NO341856B1 - Høyst potente fullstendig eller delvis agonister og antagonister av nociceptin/orfanin FQ reseptoren - Google Patents

Abstract

Peptid analoger av nociceptin/orfanin FQ, sammensetninger derav, og deres anvendelse i behandling av forstyrrelser og dysfunksjoner relatert til aktivering eller blokkering av NOP reseptorer er beskrevet.

Description

OMRÅDE FOR OPPFINNELSEN

Den foreliggende oppfinnelsen angår nociceptin/orfanin FQ (N/OFQ) peptid analoger som er i stand til å modulere aktiviteten til N/OFQ peptid reseptoren (NOP reseptor), farmasøytiske sammensetninger omfattende nevnte peptid analoger og deres anvendelse for behandling av dysfunksjoner, patologiske tilstander eller patologiske stadier som involverer nevnte reseptor.

BAKGRUNN FOR OPPFINNELSEN

I 1994, ble en ny reseptor benevnt ORL1, som er strukturelt lik opioid reseptorer, klonet; ifølge nylige IUPHAR anbefalinger, er det mest passende navnet for denne reseptoren NOP. Dens endogene ligand (N/OFQ), identifisert på slutten av 1995, er et heptadekapeptid liknende noen opioid peptider (f.eks. dynorfin A), som imidlertid ikke binder de klassiske opioid reseptorer av mu (MOP), delta (DOP) eller kappa (KOP) typene. De cellulære effektene mediert av NOP reseptoren er liknende til de som utløses av klassiske opioid reseptorer. Fra en strukturell synsvinkel, og fra synsvinkelen til signal transduksjon tilhører N/OFQ-NOP peptid/reseptor systemet opioid familien, selv om den representerer en farmakologisk distinkt sidegren. Flere studier, utført mellom 1996 og 1998, viste at N/OFQ kan modulere flere funksjoner både i sentralnervesystemet (smerte, angst, læring, hukommelse, stoffmisbruk, appetitt) og på det perifere nivå (blodtrykk, hjerterytme, nyre, gastrointestinale, urogenitale og respiratoriske funksjoner) (for videre detaljer se Massi et al., Peptider 21, 2000).

Med start fra 1996 utførte de nærværende oppfinnere studier på N/OFQ-NOP systemet noe som forte til identifiseringen av særskilte NOP reseptor ligander, slik som i) N/OFQ(1-13)-NH2, som representerer det minimale funksjonelle fragmentet med den samme aktiviteten som den naturlige N/OFQ liganden (Calo et al., Eur J Pharmacol 311, R3-5, 1996), ii) N/OFQ-NH2 som produserer, særlig in vivo, mer intense og forlengede effekter sammenlignet med N/OFQ (Rizzi et al., Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol 363, 161165. 2001), iii) [Tyr<1>]N/OFQ(1-13)-NH2, en blandet agonist som virker på NOP og på de klassiske opioid reseptorene (Calo et al., Can J Physiol Pharmacol 75, 713-8, 1997; Varani et al., Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol 360, 270-7, 1999), iv) [Phe<1>Ψ(CH2-NH)Gly<2>]N/OFQ(1-13)-NH2, en selektiv NOP reseptor ligand som oppfører seg som en ren antagonist, partiell agonist eller til og med som en full agonist, avhengig av preparasjon/undersøkelse under studien (Guerrini et al., Br J Pharmacol 123, 163-5, 1998; Okawa et al., Br J Pharmacol 127, 123-30, 1999) – basert på den detaljerte analysen av farmakologisk virkning av [Phe<1>Ψ(CH2-NH)Gly<2>]N/OFQ(1-13)-NH2 rappotert av Calo’ et al. (Peptider 21, 935-47, 2000), viser det seg denne forbindelsen er en sann partiell NOP agonist, v) [Nphe<1>]N/OFQ(1-13)-NH2, den første rene konkurrerende antagonist av NOP reseptor (Calo et al., Br J Pharmacol 129, 1183-93, 2000; Guerrini et al., J Med Chem 15, 2805-13, 2000). Virkningen av disse ligandene har blitt karakterisert i en rekke in vitro og in vivo undersøkelser (se Calo et al., Br J Pharmacol 129, 1261-83, 2000). Mer nylig ble Phe<4>resten erstattet med (pF)Phe eller (pNO2)Phe, derved oppnåddes potente selektive NOP agonister (Guerrini et al., J Med Chem 44, 3956-64, 2001). En annen interessant forbindelse, [Arg<14>,Lys<15>]N/OFQ, ble identifisert som en høyst potent agonist (17-ganger mer potent enn N/OFQ), selektiv for humane rekombinante NOP reseptorer uttrykt i HEK293 celler (Okada et al., Biochem Biophys Res Commun 278, 493-8, 2000). Virkningen av denne liganden ble videre karakterisert in vitro ved hjelp av isolerte vev sensitive til N/OFQ, og in vivo i musen (Rizzi et al., J Pharmacol Exp Ther 300, 57-63, 2002). Dessuten beskrev Zhang et al., (Zhang et al., J Med Chem, 45, 5280-5286, 2002) N/OFQ analoger, karakterisert ved en 2-amino-2-metylpropionsyre (Aib) rest i posisjon 7 og/eller 11, erstattende Ala rester og produserende en økning av ligand affinitet og potens. N/OFQ analoger ble beskrevet i WO 99/07212, WO 97/07208, WO 99/03491, WO 99/03880, og EP 1422240. Nytten av denne liganden har blitt rapportert i behandlingen/forebyggingen av sykdommer relatert til hyperalgesi, nevroendokrine funksjoner, stress, bevegelsesaktivitet og angst.

