KR100238103B1

KR100238103B1 - 신균주 스트렙토마이세스속 mt1882-v(kctc 8800p)와 피에리시딘 a1의 인터루킨-2생성 억제제로서의 용도

Info

Publication number: KR100238103B1
Application number: KR1019970040064A
Authority: KR
Inventors: 안종석; 김보연; 민태익; 안순철; 함경수; 박찬선; 이현선; 최용경; 강대욱; 오원근; 고학룡
Original assignee: 박호군; 한국과학기술연구원
Priority date: 1997-08-22
Filing date: 1997-08-22
Publication date: 2000-01-15
Also published as: KR19990017225A

Abstract

본 발명은 신균주 스트렙토마이세스속(Streptomyces sp.) MT1882-V와 다음 화학식 1로 표시되는 피에리시딘 A1을 유효성분으로 함유하고 있는 면역억제제에 관한 것이다.

Description

신균주 스트렙토마이세스속 ＭＴ1882-Ｖ(ＫＣＴＣ8800Ｐ)와 피에리시딘 Ａ1의 면역억제제로서의 용도

화학식 1

인터루킨-2(IL-2)는 T 임파구 세포성장인자로서, T 임파구가 항원이나 그 밖의 여러 요인들에 의하여 활성화되었을 때 분비되어 T 임파구 자신 또는 그와 관련된 다른 세포들에 영향을 주어 세포증식을 유도하고 세포내 여러 현상들을 유발시킨다. 인간의 인터루킨-2는 분자량이 약 14 ~ 19 kDa의 당단백질이며, 세포 표면에 존재하는 이들의 수용체는 α, β 그리고 αβ의 세가지 유형으로 구성되어진다. 이중에서 세포 표면에 항상 존재하는 β형은 세포의 활성화 시기에 α형의 발현을 유도하여 인터루킨-2에 가장 강한 결합력을 가지는 αβ형을 만든다. 인터루킨-2와 그의 수용체는 T 임파구에서 매우 중요한 역할을 하고 있으나, 이들의 과다발현은 관절염, 백혈병, 당뇨병, 만성 간염 등의 자가면역질환, 조직이식 거부, 그 밖에 T 세포, B 세포의 종양화 등 여러 현상들을 유발시킨다. 따라서 인터루킨-2와 이들의 수용체 과다발현을 억제함으로써 상기와 같은 이상 현상들의 치료에 큰 도움이 될 수 있다.

이러한 인터루킨-2 생성억제제로서 현재까지 보고된 예로는 글루코코르티코이드(glucocorticoids), 아자티오프린(azathioprine), 메토트렉세이트(methotrexate), 싸이클로스포린 A(cyclosporin A, CsA)와 FK506 등이 있으나, 이들 대부분은 세포독성의 문제점을 보이고 있다. 특히, 싸이클로스포린 A는 1976년에 곰팡이 트릭코더마 폴리스포럼(Trichoderma polysporum; Tolypocladium inflatum)으로부터 분리되었는데, 다른 저해제들에 비하여 면역세포에 대한 독성이 없어 조직이식 후 박테리아 감염을 줄일 수 있다. 또한 스트렙토마이세스 추쿠바엔시스(Streptomyces tsukubaensis)로부터 분리된 FK506은 싸이클로스포린 A보다 10 ~ 100 배의 효율이 있다고 보고되어 있는데, 이들은 세포내의 이뮤노피린(immunophilin)이라는 단백질과 결합하여 뇌동맥패쇄로 인한 쇼크, 칼슘(Ca²⁺)-의존성 세포기작 등 여러 분야에 있어서의 면역치료제로 이용될 수 있다. 그러나, 현재 임상적으로는 싸이클로스포린 A만이 적용되고 있고 FK506은 임상실험단계에 있으므로, 이들 외에도 대량생산이 가능하며 효능이 뛰어난 인터루킨-2 생성 억제제의 개발이 절실히 요구되고 있다.

그리고 현재까지 이용되고 있는 인터루킨-2 생성 억제제 탐색방법은 인터루킨-2 항체를 이용하여야 하는 등의 경제적 부담이 크고 방사선 동위원소인 3중수소로 표식된 티미딘([³H]thymidine)을 사용하기 때문에 생물학적 위험성이 크다. 또한, EL4 세포는 쥐의 T 면역세포로서 PMA(phorbol 12-myristate 13-acetate)라는 식물 추출물질을 처리하면 인터루킨-2가 생성된다. 그런데, CTLL-2 세포는 인터루킨-2 존재하에서만 세포증식이 가능하므로 PMA가 처리된 EL4 세포의 상등액에 의하여 CTLL-2 세포를 가함으로써 이들 세포의 생장여부로 면역억제제의 존재여부를 확인할 수 있으나, 가해지는 시료의 처리시간이 24시간 정도 되어야 하기 때문에 세포독성의 문제점이 있어 탐색방법으로서 장애요인이 된다.

