NO744292L - - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrorer en fremgangsmåte for fremstilling av de nye antibiotika S 7481/F-l og S 7481/F-2.

Det særegne ved fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen for fremstilling av de nye antibiotika S 7481/F-l og S 7481/F-2 er at en stamme av sopparten Cylindrocarpon lucidum Booth henhv. sopparten Trichoderma polysporum (Link ex Pers.) Rifai dyrkes på

eller i et næringsmedium, de nye antibiotika isoleres fra gjæringsbuljongen på i og for seg kjent måte ved ekstraktive og/eller adsorptive arbeidsmetoder og renses deretter kromatografisk eller ved hjelp av motstromsfordeling.

Den nye i henhold til oppfinnelsen anvendte stamme av sopparten Cylindrocarpon lucidum Booth ble isolert fra en jordprove som ble funnet i Wisconsin, USA og en kultur derav ble deponert i United States Department of Agriculture (Northers Research and Development Division), Peoria, 111., USA under nummer NRRL 5760.

Den nye stamme NRRL 5760 av Cylindrocarpon lucidum Booth stemmer

i vesentlige trekk overens med orginalbeskrivelsen (C. Booth 1966;

The Genus Cylindrocarpon; Mycological Paper nr. 104, 21). På potet-dextrose-agar danner stammen NRRL 5760 hverken klamdysporer eller mikrokonidier. Klamdysporaktive celler i makrokonidiene mangler likeledes. De bananformede, oftest med tre tverrvegger oppdelte makrokénidier er 28 - 45 x 4,8 - 5,7^u store og er dermed betydelig mindre enn angitt i den ovennevnte beskrivelse (45 - 65 x 6 - 6,5^u). En ytterligere viktig forskjell består i vekst-hastigheten, idet mens denne Typus i lopet av 7 dager skulle danne 1 - 1,5 cm store kolonier, vokser stammen NRRL 5760 i lopet av den samme tid til 7 - 8 cm store kolonier, idet det på potet-dextroseagar nesten utelukkende dannes fargelost til brunt substratmycel. Konidioforene med phialidene dannes allerede etter få dager i tette grupper og knipper, forgrener seg penicillium-til verticiliumaktig og danner i lopet av lengre tid makrokonidier som samler seg som en slimet, beige masse.

Den nye i henhold til oppfinnelsen anvendte stamme av sopparten Trichoderma polysporum ble isolert fra en i Norge funnet jordprove og en kultur derav ble deponert i United States Department of Agriculture (Northern Research and Development Division), Peoria, 111., USA under nr. NRRL 8044.

Den nye stamme NRRL 8044 av Trichoderma polysporum (Link ex Pers). Rifai vokser på 2% maltekstraktagar ved 6 til 33°C og vekst-optimum ligger ved 24°C, idet det i lopet av 12 dager dannes rent hvite, på overflaten floyelsaktige og ufoldede kolonier med tverrmål 40 - 50 mm. Ved den hoyeste temperatur som enda tillater god vekst (33°C) dannes derimot over hodet ikke noe luftmycel, men derimot en meget sterkt foldet koloni. Med tiltagende dyrkingstemperatur dannes på koloniens underside et voksende gult pigment som ved 27°C og mer utpreget ved 30 - 33°C diffunderer inn i agaren.

For dannelse av konidioforene, som både står spredt, men også i tettere grupper, fremfor alt på dyrkingskar-kanten, trenger den nye stamme av Trichoderma polysporum ved 24°C på maltekstraktagar 15 - 20 dager. Morfologien av bifruktformen avviker i noen trekk litt fra beskrivelsen for denne art (M.A. Rifai 1969: A REVISION OF THE GENUS TRICHODERMA in Mycological Papers, No. 116). Således når hovedgrenen av konidiebærerne bare et tverrmål på 2,0 - 3,8^a, mens dét for arten er angitt 4 6,3 ^u. Phialidene i den nye stamme av Trichoderma polysporum er, spesielt ved slutten av deres utvikling, strukket i lengden og dette er typisk for denne art. Til slutt er konidiene noe mindre enn angitt i artsbeskrivelsen, nemlig 2,0 - 3,1 x 1,5 - 2,0 i forhold til 2,4 - 3,8 x 1,8 2,2^1. Den foreliggende Trichoderma polysporum stamme NRRL 8044 danner under alle de nevnte dyrkingsbetingelser

ingen ekte klamydosporer.

