BRPI0606998B1

BRPI0606998B1 - Agonistas e antagonistas totais e parciais de alta atividade farmacológica do receptor nociceptina/orfanina fq

Info

Publication number: BRPI0606998B1
Application number: BRPI0606998-3A
Authority: BR
Inventors: Remo Guerrini; Severo Salvadori; Girolamo Calò; Domenico Regoli
Original assignee: Ufpeptides S.R.L.
Priority date: 2005-02-15
Filing date: 2006-02-15
Publication date: 2018-04-10
Also published as: CU23823A3; PT1851241E; DK1851241T3; CR9379A; CY1116456T1; WO2006087340A3; IL185235A0; BRPI0606998A2; NO341856B1; BRPI0606998B8; SI1851241T1; CN101128482A; WO2006087340A8; KR101294895B1; WO2006087340A2; IL185235A; ITFE20050003A1; EA011325B1; NO20074702L; MX2007009523A

Abstract

agonistas e antagonistas totais e parciais de alta atividade farmacológica do receptor nociceptina/orfanina fq . a presente invenção descreve análogos de peptideo de nociceptina/orfanina fq, composições dos mesmos e seu uso no tratamento de distúrbios e disfunções correlacionadas à ativação ou bloqueio de receptores nop.

Description

(54) Título: AGONISTAS E ANTAGONISTAS TOTAIS E PARCIAIS DE ALTA ATIVIDADE FARMACOLÓGICA DO RECEPTOR NOCICEPTINA/ORFANINA FQ (51) Int.CI.: C07K 14/665; A61K 38/33 (30) Prioridade Unionista: 15/02/2005 IT FE2005A000003 (73) Titular(es): UFPEPTIDES S.R.L.

(72) Inventor(es): GUERRINI, REMO; SALVADORI, SEVERO; CALÒ.GIROLAMO; REGOLI, DOMENICO <£>

1/35

AGONISTAS E ANTAGONISTAS TOTAIS E PARCIAIS DE

ALTA ATIVIDADE FARMACOLÓGICA DO RECEPTOR

NOCICEPTINA/ORFANINA FQ.

Campo da Invenção

A presente invenção se refere a análogos do peptídeo nociceptina/orfanina FQ (N/OFQ), capazes de modular a atividade do receptor do peptídeo N/OFQ (receptor NOP), a. composições farmacêuticas compreendendo os ditos análogos de peptídeo e seu uso no tratamento de disfunções, condicionamentos patológicos ou estados patológicos envolvendo o dito receptor.

Antecedentes da Invenção

Em 1994, foi cionado um novo receptor denominado ORLl, que é estruturalmente similar aos receptores opióides; de acordo com recentes recomendações da IUPHAR, o nome mais apropriado para este receptor é NOP. O seu ligando endógeno (N/OFQ), identificado ao final de 1995, é um heptadecapeptídeo, similar a alguns peptídeos opióides (por exemplo, dinorfina A) , que, entretanto, não se liga aos clássicos receptores opióides dos tipos μ (ΜΟΡ), δ (DOP) ou κ kappa (KOP). Os efeitos celulares mediados pelo receptor NOP são similares aos proporcionados pelos clássicos receptores opióides. Do ponto de vista estrutural e do ponto de vista de transdução de sinal, o sistema peptídeo/receptor N/OFQ-NOP pertence a família dos opióides, embora represente um ramo farmacologicamente ί

2/35 distinto. Diversos estudos realizados entre 1996 e 1998, mostraram que o N/OFQ pode modular diversas funções no sistema nervoso central {dor, ansiedade, aprendizagem, memória, vício em drogas, apetite) e no nível perioférico {pressão sangüínea, ritmo cardíaco, funcionamento dos rins, gastrintestinal, geníturínário e respiratório) (para maiores detalhes, consultar a publicação de Massi e outros, Peptides, 21, 2000).

A partir de 1996, os presentes inventores têm realizado estudos com relação ao sistema N/OFQ-NOP, levando à identificação de particulares ligandos do receptor NOP, tais como: i) N/OFQ (1-13) -NH₂, que representa . o mínimo fragmento funcional com a mesma atividade do ligando natural N/OFQ (Calo e outros, Eur. J. Pharmacol., 311, R35, 1996); ii) N/OFQ-NH₂ que produz, especialmente in vivo, efeitos mais intensos e prolongados, comparado ao N/OFQ (Rizzi e outros, Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol., 363, 161-165. 2001); iii) [Tyr¹] N/OFQ (1-13)-NH₂, um agonista misto que atua sobre o NOP e sobre os clássicos receptores opióides (Calo e outros, Can. J. Physiol. Pharmacol., 75, 713-8, 1997; Varani e outros, Naunyn Schmiedebergs Arch

Pharmacol., 360, 270-7, 1999); iv) ' [Phe^fCHzNH) Gly²] N/OFQ (1-13)-NH₂, um ligando seletivo do receptor NOP que se comporta como um antagonista puro, agonista parcial ou mesmo como agonista total, dependendo da preparação/ensaio sob pesquisa (Guerrini e outros, Br. J. Pharmacol., 123, 163-5, 1998; Okawa e outros, Br. J. Pharmacol., 121, 123-30, 1999) - baseado na análise

3/35 detalhada da ação farmacológica do [Phe^íCl·^NH) Gly²] N/OFQ {1 — 13) -NH₂, relatado por Calo e outros, (Peptides 21, 935-47, 2000), mostra gue esse composto é realmente um agonista parcial de NOP; v) [Nphe¹]N/OFQ (15 13)-NH₂, o primeiro antagonista competitivo puro do receptor NOP, (Calo e outros, Br. J. Pharmacol., 129, 118393, 2000; Guerrini e outros, J. Méd. Chem., 15, 2805-13,

2000) . A ação desses ligandos foi caracterizada em diversos ensaios in vitro e in vivo (consultar Calo e outros, Br. J.

Pharmacol., 129, 1261-83, -2000). Mais rècéntemente, o resíduo Phe⁴ foi substituído por (pF)fenila ou (pNO₂)fenila, obtendo, dessa forma, potentes seletivos agonistas de NOP (Guerrini e outros, J. Méd. Chem. 44, 3956-64, 2001). Outro composto interessante, [Arg¹⁴, Lys¹⁵]N/OFQ, foi identificado como um agonista altamente potente (17 vezes mais potente que o N/OFQ), seletivo para os receptores recombinantes humanos NOP, expressos em células HEK293 (Okada e outros, Biochem. Biophys. Res. Commun., 278, 493-8, 2000). As ações desse ligando foram ainda caracterizadas in vitro, usando tecidos isolados sensíveis ao N/OFQ, e caracterizadas in vivo no camundongo (Rizzi e outros, J. Pharmacol. Exp. Ther., 300, 57-63, 2002). Além disso, Zhang e outros, (Zhang e outros, J. Med. Chem., 45, 5280-5286, 2002) descreveram análogos de N/OFQ, caracterizados por um resíduo de ácido 2-amino-2-metil-propiônico (Aib) na posição 7 e/ou 11, substituindo os resíduos Ala e produzindo um aumento da afinidade de ligando e de atividade farmacológica. Os análogos de N/OFQ foram

4/35 descritos nos documentos de patentes WO 99/07212, WO 97/07208, WO 99/03491, WO 99/03880, e EP 1422240. A utilidade desse ligando foi relatada no tratamento/prevençao de doenças correlacionadas a hiperalgesia, funções neuroendócrinas, estresse, atividade locomotora e ansiedade.

Daqui em diante, a sequência de referência do peptídeo N/OFQ é a seguinte:

H-Phe-Gly-Gly-Phe-Thr-Gly-Ala-Arg-Lys-Ser-Ala-Arg-Lys-LeuAla-Asn-Gln-OH

Descrição das Figuras

Figura 1: Mostra o efeito da administração intracerebroventricular (i.c.v., conforme visto nos painéis superiores) ou intratecal (i.t., conforme visto nos painéis inferiores) do N/OFQ (10 nmol/camundongo) e do UFP-112 (0,1 nmol/camundongo) no teste de retirada da cauda (referência Calò e outros, Br. J. Pharmacol., 125, 375-378, 1998). Os animais de controle receberam uma injeção i.c.v. de solução salina (2 μΐ/camundongo). Cada ponto representa a média ± s.e.m. de pelo menos 4 experimentos.

Figura 2: Duração dos efeitos de N/OFQ (10 nmol/camundongo) e UFP-112 (0,1 nmol/camundongo), administrados pela via intracerebroventricular (i.c.v.), na atividade locomotora espontânea em camundongos (referência, Rizzi e outros, Naunyn Schmiedebergs Arch. Pharmacol. 363, 161-165,2001). Os animais de controle receberam uma injeção χσ

5/35

i.c.v. de solução salina (2 μΐ/camundongo). Cada ponto representa a média ± s.e.m. de pelo menos 4 experimentos. Figura 3: Cinética de ação e reversibilidade de efeitos de concentrações equi-efetivas de N/OFQ e UFP-112 no canal deferente fvas deferens) ) de camundongo após estimulação elétrica. A contração do canal deferente (vas deferens)_r induzida por estimulação elétrica, é inibida na presença de UFP-112 ou N/OFQ.