본 발명에서는 신균주 스트렙토마이세스속(Streptomyces sp.) MT1882-V와 신균주로부터 생산된 피에리시딘 A1를 면역억제제의 유효활성 물질로 사용하는 방법, 그리고 종래 인터루킨-2 생성억제제 탐색방법에 세포 세척단계를 포함시켜 상기와 같은 세포독성, 방사성 동위원소의 사용, 경제적인 부담 등의 문제를 해결하는 새로운 인터루킨-2 생성억제제 탐색방법을 제공하는 데 그 목적이 있다.

도 1은 EL4 세포성장과 인터루킨-2 생성에 대한 PMA의 영향을 나타낸 것이고,

도 2는 메탄올과 디메틸설폭사이드의 EL4 세포에 대한 독성을 나타낸 것이고,

도 3은 피에리시딘 A1의 농도별 EL4 세포의 인터루킨-2 생성억제 정도를 나타낸 것이며,

도 4는 저카트(Jurkat) 세포에서 피에리시딘 A1의 인터루킨-2 생성억제 정도를 나타낸 것이고,

도 5는 인터루킨-2 첨가에 의한 CTLL-2 세포의 재생을 나타낸 것이다.

본 발명은 신균주 스트렙토마이세스속(Streptomyces sp.) MT1882-V를 그 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 피에리시딘 A1가 유효성분으로 함유된 면역억제제를 포함한다.

또한, 본 발명은 EL4 세포에 시료를 처리하는 과정, 시료처리된 EL4 세포에 PMA(phorbol 12-myristate 13-acetate)를 처리하는 과정 및 생성된 인터루킨-2의 양을 측정하는 과정으로 이루어지는 인터루킨-2 생성억제제 탐색방법에 있어서, 상기 시료 및 PMA 처리과정 후 인산완충생리식염수(Phosphate buffer saline; PBS)를 이용하여 EL4 세포를 세척하는 공정이 부가된 인터루킨-2 생성억제제의 탐색방법을 특징으로 한다.

이와같은 본 발명을 더욱 상세히 설명하면 다음과 같다.

본 발명에 따른 신균주 스트렙토마이세스속 MT1882-V의 분리 및 동정과정은 다음과 같다.

[신규 미생물의 분리]

멸균 생리식염수 10㎖에 풍건한 토양시료 1g을 넣고 30분 동안 교반한 다음 10^-2~10^-4배로 희석하여 0.1㎖을 악티노마이세스 (Actinomycetes)분리 한천배지에 도말한 후 28℃에서 7 ~ 10일간 배양하여 나타난 집락을 순수분리하였다.

[신규 미생물의 동정]

1) 형태 및 배양학적 특성

MT 18820-V는 전형적인 스트렙토마이세스속(Streptomyces sp.)의 특성을 보이는 균주로서 배양학적 특성은 다음과 같았다. 국제방선균분류프로젝트(International Streptomyces Project, ISP)에서 추천하는 ISP 4 배지(증류수 1ℓ당 가용성 전분 10g, 제2인산칼륨 1g, 황산마그네슘 1g, 황산이암모니움 2g, 탄산칼슘 2g, 미량무기염용액 1 mℓ, 한천 20g, pH는 7.0에서 7.4로 조정)에서 가장 잘 생육하고, 이 배지에서의 생육시에 균체의 기균사의 색깔은 흰색이거나 회색이며, 배면의 색깔은 옅은 노란색이고 가용성 색소는 생성하지 않았다. 또한 형태학적인 특징으로서 ISP 4 배지에서 14일간 배양해서 생성된 포자는 전자현미경에 의한 관찰에서 포자의 표면은 돌기를 형성하고 있으며 포자들은 나선형의 체인형태로 연결되어 있다.

2) 생리학적 특성

MT 1882-V의 성장은 5 ~ 6일째 성장이 최고치에 다다르며, 7일째 피에리시딘 A1의 생산을 극대화하고 그 이후부터 서서히 감소되었다. 피에리시딘 A1 생산 최적온도는 약 30℃가 되며, 배양이 시작(pH 7.0)되고 7일 후에는 약산성인 pH 5.5 ~ 6.0으로 변하였다. 피에리시딘 A1의 생산조건은 외부환경에 매우 민감하여 통기량 0.5 vvm, 교반속도 200rpm, 온도 30℃, pH 7.0에서 7일간의 배양조건이 필수적이다. 그리고 이 균주는 세포벽을 구성하는 아미노산 중 디아미노피메릭산(DAP)의 종류가 전형적인 스트렙토마이세스속에 해당되는 LL-디아미노피메릭산이었다.