De nye soppstammer NRRL 5760 og NRRL 8044 lar seg dyrke på mange slags næringssubstrater, som inneholder de vanlige næringsstoffer for sopper. Således anvender disse stammer de for de karbon-heterotrofe organismer vanlig anvendte næringsstoffer, f.eks. sakkarose, glukose, maltose, laktose, stivelse, maltekstrakt som karbonkilde, organiske og uorganiske nitrogenholdige forbindelser, som maisstop, sojapepton, gjær- eller kj6ttekstrakter, natriumnitrat, ammoniumsulfat, ammoniumnitrat, aminosyrer etc, som nitrogenkilde såvel som de vanlige mineralsalter og spor-stoffer.

De nye antibiotika S 7481/F-l og S 7481/F-2 kan man fremstille

på den måte at

1. Et flytende medium podes med en konidie- og mycel-suspensjon

av stammen NRRL 5760 og kulturen inkuberes i 9 - 13 dager, foretrukket 11 dager, ved 24 - 30°C, foretrukket 2 7°C, og ved en pH verdi på 4,8 -8,8, foretrukket ved 8,1. Dyrkingen skjer i penicillinflasker under aerobe betingelser i en overflatekultur.

2. Et flytende medium podes med en konidie- og mycel-suspensjon

av stammen NRRL 8044 og kulturen inkuberes i 11 - 18 dager, foretrukket 13 dager, ved 25 - 30°C, foretrukket ved 27°C, og ved en pH verdi på 4,3 - 6,2, foretrukket på 5,6 i et gjæringskar av stål under omroring (170 omdreininger pr. minutt) og lufting

(1 liter luft/minutt/liter næringslosning).

Så snart en maksimal mengde antibiotika er produsert utvinnes disse fra dyrkingsbuljonen på i gg for seg kjent måte ved ekstraktive og/eller adsorptive metoder.

En metode som har vist seg hensiktsmessig, består i ekstraksjon av det ved dyrkingen av soppstammen NRRL 5760 erholdte mycel, eventuelt etter foregående mekanisk oppdeling med 90% metanol, påfolgende avdamping av metanol og flere ganger ekstraksjon av den resulterende vandige blanding med etylenklorid. Til denne ekstrakt kan tilsettes den etylenkloridekstrakt som er utvunnet fra dyrkingsfiltratet. Det kan imidlertid også anvendes andre med vann ikke blandbare losningsmidler, f.eks. kloroform, etylacetat, metylenklorid eller butylacetat.

Den organiske losningsinndampes til torrhet og resten avféttes enten ved kromatografering, f.eks. på kiselgel med kloroform med litt metanol, f.eks. i forholdet 98 : 2, eller ved fordeling meQilom petroleter og metanol, som er tilblandet en mengde vann tilstrekkelig for faseadskillelse. I det forste tilfelle forenes de mot Aspergillus niger antibiotisk virksomme fraksjoner, inndampes til torrhet og resten kromatograferes i metanolisk losning på "Sephadex LH 20". I det annet tilfelle konsentreres den metanolisk-vandige fase, eventuelt etter tilsetning av ytterligere vann, så langt at hovedmengden av metanolen er avdestillert, hvoretter den vandige blanding ekstraheres med etylenklorid, eller et annet av de ovennevnte, med vann ikke-blandbare losningsmidler, den resulterende organiske losninga inndampes til torrhet og resten kromatograferes i metanolisk losning på "Sephadex LH 20". Den videre oppdeling og rensing av de to antibiotika skjer ved fornyet kromatografering på aluminiumoksyd eller kiselgel, eller ved etterfSigende anvendelse av begge adsorpsjonsmidler.