Heretter er referanse sekvensen til N/OFQ peptidet følgende: H-Phe-Gly-Gly-Phe-Thr-Gly-Ala-Arg-Lys-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Ala-Asn-Gln-OH

CHANG et al. (CHANG et al., Regulatory Peptides, 130(3), 116-122, 2005) beskriver peptidanaloger der virker som agonister av NOP reseptoren med den generelle formel: Phe-ψ-Gly-Gly-Xaa<4>-Thr-Gly-Ala<7>-Arg-Lys-Ser-Ala-Arg-Lys-Xbb<14>-Xcc<15>-Asn-Gln-R.

WO 2005/004896 beskriver N/OFQ peptidderivater, der virker som agonister og antagonister av NOP-reseptorer.

WO 03/093294 beskriver ORL-1 reseptor agonister med konformasjonelle begrensede aminosyrer som favoriserer alfa-helix-konformasjoner.

BESKRIVELSE AV FIGURENE

Figur 1: Effekten av intracerebroventrikulær (i.c.v., som vist i de øvre panelene) eller intratekal (i.t., som vist i de nedre panelene) administrasjon av N/OFQ (10 nmol/mus) og av UFP-112 (0.1 nmol/mus) i haletilbaketrekningsundersøkelsen (ref. Calò et al. Br J Pharmacol. 125, 375-378, 1998). Kontrolldyr mottok én i.c.v. injeksjon med saltoppløsning (2 µl/mus). Hvert punkt representerer middelverdien ± s.e.m. av minst 4 eksperimenter.

Figur 2: Varighet av effektene av N/OFQ (10 nmol/mus) og UFP-112 (0.1 nmol/mus), administrert intracerebroventrikulært (i.c.v.), på spontan bevegelsesaktivitet i mus (ref. Rizzi et al., Naunyn Schmiedebergs Arch. Pharmacol. 363, 161-165,2001). Kontrolldyr mottok én i.c.v. injeksjon med saltoppløsning (2 µl/mus). Hvert punkt representerer middelverdien ± s.e.m. av minst 4 eksperimenter.

Figur 3: Kinetikk av virkning og reversibilitet av effektene av like-effetive konsentrasjoner av N/OFQ og UFP-112 i sædlederen (vas deferens) av mus etter elektrisk stimulering. Vas deferens sammentrekning indusert ved elektrisk stimulering blir hemmet under tilstedeværelsen av UFP-112 eller N/OFQ.

DETALJERT BESKRIVELSE AV OPPFINNELSEN

Betegnelsene anvendt i dette patentet har en betydning som kjent på fagområdet, som for eksempel i IUPHAR on Reseptor Nomenclature and Drug Classification, Pharm. Rev. (2003) Vol 55, No 4, p.597, som rapportert her: Virkeevne – et konsept som uttrykker graden til hvilken ulike agonister frembringer ulike responser, selv når de opptar den samme forhold av reseptorer.

Potens – et uttrykk for aktiviteten av en forbindelse, definert på vilkår av konsentrasjonen eller mengden nødvendig for å produsere en definert effekt. Potensen blir målt som pEC50 for agonister og som pA2 for antagonister.

Hensikter med den foreliggende oppfinnelsen er N/OFQ peptid analoger, av generell formel (I)

Xaa<1>-ψ-Gly<2>-Gly<3>-Xbb<4>-Thr<5>-Gly<6>-Aib<7>-Arg<8>-Lys<9>-Ser<10>-Ala<11>-Arg<12>-Lys<13>Arg<14>-Lys<15>-Asn-Gln-NH2

(I)

hvor

når Xaa<1>er Phe, Ψ representerer bindingen mellom de to første aminosyrerestene og er CO-NH, Xbb<4>er pFPhe hvor “p” indikerer paraposisjonen i fenylringen av Phe; eller når Xaa<1>er Phe, ψ er CH2-NH, Xbb<4>er pFPhe; eller når Xaa<1>er N-benzyl-glysin (Nphe), ψ er CO-NH, og Xbb<4>er Phe.

Enn videre inkluderer oppfinnelsen farmasøytisk godtagbare salter av disse forbindelsene (I), særlig organiske- og mineralsyresalter slik som, hydroklorid, hydrobromid, fosfater, sulfater, acetater, succinater, ascorbater, tartrater, glukonater, benzoater, maleater, fumarater og stearater.

Forbindelsene ifølge oppfinnelsen, som faller under formel I, har en dokumentert farmakologisk aktivitet, til og med 100-ganger høyere enn peptidligandene kjent på fagområdet. Det er derfor mulig å anta en synergetisk effekt av de forskjellige kombinasjonene ifølge formel I: for posisjoner 1, 4, 7, 11, 14, og 15 og bindingen mellom de to første aminosyrerestene. En høyere aktivitet av forbindelsene av formel I og særlig av de foretrukne forbindelsene, fortrinnsvis agonister og mer foretrukket [(pF)Phe<4>,Aib<7>,Arg<14>,Lys<15>]N/OFQ-NH2 er demonstrert med hensyn til affinitet, potens, protease resistens, in vitro virkningskinetikk, og, fremfor alt, varighet av deres virkning in vivo.