Descrição Detalhada da Invenção

Os termos usados no presente pedido de patente possuem significados conhecidos na técnica, como, por exemplo, conforme IUPHAR, no que diz respeito à Nomenclatura de Receptor e Classificação de Fármaco, Pharm.

Rev. (2003), Volume 55, No 4, página 597, conforme aqui relatado:

Eficácia - um conceito que expressa o grau com que diferentes agonistas produzem variadas respostas, mesmo quando ocupam a mesma proporção de receptores.

Atividade farmacológica - uma expressão da atividade de um composto, definida em termos da concentração ou quantidade necessária para produzir um efeito definido. A atividade farmacológica é medida como pECso para os agonistas e como pA₂ para os antagonistas.

Constituem objetivos da presente invenção os análogos de peptídeo N/OFQ, de fórmula geral· (I): Xaa¹-W-Gly²-Gly³-Xbb⁴-Thr⁵-Gly⁶-Xcc⁷-Arg⁸-Lys⁹-Ser¹⁰-Xdd¹¹Arg¹²-Lys¹⁵-Xee¹⁴-Xff ¹⁵-R

6/35 onde

Xaa¹ é Phe ou N-benzil-giicina (N-phe); Ψ representa a ligação entre os primeiros dois resíduos aminoácidos, sendo escolhido dentre CO-NH, CH2-NH e CH2-O; Xbb⁴ é Phe ou (pX)Phe, onde X representa H, Cl, Br, I, F, NO2, CN e p indica a posição para no anel de fenila de Phe; Xcc⁷ e Xdd¹¹são escolhidos entre: Ala; ácido 2-amino-2-metil-propiônico (Aib); ácido 2-amino_2- metil-butírico (Iva); ácido 2amino-2-etil-butírico (Deg); ácido 2-amino-2-propilpentanóico (Dpg); (CaCH3)Leu; (CaCH3)Val; ácido 1-aminociclopropan-carboxílíco (Ac3c); ácido 1-amino-ciclopentancarboxílico (Acsc) e ácido 1-amino-ciclohexano-carboxílico (Ac6c) ; Xee¹⁴ e Xff¹⁵ são escolhidos entre Arg,:. Lys, Orn, omoArg, ácido diaminobutírico, ácido diaminopropiônico, ou Trp; R representa o dipeptídeo Asn-Gln-NH2 ou Asn-Gln-OH ou o aminoácido Asn com um grupo terminal amida (-NH₂) ou um grupo terminal carboxílico (-OH) ou um grupo terminal amino (-NH₂) ou um grupo terminal hidroxila (-OH).

Além disso, a presente	invenção inclui os	sais
farmaceuticamente	aceitáveis	desses	compostos	(I) ,
particularmente, os	sais de ácido	orgânico	e mineral,	tais

como, cloridratos, bromidratos, fosfatos, sulfatos, acetatos, succínatos, ascorbatos, tartaratos, gliconatos, benzoatos, maleatos, fumaratos e estearatos.

Os compostos de acordo com a presente invenção, que se enquadram dentro da fórmula (I), apresentam uma comprovada atividade farmacológica, de até 100 vezes maior que os ligandos de peptídeos conhecidos na técnica.

7/35

Portanto, é possível supor um efeito sinergístico de permutações, de acordo com a fórmula (I), para as posições 1, 4, 7, 11, 14, e 15 e para a ligação entre os primeiros dois resíduos aminoácidos. Uma maior atividade dos compostos de fórmula (I) e particularmente de compostos preferidos, preferivelmente, agonistas, mais preferivelmente, o composto de [ (pF) Phe⁴, Aib⁷, Arg¹⁴, Lys¹⁵]N/OFQ-NH₂ é demonstrada com relação à afinidade, atividade farmacológica, resistência à protease, cinética de ação in vitro, e, acima de tudo, duração de sua ação in vivo.

Os compostos preferidos são os compostos de fórmula (I), em que Ψ é CO-NH ou CH₂-NH ou CH₂-O, Xaa¹ é Phe ou Nphe, Xbb⁴ é Phe ou (pX)Phe, onde (pX) é conforme definido acima, Xcc⁷ e Xdd¹¹ são conforme definido acima, Xee¹⁴ e Xff¹⁵ são Arg, Lys, Orn/ omoArg., ou Trp; R é -NH₂ ou -OH ou Asn-NH₂ ou Asn-OH ou Asn-Gln-NH₂ ou Asn-Gln-OH.

Mais preferidos são aqueles compostos de fórmula (I), em que Ψ é CO-NH ou CH₂-NH ou CH₂-O; Xaa¹ é Phe ou Nphe; Xbb⁴ é Phe ou (pF) Phe ou (pNO2) Phe; Xcc⁷ e Xdd¹¹ são Ala; 2-ácido amino-2-metil-propiônico (Aib); ácido 2-amino2- metil-butírico (Iva); ácido 2-amino-2-etil-butírico (Deg); ácido 2-amino-2-propil-pentanóico (Dpg); (CaCH3)Leu; (C«CH3)Val; ácido 1-amino-ciclopropan-carboxílico (Ac₃c) ; ácido 1-amino-ciclopentan-carboxílico (Acsc) e ácido 1amino-cicloexano-carboxílico (Ac^c) ; Xee¹⁴ e Xff¹⁵ são Arg ou Lys; R é Asn-Gln-NH₂ ou -NH₂.

Ainda mais preferidos são os análogos de peptídeo que apresentam a fórmula (I), na qual variáveis

8/35 resíduos possuem o significado mostrado na tabela seguinte:

	Xaa¹	Ψ	Xbb⁴	Xcc⁷	Xdd¹¹	Xee¹⁴	x^ff15	R
1	Nphe	CO-NH	Phe	Aib	Ala	Arg	Lys	Asn-Gln-NH₂
2	Phe	CO-NH	(pF)Phe	Aib	Ala	Arg	Lys	Asn-Gln-NH₂
3	Phe	CH₂-NH	(pF)Phe	Aib	Ala	Arg.	Lys	Asn-Gln-NH₂
4	Phe	ch₂-o	(pF)Phe	Aib	Ala	Arg	Lys	Asn-Gln-NH₂
5	Nphe	CO-NH	Phe	Aib	Ala	Arg	Lys	-nh₂
6	Phe	CO-NH	(pF)Phe	Aib	Ala /	Arg	Lys	-nh₂
7	Phe	ch₂-nh	(pF)Phe	Aib	Ala o	Arg -	Lys	-nh₂
8	Phe	ch₂-o	(pF)Phe	Aib	Ala'	Arg	Lys	-nh₂
9	Nphe	CO-NH	Phe	Aib	Aib	Arg	Lys	Asn-Gln-NH₂
10	Phe	CO-NH	(pF)Phe	Aib	Aib	Arg	Lys	Asn-Gln-NH₂
11	Phe	CH₂-NH	(pF)Phe	Aib	Aib	Arg	Lys	Asn-Gln-NH₂
12	Phe	ch₂-o	(pF)Phe	Aib	Aib	Arg	Lys	Asn-Gln-NH₂
13	Nphe	CO-NH	Phe	Aib	Aib	Arg	Lys	-nh₂
14	Phe	CO-NH	(pF)Phe	Aib	Aib	Arg	Lys	-nh₂
15	Phe	CH₂-NH	(pF)Phe	Aib	Aib	Arg	Lys	-nh₂
16	Phe	ch₂-o	(pF)Phe	Aib	Aib	Arg	Lys	-nh₂
17	Nphe	CO-NH	Phe	Iva	Ala	Arg	Lys	Asn-Gln-NH₂
18	Phe	CO-NH	(pF)Phe	Iva	Ala	Arg	Lys	Asn-Gln-NH₂
19	Phe	ch₂-nh	(pF)Phe	Iva	Ala	Arg	Lys	Asn-Gln-NH₂
20	Phe	ch₂-o	(pF)Phe	Iva	Ala	Arg	Lys	Asn-Gln-NH₂
21	Nphe	CO-NH	Phe	Iva	Ala	Arg	Lys	-nh₂
22	Phe	CO-NH	(pF)Phe	Iva	Ala	Arg	Lys	-nh₂
23	Phe	ch₂-nh	(pF)Phe	Iva	Ala	Arg	Lys	-nh₂