En ytterligere metode, som har vist seg hensiktsmessig, består i ekstraksjon .av den ved dyrkingen av soppstammdn NRRL 8044 erholdte dyrkingsbuljong ved hjeip av et med vann ikkebblandbartlosnings-middel eventuelt etter foregående mekanisk oppdeling. Som løsningsmiddel kan fortrinnsvis anvendes etylenklorid, men kloroform, etylacetat, metylenklorid eller butylacetat kan også anvendes. Den organiske fase fraskilles, torres og inndampes. Resten kromatograferés, foretrukket med en metanol16sningjpå "Sephadex LH 20", idet de mot Aspergillus niger aktive fraksjoner forenes og kromatograferes en gang til på aluminiumoksyd med toluen som ble tilsatt 10 - 50% etylacetat. Påvisningen av de aktive substanser skjer også her ved aktivitetsprover overforAspergillus niger. Rensingen av de to antibiotika skjer ved

fornyet kromatografering.

For fremstilling av de nye antibiotika lar seg også stammer anvende, som disse kan oppnås f.eks. ved seleksjon eller mutasjon under innvirkning av ultrafiolette eller rontgen-stråler eller ved anvendelse av andre forholdsregler, f.eks. ved behandling av laboratoriekulturer med egnede kjemikalier.

De nye antibiotika S 7481/F-l og S 7481/F-2 utmerker seg ved interessante kjemoterapeutiske og farmakologiske egenskaper og kan folgelig anvendes som medisin. Således hemmer begge antibiotikaveksten avAspergillus niger. Spesielt utmerker substansen S 7481/F-l seg ved en immunosuppresiv virkning. Både S 7481/F-l og S 7481/F-2 viser dertil betennelseshemmende egenskaper. Det skal fremheves at begge antibiotika er lite sytostatisk aktive.

Den immunosuppresive virkning av S 7481/F-l kan vises på

folgende måte:

a) Lokal hemolyse i gel in vitro, hjerne-proven:

Hemming av hemolyse i % i forhold til kontrollprover utgjor ved

en dose på 2 x 60 mg/kg i.p. 99%, ved en dose på 1 x 150 mg/kg p.o. 90% og ved en dose på 3 x 200 mg/kg p.o. 99,5%. Både dannelsen av immunoglobulin M- og av immunoglobulin G-antistoffer hemmes.

b) Hemagglutinasjonsprove (HAT) i mus:

De mot-erutrocyter fra sau dannede antistoffer bestemmes.

Hemmingen uttrykkes i suppresiy indeks (SI) idet den ubehandlende kontrollprove angis med 1,00. SI = 0,3 etter p.o. 5 x 200 mg/kg.

c) Hud-transplantasjonsprove i mus:

I H-2 histoin-tålende mus forlenges overlevelses-tidsforlengelsen for hudtransplantatet i forhold til ubehandlende kontrolldyr etter en dose på 10 x 200 mg/kg'p.o. i noen grad: ca. 16 dager lenger enn kontrollprovene. d) Ekspermimentell allergisk encefalomyelitis (EAE) i rotter: De eksperimentelt fremkalte nervevevs-skader, som lammet 8 av

10 dyr ved ubehandlende kontrolldyr, ga ved det samme antall

forsoksdyr som var blitt behandlet med 13 x 25 mg/kg i.p., en 100% beskyttelse.

e) Oksazolon-prove i mus:

Avtagningen av oresvellingen uttrykkes som suppresiv indeks

(SI); SI = 0,6 etter 6 x 75 mg/kg p.o.

f) Zytopenier i knokemarg og blod:

Den hoye orale tilforsel av 6 x 500 mg/kg viser ingen tydelig

depresjon av de bloddannende celler i knokemargen og ingen leukopeni i blodet den 1, 3 og 7 dag etter den siste substans-tilforsel.

På grunn av deres immunosuppresive virkning kan forbindelsen

S 7481/F-l anvendes for profylaks og behandling av sykdommer som anvendes i sammenheng med påvirkning av forsvarsreåksjonen på negativ måte.