Foretrukne forbindelser er peptidanalogene som har formel (I) i hvilke variable rester har betydningen rapportert i følgende tabell:

Disse forbindelser er representert ved de følgende formlene:

a) H-Nphe-Gly-Gly-Phe-Thr-Gly-Aib-Arg-Lys-Ser-Ala-Arg-Lys-Arg-Lys-Asn-Gln-NH2

b) H-Phe-Gly-Gly-(pF)Phe-Thr-Gly-Aib-Arg-Lys-Ser-Ala-Arg-Lys-Arg-Lys-Asn-Gln-NH2

c) H-Phe-Ψ(CH2-NH)-Gly-Gly-(pF)Phe-Thr-Gly-Aib-Arg-Lys-Ser-Ala-Arg-Lys-Arg-Lys-Asn-Gln-NH2

Peptidanaloger ifølge oppfinnelsen kan bli syntetisert ved ulike teknikker kjent i litteraturen, for eksempel Schroeder et al. “The Peptides” vol 1, Academic Press, 1965; Bodanszky et al. “Peptide Synthesis” Interscience Publisher, 1966; Barany & Merrifield, “The peptides; Analysis, Synthesis, Biology”, 2, Academic Press, 1980; E. Atheron e R.C. Sheppard, “Solid Phase Peptid Synthesis” IRL Press at Oxford University Press 1989; J. Jones, “The Chemical Synthesis of Peptides”, Claredon Press, Oxford 1994. Disse teknikkene inkluderer fastfasepeptidsyntese eller løsningsfasepeptidsyntese, organiskkjemiske syntesemetoder, eller hvilken som helst kombinasjon av de over. Valget av synteseskjema vil være innlysende avhengig av sammensetningen av et gitt peptid. Fortrinnsvis, blir syntese metoder anvendt som er basert på en passende kombinasjon av fastfaseteknikker og klassiske løsningsfasemetoder, som omfatter lave produksjonskostnader, særlig i en industriellskala. I detalj omfatter nevnte metoder:

i) Syntese i løsning av peptidkjedefragmenter gjennom sekvensiell kobling av N-beskyttede hensiktsmessig aktiverte aminosyrer, til en aminosyre eller en C-beskyttet peptidkjede, med isolering av mellomproduktene, etterfølgende selektiv avbeskyttelse av N og C-terminal endene av nevnte fragmenter, og dere repeterte kobling inntil det ønskede peptid er oppnådd. Om nødvendig blir sidekjeder avbeskyttet.

ii) Fastfasesyntese av peptidkjeden fra den C-terminale enden mot den N-terminale enden på en uløselig polymerstøtte. Peptidet blir fjernet fra harpiksen ved hydrolyse med vannfri flussyre eller trifluoreddiksyre, med samtidig av beskyttelse av sidekjedene.

Ved slutten av syntesen kan peptider bli renset og isolert ved behandling med egnede løsningsmidler og ved kromatografi teknikker, slik som HPLC.

Peptid analogene ifølge oppfinnelsen virker på NOP reseptoren som i) full agonister, når de fremviser strukturen [Phe<1>Ψ(CO-NH)Gly<2>], ii) delvis agonister, når de fremviser strukturen [Phe<1>Ψ(CH2-NH)Gly<2>] eller [Phe<1>Ψ(CH2-O)Gly<2>], og som rene antagonister, når de fremviser strukturen [Nphe<1>Ψ(CO-NH)Gly<2>].

Beskrevet heri er også farmasøytiske sammensetninger inneholdende peptid analogene beskrevet her, muligens i kombinasjon med farmasøytisk godtakbare vehikler og eksipienter. Sammensetningene som beskrevet heri kan bli administrert gjennom den orale eller parenterale ruten, eller gjennom den respiratoriske, rektale, spinale, intrathekale, intravesikale eller topiske ruten, som injiserbart preparat, kapsel, tablett, granulat, oppløsning, suspensjon, sirup, stikkpille, nesespray, krem, salve, gel, kontrollert frigivelses preparat eller andre. Prinsippene og metodene for fremstilling av farmasøytiske sammensetninger er velkjent for ekspertene på fagområde og er beskrevet, for eksempel, i Remington’s Pharmaceutical Sciences, 18° Edition, Mack Publishing Company, Easton, Pa, 1990. Farmasøytisk sammensetninger som beskrevet heri vil inneholde en effektiv mengde av peptider (eller av deres derivater) vanligvis i området mellom 0,001 og 100 mg, fortrinnsvis mellom 0,01 og 10 mg. Den daglige dosen vil variere avhengig av type av patologi/dysfunksjon, alder, kjønn og pasientens kroppsvekt, den generelle helse status og andre variable som må vurderes på en fra tilfelle til tilfelle basis.

Tatt i betraktning aktivitetsprofilen oppvist av peptidene ifølge oppfinnelsen i biologiske tester, kan de farmasøytiske sammensetningene inneholdende nevnte peptider bli brukt for behandling av dysfunksjoner, tilstander eller patologiske tilstander, omfattende neurologiske og neuro-sensoriske dysfunksjoner. Det er ønskelig å oppnå en potent og forlenget NOP reseptor aktivering for behandlingen av angst, anoreksi, hypertensjon, takykardi, vann retensjonslidelser, hyponatremi, kongestiv hjertesvikt, glattmuskel bevegelses dysfunksjoner i magetarm-, respirasjon-, og urogenitalsystemene (særlig urin inkontinens følgende neurogenblære), inflammatoriske tilstander, eller perifere eller spinal analgesi, særlig for behandlingen av kronisk smerte, eller, enda mer, i hostekontroll. Dessuten vil det være mulig å bruke antagonistene for behandling av hukommelse, sinnsstemning, bevegelsesaktivitet (f.eks. Parkinson’s sykdom), spiseforstyrrelser (f.eks. bulimi), eller, mer generelt, for behandling av fete pasienter. Den høye molekylvekten av disse forbindelsene, og tilstedeværelsen inni den av rester som kan være positivt ladet ved fysiologisk pH gjør det lite trolig at de kan krysse hjerne-blodbarrieren. Nevnte forbindelser kan utøve sentrale effekter følgende lokal administrasjon, selv om de hovedsakelig viser en perifer distribusjon. For eksempel kan agonist forbindelser virke smertestillende på sentralnervesystem nivå etterfølgende intratekal eller spinal administrasjon.

