EA011325B1

EA011325B1 - Высокоэффективные полные и частичные агонисты и антагонисты рецептора ноцицептина/орфанина fq

Info

Publication number: EA011325B1
Application number: EA200701732A
Authority: EA
Inventors: Ремо Гуеррини; Северо Сальвадори; Джироламо Кало; Доменико Реголи
Original assignee: Уфпептидес С.Р.Л.
Priority date: 2005-02-15
Filing date: 2006-02-15
Publication date: 2009-02-27
Also published as: AU2006215639A1; MA29288B1; NO341856B1; CN101128482A; RS54095B1; JP5281292B2; CA2598121C; UA91844C2; ZA200707714B; NI200700205A; EP1851241B1; KR20070119614A; JP2008530058A; PT1851241E; CU23823A3; DK1851241T3; CN104689293A; HRP20150731T1; US8227414B2; CA2598121A1

Abstract

Описаны пептидные аналоги ноцицептина/орфанина FQ, их композиции и их применение в лечении расстройств и дисфункций, относящихся к активации или блокированию рецепторов NOP.

Description

Настоящее изобретение относится к пептидным аналогам ноцицептина/орфанина Ερ (Ν/ΟΕΡ). способным регулировать активность рецептора пептида Ν/ΟΕΡ (рецептора ΝΟΡ). фармацевтическим композициям. содержащим указанные пептидные аналоги. и их применению для лечения дисфункций. патологических условий или патологических состояний. затрагивающих указанный рецептор.

Уровень техники

В 1994г. был клонирован новый рецептор. названный ΟΚΕ1. структурно подобный опиоидным рецепторам; согласно последним рекомендациям Международного союза фармакологов (ΙϋΡΗΑΚ) ΝΟΡ является наиболее подходящим названием для этого рецептора. Его эндогенным лигандом (Ν/ΟΕΡ). идентифицированным в конце 1995г.. является гептадекапептид. подобный некоторым опиоидным пептидам (например. динорфину А). который. однако. не связывается с классическими опиоидными рецепторами мю (ΜΟΡ). дельта (ΌΟΡ) или каппа (ΚΟΡ) типов. Клеточные эффекты. опосредованные рецептором ΝΟΡ. сходны с эффектами. вызываемыми классическими опиоидными рецепторами. С точки зрения структуры и с точки зрения сигнальной трансдукции. система пептид/рецептор Ν/ΟΕΡ-ΝΟΡ принадлежит к опиоидному семейству. хотя она представляет собой фармакологически отдельную ветвь. Некоторые исследования. выполненные между 1996 и 1998гг.. показали. что Ν/ΟΕΡ может регулировать некоторые функции как в центральной нервной системе (боль. страх. обучение. память. злоупотребление наркотиками. аппетит). так и на периферическом уровне (кровяное давление. ритм сердца. почечные. желудочно-кишечные. мочеполовые периферические и респираторные функции) (более подробно см. Мазз1 с1 а1.. ГерНбез 21. 2000).