De nye antibiotika S 7481/F-l S 7481/F-2 har likeledes en arthritishemmende virkning. Således virker de f.eks. i Freund-Adjuvans-Arhtritis-La.tenztidsforsok i rotter sterkt svellings-hemmende i doser på ca. 50 mg/kg kroppsvekt.

En tilsvarende virkning iakttas i Freund-Adjuvans-Arthritis-terapiforsok i rotter i doser på ca. 50 mg/kg/dag.

På grunn av deres arthritishemmende virkning kan disse antibiotika anvendes for profylaks og behandling av arthritis og reumatiske sykdommer.

De doser som anvendes varierer selvf olgeli g alt etter typen av antibiotikum, tilforselsmåten og den tilstand som skal behandles. Vanlig oppnås dog i forsoksdyr tilfredsstillende resultater med en dose på 10 til 20 mg/kg kroppsvekt. Denne dose kan om nodvendig tilfores i 2 til 4deldoser eller også som retardform. For storre pattedyr ligger dågsdosen ved omtrent 50 til 900 mg. For oral tilforsel kan deldosene f.eks. inneholde omtrent 25 til 300 mg av de nye antibiotika ved siden av faste og flytende bærersubstanser.

Som medisin kan de nye antibiotika tilfores alene eller i passende preparatform med farmakologisk indifferente hjelpestoffer. 1 de etterfølgende eksempler som skal illustrere oppfinnelsen nærmere, er alle temperaturangivelser i °C.

Eksempel 1.

o

10 liter næringsløsning som pr. liter inneholder 30 g sakkarose, 10 gram mais-stop, 3 gram NaNO^, 1 gram K^HPC^, 0,5 g MgS04 x 7H20, 0,5 gram KC1 og 0,01 gram FeS04 x 7H20 podes med .100 ml av en konidie- og mycel-suspensjon av stammen NRRL 5760 og inkuberes i penicillinflasker med hver 700 ml rominnhold i 11 dager ved 27°C.

Det fra dyrkingsbuljongen fraskilte mycel ekstraheres ved knusing og omroring med 3,5 liter 90% metanol og det ved avsuging på filter fra losningsmidlet adskilte, knuste mycel behandles ytterligere 2 ganger på den samme måte med 90% metanol. De forenede filtrater inndampes i vakuum ved 40°C.badtemperatur så langt at væsken hovedsakelig bare består av vann. Den resulterende blanding ekstraheres 6 ganger med det samme volum etylenklorid ved utristing, hvoretter de forenede etylenklorid-losninger renses ved utrysting med vann og inndampes i vakuum ved 40°C badtemperatur. Den således erholdte rest kromatograferes på 2 50 gram kiselgel (kiselgel 60 "Merck", kornstorrelse 0,063 - 0,200 mm) under anvendelse av kloroform med en tilsetning av 2% metanol som elueringsvæske, som oppfanges i 200 ml fraksjoner. De ved plate-diffusjonstest mot Aspergillus niger antibiotisk virksomme fraksjoner forenes, inndampes til torrhet på beskrevet måte og kromotograferes etter losning i metanol på ilO gram "Sephadex LH 20" med det samme løsningsmiddel, hvoretter man forener de 20 ml fraksjoner som ved den samme prove som ovenfor har vist seg antibiotisk virksom mot Aspergillus niger. Ved undersøkelsen i tynnsjikt kromatogram, f.eks. ved hjelp av kiselgel på "Polygram"-folier og heksan-aceton (1:1) som flytemiddel viser det seg at resten av den på den ovenfor beskrevne måte inndampede metanollosning hovedsakelig består av de to nye substanser S 7481/F-l og S 7481/F-2. De skilles og renses samtidig, idet deres blanding kromatograferes på nytt under anvendelse av den tusendobbelte mengde kiselgel av den ovennevnte, kvalitet og kloroform som er tilsatt 2% metanol. Undérsokelsen av eluatfraksjonene, hvis volum i ml er halvparten så stort som vekten av kiselgel i gram, ved tynnsjiktkromatogram viser at substansen S 7481/F-l forst kommer til syne i eluatet fulgt av en blanding av de to substanser og deretter av enhetlig S 7481/F-2. Fra blandingen kan under de samme betingelser ved gjentatt kromatografering utvinnes ytterligere mengder av de to substanser.