EKSPERIMENTELL DEL

1. PEPTID SYNTESE

1.1 Generell plan for syntese

Peptidene ifølge oppfinnelsen ble fremstilt ved fastfasesyntese ved anvendelse av en harpiks 4-(2’,4’-dimetoksyfenyl-Fmocaminometylfenoksyacetamido-norleucyl-harpiks (Rink-Amide MBHA resin). Fmoc aminosyrer (fluoremylmetoksykarbonyl) har blitt kondensert ved anvendelse av [O-(7-azabenzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetrametyluroniumeksafluorofosfat] (HATU) som reagens for aktivering av karboksylfunksjonen. Fmoc grupper har blitt fjernet ved anvendelse av 20% piperidin i DMF (dimetylformamid) og harpiksen bundet til det beskyttede peptidet har blitt behandlet med K reagensen for å oppnå råpeptidet. Forbindelser inneholdende en modifisert peptidbinding mellom de to første aminosyrerestene [Phe<1>Ψ(CH2-NH)Gly<2>] eller [Phe<1>Ψ(CH2-O)Gly<2>] har blitt oppnådd ved kondensering av Boc-Phe-CHO på det beskyttede peptidet (2-17) eller (2-16) eller (2-15) bundet til harpiksen under det siste syntesetrinnet, derved reduserende in situ “imino” derivat mellomproduktet med NaBH3CN, eller kondenserende fragmentet Boc-[Phe<1>Ψ(CH2-O)Gly<2>]-OH (som ble oppnådd ved å følge metodene rapportert i litteraturen: Balboni et al. J. Chem. Soc. Perkin Trans I, 1998, side 1645-1651) på det beskyttede peptidet (3-17) eller (3-16) eller (3-15) bundet til harpiksen under der siste syntesetrinnet ved anvendelse av HATU som kondenseringsmiddel.

Den analytiske kontrollen av bade rå og slutt produkter ble gjort ved analytisk HPLC i Beckmann Systemet Gold 168, ved anvendelse av en Alltech C-18 kolonne (150 x 4.6 mm, 5 μm). Forbindelser ble analysert ved anvendelse av et binært elueringssystem bestående av løsningsmiddel A: 35 mM NaH2PO4 (pH 2.1) og løsningsmiddel B: 59 mM NaH2PO4 (pH 2.1)-acetonitril (60:40 v/v), gradienten programmert ifølge de fysisk-kjemiske egenskapene til forbindelsene som skal analyseres, ved en strømningshastighet på 1 mL/min og en bølgelengde på 220 nm. Råpeptidet har blitt renset ved hjelp av det vannpreparative HPLC Delta Prep 4000 systemet, ved bruk av en vann radial pakkingskolonne (Water radial packing column) Delta-LC 40 mm (30 x 40 cm, C18, 300 A, 15 μm) som ble eluert med den samme mobile fase som ble brukt for analytisk HPLC og med en gradient programmert ifølge den analytiske profilen til de rå reaksjonsproduktene. Molekylvekten til sluttforbindelsen ble oppnådd ved elektro-spraymassespektrometri ved bruk av instrumentet mikromasse ZMD2000.

For mellomproduktene av noen peptider ble en spektroskopisk 1HNMR analyse utført ved bruk av et Bruker 200MHz instrument.

1.2 Prosedyre.

Peptid analoger b), c) og d) beskrevet over ble fremstilt ifølge prosedyrene beskrevet her under.

Resinet Rink-Amide MBHA (0,65 mmol/g, 0,2 g) ble behandlet med piperidin (20%) i DMF og kondensert med Fmoc-Gln(Trt)-OH, aktiverende karboksylfunksjonen med HATU. De følgende Fmoc aminosyrene ble koplet sekvensielt til den voksende peptidkjeden: Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Arg(Pmc)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Arg(Pmc)-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Arg(Pmc)-OH, Fmoc-Aib-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-(pF)Phe-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Phe-OH. Alle Fmoc aminosyrene (4 ekvivalenter) ble koplet til den voksende peptidkjeden ved bruk av HATU (4 ekvivalenter) og diisopropyletylamin (4 ekvivalenter) i DMF; koplingsreaksjonen utført i en time. For å optimalisere syntese utbyttet og gjøre rensingen av forbindelsene enklere var dobbelkopling med en time acylering nødvendig for Aib resten. Piperidin (20%) i DMF ble brukt for å fjerne Fmoc grupper i hvert trinn. Etterfølgende avbeskyttelsen av den siste N<α>-Fmoc gruppen ble peptidresinet vasket med metanol og tørket under vakuum for å gi [(pF)Phe<4>,Aib<7>,Arg<14>,Lys<15>]-N/OFQ(1-17)-Rink-Amide MBHA-beskyttet resin. Dette beskyttede peptidresinet ble behandlet med K reagensen (TFA / H20 / fenol / etanditiol / tioanisol 82,5: 5: 5: 2,5: 5; v/v; 10 ml / 0,2 g resin) i 1 time ved romtemperatur. Etter filtrering av den brukte resinet ble løsningsmiddelet konsentrert under vakuum og resten ble løst i eter. Råpeptidet ble renset ved preparativreversfase HPLC, og et hvitt pulver ble oppnådd etter frysetørking.