3) 신균주 미생물 스트렙토마이세스속(Streptomyces sp.) MT1882-V의 동정 및 명명

형태적, 배양학적 및 생리적 특성을 분석한 결과, 본 발명에서 분리된 균주는 스트렙토마이세스속(Streptomyces sp.)에 속하는 미생물임을 버기스 매뉴얼(Bergey's Manual Systematic Bacteriology Vol 2, William & Wilkins Co., 1989)에서 확인할 수 있었다. 동정 결과가 정확하게 일치되는 균주는 없었지만, 스트렙토마이세스속(Streptomyces sp.)에 해당되는 스트렙토마이세스속(Streptomyces sp.)의 변종으로 판단된다.

분리된 미생물을 스트렙토마이세스속 MT1882-V로 명명하고, 1997년 5월 19일부로 대한민국 특허균주 기탁기관인 한국과학기술연구소 생명공학연구소내 유전자원센타에 기탁하여 수탁번호 KCTC 8800P를 부여받았다.

[피에리시딘 A1의 분리]

배양배지로 물 1ℓ당 포도당 10g, 수용성 전분 20g, 대두분 25g, 효모추출액 4g, 제2인산칼륨 0.05g 및 탄산칼슘 2g을 사용한다. 종균 배양은 이와같은 조성의 기본배지에 멸균하여 선정된 스트렙토마이세스속(Streptomyces sp.)MT1882-V를 접종한 후 10일간 배양한다. 본 배양은 이렇게 배양된 종균 배양액 2%를 접종하고 발효조내의 통기량 0.5 vvm, 교반속도 200 rpm으로 30℃에서 7일간 배양한 뒤 배양액을 회수하고, 6,000 rpm으로 10분간 원심분리하여 배양상등액을 앰버라이트(Amberlite XAD-4)에 흡착시켜 50%이상 아세톤으로 활성물질을 용출하고, 균체는 60% 아세톤으로 추출하여 상등액-용출액과 합쳐 감압농축한다. 에틸아세테이트로 3회 반복추출하여 농축한 후 실리카겔 칼럼크로마토그라피에서 클로포름/메탄올(20/1 부피비)을 용매로하여 용출시켜 활성분획을 세파덱스 SH-20 칼럼크로마토그리피에서 메탄올로 용출하고 로바 저압 LC (RP-18)에서 메탄올/물(9/1 부피비)로 활성물질을 용출, 피에리시딘 A1을 분리 정제한다.

상기로부터 분리한 피에리시딘 A1의 항균스펙트럼, UV스펙트럼 및 NMR스펙트럼 등으로 분석한 결과는 다음과 같으며, 항균제로 알려진 피에리시딘A1과 동일한 것으로 밝혀졌다.

1) 외관: 연한노랑의 액상

2) 용해도: 메탄올, 에탄올, 에틸아세테이트, 클로로포름에 잘녹음

3) 분자식: C₁₂H₃₇O₁₄

4) 자외선 분광광도스펙트럼(λ_max)

230, 237, 267 nm (중성)

230, 237 nm (산성)

230, 237, 273 nm (알카리성)

5) 고속원자폭격 질량분석 스펙트럼 : m/z 415 [M+H]

6)¹³C-핵자기공명스펙트럼(300 MHZ, CDC1₃), ppm : 34.5(C-1, CH₂), 122.4(C-2, CH), 134.7(C-3, C), 43.2(C-4, CH₂), 126.7(C-5, CH), 135.9(C-6, CH), 134.7(C-7, C), 133.2(C-8, CH), 37.0(C-9, CH), 82.9(C-10, CH), 135.9(C-11, C), 123.3(C-12, CH), 13.1(C-13, CH₃), 10.7(C-14, CH₃), 17.5(C-15, CH₃), 16.6(C-17, CH₃), 150.8(C-1', C), 112.2(C-2', C), 154.3(C-3', C), 128.0(C-4', C), 153.7(C-5', C), 10.5(C-6', CH₃), 60.5(C-7', OCH₃), 53.0(C-8'. OCH₃)

[인터루킨-2 생성억제제 탐색방법]

EL4 세포는 쥐의 T 면역세포로서 PMA(phorbol 12-myristate 13-acetate)라는 식물 추출물질을 처리하면 인터루킨-2가 생성된다. 그리고, CTLL-2 세포는 인터루킨-2 존재하에서만 세포증식이 가능하다. 따라서, PMA가 처리된 EL4 세포의 상등액에 CTLL-2 세포를 처리함으로써 면역억제물질의 존재여부를 확인할 수가 있게 된다.