Начиная с 1996г.. изобретатели настоящего изобретения выполняли исследования на системе Ν/ΟΕΡ-ΝΟΡ. приведшие к идентификации отдельных лигандов рецептора ΝΟΡ. таких как: ί) Ν/ΟΕΡ( 113)-ΝΗ₂. который представляет собой минимальный функциональный фрагмент с активностью. подобной активности природного лиганда Ν/ΟΕΡ (Са1о с1 а1.. Еиг. 1. Ρΐιαηηαοοί. 311. Κ3-5. 1996). ίί) Ν/ΟΕΡΝΗ₂. который вызывает. особенно ίη νίνο. более сильные и длительные эффекты по сравнению с Ν/ΟΕΡ (Κίζζί с1 а1.. Ыаипуп БскииебеЬегдз Агск. ΡΉ™αοο1. 363. 161-165. 2001). ίίί) |Τ\τ^||Ν/ΟΕΡ(1-13)-ΝΗ2. смешанный агонист. который действует на ΝΟΡ и на классические опиоидные рецепторы (Са1о с1 а1.. Сап. 1. Гкузюк Ρка^тасο1. 75. 713-8. 1997; Уаташ е1 а1.. Ыаипуп БскпиебеЬегдз Агск. Ρка^тасο1. 360. 270-7. 1999). ίν) [Ρ^ψΉΗ^ΝΗΉ^Ν/ΟΡΡΗ-^-ΝΗ^ селективный лиганд рецептора ΝΟΡ. который ведет себя как чистый антагонист. частичный агонист или даже полный агонист. в зависимости от способа получения/ анализа при исследовании (Риетш е1 а1.. Вг. 1. Ρка^тасο1. 123. 163-5. 1998; Ο1<α\να е1 а1.. Вг. 1. Ρка^тасο1. 127. 123-30. 1999) - исходя из подробного анализа фармацевтического действия рке^СН2ΝΗ)6Ε'²|Ν/ΟΕΟ(1-13)-ΝΗ2. сообщенного Са1о е1 а1. (Терббез 21. 935-47. 2000). оказывается. что данное соединение. в самом деле. является частичным агонистом ΝΟΡ. ν) |Νρ1κ'|Ν/ΟΕΟ(1-13)-ΝΗ₂. первый чистый конкурентный антагонист рецептора ΝΟΡ (Са1о е1 а1.. Вг. 1. ΡΙκιοι-π-κοΡ 129. 1183-93. 2000; Риетш е1 а1.. 1. Меб. Скет. 15. 2805-13. 2000). Действие этих лигандов охарактеризовано в некоторых исследованиях 1п νίΙΐΌ и 1п νί\Ό (см. Са1о е1 а1.. Вг. 1. ΡΙ-™-^. 129. 1261-83. 2000). Позднее остаток Ρ1Ή был замещен (ρΕ)Ρ1κ или (ρΝΌ₂)Ρ^. таким образом были получены сильные селективные агонисты ΝΟΡ (Риетш е1 а1.. 1. Меб. Скет. 44. 3956-64. 2001). Другое интересное соединение. |Αγ§^Ι4.Ελ·5^|5|Ν/ΟΕΟ. было идентифицировано в качестве высокоэффективного агониста (в 17 раз более эффективное. чем Ν/ΟΕΡ). селективного для человеческих рекомбинантных рецепторов ΝΟΡ. экспрессируемых в клетках ΗΕΚ293 ^каба е1 а1.. Вюскет. Вюркуз. Рез. Соттип. 278. 493-8. 2000). Действия этого лиганда были. кроме того. охарактеризованы ш уйго с использованием изолированных тканей. чувствительных к Ν/ΟΕρ. и на мыши ш νί\Ό (Κίζζί е1 а1.. 1. Ρка^тасο1. Ехр. Ткег. 300. 57-63. 2002). Кроме того. 2йапд е1 а1. (Ζΐκπίβ е1 а1.. 1. Меб. Скет.. 45. 5280-5286. 2002) описали аналоги Ν/ΟΕρ. отличающиеся остатком 2-амино-2-метилпропионовой кислоты (А1Ь) в положении 7 и/или 11. замещающим остатки А1а и вызывающим увеличение аффинности и силы лиганда. Аналоги Ν/ΟΡΡ были описаны в XVΟ 99/07212. XVΟ 97/07208. ΧνΟ 99/03491. ΧνΟ 99/03880 и ЕР 1422240. Полезность данного лиганда была описана в лечении/предупреждении болезней. связанных с гипералгезией. нейроэндокринными функциями. стрессом. двигательной активностью и страхом.

В дальнейшем исходной последовательностью пептида Ν/ΟΡΡ является следующая:

Η-Ρке-61у-61у-Ρке-Τк^-61у-Α1а-Α^д-^у8-§е^-Α1а-Α^д-^у8-^еи-Α1а-Α8η-61η-ΟΗ

Описание чертежей

Фиг. 1. Эффект интрацеребровентрикулярного (и.ц.в.. верхние панели) или интратекального (и.т.. нижние панели) введения Ν/ΟΡΡ (10 нмоль/мышь) и введения в хвост ϋΕΡ-112 (0.1 нмоль/мышь) в исследовании отдергивания хвоста (ссылка Са1о е1 а1.. Вг. 1. ΡΙ-™-^. 125. 375-378. 1998). Контрольные животные получили одну и.ц.в. инъекцию физиологического раствора (2 мкл/мышь). Каждая точка представляет собой среднее значение ± стандартная ошибка измерения из по меньшей мере 4 экспериментов.

Фиг. 2. Продолжительность эффектов Ν/ΟΡΡ (10 нмоль/мышь) и υΕΡ-112 (0.1 нмоль/мышь). введенного интрацеребровентрикулярно (и.ц.в.). на самопроизвольную двигательную активность у мышей (ссылка Κίζζί е1 а1.. Ыаипуп ЗсктгебеЬетдз Агск. Ρ1-™α^1. 363. 161-165. 2001). Контрольные животные

- 1 011325 получали одну и.ц.в. инъекцию физиологического раствора (2 мкл/мышь). Каждая точка представляет собой среднее значение ± стандартная ошибка измерения из по меньшей мере 4 экспериментов.

Фиг. 3. Кинетика действия и обратимости эффектов равноэффективных концентраций Ν/ОБО и ИЕР-112 уак беГегепк мыши после электрической стимуляции. Сокращение уак беГегепк. вызванное электрической стимуляцией, ингибируется в присутствии ИРР-112 или Ν/ΟΡφ.