Det nye antibiotikum S 7481/F-l har fSigende egenskaper:

Amorft, fargelSst pulver med smeltepunkt 137 - 140°C (spalting);

/ a7p° -236° (CHC13, C 0,5)

UV: se fig. 1.

IR: se fig. 2.

Proton-NMR: se fig. 3.

13

C-NMR: se tabellen.

Massepektrum (CEC massespektrometer 21-1108, ionekilde E.B.: InnfSringssystem:direkte, elektronenergi: 70 eV, ioneaksellerasjon: 4 kV, temperatur for ionekilden, 290°C, trykk: 5.IO<-6>Torr,

Peak-Matching-fremgangsmåten, refereransesubstans "PCR 8" /Tris-pentadekafluorheptyl-1,3,5-triazin, M=1184, 9374/: hSyeste massetopp m/e = 1183,831 (+ 0,004), tilsvarende massen av ionet C62<H>109N11<<>^11' Pro<^u^tet fra eliminering av vann fra det virkelig molekyl C62<H>iiiNn<0>i2<*>LSselighet: lettlSselig i de fleste vanlige organiske ISsningsmidler, praktisk ulSselig i petroleter og vann. Opptreden i tynnsjikt-kromatogram (substansflekker gjort

-synlige med joddamp):

a) Kiselgel på glassplater: kloroform + 4% metanol som flytemiddel: Rf = 0,52. b) Kiselgel på folier " polygram"; heksan/aceton 1 : 1 som flytemiddel: Rf = 0,37; kloroform/aceton 2 : 1 som flytemiddel: Rf = 0,34.

Elementæranalyse (proven lost i benzen, losningen inndampet til torrhet, resten torret i hoyvakuum i 5 timer ved 100°C): funnet C 61,8 H 9,4 N 13,0 O 15,7%.

De verdier som ble funnet stemmer overens med bruttoformlen,

<C>62<H>111<N>11°12-

I hydrolysatet, som erholdes ved koking av forbindelsen S 7481/F-l med 6 N saltsyre (20 timer), kan aminosyren alanin, a-amino-smorsyre, N-metylleucin, N-metylglycin og valin påvises. Det

nye antibiotikum S 7481/F-2 har fSigende egenskaper:

Amorft, fargelSst pulver med smeltepunkt 127 - 130°C ;(;spalting) • /o/£° = -243° (kloroform, c = 0,5)

UV: se fig. 4.

IR: se fig. 5.

Proton-NMR: se fig. 6.

Massespektrum (opptagningsbetingelser se antibiotikum S 7481/F-l): HSyeste massetopp m/e = 1169,815 (+ 0,006), tilsvarende massen av ionet C5i<H>io7Nll°ll'Proc^u^tet fra eliminering av vann fra molekylet<Gg>1<H>l09<N>ii<o>i2<*>

Loselighet: lettloselig i de fleste vanlige organiske losningsmidler-: praktisk uloselig i petroleter og vann.

Forhold i tynnsjiktkromotogram (substansflekker gjort synlige med j oddamp): a) Kiselgel på glassplater; kloroform + 4% metanol som flytemiddel: Rf =. 0,46.

b) .Kiselgel på folier "polygram"; heksan/aceton 1 : 1 som flytemiddel: Rf = 0,28; kloroform/aceton 2 : 1 som flyte-

middel: Rf = 0,26.

Elementæranalyse (prove torret i 5 timer i hoyvakuum ved 100°C): Funnet C 61,7 H 9,1 N 13,1 O 16,5%.