9/35

24	Phe	ch₂-o	(pF)Phe	Iva	Ala	Arg	Lys	-nh₂
25	Nphe	CO-NH	Phe	Iva	Aib	Arg	Lys	Asn-Gln-NH₂
26	Phe	CO-NH	(pF)Phe	Iva	Aib	Arg	Lys	Asn-Gln-NH₂
27	Phe	CH₂-NH	(pF)Phe	Iva	Aib	Arg	Lys	Asn-Gln-NH₂
28	Phe	ch₂-o	(pF)Phe	Iva	Aib	Arg	Lys	Asn-Gln-NH₂
29	Nphe	CO-NH	Phe	Iva	Aib	Arg	Lys	-nh₂
30	Phe	CO-NH	(pF)Phe	Iva	Aib	Arg	Lys	-nh₂
31	Phe	ch₂-nh	(pF)Phe	Iva	Aíbi :	Arg ;	Lys	;-NH₂
32	Phe	ch₂-o	(pF)Pe	Iva	Aib;	Arg	^: Lys	-,--nh₂
33	Nphe	CO-NH	Phe	Aib	Iva	Arg	Lys	Asn-Gln-NH₂
34	Phe	CO-NH	(pF)Phe	Aib	Iva ^;:	Arg ^f	Lys	Asn-Gln-NH₂
35	Phe	CH₂~NH	(pF)Phe	Aib	Iva;	Arg	Lys	Asn-Gln-NH₂
36	Phe	ch₂-o	(pF)Phe	Aib	Iva	- Arg ;	Lys	Asn-Gln-NH₂
37	Nphe	CO-NH	Phe	Aib	Iva	Arg	Lys	^::-nh₂
38	Phe	CO-NH	(pF)Phe	Aib	Iva	Arg	Lys	-nh₂
39	Phe	CH₂-NH	(pF)Phe	Aib	Iva	Arg	Lys	-nh₂
40	Phe	ch₂-o	(pF)Phe	Aib	Iva	Arg	Lys	-nh₂
41	Nphe	CO-NH	Phe	Aib	Ala	Arg	Lys	Asn-Gln-NH₂
42	Phe	CO-NH	(pNO₂)Phe	Aib	Ala	Arg	Lys	Asn-Gln-NH₂
43	Phe	ch₂-nh	(pNO₂)Phe	Aib	Ala	Arg	Lys	Asn-Gln-NH₂
44	Phe	ch₂-o	(pNO₂)Phe	Aib	Ala	Arg	Lys	Asn-Gln-NH₂
45	Nphe	CO-NH	Phe	Aib	Ala	Arg	Lys	-NH₂
46	Phe	CO-NH	(pNO₂)Phe	Aib	Ala	Arg	Lys	-nh₂
47	Phe	ch₂-nh	(pNO₂)Phe	Aib	Ala	Arg	Lys	-nh₂
48	Phe	ch₂-o	(pNO₂)Phe	Aib	Ala	Arg	Lys	-nh₂
49	Nphe	CO-NH	Phe	Aib	Aib	Arg	Lys	Asn-Gln-NH₂
50	Phe	CO-NH	(pNO₂)Phe	Aib	Aib	Arg	Lys	Asn-Gln-NH₂
51	Phe	ch₂-nh	(pNO₂)Phe	Aib	Aib	Arg	Lys	Asn-Gln-NH₂

ί i

10/35

52	Phe	CH₂-0	(pNO₂)Phe	Aib	Aib	Arg	Lys	Asn-Gln-NH₂
53	Nphe	CO-NH	Phe	Aib	Aib	Arg	Lys	-NH₂
54	Phe	CO-NH	(pNO₂)Phe	Aib	Aib	Arg	Lys	-nh₂
55	Phe	ch₂-nh	(pNO₂)Phe	Aib	Aib	Arg	Lys	-nh₂
56	Phe	ch₂-o	(pNO₂)Phe	Aib	Aib	Arg	Lys	-nh₂
57	Nphe	CO-NH	Phe	Iva	Ala	Arg	Lys	Asn-Gln-NH₂
58	Phe	CO-NH	(pNO₂)Phe	Iva	Ala	Arg	Lys	Asn-Gln-NH₂
59	Phe	CH₂-NH	(pNO₂)Phe	Iva	Ala	Arg	Lys	Asn-Gln-NH₂
60	Phe	ch₂-o	(pNO₂)Phe	Iva	Ala	Arg	Lys	Asn-Gln-NH₂
61	Nphe	CO-NH	Phe	Iva	Ala	Arg	Lys	-NH₂
62	Phe	CO-NH	(pNO₂)Phe	Iva	Ala	Arg	Lys	-NH₂
63	Phe	CH₂-NH	(pNO₂)Phe	Iva	Ala ¹	Arg	Lys	-nh₂
64	Phe	ch₂-o	(pNO₂)Phe	Iva	Ala;	Arg	^; Lys	~nh₂
65	Nphe	CO-NH	Phe	Iva	Aib	Arg	Lys	Asn-Gln-NH₂
66	Phe	CO-NH	(pNO₂)Phe	Iva	Aib	Arg	Lys	Asn-Gln-NH₂
67	Phe	CH₂-NH	(pNO₂)Phe	Iva	Aib	Arg	Lys	Asn-Gln-NH₂
68	Phe	ch₂-o	(pNO₂)Phe	Iva	Aib	Arg	Lys	Asn-Gln-NH₂
69	Nphe	CO-NH	Phe	Iva	Aib	Arg	Lys	-nh₂
70	Phe	CO-NH	(pNO₂)Phe	Iva	Aib	Arg	Lys	-nh₂
71	Phe	ch₂-nh	(pNH₂)Phe	Iva	Aib	Arg	Lys	-nh₂
72	Phe	ch₂-o	(pNO₂)Phe	Iva	Aib	Arg	Lys	-nh₂
73	Nphe	CO-NH	Phe	Aib	Iva	Arg	Lys	Asn-Gln-NH₂
74	Phe	CO-NH	(pNO₂)Phe	Aib	Iva	Arg	Lys	Asn-Gln-NH₂
75	Phe	ch₂-nh	(pNO₂)Phe	Aib	Iva	Arg	Lys	Asn-Gln-NH₂
76	Phe	ch₂-o	(pNO₂)Phe	Aib	Iva	Arg	Lys	Asn-Gln-NH₂
77	Nphe	CO-NH	Phe	Aib	Iva	Arg	Lys	-NH₂
78	Phe	CO-NH	(pNO₂)Phe	Aib	Iva	Arg	Lys	-nh₂
79	Phe	ch₂-nh	(pNO₂)Phe	Aib	Iva	Arg	Lys	-nh₂

ί

11/35

80

Phe

CH₂-O

(pNO₂)Phe

Aib

Iva

Arg

Lys

-nh₂

Dentre estes, ainda mais preferidos são os compostos em que Ψ é CO-NH ou CH₂-NH ou CH₂-O; Xaa¹ é Phe ou Nphe; Xbb⁴ é Phe ou (pF) Phe ou (pNO₂)Phe; Xcc⁷ e Xdd¹¹ são

Ala; ácido 2-amino-2-metil-propiônico (Aib); ácido 2-amino2-metil-butirico (Iva) ; Xee¹⁴ é Arg; Xff¹⁵ é Lys; R é AsnGln-NH₂ ou -NH₂, representados pelas seguintes fórmulas:

a) H-Nphe-Gly-Gly-Phe-Thr-Gly-Aib-Arg-Lys-Ser-AlaArg-Lys-Arg-Lys-Asn-Gln-NH₂

b) H-Phe-Gly-Gly-(pF)Phe-Thr-Gly-Aib-Arg-Lys-SerAla-Arg-Lys-Arg-Lys-Asn-Gln-NH₂

c) H-Phe-Ψ (CH₂-NH) -Gly-Gly- (pF) Phe-Thr-Gly-Aib-ArgLys-Ser-Ala-Arg-LyS“Arg-Lys-Asn-Gln-NH₂

d) H-Phe-Ψ (CH₂-O) -Gly-Gly- (pF) Phe-Thr-Gly-Aib-Arg-Lys15 Ser-Ala-Arg-Lys-Arg-Lys-Asn-Gln-NH₂

e) H-Phe-Gly-Gly- (pNO₂) Phe-Thr-Gly-Aib-Arg-Lys-SerAla-Arg-Lys-Arg-Lys-Asn-Gln-NH₂

f) H-Phe-Ψ (CH₂-NH) -Gly-Gly- (pNO₂) Phe-Thr-Gly-Aib-ArgLys-Ser-Ala-Arg-Lys-Arg-Lys-Asn-Gln-NH₂

g) H-Phe-Ψ (CH₂-O) -Gly-Gly- (pNO₂) Phe-Thr-Gly-Aib-ArgLys-Ser-Ala-Arg-Lys-Arg-Lys-Asn-Gln-NH₂

h) H-Nphe-Gly-Gly-Phe-Thr-Gly-Aib-Arg-Lys-Ser-AlaArg-Lys-Arg-Lys-NH₂

i) H-Phe-Gly-Gly-(pF)Phe-Thr-Gly-Aib-Arg-Lys-Ser25 Ala-Arg-Lys-Arg-Lys-NH₂

1) H-Phe-Ψ(CH2-NH)-Gly-Gly-(pF)Phe-Thr-Gly-Aib-ArgLys-Ser-Ala-Arg-Lys-Arg-Lys-NH₂