본 발명에 따른 인터루킨-2 생성억제제 탐색방법을 구체적으로 설명하면 다음과 같다.

먼저, 96웰 멀티적정 플래이트(96 well multititer plate)의 각 웰에 시료를 10㎕ 넣은후 2 × 10⁵cells/㎖의 EL4 세포에 PMA 농도가 3 ng/㎖ 되도록 처리하여 시료가 들어있는 각 웰에 200㎕씩 분주한다. 5분동안 CO₂세포배양기에 웰 플래이트를 방치후 1,200 rpm에서 5분동안 원심분리하여 200㎕의 인산완충생리식염수(PBS)를 넣은 뒤, 다시한번 원심분리하여 세포를 세척하고 PMA 3 ng/㎖ 포함된 RPMI1640 배지 200㎕를 각 웰에 넣고 24시간 배양한다. 그 후 30㎕의 배양 상등액을 다른 96웰 플래이트의 각 웰에 넣고 인산완충생리식염수(PBS)로 세척된 1 × 10⁵cells/㎖의 CTLL-2 세포 100㎕를 넣어 CO₂배양기에 24시간 배양한다. MTT 방법에 의해 CTLL-2 세포 증식정도를 측정하여 인터루킨-2 생성정도를 알 수 있다.

상기에서 설명한 바와 같은 본 발명의 인터루킨-2 생성억제제 탐색방법에 의한 결과, 인터루킨-2 측정을 위한 고가의 항체사용이나 3중수소로 표식된 [³H]-티미딘 혹은 [³H]2-데옥시글루코스 등의 동위원소 사용없이, 세포세척 방법으로써 시료에 의한 세포독성을 극소화 시켜 시료양을 최대로 첨가할 수 있어 시료 속의 매우 적은 농도의 활성물질도 확인할 수 있게 된다.

이와같은 본 발명을 다음의 실시예에 의거 더욱 상세히 설명하겠는 바, 본 발명이 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1 : EL4 세포에서 인터루킨-2 생성을 위한 PMA의 적정농도

96 웰 멀티적정 플레이트(well multititer plate)의 각 웰(well)에 RPM1640 배지를 넣고, 각 웰에 EL4 세포를 세포농도 2 × 10⁵cells/㎖ 되게하여 200㎕씩 넣은다음 PMA의 농도를 1 ~ 100 ng/㎖로 변화시키면서 24시간 CO₂배양기에서 배양하였다. 그런 다음, 그 배양액중 30㎕씩을 다른 96 웰 플레이트상의 각각 다른 웰에 넣고, CTLL-2 세포를 RPM1640 배지에서 1 × 10⁵cells/㎖의 농도로 하여 100㎕씩 상기 배양액이 들어있는 웰에 넣어 24시간 배양한 후 CTLL-2 세포의 증식여부를 MTT 염색반응법(Alley, M.C. el, Canceres. 48 : 589 ~ 601, 1988)에 의하여 확인하였다.

그 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이 1 ng/ml 농도에서 PMA는 EL4세포의 인터루킨-2 생성을 유도하기 시작하였고 100 ng/㎖에서도 세포독성을 보이지 않았다. 또한 PMA자체가 CTLL-2 세포증식에 직접적으로 영향을 줄 수도 있다는 가능성을 조사하였는데, PMA자체가 CTLL-2 세포에 직접 최종농도 0 ~ 23 ng/㎖로 처리하였을 때, 이 농도구간에서 CTLL-2 세포에 증식에는 아무런 영향이 없었다. 따라서 PMA는 CTLL-2 세포에는 직접 영향을 주지않고 EL4 세포의 인터루킨-2생성을 유도함을 알 수 있다.

실시예 2 : EL4 세포에 처리될 수 있는 용매의 최적량

용매의 최적량을 결정하기 위하여 메탄올(MeOH)과 디메틸설폭사이드(DMSO)의 양을 최종농도 0 ~ 80%까지 변화시키면서 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 수행하였다.

그 결과, 도 2에 나타낸 바와같이 MeOH이나 DMSO는 최종농도 40%까지는 EL4 세포에 전혀 영향을 주지않았고 50 ~ 60%까지는 약간의 손상을 주었으며 80% 정도에서는 강한 세포독성을 보였다.

