735 (1975)) kopolymeroimalla NCA ^3-bentsyyli-aspartaattia ja NCA leusiinia (N-karboksianhydridejä) yhtä suurina moolimäärinä. Bentsyyliesteriryhmät transesteröi-tiin metanolilla, jolloin saatiin poly-(/3-metyyliaspartaat-ti/leusiini)-kopolymeeri. Sitten metyyliesteriryhmät saippuoitiin N/10 natriumhydroksidilla metanolissa,jolloin saatiin polv-(ASP(OH)/leu)-happo. Aminohappojen analyysi osoittaa, että leusiinia on 56 % ja 44 % aspargiinihapon määrästä.

Molekyylipaino Mn on 35 000 (mitattu geelikromatografiäl lä) .

Liuotetaan 1 g poly-(Aps(OH)/leu)-happoa 20 gtaan kuivaa DMF:a. Lisätään 3,25 g tributyyliamiinia (4 ekvivalenttia suhteessa Asp(OH)-ryhmiin) ja 2,64 g kloorimetyylipivalaat-tia (4 ekvivalenttia). Jätetään sekoittaen 3 vuorokaudeksi huoneenlämpötilaan. Polymeeri saostetaan tislatussa H20:ssa, se liuotetaan uudelleen asetoniin, saostetaan pet-rolieetterissä, liuotetaan takaisin asetoniin, saostetaan H20:lla. Kuivataan.

NMR-analyysi osoittaa, että on saatu poly-(pivaloyylioksime-tyyliaspartaatti/leusiiniia), esteröitymisasteen ollessa noin 20 % (5 = 7,5, bentsyyliprotone ja; 8 ppm, NH-pro- toneja; δ = 5,4 ja 4,8, alfa-CH-protoneja; δ = 3,95, saippu-oitumattomia -0-CH3~protoneja; S- 3,3 ja 2, -CH2~protone-ja; δ = 1,35 ppm, t-butyyliprotoneja). Suhteellisen pienestä esteröitymisasteesta huolimatta kopolymeeri liukenee asetoniin.

Esimerkki 15

Vertailun vuoksi tutkittiin keksinnön mukaisen esimerkissä 7 selitetyllä tavalla merkatun kopolymeerin (esimerkin 8 mukainen pivaloyylioksimetyyli-leusiiniglutamaatti -kopolymeeri 85-15} ja tunnetuilla tavanomaisilla menetelmillä metanolin avulla valmistetun l^C-merkatun metyylipolygluta- 73448 23 maatti-leusiini 85-15 kopolymeerin hydrolysoitumisnopeuksia alkalisessa väliaineessa.

Keksinnön mukainen polymeeri (A) muutettiin noin 0,25 mm:n kalvoksi levittämällä lasilevylle kerros asetoniliuosta, joka sitten haihdutettiin ilmassa. Vertailukalvon (B) osalta meneteltiin samoin lähtien TFA-happoliuoksesta. Viimeksi mainittu kalvo pestiin huolellisesti vedellä kaikkien TFA-jäämien eliminoimiseksi.

Kalvot (A) ja (B) upotettiin vesiliuoksiin, joiden pH oli 9.5 (fosfaattipuskuri), hitaasti sekoittaen ja aika ajoin mitattiin näihin liuoksiin liuonneiden aineiden radioaktiivisuus, josta laskettiin tutkittavien polymeerien hydroly-soitumisasteet.

Saatiin seuraavat tulokset, jotka ilmaistaan hydrolysoituneen aineen paino-%:ina annetun ajan (tunteja) kuluttua.

Koekappale (A) Koekappale (B)

Aika (h) Paino-% Aika (h) Paino-% 1.5 2,8 18 1,8 2.5 5,0 42 4,2 4.5 13,2 64 5 8 37,25 88 5,9 8 liukeneminen 112 6,8

Yllä olevista tuloksista nähdään, että kopolymeeri (A) hajoaa siinä määrin 8-10 tunnissa, että sen mahdollisesti sisältämä lääke olisi liuennut kokonaan tällaisissa olosuhteissa, kun sen sijaan tunnetun tekniikan mukainen kopolymeeri on vain hieman muuntunut 112 tunnin kuluttua samoissa olosuhteissa.