1t

I ι

12/35

m) H-Phe-Ψ (CH₂-O) -Gly-Gly- (pF) Phe-Thr-Gly-Aib-Arg-LysSer-Ala-Arg-Lys-Arg-Lys-NH₂

n) H-Phe-Gly-Gly-(pNO₂) Phe-Thr-Gly-Aib-Arg-Lys-SerAla-Arg-Lys-Arg-Lys-NH₂

o) H-Phe-Ψ (CH₂-NH) -Gly-Gly- (pNO₂) Phe-Thr-Gly-Aib-ArgLys-Ser-Ala-Arg-Lys-Arg-Lys-NH₂

p) H-Phe-Ψ (CH₂-O) -Gly-Gly- (pNO₂) Phe-Thr-Gly-Aib-ArgLys-Ser-Ala-Arg-Lys-Arg-Lys-NH₂ aa) H-Nphe-Gly-Gly-Phe-Thr-Gly-Aib-Arg-Lys-Ser-AibArg-Lys-Arg-Lys-Asn-Gln-NH₂ bb) H-Phe-Gly-Gly-(pF)Phe-Thr-Gly-Aib-Arg-Lys-SerAib-Arg-Lys-Arg-Lys-Asn-Gln-NH₂ cc) H-Phe-Ψ (CH₂-NH) -Gly-Gly- (pF) Phe-Thr-Gly-Aíb-Arg15 Lys-Ser-Aib-Arg-Lys-Arg-Lys-Asn-Gln-NH₂ dd) H-Phe-Ψ (CH₂-O) -Gly-Gly- (pF) Phe-Thr-Gly-Aib-ArgLys -Ser-Aib-Arg-Lys -Arg-Lys -Asn-Gln-NH₂ ee) H-Phe-Gly-Gly-(pNO₂) Phe-Thr-Gly-Aib-Arg-Lys-SerAib-Arg-Lys-Arg-Lys-Asn-Gln-NH₂ f f) H-Phe-Ψ (CH₂-NH) -Gly-Gly- (pN0₂) Phe-Thr-Gly-Aib-ArgLys -Ser-Aib-Arg-Lys -Arg-Lys-Asn-Gln-NH₂ gg) H-Phe-Ψ(CH₂-O) -Gly-Gly- (pNO₂) Phe-Thr-Gly-Aib-ArgLys -Ser-Aib-Arg-Lys-Arg-Lys-Asn-Gln-NH₂ hh) H-Nphe-Gly-Gly-Phe-Thr-Gly-Aib-Arg-Lys-Ser-Aib25 Arg-Lys-Arg-Lys-NH₂ ii) H-Phe-Gly-Gly-(pF)Phe-Thr-Gly-Aib-Arg-Lys-SerAib-Arg-Lys-Arg-Lys-NH₂ ι

13/35

11) H-Phe-Ψ(CH₂-NH) -Gly-Gly- (pF) Phe-Thr-Gly-Aib-ArgLys-Ser-Aib-Arg-Lys-Arg-Lys-NH₂ mm) H-Phe-Ψ (CH₂-O) -Gly-Gly- (pF) Phe-Thr-Gly-Aib-ArgLys-Ser-Aib-Arg-Lys-Arg-Lys-NH₂ nn) H-Phe-Gly-Gly-(pNO₂)Phe-Thr-Gly-Aib-Arç-Lys-Ser~

Aíb-Arg-Lys-Arg-Lys-NH₂ oo) H-Phe-Ψ (CH₂-NH) -Gly-Gly- (pNO₂) Phe-Thr-Gly-Aib-ArgLys-Ser-Aib-Arg-Lys-Arg-Lys-NH₂ pp) H-Phe-Ψ(CH₂-O) -Gly-Gly- (pNO₂) Phe-Thr-Gly-Aib-Arg10 Lys-Ser-Aib-Arg-Lys-Arg-Lys-NH₂ aaa) H-Nphe-Gly-Gly-Phe-Thr-Gly-Aib-Arg-Lys-Ser-IvaArg-Lys-Arg-Lys-Asn-Gln-NH₂ bbb) H-Phe-Gly-Gly-(pF)Phe-Thr-Gly-Aib-Arg-Lys-Ser15 Iva-Arg-Lys-Arg-Lys-Asn-Gln-NH₂ ccc) H-Phe-Ψ (CH₂-NH) -Gly-Gly- (pF) Phe-Thr-Gly-Aib-ArgLys-Ser-Iva-Arg-Lys-Arg-Lys-Asn-Gln-NH₂ ddd) H-Phe-Ψ (CH₂-O) -Gly-Gly- (pF) Phe-Thr-Gly-Aib-ArgLys-Ser-Iva-Arg-Lys-Arg-Lys-Asn-Gln-NH₂ eee) H-Phe-Gly-Gly-(pNO₂)Phe-Thr-Gly-Aib-Arg-Lys-SerIva-Arg-Lys-Arg-Lys-Asn-Gln-NH₂ f f f) H-Phe-Ψ (CH₂-NH) -Gly-Gly- (pNO₂) Phe-Thr-Gly-Aib-ArgLys-Ser-Iva-Arg-Lys-Arg-Lys-Asn-Gln-NH₂ ggg) H-Phe-Ψ (CH₂-O)-Gly-Gly- (pNO₂) Phe-Thr-Gly-Aib-Arg25 Lys-Ser-Iva-Arg-Lys-Arg-Lys-Asn-Gln-NH₂ hhh) H-Nphe-Gly-Gly-Phe-Thr-Gly-Aib-Arg-Lys-Ser-IvaArg-Lys-Arg-Lys-NH₂

14/35 iii) H-Phe-Gly-Gly-{pF)Phe-Thr-Gly-Aib-Arg-Lys-SerIva-Arg-Lys-Arg-Lys-NH₂

111) H-Phe-Ψ (CH₂-NH) -Gly-Gly- (pF) Phe-Thr-Gly-Aib-ArgLys-Ser- Iva-Arg-Lys-Arg-Lys-NH₂ mmm) H-Phe-Ψ (CH₂-O) -Gly-Gly- (pF) Phe-Thr-Gly-Aib-ArgLys-Ser- Iva-Arg-Lys -Ar g-Lys-NH₂ nnn) H-Phe-Gly-Gly- (pNO₂) Phe-Thr-Gly-Aib-Arg-Lys-SerIva-Arg-Lys-Arg-Lys-NH₂ ooo) H-Phe-Ψ (CH₂“NH) -Gly-Gly- (pNO₂) Phe-Thr-Gly-Aib-ArgLys-Ser- Iva-Arg-Lys -Ar g-Lys-NH₂ ppp) H-Phe-Ψ (CH₂-O) -Gly-Gly- (pNO₂) Phe-Thr-Gly-Aib-ArgLys-Ser- Iva-Arg-Lys -Ar g-Lys-NH₂ .

Os peptídeos análogos, de acordo com a invenção, podem ser sintetizados através de diferentes técnicas conhecidas na literatura, por exemplo, Schroeder e outros, The Peptides volume 1, Academic Press, 1965; Bodanszky e outros, Peptide Synthesis Interscience Publisher, 1966; Barany & Merrifield, The peptides; Analysis, Synthesis, Biology, 2, Academic Press, 1980; E. Atheron e R.C. Sheppard, Solid Phase Peptide Synthesis IRL Press na Oxford University Press 1989; J. Jones, The Chemical Synthesis of Peptides, Claredon Press, Oxford 1994. Essas técnicas incluem a síntese de peptídeo de fase sólida ou síntese de peptídeo de fase em solução, métodos sintéticos

de química	orgânica, ou qualquer combinação	das	técnicas
mencionadas	acima. A escolha	do esquema	de	síntese,
obviamente,	irá depender da	composição	de	um dado
peptídeo.	Preferivelmente,	são empregados	métodos

-JO ' 15/35 sintéticos que se baseiam em apropriadas combinações de técnicas de fase sólida e métodos clássicos de fase sólida _f envolvendo baixos custos de produção, particularmente, em escala industrial. Em detalhes, os ditos métodos compreendem:

i) Síntese em solução de fragmentos de cadeia de peptídeo através do acoplamento sequencial de aminoácidos protegidos por N, adequadamente ativados, a um aminoácido ou a uma cadeia de peptídeos protegida por C, com isolamento dos intermediários, subsequente desproteção seletiva dos terminais de N e C dos ditos fragmentos e seu repetido acoplamento até o desejado peptídeo . ser obtido. Quando necessário, as cadeias laterais são desprotegidas.

ii) Síntese da fase sólida da cadeia de peptídeo, a partir da extremidade do terminal C, na direção da extremidade do terminal N, sobre um suporte polimérico insolúvel. 0 peptídeo é removido da resina mediante hidrólise com ácido fluorídrico anidro ou ácido trifluoroacético, com simultânea desproteção das cadeias laterais.