Syntesen av [Phe<1>Ψ(CH2-NH)Gly<2>,(pF)Phe<4>,Aib<7>,Arg<14>,Lys<15>]-N/OFQ-NH2 (peptid c) ble gjort med utgangspunkt fra mellomproduktet [(pF)Phe<4>,Aib<7>Arg<14>,Lys<15>]-N/OFQ-(2-17)-resin syntetisert som beskrevet over. Dette mellomproduktet (0,2 g, 0,65 mmol/g, 0,13 mmol) ble resuspendert og svellet i metanol inneholdende 1% (V/V) eddiksyre (2 ml). Etter 20 minutter ble en løsning inneholdende Boc-Phe-CHO (0,065 g, 0,26 mmol) og NaBH3CN (0,033 g, 0,52 mmol) oppløst i metanol (0,8 ml) tilsatt og reaksjonsblandingen ble omrørt i 1,5 timer. Resinet ble så vasket med metanol og behandlet med reagens K som beskrevet over. Syntesen av [Phe<1>Ψ(CH2-O)Gly<2>,(pF)Phe<4>,Aib<7>,Arg<14>,Lys<15>]N/OFQ-NH2 (peptid d) ble gjort med utgangspunkt fra mellomproduktet [(pF)Phe<4>,Aib<7>Arg<14>,Lys<15>]-N/OFQ(3-17)-resin syntetisert som beskrevet over. Mellomproduktet (0,2 g, 0,65 mmol/g, 0,13 mmol) ble acylert i det siste trinnet med Boc-Phe[Ψ(CH2-O)]Gly-OH (4 ekvivalenter, 0,16 g, 0,52 mmol) aktiverende karboksylfunksjonen med HATU under de samme betingelsene som beskrevet for de normale acyleringstrinnene. Deretter ble resinet vasket med metanol og behandlet med reagens K som beskrevet over.

2. Farmakologiske tester.

2.1 Materialer og metoder

Forbindelsene ble testet in vitro på Hamster oocytt membraner som uttrykker den humane rekombinante NOP reseptoren (CHOhNOP) (reseptorbindingseksperimenter og GTPγS bindingsstimuleringseksperimenter) og på mus vas deferens etter elektriskstimulering. Betingelsene som ble brukt for å studere effektene av forbindelsene i bioundersøkelseseksperimentene (mus vas deferens) er beskrevet i Bigoni et al. (Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol 359, 160-7, 1999), mens betingelsene som ble brukt for å studere effektene i CHOhNOP celler er beskrevet i Mc Donald et al. (Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol, 367, 183-187, 2003). I hver serie av eksperimenter ble aktiviteten av nye forbindelser sammenlignet med den av det naturlige N/OFQ peptidet.

2.2 Resulter.

I reseptorbindingseksperimenter viste alle testede forbindelser seg å være i stand til å fortrenge fullstendig det tritierte N/OFQ fra den humane rekombinante NOP reseptoren. Forbindelsene oppviste svært forskjellige reseptoraffiniteter (pK i) avhengig av de ulike kjemiske modifikasjonene. Generelt viste forbindelser med strukturen [Phe<1>Ψ(CO-NH)Gly<2>] høyere affinitet enn de med strukturen [Phe<1>Ψ(CH2-NH)Gly<2>] og ekstremt høyere affinitet enn de med strukturen [Nphe<1>Ψ(CO-NH)Gly<2>]. Videre viste forbindelsene med de kombinerte modifikasjonene [(pF)Phe<4>,Aib<7>,Arg<14>,Lys<15>] større affinitet enn de med enkle modifikasjoner.

I funksjonstester som involverer stimulering av GTPγS binding og i testene som involverer inhibering av rykningen indusert av elektriskstimulering av mus vas deferens etterliknet forbindelser med strukturen [Phe<1>Ψ(CO-NH)Gly<2>] effektene av N/OFQ, og induserte særlig liknende maksimal effekter, og virker derfor som fulle agonister, mens forbindelser med strukturen [Phe<1>Ψ(CH2-NH)Gly<2>] virket som delvis agonister siden deres maksimale effekter var lavere enn med N/OFQ. Endelig produserte forbindelser med strukturen [Nphe<1>Ψ(CO-NH)Gly<2>] ikke noen effekt per se men virket som konkurrerende antagonister av N/OFQ.

For å forenkle rapporterer Tabell 1 resultatene oppnådd med forbindelsene [(pF)Phe<4>,Aib<7>Arg<14>,Lys<15>]N/OFQ-NH2(UFP-112),

[Phe<1>Ψ(CH2-NH)Gly<2>,(pF)Phe<4>,Aib<7>Arg<14>,Lys<15>]N/OFQ-NH2(UFP-113), [Nphe<1>,Aib<7>Arg<14>,Lys<15>]N/OFQ-NH2 (UFP-111), og med referansepeptidet N/OFQ.

Som det er fremhevet i Tabell 1 oppfører forbindelsen UFP-113 seg som delvis NOP reseptor agonist, fremkallende maksimal effekter som er lavere enn N/OFQ, både i GTPγS undersøkelsen og i inhiberingsundersøkelsen av sammentrekning indusert ved elektriskstimulering av mus vas deferens. UFP-111 viste seg å være en ren og potent antagonist selektiv for NOP reseptoren. Analysen ved Schild (utført i både GTPγS eksperimentene og med mus vas deferens systemet) indikerer at forbindelsen oppfører seg som konkurrerende antagonist av NOP reseptor med potensverdier (uttrykt som pA2) på 8,68 og 7,46, henholdsvis (se Tabell 1).