De verdier som ble funnet stemmer overens med bruttoformlen<C>61<H>109<N>11°12'

Den som utgangsmaterial for podingen anvendte konidie- og mycel-suspensjon fremstilles fra en kultur av den opprinnelig isolerte stamme NRRL 5760, som ble dyrket i 10 dager på et agarmedium, som pr. liter inneholdt 20 gram maltekstrakt, 20 agar, 4 gram gjæreks trakt og avmineralisert vann. Konidiene og mycelet ble opptatt i fysiologisk koksaltlosning. Denne suspensjon tjener til poding av den ovennevnte næringsløsning.

Eksempel 2:

2 50 liter av en næringsløsning som pr. liter inneholdt 30 gram sakkarose, 10 gram mais=stop, 3 gram NaNO^/1 gram K2HP04, 0,5

gram MgS04x 7H20, 0,5 gram KC1 og 0,01 gram FeSC>4x 7H20 ble podet med 2,5 liter, konidie- og mycel-suspensjon av stammen NRRL 5760 og inkubert i penicillinflasker med hver 700 ml rominnhold i 11 dager ved 27°C.

Frå dyrkingsbuljongen fraskilles mycelet ved sentrifugering og homogeniseres i en ultra-hurtigmikser med 80 liter 90% metanol, deretter skilles den metanoliske ekstraktlosning ved sentrifugering

-fra faststoffet og det siste ekstraheres enda to ganger på den samme måte med 90% metanol. De forenede ekstraktlosninger konsentreres i vakuum ved 30 - 40°C til 15 liter. Den tilbake-blivende vandige fase ekstraheres 8 ganger med det samme volum-etylenklorid. Hver av etylenkloridekstraktene vaskes med 5 liter vann. Etylenkloridlosningene inndampes etter forening i vakuum ved 30 - 40°C. For avfetting fordeles ekstraktresten på den måte mellom petroleter og 90% metanol at den etter losning i 2 liter 90% metanol i rekkefolge rystes 3 ganger med hver gang 2 liter petroleter (kokepunkt 30 - 35°C), som befinner seg i 3 ryste-trakter, hvoretter de 3 petroleterfaser etter hverandre enda, ekstraheres 2 ganger med hver gang 2 liter 90% metanol. Til de forenede metanoliske losninger tilsettes 3 liter vann og blandingen konsentres i vakuum ved 30 - 40°C til et volum på 2 liter. Det vandige konsentrat ekstraheres ved 5 gangers utrysting med hver gang 2 liter etylenklorid, etylenkloridlosningene vaskes med hver gang 0,5 liter vann, forenes og inndampes til torrhet i vakuum ved 30 - 40°C.. Resten underkastes kromatografering på den tjuedobbelte mengde "Sephadex LH 20 ", hvorved metanol anvendes som elueringsmiddel. Eluatet oppfanges i 20 ml fraksjoner og de av fraksjonene som viser seg antibiotisk virksomme mot Aspergillus niger forenes og inndampes i vakuum ved 30 - 40°C

til torrhet. Deretter kromatograferes resten på den syttidobbelte mengde aluminiumoksyd (noytral) med aktivitetsgrad 1, hvorved blandinger av toluen og etylacetat tjener for eluering. Med toluen som er tilsatt 15% etyleacetat kommer i de forste 10 fraksjoner (volumet av fraksjonene: halvparten så mange liter som adsorpsjonsmiddel i kg) forst hovedmengden av substansen S 7481/F-l til syne, fulgt av en blanding av S 7481/F-l og 7481/F-2.. En ytterligere mengde av den samme blanding isoleres sammen med litt fremmed-substans ved etterfolgende eluering med toluen-etylacetat (1 : 1). Påvisningen av substansene i eluatfraksjonene skjer på tynnsjikt-kromatograf isk måte, f .eks.? ved hjelp av kiselgel på "polygram"-folier og heksanaceton 1:1) som flytemiddel. Fra de forenede

fraksjoner, som inneholder substansen S 7481/F-l i enhetlig form, utvinnes substansen ved inndamping i vakuum ved 30 - 40°C og etterfSigende tSrring av resten i hSyvakuum ved 50°C. De forenede eluatfraksjoner, som inneholder blandingen, inndampes likeledes under de samme betingelser. For isolering av ytterligere S 7481/F-l og av enhetlig S 7481/F-2 underkastes resten kromatografering på den tusendobbelte mengde kiselgel, idet kloroform, som innehol<*>der 2% metanol, anvendes som elueringsmiddel som dette og de videre foranstaltniger ble beskrevet i eksempel 1-

Eksempel 3.