Ao final da síntese, os peptídeos podem ser purificados e isolados mediante tratamento com adequados solventes e através de técnicas cromatográficas, tais como, HPLC. Os análogos de peptídeo, de acordo com a presente invenção, atuam sobre o receptor NOP, como, (i) agonistas totais, quando possuem a estrutura [Phe¹T(CONH)Gly²]; ii) agonistas parciais, quando possuem a estrutura [Phe^ (CH2-NH) Gly²] ou [ Phe^ (CH2-O) Gly²] , e como t

16/35 antagonistas puros, quando possuem a estrutura [Nphe¹^(C0NH)Gly²] .

Além disso, a presente invenção se refere a composições farmacêuticas contendo os análogos de peptideo aqui descritos, possivelmente em combinação com veículos e excipientes farmaceuticamente aceitáveis. As composições da presente invenção podem ser administradas através da rota oral ou parenteral ou através das rotas respiratória, retal, espinhai, intratecal, intravesical ou tópica, na forma de preparações injetáveis, cápsulas, comprimidos, forma granulada, solução, suspensão, xarope, supositório, pulverização nasal, cremes, pomadas, géis, preparações de liberação controlada, ou outro tipos de preparações. Os princípios e os métodos para preparação das composições farmacêuticas são bem conhecidos para os especialistas versados na técnica e são descritos, por exemplo, na publicação Remington's Pharmaceutical Sciences, 18^a . Edição, Mack Publishing Company, Easton, Pa, 1990. As composições farmacêuticas, de acordo com a invenção, irão conter uma quantidade efetiva de peptídeos (ou de seus derivados) , geralmente, variando entre 0,001 e 100 mg, preferivelmente, entre 0,01 e 10 mg. A dose diária irá variar, dependendo do tipo de patologia/disfunção, idade, sexo e peso do corpo do paciente, situação geral de saúde e outras variáveis, que precisam ser avaliadas com base em cada caso.

Considerando o perfil de atividade mostrado pelos peptídeos da invenção em testes biológicos, as

I ι

17/35 composições farmacêuticas contendo os ditos peptídeos podem ser usadas no tratamento de disfunções, condicionamentos doentios ou estados patológicos, compreendendo disfunções neurológicas e neuro-sensoriais.

É desejável se obter uma potente e prolongada ativação do receptor NOP para o tratamento de ansiedade, anorexia, hipertensão, taquicardia, distúrbios de retenção de água, hiponatremia, deficiência congestiva cardíaca, disfunções motoras do músculo liso nos tratos gastrintestinal, respiratórios e geniturinários (especialmente incontinência urinária seguinte à bexiga neurogênica), estados inflamatórios ou analgesia periférica ou espinhal, particularmente, para o tratamento da dor crônica ou, mais ainda, no controle da tosse. Além disso, será possível se usar os antagonistas para o tratamento de memória, humor, atividade locomotora (por exemplo, doença de Parkinson) , distúrbios de ingestão de alimentos (por exemplo, bulimia) ou, de modo mais geral, para o tratamento de pacientes obesos. O alto peso molecular desses compostos e a presença dentro dos mesmos de resíduos que podem ser positivamente introduzidos em pH fisiológico, tornam improvável que os mesmos possam cruzar a barreira do sangue cerebral. Os referidos compostos podem exercer efeitos centrais após a administração local, muito embora eles demonstrem uma distribuição predominantemente periférica. Por exemplo, os compostos agonistas podem induzir analgesia no nível do sistema nervoso central, após administração intratecal ¹ 18/35 ou espinhal.

Parte Experimental 1. Síntese do Peptídeo

1.1 - Esquema Geral de Síntese

Os peptídeos da invenção foram preparados através de síntese de fase sólida, usando uma resina 4-{2',4'dimetoxifenil-Fmoc-amínometilfenoxiacetamido-norleucil (Resina Rink-Amide MBHA). Os aminoácidos Fmoc (fluoremilmetoxicarbonil) foram condensados usando o composto de [O-(7-azabenzotriazol-l-il)-1, 1,3,3-tetrametilurônio-hexafluorofosfato] (HATU) como reagente para ativação da função carboxílica. Os grupos Fmoc foram removidos mediante uso de piperidina a 20% em DMF (dimetilformamida) e a resina ligada ao peptídeo protegido foi tratada com o reagente K, a fim de se obter o peptídeo bruto. Os compostos contendo uma ligação de peptídeo modificado entre os primeiros dois resíduos aminoácidos [Phe¹W(CH2-NH) Gly²] ou [Phe^ <CH2-O) Gly²] , foram obtidos através de condensação de Boc-Phe-CHO no peptídeo protegido (2-17) ou (2-16) ou (2-15), ligado à resina durante a última etapa da síntese, reduzindo, dessa forma, in situ, o derivado imino intermediário com NaBH₃CN ou condensando o fragmento Boc- [Phe^ (CH₂-O) Gly²] -OH (que foi obtido segundo os métodos relatados em literatura: Balboni e outros, J.

Chem. Soc. Perkin Trans I, 1998, pg 164 5-1651) no peptídeo protegido (3-17) ou (3-16) ou (3-15), ligado à resina

-2¾

19/35 durante a última etapa da síntese, usando HATU como agente de condensação.

controle analítico de ambos os produtos, bruto e final, foi feito através de HPLC analítica, no Sistema

Gold de Beckmann 168, usando uma coluna C-18 Alltech (150 x

4,6 mm,	5	pm). Os	compostos foram	analisados	usando um
sistema	de	eluição	binário composto	do	solvente	A: 35 mM
NaH₂PO₄	(pH	2,1) e	solvente B: 59	mM	NaH₂PO₄	(pH 2,1)-
acetonitrila (60:40	v/v) , programando	o	gradiente conforme

as propriedades fisico-químicas dos compostos a serem analisados, em uma vazão de 1 mL/min e em um comprimento de onda de 220 nm. O peptídeo bruto foi depois purificado mediante uso do sistema HPLC Delta Prep 4000, preparatório da Water, usando uma coluna de empacotamento radial da

Water, Delta-LC 40 mm (30 x 40 cm, C18, 300 A, 15 pm) , que foi eluída com a mesma fase móvel usada para HPLC analítica e com um gradiente programado de acordo com o perfil analítico dos produtos reacionais brutos. O peso molecular do composto final foi obtido mediante espectrometria de massa por eletro-pulverização, usando o instrumento de micromassa ZMD2000.

Para os intermediários dos mesmos peptídeos, uma análise espectroscópica por meio de ^NMR foi executada, usando um instrumento Bruker em 200MHz.

1.1 Procedimento

Os análogos dos peptídeos (b) , (c) e (d) descritos acima foram preparados de acordo com os procedimentos descritos abaixo.

20/35

A resina Rink-Amide MBHA (0,65 mmol/g, 0,2 g) foi tratada com piperidina (20%) em DMF e condensada com FmocGln(Trt)-OH, ativando a função carboxílica com HATU. Os aminoácidos de Fmoc seguintes foram acoplados seqüencialmente, de modo a alongar a cadeia do peptídeo: Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Arg(Pmc)-OH, FmocLys(Boc)-OH, Fmoc-Arg(Pmc)-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Ser(tBu)OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Arg(Pmc)-OH, Fmoc-Aib-OH, FmocGly-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-(pF)Phe-OH, Fmoc-Gly-OH,

Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Phe-OH. Todos os aminoácidos de Fmoc (4 equivalentes) foram acoplados à cadeia de alongamento de peptídeo usando HATU (4 equivalentes) e diisopropiletílamina (4 equivalentes) em DMF; a reação de acoplamento foi realizada em uma hora. A fim de otimizar o rendimento da síntese e tornar a purificação dos compostos mais fácil, um acoplamento duplo com um tempo de acilação de uma hora foi necessário para o resíduo de Aib. Foi usado piperidina (20%) em DMF para remover os grupos Fmoc em cada etapa. Após a desproteção do último grupo N^-Fmoc, a resina de peptídeo foi lavada com metanol e seca sob vácuo para produzir a resina protegida [ (pF) Phe⁴, Aib⁷, Arg¹⁴, Lys¹⁵] N/OFQ(1-17)-Rink-Amide MBHA. Essa resina de peptídeo protegida foi tratada com o reagente K (TFA / H2O / fenol / etanoditiol / tioanisol 82,5: 5: 5: 2,5: 5; v/v; 10 mL /

0,2 g resina) durante 1 hora à temperatura ambiente. Após filtração da resina exaurida, o solvente foi concentrado a vácuo e o resíduo foi moído em éter. O peptídeo bruto foi

Μ ' 21/35 purificado através de HPLC preparatória de fase reversa, sendo obtido um pó branco após liofilização.