Claims

1. Biologisesti hajoava asyylioksimetyyli- tai aroyylioksi-metyylipolyaspartaatista tai -polyglutamaatista muodostuva polypeptidi, tunnettu siitä, että se on kaavan (-NH-CH-CO)x- I (CH2)n-COO-CR1R2-OOC-R mukainen, jossa kaavassa R^ ja R2 ovat alkyyliryhmiä tai vety, R:n ollessa jokin substituoitu tai substituoimaton alifaatti-nen tai aromaattinen jäännös, tai R2 on jokin alkyyliryhmä tai vety ja R^ ja R ovat sitoutuneet toisiinsa substituoiduksi tai substituoimattomaksi etyleeni- tai vinyleenisillaksi; tai sen kopolymeeri muiden aminohappojen kanssa, kaavan R' -(NH-CH-CO)v-(NH-CH-CO)z- II I Y (CH2)n-COO-CR1R2-OOC-R mukaan, jossa R, R^ ja R2 tarkoittavat samaa kuin edellä ja jossa R' on jokin vapaa tai osaksi tai kokonaan esteröitynyt aminohappojäännös; n on 1 tai 2 ja x, joka on yhtä kuin y + z, valitaan aina sellaiseksi, että polypeptidin molekyylipaino ei ole pienempi kuin 5000. 25 73448

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen polypeptidi, tunnet-t u siitä, että R on jokin metyyli-, etyyli-, isopropyyli-, isobutyyli-, tert-butyyli-, fenyyli- ja bentsyyliryhmistä.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen polypeptidi, tunnet-t u siitä, että R:n ja R^-in ollessa sidotut toisiinsa, niiden muodostama rengaslenkki on valittu seuraavien kaavojen joukosta: -CH2-CH2-; -CH=CH-; -CH(CH3)-CH(CH3)-; -C(CH3)=C(CH3)-; 1,2-fenyleeni; sykloheksenyleeni; syklopentenyleeni; syklo-pentadienyleeni.

4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen polypeptidi, tunnet-t u siitä, että yhdiste I on valittu asyyli- ja aroyylioksi-metyyliglutamaatin ja -aspartaatin joukosta ja että yhdiste II on valittu asyyli- ja aroyylioksimetyyliglutamaatin tai -aspartaatin kopolymeerien joukosta yhdessä yhden tai useamman muun aminohapon kanssa, jotka on valittu alaniinin, leusiinin, valiinin ja fenyylialaniinin joukosta.

5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen polypeptidi, tunnet-t u siitä, että kopolymeeri II on valittu kaavan I mukaisten polyglutamaatti- tai aspartaattikopolymeerien joukosta käyttäen vastaavasti glutamiinihappoa ja/tai alempien alkyylien glutamaatteja ja aspargiinihappoa ja/tai alempien alkyylien aspartaatteja.

6. Patenttivaatimuksen 4 mukainen polypeptidi, tunnet-t u siitä, että asyyliryhmät on valittu asetyyli-, propio-nyyli-, butyryyli-, isobutyryyli-, pivaloyyli-, bentsoyyli- ja fenyyliasetyyliryhmien joukosta.

7. Patenttivaatimuksen 1 mukaisen polypeptidin I ja sen ko-polymeerien II käyttö lääkeaineen hitaasti elimistöön liukenevana säiliönä, lääkeaineen vapautuessa vähitellen kohdepaikas-saan kantajapolymeerin biologisen hajoamisen seurauksena. 26 7 3 4 4 8

8. Patenttivaatimuksen 7 mukainen käyttö, tunnettu siitä, että mainittu lääkeaine ja mainittu polymeeri sekoitetaan homogeenisesti ja että tämä seos muokataan farmaseuttisesti hyväksyttävään muotoon.

9. Patenttivaatimuksen 8 mukainen käyttö, tunnettu siitä, että polymeeriin sekoitetaan jokin polyalkyleeniglykoli sen pehmentämiseksi, että siihen lisätään jokin lääkeaine, että sitten muovataan näin saatu termoplastinen tuote lämmön avulla rakeiksi, sauvoiksi, kapseleiksi tai muiksi osasiksi, jotka soveltuvat otettaviksi millä tahansa tavanomaisella tavalla.

10. Patenttivaatimuksen 1 mukaisten polymeerien I ja kopoly-meerien II käyttö kirurgiassa käytettävien biologisesti hajoavien istutteiden ja proteesien valmistamiseen.

11. Menetelmä kaavan I mukaisten polypeptidien valmistamiseksi, tunnettu siitä, että vastaava polyaminohappo saatetaan reagoimaan tertiäärisenä amiiinisuolanaan kaavan X-CR^R^OCO-R (III) mukaisen halogeenimetyyliesterin kanssa, jossa kaavassa X = Cl, Br tai I ja R, R^ ja R^ vastaavat edellä olevia määrityksiä, kaavan I mukaisen yhdisteen muodostuessa vastaavan halo-geenivetyhapon amiinisuolan samanaikaisesti eliminoituessa.

12. Menetelmä kaavan II mukaisen kopolymeerin valmistamiseksi, tunnettu siitä, että menetellään kuten patenttivaatimuksessa 11 on mainittu lähtien vastaavasta kopolyamino-haposta.

7 S 4 4 8