500 liter av en næringslSsning, som pr. liter inneholdt 40 g glukose, 5 gram kaseinpepton, 5 g MgS04xWH^ O, 2 gram KH2PC>4

3 gram NaNO^-, 0,5 gram KC1, 0,01 gram FeS04og avmineralisert vann, ble podet med 50 liter av en forkultur av stammen NRRL

8044 og inkubert i et gjæringskar av stål under omrSring (170 omdreininger pr. minutt) og lufting 01 liter luft/minutt/liter næringslSsning) i 13 dager ved 27°C.

500 liter dyrkingsbuljong knuses i ultra-hurtigmixer og ekstraheres flere ganger med hver gang 500 liter 1,2-dikloretan. Den organiske fase fraskilles, tSrres over natriumsulfat og inndampes i vakuum. Inndampningsresten kromatograferes på den hundredobbelte mengde "Sephadex LH 20" med metanol. De mot-Aspergillus niger aktive fraksjoner forenes og blandingen kromatograferes pa den hundre til tohundre dobbelte mengde nSytralt aluminiumoksyd (aktivitetsgrad I). Elueringen foregår med toluen som var tilsatt 10 - 50% etylacetat. Det elueres fSrst overveiende biprodukter, deretter S 7481/F-l og deretter S 7481/F-2. Påvisningen av de aktive stoffer i fraksjonene skjer også her ved aktivitetsprSving overfor Aspergillus niger. For renhetskontroll foretas tynnsjiktkromatografisk undersSkelse på kiselgelplater med kloroformmetanol (96 : 4), idet antibiotika-forbindelsene gjSres synlige med joddamp. De rene fraksjoner forenes og utgnis med heksan, idet antibiotikaforbindelse med S 7481/F-l og S 7481/F-2 erholdes i form av et hvitt amorft

o

pulver om torres i hoyvakuum ved 50°C.

Den som utgangsmaterial anvendte forkultur erholdes på folgende måte: Den for poding anvendte spore- og mycelsuspensjon fremstilles fra en kultur av den opprinnelig isolerte stamme NRRL 8044, som var dyrket i 21 dager ved 27°C på et agarmedium som pr. liter inneholdt 20 gram maltekstrakt, 20 agar, 4 gram gjærekstrakt og avmineralisert vann. Sporene og mycelet i denne kultur ble opptatt i fysilogisk koksaltlosning.

Med denne suspensjon ble 50 liter av en næringslSsning, som

hadde den samme sammensetning som i det 500 liter's gjæringskar av stål, podet og inkubert i et gjæringskar av stål under omrSring (200 -omdreininger pr. minutt) og lufting (1 liter luft/ minutt/liter næringslSsning) i 3 dager ved 27°C. Denne gjærings-lSsning tjener som podematerial for det 500 1iter"s gjæringskar av stål.

Claims (3)

1. Fremgangsmåte for fremstilling av de nye antibiotika S 7481/F-l og S 7481/F-2, karakterisert ved at en ny stamme av sopparten Cylindrocarpon lucidum Booth henhv. av soppstammen Trichoderma polysporum (Link ex Pers.) eller en av deres mutanter dyrkes på eller i et næringsmedium og deretter isoleres de nye antibiotika S 7481/F-l og S 7481/F-2 fra nærings-mediet og isoleres på i og for seg kjentamåte.

2. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved at det som ny stamme av sopparten Cylindrocarpon lucidum Booth anvendes stammen NRRL 5760.

3. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved at det som ny stamme av sopparten Trichoderma polysporum (Link ex Pers.) anvendes stammen NRRL 8044.