A síntese do composto [Phe¹T(CH2NH)Giy^{2 *}, (pF) Phe⁴, Aib⁷, Arg¹⁴, Lys¹⁵] -N/OFQ-NH2 (peptídeo c) foi feita a partir da resina intermediária de fórmula [ (pF) Phe⁴, Aib⁷Arg¹⁴, Lys¹⁵] -N/OFQ- (2-17) , sintetizada conforme descrito acima. Esse composto intermediário (0,2 g, 0,65 mmol/g, 0,13 mmol) foi colocado novamente em suspensão e expandido em metanol contendo 2 mL de ácido acético a 1% (volume/volume) . Após 20 minutos, foi adicionada uma solução contendo Boc-Phe-CHO (0,065 g, 0,26 mmol) e NaB^CN (0,033 g, 0,52 mmol) solubilizada em metanol (0,8 mL) e a mistura reacional foi agitada por uma hora e meia. A resina foi depois lavada com metanol e tratada com o reagente K, conforme descrito acima. A síntese do composto [Phe¹T(CH2O)Gly², (pF) Phe⁴, Aib⁷, Arg¹⁴, Lys¹⁵] N/OFQ-NH2 (peptídeo d), foi feita a partir da resina intermediária (pF) Phe⁴, Aib⁷Arg¹⁴, Lys¹⁵]-N/OFQ (3-17) , sintetizada conforme descrito acima. Esse composto intermediário (0,2 g, 0,65 mmol/g, 0,13 mmol) foi acilado na última etapa com BocPhe [Ψ (CH₂-O) ] Gly-OH (4 equivalentes, 0,16 g, 0,52 mmol) , ativando a função carboxílica com HATU, sob as mesmas condições descritas para as etapas normais de acilação. Em seguida, a resina foi lavada com metanol e tratada com o reagente K, conforme descrito acima.

2. Testes Farmacológicos

2.1 Materiais e Métodos t

22/35

Os compostos foram testados in vítro em membranas de oócitos de Hamster, expressando o receptor recombinante humano NOP (CHOmop) (em experimentos de ligação do receptor e experimentos de estimulação de ligação de GTPyS) e no canal deferente (vas deferens) de camundongo após estimulação elétrica. As condições usadas para estudo dos efeitos dos compostos em experimentos de bioensaio do canal deferente de camundongo são descritas por Bigoni e outros, (Naunyn Schmiedebergs Arch. Pharmacol., 359, 160-7, 1999), enquanto as condições usadas para estudo dos efeitos nas células CHOhnop são descritas por Mc Donald e outros, (Naunyn Schmiedebergs Arch. Pharmacol., 367, 183-187,

2003). Em cada série de experimentos, a atividade dos novos compostos foi comparada com a do peptídeo natural N/OFQ.

2.2 Resultados.

Nos experimentos de ligação do receptor, todos os compostos testados provaram ser capazes de completamente deslocar o N/OFQ triciado do receptor recombinante humano NOP. Os compostos exibiram afinidades de receptor (pK±) bastante diferentes, dependendo de diversas modificações químicas. Em geral, os compostos com estrutura Phe^fCONH)Gly²] mostraram maior afinidade que os compostos tendo a estrutura [ ΡήΘ¹Ψ (CH₂-NH) Gly² ] e uma afinidade extremamente maior que os compostos tendo a estrutura [Nphe¹T^f(CO25 NH)Gly²]. Além disso, os compostos tendo as modificações combinadas [ (pF) Phe⁴, Aib⁷, Arg¹⁴, Lys¹⁵] mostraram afinidade maior que aqueles tendo modificações isoladas.

^δ ι

23/35

Nos testes funcionais envolvendo a estimulação da ligação de GTPyS e nos testes envolvendo a inibição da contração muscular induzida por estimulação elétrica do canal deferente (vas deferens) de camundongo, os compostos tendo a estrutura [ Phe¹!¹ (CO-NH) Gly²] imitaram os efeitos do receptor N/OFQ e, em particular, induziram efeitos máximos similares, dessa forma, atuando como agonistas totais, enquanto os compostos tendo a estrutura [Phe¹!' (CH₂-NH) Gly²] atuaram como agonistas parciais, uma vez que seus efeitos máximos foram inferiores aos dos compostos com N/OFQ. Pelo menos, os compostos tendo a estrutura [ΝρΗθ⁴Ψ (CO-NH) Gly²] nao produziram qualquer efeito per si, mas, atuaram como antagonistas competitivos do receptor N/OFQ.

Para simplificar, a Tabela 1 relata os resultados que foram obtidos com os compostos [ (pF) Phe⁴, Aib⁷Arg¹⁴, Lys¹⁵] N/OFQ-NH2 (UFP-112) , [Phe^íCHsNHJGly², (pF) Phe⁴, Aib⁷Arg¹⁴, Lys¹⁵] N/OFQ-NH2 (UFP-113) , [Nphe¹, Aib⁷Arg¹⁴, Lys¹⁵] N/OFQ-NH₂ (UFP-111) , e com o peptideo de referência N/OFQ.

y

Atividade Biológica de: [ (pF) Phe⁴,Aib⁷,Arg¹⁴,Lys¹⁵]N/OFQ-NH2 (UFP-112), [Phe²¥ (CH2NH)Gly², (pF) Phe⁴, Aib⁷, Arg¹⁴, Lys¹⁵] N/OFQ-NH2 (UFP-113) , [Nphe¹, Aib⁷, Arg¹⁴, Lys¹⁵] N/OFQ-NH2 (UFP-111) , e do peptídeo de referência N/OFQ.

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25/35

Conforme destacado na Tabela 1, o composto UFP-113 se comporta como um agonista parcial do receptor NOP, proporcionando efeitos máximos que são inferiores ao N/OFQ, ambos no ensaio de GTPyS e no ensaio de inibição de contração induzido por estimulação elétrica do canal deferente (vas deferens) de camundongo. O composto de UFP-111 provou ser um puro e potente seletivo antagonista para o receptor NOP. A análise de Schild (executada em ambos os experimentos de GTPyS e com o sistema de canal deferente indica que o composto se comporta como um antagonista competitivo do receptor NOP, com valores de atividade farmacológica (expressos como PA2) de 8,68 e 7,46, respectivamente (ver a Tabela 1).

2.3. Seletividade do Composto UFP-112

Os efeitos do composto UFP-112 são mediados pela ativação do receptor NOP, como mostrado pelo fato de que a ação desse peptídeo no canal deferente (vas deferens) não foi modificada na presença de naloxona (um antagonista nãoseletivo de receptores opióides clássicos, mas, não do receptor NOP) mas, foi proporcionada como sendo efetivamente antagonizada pelo composto UFP-101, que é um antagonista seletivo do receptor NOP ( [Nphel,Argl4,Lysl5]N/OFQ-NH₂, Calò e outros, Sr. J. Pharmacol., 136, 303-311, 2002). O composto

UFP-101 usado na competição com o composto UFP-112, mostrou um valor de atividade farmacológica (pA₂ 6,81), similar ao obtido quando tal composto é usado na competição com o agonista endógeno N/OFQ (pA₂ 6,91). Isso mostra que as três moléculas (N/OFQ, UFP-112 e UFP-101) interagem com o mesmo receptor: o receptor NOP. Isso é ainda mostrado pelos resultados obtidos ί

26/35 com tecidos dos camundongos abatidos {Ref. Nishi, M. e outros, Unrestrained nociceptive response and disregulatíon of hearing ability in mice lacking the nociceptin/orphaninFQ receptor, Embo J. 16 (8) : 1858-64, 1997) para o gene do receptor NOP (NOP^/_) (ver a Tabela 2) .

Tabela 2 - Efeitos do agonista N/OFQ e UFP-112 e do agonista OOP, D-Pen2,D-Pen-5-encefalin (DPDPE), no canal deferente (vas deferens) de camundongos tipo selvagem (NOP^+/+) e camundongos abatidos para o receptor NOP (NOP^_/“) .

	NOP ^+/+	NOP “^/_
Composto	pEC₅o	Emax	pEC₅₀	Emax
N/OFQ	7,47	84±4%	< 6	-
UFP-112	8,94	93±3%	< 6	-
DPDPE	8,40	93±3%	8,20	91+5%

O efeito inibitório sobre a contração induzida por estimulação elétrica, proporcionado pelo composto UFP-112 {similar ao encontrado com N/OFQ) desapareceu no canal deferente (vas deferens) , isolado de camundongos NOP“^/_, confirmando que as ações biológicas do UFP-112 são devido apenas à interação com o receptor NOP.

O composto [D-Pen², D-Pen⁵] -Encefalin, DPDPE (Ref. Life Sei. 1983;33 Suppl. 1:447-50), um agonista seletivo de

DOP, foi usado como controle positivo. Esse controle mostra

27/35 quais são os tecidos derivados do receptor NOP de camundongos abatidos, que normalmente respondem aos estímulos inibitórios que não usam o receptor NOP.

2.4 Testes Farmacológicos sobre a Seletividade dos Compostos 5 de acordo com a Invenção

Os compostos foram testados in vitro em membranas de oócitos de Hamster (CHO) que expressam o receptor recombinante humano NOP (CHOmop) t como descrito no parágrafo 2.1, de acordo com Mc Donald e outros, (Naunyn Schmiedebergs Arch.

Pharmacol., 367, 183-187, 2003).

Os estudos sobre a seletividade desses compostos para o receptor NOP foram executados através de estudos de ligação do receptor de células CHO transfectadas com receptores opióides recombinantes humanos, do tipo μ (MOP) , δ (DOP) e κ (KOP) , usando o mesmo método utilizado para CHO_hMOp.