2.3. Selektivitet av UFP-112 forbindelsen.

UFP-112 effekter er formidlet ved NOP reseptoraktivering som vist ved det faktum at virkningen av dette peptidet i mus vas deferens ikke ble formidlet i tilstedeværelsen av naloxon (en ikke-selektiv antagonist av klassiske opioid reseptorer, men ikke av NOP reseptoren) men viste seg å være effektivt antagonisert av UFP-101 som er en selektiv NOP reseptor antagonist ([Nphe1,Arg14,Lys15]N/OFQ-NH2, Calò et al., Br J Pharmacol 136, 303-311, 2002). UFP-101 brukt i konkurranse med UFP-112 viste en potensverdi (pA2 6,81) liknende den oppnådd når den er brukt i konkurranse med den endogene agonisten N/OFQ (pA2 6,91). Dette viser at de tre molekylene (N/OFQ, UFP-112 e UFP-101) samhandler med den samme reseptoren: NOP reseptoren. Dette er videre vist ved resultatene oppnådd med vev fra knock-out mus (Ref. Nishi, M. et al., Unrestrained nociceptive response and disregulation of hearing ability in mice lacking the nociceptin/orphaninFQ receptor. Embo J 16 (8): 1858-64, 1997) for NOP reseptor genet (NOP<-/->) (se Tabell 2).

Tabell 2 – effekter av agonisten N/OFQ og UFP112 og av agonisten DOP, D-Pen2,D-Pen5enkefalin (DPDPE), på vas deferens av villtype (NOP<+/+>) og knock-out mus for NOP reseptoren (NOP<-/->).

Den inhibitoriske effekten på sammentrekningen indusert av elektriskstimulering fremkalt av UFP-112 (liknende hva som er funnet med N/OFQ) forsvant i vas deferens isolert fra NOP<-/->mus, noe som bekrefter at de biologiske virkningene av UFP-112 bare er beroende på samhandlingen med NOP reseptoren.

Forbindelsen [D-Pen<2>,D-Pen<5>]-enkefalin, DPDPE (Ref. Life Sci. 1983;33 Suppl 1:447-50), en selektiv DOP agonist, ble brukt som den positive kontrollen. Denne kontrollen viser hvilke som er vevene avledet fra NOP reseptor knockout mus som responderer normalt på inhibitoriske stimuli som ikke bruker NOP reseptoren.

2.4 Farmakologiske tester på selektivitet av forbindelsene ifølge oppfinnelsen

Forbindelsene har blitt testet in vitro på membraner av Hamster oocytter (CHO) som uttrykker den humane rekombinante NOP reseptoren (CHOhNOP), som i avsnitt 2.1, ifølge Mc Donald et al. (Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol 367, 183-187, 2003).

Studiene på selektivitet av disse forbindelsene for NOP reseptoren ble utført ved reseptorbindingsstudier på membraner av CHO celler transfektert med humane rekombinante opioid reseptorer av mu (MOP), delta (DOP) og kappa (KOP) type, ved bruk av de samme metodene som for CHOhNOP. Selektivitetsstudier ble utført ved konkurranse eksperimenter ifølge metodene beskrevet i Mc Donald et al. (Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol 367, 183-187, 2003). For å male pKi for N/OFQ ble tritiert N/OFQ brukt som radioligand, mens [<3>H]-Diprenorfin ble brukt for de klassiske opioid reseptorene. Aktiviteten ab de nye forbindelsene ble sammenliknet med den for det naturlige peptid N/OFQ.

I reseptorbindingseksperimenter utført på membraner av transfekterte CHO celler viste UFP-111, UFP-112 og UFP-113 en høyere selektivitet (>100 ganger) for NOP reseptoren enn MOP, KOP og DOP reseptorene (se Tabell 3).

Tabell 3 Affinitet (pK i) av UFP-112, UFP-113 og UFP-111 for NOP, MOP, DOP og KOP reseptorene transfektert i CHO celler (Ref. Mc Donald et al. (Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol 367, 183-187, 2003).

Data er gjennomsnittene av 4 eksperimenter.

• Note 1 - Den tritierte liganden som er brukt er [<3>H]N/OFQ

• Note 2 – DAMGO betyr [<D>-Ala(2),N-MePhe(4),Gly-ol(5)]enkefalin • Note 3 – Den tritierte liganden som er brukt er [<3>H]-Diprenorfine

3. In vivo studier på virkningsgraden av de fulle agonist forbindelsene UFP-112

Forbindelsen UFP-112; som er en full agonist, ble testet in vivo i mus i ulike undersøkelser:

1) haletilbaketrekningsundersøkelse ifølge de eksperimentelle protokollene beskrevet av Calò et al., (Br J Pharmacol 125, 373-378, 1998) og Rizzi et al. (Clin Pharmacol 18, 56, 2004);

2) måling av matinntak i fór dyr som beskrevet av Rizzi et al. (National Congress of the Italian Society of Neuroscience and joint Italian-Swedish Neuroscience Meetings, Ischia (Napoli) 1-4 oktober 2005);

3) undersøkelse for måling av spontan bevegelsesaktivitet, som beskrevet av Rizzi et al., (Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol 363, 161-165, 2001.

I hver undersøkelse ble UFP-112 og N/OFQ aktivitetene målt som ekvieffektive doser. Ettersom UFP-112 viser omkring 100-ganger høyere potens ble peptid UFP-112 brukt i doser omfattende mellom 0,001 og 0,1 nmol og N/OFQ ble brukt i doser omfattende mellom 0,1 og 10 nmol.