따라서 다른 탐색방법과는 다르게 본 발명에서의 방법으로는 적어도 40% 정도까지의 시료를 적용해 볼 수 있어 시료 속의 매우 적은농도의 활성물질 탐색에 유용할 수 있다.

실시예 3 : 피에리시딘 A1의 EL4 세포에서의 인터루킨-2 생성억제활성

스트렙토마이세스속 배양액 또는 추출액 40㎕를 EL4 세포액 200㎕에 5분간 처리하고 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 실행하였다. 이로써 약 2,000 종의 배약액 시료중 스트렙토마이세스속 MT1882-V의 배양액으로부터 분리된 피에리시딘 A1(C₂₅H₃₇O₄N)이 인터루킨-2 생성억제능을 가짐을 확인하였다.

그 결과, 도 3에서 볼 수 있듯이 피에리시딘 A1은 약 50 ng/㎖의 농도에서 EL4 세포에서 PMA에 의한 인터루킨-2 생성을 50% 정도 저해하였고, 100 ng/㎖ ~ 2.5 ㎍/㎖까지는 90% 정도 저해하고 그 이후는 세포독성을 보였다.

실시예 4 : 피에리시딘 A1의 저카트 T 세포에서의 인터루킨-2 생성억제활성

저카트 T 세포는 CD3 항체와 PMA를 함께 처리할 때 인터루킨-2 생성이 매우 증가하는 것으로 알려져있다. 피에리시딘 A1이 저카트 세포에서도 인터루킨-2 생성을 억제하는지 알아보기 위하여 저카트 세포에 CD3항체와 50 ng/㎖의 PMA를 함께 처리하고 피에리시딘 A1을 농도별로 첨가하여 실시예 3의 방법에 의해 인터루킨-2 생성을 측정하였다.

그 결과, 도 4에서와 같이 피에리시딘 A1은 저카트 세포에서 약 1 ㎍/㎖에서 50% 저해효과를 보였으나 저카트 세포독성은 보이지 않았다.

실시예 5 : 피에리시딘 A1의 CTLL-2에 대한 세포독성 유무

피에리시딘 A1이 PMA에 의한 EL4 세포에서 인터루킨-2 생성을 억제한다는 사실이 잔존 피에리시딘 A1의 CTLL-2에 대한 세포독성에 의한 것인지 아닌지를 확인하기 위해 실시예 3에서의 각 웰에 새로운 인터루킨-2를 첨가시켰다.

그 결과, 도 5에서 보듯이 인터루킨-2를 새로이 추가시켰을때 CTLL-2는 다시 증가함을 알 수 있고 이는 FK506의 경우와 비교해도 알 수 있다.

실시예 6 : 정제의 제조

피에리시딘 A1 10g

락토스 70g

결정성 셀룰로오스 15g

마그네슘 스테아레이트 5g

총 량 100g

상기에서 나열된 성분들을 잘게 부숴 혼합한 후, 직타법(direct tableting method)에 의해 정제를 제조하였다. 각 정제의 총량은 100㎎ 이었고, 그 중 유효성분의 함량은 10㎎ 이었다.

실시예 7 : 분말제의 제조

피에리시딘 A1 10g

옥수수전분 50g

카르복시 셀룰로오스 15g

총 량 100g

상기에서 나열된 성분들을 잘게 부숴 혼합하여 분말을 제조하였다. 5번 경질캡슐에 분말 100㎎을 넣어 캡슐제를 제조하였다.

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명은 신규한 미생물을 제공하고, 이로부터 생산된 피에리시딘 A1이 인터루킨-2의 생성억제제로서의 기능을 갖는 바 이를 이용하여 새로운 면역억제제의 제제화가 가능하며, 또한 종래의 인터루킨-2의 생성 저해물질 탐색방법에 세포세척단계를 포함시킴으로써 세포독성을 경감시키고 시료 속의 매우 적은 농도의 활성물질 탐색에도 유용할 뿐만 아니라 방사성 동위원소의 사용을 배제함으로써 인체내의 위험성을 감소시켰고, 또한 인터루킨-2 항체사용을 배제하여 보다 경제적인 효과가 있다.

Claims

피에리시딘 A1을 생산하는 스트렙토마이세스속 MT1882-V(KCTC 8800P).
다음 화학식 1로 표시되는 피에리시딘 A1을 유효성분으로 함유하고 있는 것임을 특징으로 하는 인터루킨-2 생성 억제제.

화학식 1