Os estudos de seletividade foram realizados mediante experimentos de competição, de acordo com os métodos descritos por Mc Donald e outros, (Naunyn Schmiedebergs Arch. Pharmacol., 367, 183-187, 2003). Para medir o pK_± para o

N/OFQ, foi usado N/OFQ triciado como radioligando, enquanto [³H]-Diprenorfina foi usada para os receptores opióides clássicos. A atividade dos novos compostos foi comparada com a atividade do peptídeo natural N/OFQ.

Nos experimentos de ligação de receptor, realizados em membranas de células de CHO transfectadas, os compostos de UFP-111, UFP-112 e UFP-113 mostraram uma seletividade mais alta (>100 vezes) para o receptor NOP, comparada aos receptores MOP, KOP e DOP (ver a Tabela 3).

/

28/35

Tabela 3: Afinidade (pKJ dos compostos UFP-112, UFP-113 e

UFP-111 para os receptores NOP, MOP, DOP e KOP, em células t rans fect adas de CHO (Ref. Mc Donald e outros (Naunyn Schmiedebergs Arch. Pharmacol., 367, 183-187, 2003).

	pKi
Receptores (ligandos padrão usados por receptor)	NOP (N/OFQ)¹	MOP (DAMGO)²·³	DOP (Naltrindol)³	KOP (Nor- BNI)³
Ligandos padrão	9,50	8,43	9,97	9,90
UFP-112	10,55	7,13	6,37	8,36
UFP-113	10,26	6,45	5,69	7,55
UFP-111	7,75	<5,0	<5,0	6,17

Os dados representam a média de 4 experimentos.

Nota 1-0 ligando triciado é [³H]N/OFQ;

Nota 2 - DAMGO significa: [D-Ala(2),N-MePhe{4),Gly-ol(5)]encefalin

Nota 3-0 ligando triciado usado é [³H]-Diprenorf ina

3. Estudos in vivo sobre a Eficácia do Composto Agonista Total

UFP-112

O composto UFP-112, que é um agonista total, foi testado in vivo em camundongos, em diferentes ensaios:

1) Ensaio de retirada da cauda, de acordo com protocolos experimentais descritos por Calo e outros, (Br. J. Pharmacol., 125, 373-378, 1998) e Rizzi e outros (Clín. Pharmacol., 18,

56, 2004);

Ύ ‘ 29/35

2) Medição da ingestão de alimentos em animais alimentados, conforme descrito por Rizzi e outros (National Congress of the Italian Society of Neuroscience and joint Italian-Swedish Neuroscience Meetings, Ischia (Napoli), 1-4 Outubro de 2005);

3) Ensaio para medição da atividade locomotora espontânea, conforme descrito por Rizzi e outros, (Àfàunyn Schmíedebergs Arch. Pharmacol., 363, 161-165, 2001.

Em cada ensaio, as atividades de UFP-112 e N/OFQ foram medidas como doses igualmente efetivas. Como o composto

UFP-112 mostra uma atividade farmacológica cerca de 100 vezes maior, o peptídeo UFP-112 foi usado em doses compreendendo entre 0,001 e 0,1 nmol e o N/OFQ foi usado em doses compreendendo entre 0,1 e 10 nmol.

No teste analgesiométrico de retirada de cauda de camundongos, o UFP-112 em doses igualmente efetivas imitou os efeitos do ligando natural N/OFQ, embora tenha mostrado sua ação por um período mais longo (> 120 minutos).

composto UFP-112, na faixa de dosagem entre 0,0010,1 nmol, induz efeitos pró-nociceptivos se injetado pela via intracerebroventricular (i.c.v.), enquanto proporcionou efeitos anti-nociceptivos quando foi administrado pela via intratecal (i.t.) (ver a Figura 1) . Os ditos efeitos (similares aos encontrados com o N/OFQ) são mediados pela ativação do receptor NOP, pelo fato de estarem ausentes nos camundongos NOP^-7.

Os compostos de N/OFQ e UFP-112 em doses igualmente efetivas foram examinados no teste de ingestão de alimentos por camundongos alimentados. Ambos os compostos induziram um

30/35 significativo aumento da ingestão de alimentos e, também, nesses ensaios, o composto de UFP-112 provou ser 100 vezes mais potente que o N/OFQ. Nesse teste, os efeitos hiperfágicos do N/OFQ e UFP-112 são exclusivamente devido à ativação do receptor NOP, pelo fato de que tais efeitos estavam presentes nos camundongos NOP^+/+, mas, ausentes em camundongos NOP^_/_.

A fim de investigar a duração da ação do UFP-112 in vivo, foram realizados experimentos em camundongos que compararam a duração (de 5:30 da tarde às 7:30 da manhã) do efeito de doses iguais efetivas do N/OFQ (10 nmol) e UFP-112 (0,1 nmol), ambos administrados pela via i.c.v., sobre a atividade locomotora espontânea. Ambos os peptídeos inibiram a atividade locomotora, mas o efeito do N/OFQ acabou 60 minutos após a injeção pela via i.c.v., enquanto o efeito induzido pelo UFP-112 acabou após cerca de 6 horas (ver a Figura 2).

4. Estabilidade Metabólica do N/OFQ e dos novos Derivados UFP111, UFP-112 e UFP-113 em Homogeneizados de Cérebro e no

Plasma

Amostras de plasma e tecido cerebral foram obtidas de camundongos machos do tipo Suíço (Morini, Reggio Emilia, Itália, 25-30 g). 0 animal, sacrificado por anestesia de éter, foi submetido à perfusão com uma solução de heparina fisiológica injetada através de uma agulha colocada no ventrículo esquerdo. O sangue foi depois retirado e centrifugado a 14000 xg por 2 minutos à temperatura ambiente.

Após a separação do grânulo, o plasma foi tomado em fração e armazenado à temperatura de -80°C. Após a retirada do sangue,

31/35 ο animal foi submetido ainda à perfusão com uma solução fisiológica por 2 minutos, antes da remoção do cérebro. 0 tecido cerebral foi homogeneizado em 5 volumes (peso/volume) de Tris/HCl {50. mM, pH 7,4, 0°C) em um dispositivo Ultra5 Turrax (Janke Kunkei, Staufen, FRG), 3 vezes por 15 segundos cada. 0 sobrenadante obtido por centrifugação (3000 xg por 15 minutos à temperatura de 4°C) foi decantado e depois armazenado à temperatura de -80°C.

teor de proteína das preparações, determinado pelo método Bradford, conforme descrito em Anal. Biochem., 72, 248254, 1976, foi de aproximadamente 8 gg/gL para o homogeneizado cerebral e de 17 gg/gL para o plasma.

Uma fração de 100 gL de solução de cada peptídeo (3 mg/500 gL Tris) foi incubada (em uma concentração final de 6 gg/gL)' com o homogeneizado do cérebro ou plasma (450 gL) em um volume total de 1 mL, contendo um tampão de Tris/HCl 50 mM, pH 7,4. A incubação das frações foi realizada à temperatura de 37°C durante diversos períodos, até 240 minutos. Em diferentes tempos de incubação, uma fração da solução (100 gL) foi removida e a decomposição foi bloqueada mediante adição de uma solução de TFA 4,5% (200 gL). Após centrifugação (3000 rpm por 15 minutos), uma fração (100 gL) de sobrenadante foi injetada em una coluna de RP-HPLC. A análise de HPLC foi realizada em uma coluna Kromasil 100-5C18 (4,6 x 250 mm), usando um sistema de cromatografia Beckman System Gold, dotado de um detetor de UV de comprimento de onda variável.

As condições experimentais para eluição incluíram uma análise de gradiente com água (solvente A) e acetonitrila (solvente B) , ambos contendo TFA 0,1%, em uma vazão de 0,7

3'ί

32/35 mL/min. Ο protocolo seguinte foi usado para análise de gradiente, selecionado com base nas características fisicoquímicas do analisado: gradiente linear de 5% a 40% de B em 20 minutos; gradiente linear de 40% a 40% de B em 5 minutos;

gradiente linear de 60% a 5% de B em 5 minutos. O eluato foi monitorado em 220 nm. 0 tempo de meia vida (Ti_/2) foi obtido mediante regressão linear através do método dos mínimos quadrados, diagramando as áreas de pico de cada derivado em função dos tempos de incubação, usando pelo menos cinco pontos para cada análise.

Os dados são mostrados na Tabela 3, como média ± desvio padrão e são obtidos a partir de pelo menos 3 experimentos separados.

Tabela 3: (min) do composto N/OFQ e derivados, em plasma e tecido cerebral de camundongo.