I analgesiometrisk haletilbaketrekningsundersøkelse i mus etterliknet UFP-112 i ekvi-effektive doser effektene av den naturlige liganden N/OFQ, selv om den viste sin virkning over en lengre periode(> 120 minutter).

UFP-112, i doseringsområdet mellom 0,001-0,1 nmol, fremkaller pronociceptive effekter dersom den injiseres via den intracerebroventrikulære (i.c.v.) ruten, mens det fremkalte antinociceptive effekter dersom det ble administrert intratekalt (i.t.) (se Figur 1). Nevnte effekter (liknende på hva som er funnet med N/OFQ) er formidlet av NOP reseptor aktivering på grunn av at de er fraværende i NOP<-/->mus.

N/OFQ og UFP-112 ved ekvi-effektive doser ble undersøkt i testen av matinntak i fórmus. Begge forbindelser fremkalte en signifikant økning i matinntaket, og også i disse undersøkelsene viste UFP-112 seg å være 100 ganger mer potent enn N/OFQ. I denne testen er de hyperfagiske effektene av N/OFQ og UFP-112 utelukkende beroende på NOP reseptoraktivering på grunn av at slike effekter var tilstede i NOP<+/+>mus men fraværende i NOP<-/->mus.

For å undersøke varigheten av UFP-112 virkning in vivo ble eksperimenter utført I mus som sammenlignet varigheten (fra 5:30 p.m. til 7:30 a.m.) av effekten av ekvi-effektive doser av N/OFQ (10 nmol) og UFP-112 (0,1 nmol), begge administrert i.c.v., på den spontane bevegelsesaktiviteten. Begge peptider inhiberte bevegelsesaktiviteten, men effekten av N/OFQ endte 60 minutter etter i.c.v. injeksjonen mens effekten fremkalt av UFP-112 endte etter omkring 6 timer (se Figur 2).

4. Metabolskstabilitet av N/OFQ og av de nye derivatene UFP-111, UFP-112 og UFP-113 i hjernehomogenater og i plasma.

Plasma og hjernevevsprøver ble oppnådd fra hann sveitser mus (Swiss mice) (Morini, Reggio Emilia, Italy, 25-30 g). Dyret, som ble ofret ved eter anestesi, ble perfusert med fysiologisk heparinoppløsning injisert gjennom en nål plassert i den venstre ventrikkelen. Blod ble så dratt ut og ble sentrifugert ved 14000 xg i 2 minutter ved romtemperatur. Etter separasjon fra pelleten ble plasma alikvotert og lagret ved -80°C. Etter blod uttrekk ble dyret perfusert videre med en fysiologisk oppløsning i 2 minutter før hjernen ble fjernet. Hjernevevet ble homogenisert i 5 vol. (w/v) av Tris/HCl (50 mM, pH 7,4, 0°C) med en ultra-Turrax (Janke Kunkel, Staufen, FRG) 3 ganger i 15 sekunder hver gang. Supernatanten oppnådd ved sentrifugering (3000 xg i 15 min ved 4°C) ble dekantert og så lagret ved -80°C.

Proteininnholdet i preparatene, som bestemt ved Bradford metoden som beskrevet i Anal. Biochem., 72, 248-254, 1976, var omtrent 8 µg/µl for hjernehomogenatet og 17 µg/µl for plasma

En alikvot på100 µl løsning av hvert peptid (3 mg/500 µl Tris) ble inkubert (ved en sluttkonsentrasjon på 6 µg/µl) med hjernehomogenat eller plasma (450 µl) i et totalt volum på 1 ml, inneholdende Tris/HCl 50 mM pH 7,4 buffer. Inkubasjon av alikvotene ble utført ved 37 °C i ulike perioder på opptil 240 min. Ved ulike inkubasjonstider ble en alikvot av løsningen (100 µl) fjernet og degraderingen ble blokkert ved tilsetning av 4,5% TFA løsning (200 µl). Etter sentrifugering (3000 rpm i 15 minutter) ble en alikvot (100 µl) av supernatant injisert inn i RP-HPLC. HPLC analye ble utført i en Kromasil 100-5C18 kolonne (4.6 x 250 mm) ved bruk av et Beckman System Gold kromatografisystem utstyrt med en variabel bølgelengde UV detektor.

De eksperimentelle betingelsene for eluering inkluderte en gradient analyse med vann (løsningsmiddel A) og acetonitril (løsningsmiddel B), begge inneholdende 0,1% TFA, ved en strømningshastighet på 0,7 ml/min. Den følgende protokollen ble brukt for gradient analyse, utvalgt på basis av de fysisk-kjemiske karakteristikkene av analytten: lineær gradient fra 5% til 40% B i 20 minutter; lineær gradient fra 40% til 60% B i 5 minutter; lineær gradient fra 60% til 5% B i 5 minutter. Eluatet ble overvåket ved 220 nm. Halveringstiden (T1/2) ble oppnådd ved lineær regresjon med minste kvadratmetoden, diagrammer av topp arealene av hvert derivat som en funksjon av inkubasjonstider, ved bruk av minst fem punkter for hver analyse.

Data er vist i Tabell 3 som middel ± standard avvik, og er oppnådd fra minst 3 separate eksperimenter.

Tabell 3. T1⁄2 (min) av N/OFQ og derivater i mus plasma og hjernevev.

N/OFQ viste halveringstider i plasma på omkring 1 time, som er svært forskjellig sammenliknet med de oppnådd med hjernehomogenatet, som var omkring 3 min. Alle studerte peptider ifølge oppfinnelsen oppviste signifikant lengre halveringstider sammenliknet med det naturlige peptidet. I særdeleshet er plasma T1⁄2 av UFP-111 og UFP-113 omkring to ganger så lang som N/OFQ, mens T1⁄2 av UFP-112 er nesten treganger lengre enn N/OFQ.