	Plasma	Cérebro
N/OFQ	64 ± 1	3,2 ± 1,8
UFP-111	137 ± 4	11,0 ± 1,9
UFP-112	167 ± 9	11,3 ± 1,4
UFP-113	110 ± 10	12,3 ± 0,8

O composto de N/OFQ mostrou tempos de meia vida no plasma de cerca de 1 hora, que são bastante diferentes se comparados aos tempos obtidos com o homogeneizado cerebral, que foram de cerca de 3 minutos. Todos os peptídeos estudados, de acordo com a invenção, exibiram tempos de meia vida

33/35 significativamente mais altos em relação ao peptídeo natural. Em particular, o TPs do plasma com relação aos compostos UFP111 e UFP-113 é cerca de duas vezes tão grande quanto o do composto N/OFQ, enquanto o 1½ do composto UFP-112 é quase três vezes maior que o do N/OFQ.

Os tempos de meia vida maiores exibidos pelos derivados, comparados ao N/OFQ, foram mais pronunciados no homogeneizado cerebral que no plasma. De fato, o de todos os derivados foi mais de três vezes maior que o valor mostrado pelo composto de N/OFQ (3 minutos) no tecido cerebral.

Esses dados mostram que as modificações químicas das sequências de UFP-111, 112 e 113 aumentou sua atividade farmacológica como agonistas ou antagonistas, comparado ao N/OFQ; tais modificações modulam a sua eficácia no receptor NOP e determinam uma importante redução da susceptibilidade à decomposição pelas peptidases presentes no plasma e no tecido cerebral. Essa importante característica, certamente, é crucial para prolongar a ação dessas moléculas in vivo, como foi bem documentado para o UFP-112 na série de experimentos resumidos em 3 seções (pesquisas in vivo).

5. Cinética dos Efeitos Inibitórios do UFP-112 no Canal

Deferente (vas deferens) de Camundongo

No canal deferente eletricamente estimulado de camundongo, a cinética de ação do UFP-112 e a reversibilidade dos efeitos após a lavagem foram muito mais lentas do que com o N/OFQ (ver a Figura 3) . Isso foi demonstrado pelo efeito inibitório sobre a contração induzida pela estimulação

9?

34/35 elétrica no canal deferente. Junto com os dados de estabilidade metabólica, isso poderia explicar a maior ação in vivo do UFP-112, comparado ao ligando endógeno N/OFQ.

6. Atividade Biológica de alguns Compostos.de Fórmula (I), no

Canal Deferente de Camundongo, após Estimulação Elétrica

A Tabela 4 resume os resultados obtidos no canal deferente (vas deferens) de camundongo após estimulação elétrica, na presença de uma série de compostos de fórmula (I) , portando diferentes modificações químicas nas posições 7 a 11 do modelo agonista N/OFQ-NH2. Esses dados mostram que diferentes substituições aminoacídicas nao modificam a eficácia dos compostos que atuam como agonistas totais, mas, em alguns casos (por exemplo, [AC5C¹¹] N/OFQ-NH2 e [D/L15 Iva¹¹]N/OFQ-NH2) , aumentam a atividade farmacológica, comparado à seqüência de referência. Deve ser observado que o aumento na atividade farmacológica, obtido como resultado dessas modificações individuais (2 vezes, comparado à seqüência de referência), é menor que o aumento da atividade farmacológica obtido como resultado da modificação combinada em diferentes posições, como no caso do composto UFP-112 (Tabela 1), cuja atividade farmacológica aumentou mais de 100 vezes.

Tabela 4: Atividade Farmacológica, medida no canal deferente eletricamente estimulado de camundongo, de uma série de compostos de fórmula geral (I) , obtidos com diversas modificações químicas nas posições 7 a 11.

<1$

35/35

Composto	pECgo (CL 95%)	Emax
N/OFQ-NH2	7,80 (7,74-7,86)	93 ± 2%
[Ac₃c⁷]N/OFQ-NH2	7,08 (6,82-7,34)	98 ± 1%
[Ac₅c⁷]N/OFQ-NH2	7,60 (7,40-7,80)	98 ± 1%
[Ac₆c⁷]N/OFQ-NH2	7,20 (6,86-7,54)	87 ± 1%
[(aMe)D/L-Val⁷]N/OFQ-NH2 (diastereômero 1)	7,26 (7,00-7,52)	88 ± 1%
[(aMe)D/L-Val⁷]N/OFQ-NH₂ (diastereômero 2)	7,56 (7,34-7,78)	95 ± 1%
[(aMe)D/L-Leu⁷]N/OFQ-NH2 (diastereômero 1)	7,33 (7,04-7,62)	84 ± 1%
[(aMe)D/L-Leu⁷]N/OFQ-NH₂ (diastereômero 2)	7.12 (7.02-7.22)	95 ± 2%
[Iva⁷]N/OFQ-NH₂ (diastereômero 1)	7,83 (7,74-7,92)	91 ±4%
[Iva⁷JN/OFQ-NH2 (diastereômero 2)	7,62 (7,32-7,92)	88 ± 3%
[Deg⁷]N/OFQ-NH2	7,91 (7,53-8,27)	89 ± 2%
[Dpg⁷]N/OFQ-NH2	7,90 (7,71-8,11)	91 ±4%
[Ac₃c]N/OFQ-NH2	7,78 (7,62-7,94)	91 ±4%
[Ac5c'‘]N/OFQ-NH2	8,08 (7,93-8,23)	89 ±4%
[Ac₆c]N/OFQ-NH2	7,79 (7,53-8,05)	89 ± 4%
[(aMe)D/I.-Val]N/OFQ-NH₂ (diastereômero 1)	7,71 (7,37-8,05)	93 ± 2%
[(aMe)D/L-Val^u]N/OFQ-NH₂ (diastereômero 2)	7,83 (7,67-7,99)	86 ± 4%
[(aMe)D/L-Leu]N/OFQ-NH₂	7,87 (7,67-8,07)	91 ±4%
[D/L-Iva“]N/OFQ-NH₂	8,12 (7,78-8,46)	90 ± 4%
[Deg]N/OFQ-NIl2	7,75 (7,43-7,89)	87 ± 4%
[Dpg¹¹]N/OFQ-NH2	7,53 (7,17-8,04)	86 ± 3%

1/2

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Análogo do peptídeo nociceptina/orfanina FQ (N/OFQ), apresentando a fórmula geral (I): Xaa¹^-Gly²-Gly³-Xbb⁴-Thr⁵-Gly⁶-Aib⁷-Arg⁸-Lys⁹-Ser¹⁰-Ala¹¹Arg¹²-Lys¹³-Arg¹⁴-Lys¹⁵-R, caracterizado pelo fato de que:

quando Xaa¹ é Phe, Ψ representa a ligação entre os primeiros dois resíduos de aminoácidos, sendo escolhido do grupo que consiste em CO-NH, CH2-NH ou CH2-O, e Xbb⁴ é pFPhe, onde p indica a posição para no anel de fenila de Phe;

ou quando Xaa¹ é N-benzil-glicina (Nphe), Ψ representa a ligação entre os primeiros dois resíduos de aminoácidos, e é CO-NH, e Xbb⁴ é Phe; e

R é escolhido a partir do grupo que consiste em dipeptídeo

Asn-Gln-NH2 e um grupo terminal amino (-NH2);

e seus sais farmaceuticamente aceitáveis.
2. Análogo do peptídeo (N/OFQ), de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que Xaa¹ é Phe, Ψ representa a ligação entre os primeiros dois resíduos de aminoácidos e é escolhido do grupo que consiste em CO-NH, CH2-NH ou CH2-O, e Xbb⁴ é pFPhe.
3. Análogo do peptídeo (N/OFQ), de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que Xaa¹ é Phe, Ψ é CO-NH e Xbb⁴ é pFPhe.
4. Análogo do peptídeo (N/OFQ), de acordo com a reivindicação 1, 2 ou 3, caracterizado pelo fato de que

Xaa¹ é Phe, Ψ é CO-NH e Xbb⁴ é pFPhe e R é Asn-Gln-NH2.
5. Análogo do peptídeo (N/OFQ), de acordo com a de 06/10/2017, pág. 16/78

2/2 reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que Xaa¹ é Phe, Ψ é CH2-NH e Xbb⁴ é pFPhe e R é Asn-Gln-NH2.
6. Análogo do peptídeo (N/OFQ), de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo

5 fato de que atua como um agonista do receptor NOP.
7. Análogo do peptídeo (N/OFQ), de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que Xaa¹ é Nbenzil-glicina (Nphe), Ψ é CO-NH, e Xbb⁴ é Phe.
8. Análogo do peptídeo (N/OFQ), de acordo com a 10 reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que Xaa¹ é Nbenzil-glicina (Nphe), Ψ é CO-NH, Xbb⁴ é Phe e R é Asn-GlnNH2.
9. Análogo do peptídeo (N/OFQ), de acordo com a reivindicação 7 ou 8, caracterizado pelo fato de que atua

15 como um agonista do receptor NOP.
10. Composições caracterizadas pelo fato de compreenderem os análogos do peptídeo (N/OFQ), conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 9.
11. Composição farmacêutica caracterizada pelo 20 fato de compreender os análogos do peptídeo (N/OFQ), conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 9, combinados com veículos e/ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis.

Petição 870170075810, de 06/10/2017, pág. 17/78

7?^

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