De lengre halveringstider oppvist av derivatene, som sammenliknet med N/OFQ, var mer uttalt i hjernehomogenatet enn i plasma. Faktisk var T1⁄2 for alle derivatene mer enn 3-ganger lengre enn verdien oppvist av N/OFQ (3 min.) i hjernevevet.

Disse data viser at de kjemiske modifikasjonene av UFP-111, 112 og 113 sekvenser øker deres potens som agonister eller antagonister, sammenliknet med N/OFQ: slike modifikasjoner modulerer deres virkeevne på NOP reseptoren og bestemmer en viktig reduksjon av følsomheten for degradering av peptidaser tilstede både i plasma og i hjernevev. Denne viktige karakteristikken er helt opplagt avgjørende for å forlenge virkningen av disse molekylene in vivo, som veldokumentert for UFP-112 i serien av eksperimenter oppsummert i avsnitt 3 (in vivo studier).

5. Kinetikk for de inhibitoriske effektene av UFP-112 på mus vas deferens I de elektriskstimulerte vas deferens av mus, ble både kinetikken og virkningen av UFP-112 og reversibiliteten av effektene etter vasking mye tregere enn med N/OFQ (se figur 3). Dette ble vist ved den inhibitoriske effekten på vas deferens sammentrekningen fremkalt ved elektriskstimulering. Sammen med metabolskstabilitetsdata kan dette forklare den lengre in vivo virkningen av UFP-112 sammenliknet med den endogene liganden N/OFQ.

6 Biologisk aktivitet av noen forbindelser av formel I i mus vas deferens etter elektriskstimulering.

Tabell 4 oppsummerer resultatene oppnådd i mus vas deferens etter elektriskstimulering i tilstedeværelsen av en serie av forbindelser av formel I, som bærer ulike kjemiske modifikasjoner i posisjon 7 og 11 av agonist modell N/OFQ-NH2. Disse data viser at ulike aminosyre utskiftinger ikke endrer virkeevnen av forbindelsene som alle virker som fulle agonister men i noen tilfeller (for eksempel [Ac5c<11>]N/OFQ-NH2 og [D/L-Iva<11>]N/OFQ-NH2) øker potensen sammenliknet med referansesekvensen. Det skulle bemerkes at økningen i potens, oppnådd som resultat av disse individuelle modifikasjonene (2-ganger sammenliknet med referansesekvensen), er lavere enn økningen i potens oppnådd som resultat av de kombinerte modifikasjonene ved ulike posisjoner, som i forbindelse UFP-112 (tabell 1), hvis potens øker mer enn 100-ganger.

Tabell 4: Potens, som målt i elektriskstimulerte vas deferens av mus, av en serie av forbindelser med generell formel I oppnådd med ulike kjemiske modifikasjoner i posisjon 7 og 11

Forbindelse pEC50 Emax

(CL 95%)

N/OFQ-NH27,80 (7,74-7,86) 93 ± 2%[Ac3c<7>]N/OFQ-NH2<7,08 (6,82-7,34) 98 ± 1%>[Ac5c<7>]N/OFQ-NH2<7,60 (7,40-7,80) 98 ± 1%>[Ac6c<7>]N/OFQ-NH2<7,20 (6,86-7,54) 87 ± 1%>[(αMe)D/L-Val<7>]N/OFQ-NH2(diastereomer 1)<7,26 (7,00-7,52) 88 ± 1%>[(αMe)D/L-Val<7>]N/OFQ-NH2(diastereomer 2)<7,56 (7,34-7,78) 95 ± 1%>[(αMe)D/L-Leu<7>]N/OFQ-NH2(diastereomer 1)<7,33 (7,04-7,62) 84 ± 1%>[(αMe)D/L-Leu<7>]N/OFQ-NH2(diastereomer 2)<7,12 (7,02-7,22) 95 ± 2%>[Iva<7>]N/OFQ-NH2(diastereomer 1)<7,83 (7,74-7,92) 91 ± 4%>[Iva<7>]N/OFQ-NH2(diastereomer 2)<7,62 (7,32-7,92) 88 ± 3%>[Deg<7>]N/OFQ-NH2<7,91 (7,53-8,27) 89 ± 2%>[Dpg<7>]N/OFQ-NH2<7,90 (7,71-8,11) 91 ± 4%>[Ac3c<11>]N/OFQ-NH2<7,78 (7,62-7,94) 91 ± 4%>[Ac5c<11>]N/OFQ-NH2<8,08 (7,93-8,23) 89 ± 4%>[Ac6c<11>]N/OFQ-NH2<7,79 (7,53-8,05) 89 ± 4%>[(αMe)D/L-Val<11>]N/OFQ-NH2(diastereomer 1)<7,71 (7,37-8,05) 93 ± 2%>[(αMe)D/L-Val<11>]N/OFQ-NH2(diastereomer 2)<7,83 (7,67-7,99) 86 ± 4%>[(αMe)D/L-Leu<11>]N/OFQ-NH2<7,87 (7,67-8,07) 91 ± 4%>[D/L-Iva<11>]N/OFQ-NH2<8,12 (7,78-8,46) 90 ± 4%>[Deg<11>]N/OFQ-NH2<7,75 (7,43-7,89) 87 ± 4%>[Dpg<11>]N/OFQ-NH2<7,53 (7,17-8,04) 86 ± 3%>