Подробное описание изобретения

Термины. использованные в данном патенте. имеют значение. известное в данной области техники. как. например. в Международном союзе фармакологов (ШРНАй) оп йесерЮг Штепсй-Ииге апб Эгад С1а88гГ1сайоп. РИагт. йеу. (2003) Уо1. 55. Νο. 4. р.597. как сообщено здесь:

Эффективность - понятие. которое выражает степень. с которой различные агонисты вызывают отличающиеся ответы. даже когда занимают одинаковую долю рецепторов.

Активность - выражение активности соединения. определенной в показателях концентрации или количества. необходимого для получения определенного эффекта. Активность измеряется как рЕС₅₀ для агонистов и как рА₂ для антагонистов.

Целями настоящего изобретения являются пептидные аналоги Ν/ΟΡφ. общей формулы (I)

Хаа¹-Ф-С1у²-О1у³-ХЪЬ⁴-Т11г⁵-Ст1у⁶-Хсс⁷-Аг§®-Еу5⁹-8ег¹⁰-Х(1д¹¹-Аг§¹²-Еу5^П-Хее¹⁴“ХГГ¹⁵-К (I) где Хаа¹ является РИе или Ν-бензилглицин (Νρίκ): ψ представляет собой связь между первыми двумя аминокислотными остатками и выбрана из СО-ΝΗ. и СН2-ЯН. и СН2-О: ХЬЬ⁴ является РИе или (рХ)РИе. где X представляет собой Н. С1. Вг. I. Ρ. ΝΟ2. СИ и р указывает пара-положение в фенильном кольце РИе: Хсс⁷ и Хбб¹¹ выбраны из А1а: 2-амино-2-метилпропионовой кислоты (А1Ь): 2-амино-2-метилмасляной кислоты (1уа): 2-амино-2-этилмасляной (Эед) кислоты; 2-амино-2-пропилпентановой кислоты (Эрд): (СаСН3)Ьеи: (СаСН3)Уа1: 1-аминоциклопропанкарбоновой кислоты (Ас3с): 1-аминоциклопентанкарбоновой кислоты (Ас5с) и 1-аминоциклогексанкарбоновой кислоты (Ас6с): Хее¹⁴ и ХГГ¹⁵ выбраны из Агд. Ьук. От. отоАгд. диаминомасляной кислоты или Тгр: й представляет собой дипептид А5п-С1п-ХН2 или АкпС1п-ОН или аминокислоту Аки или с амидной (-ХН₂). или с карбоксильной (-ОН) терминальной группой или амино (-ХН₂) или гидроксильной (-ОН) терминальной группой.

Кроме того. изобретение включает фармацевтически приемлемые соли этих соединений (I). особенно соли органических и неорганических кислот. такие как гидрохлорид. гидробромид. фосфаты. сульфаты. ацетаты. сукцинаты. аскорбаты. глюконаты. бензоаты. малеаты. фумараты и стеараты.

Соединения согласно изобретению. которые подпадают под формулу I. имеют доказанную фармакологическую активность. даже в 100 раз выше. чем пептидные лиганды. известные в данной области техники. Следовательно. возможно предположить синергический эффект перестановок согласно формуле I: для положений 1. 4. 7. 11. 14. и 15 и связи между первыми двумя аминокислотными остатками. Более высокая активность соединений формулы I и особенно предпочтительных соединений. предпочтительно агонистов и более предпочтительно [(рΡ)Рйе⁴.А^Ь⁷.А^д¹⁴.^у8¹⁵]N/ΟΡ^-NΗ₂ продемонстрирована в отношении аффинности. активности устойчивости к протеазам. кинетики действия ш уйто и. прежде всего. продолжительности их действия ш у1уо.

Предпочтительными соединениями являются соединения формулы (I). в которой ψ представляет собой ίΌ-ΝΗ или СН₂-ХН. или СН₂-О. Хаа¹ является РИе или ХрИе. ХЬЬ⁴ является РИе или (рХ)РИе. где (рХ) является. как определено выше. Хсс⁷ и Хбб¹¹ являются. как определено выше. Хее¹⁴ и ХГГ¹⁵ являются Агд. Ьук. От. отоАгд или Тгр: й является -ХН₂. или -ОН. или Акп-ХН^ или Акп-ОН. или Акп-С1пХН₂. или Акп-С1п-ОН.

Более предпочтительными являются те соединения формулы (I). в которых ψ представляет собой СО-ХН. или СН₂-ЫН. или СН₂-О: Хаа¹ является РИе или НрИе: ХЬЬ⁴ является РИе. или (рР)РИе. или (рNΟ2)Рйе: Хсс⁷ и Хбб¹¹ являются А1а: 2-амино-2-метилпропионовой кислотой (А1Ь): 2-амино-2-метилмасляной кислотой (Па): 2-амино-2-этилмасляной (Эед) кислотой: 2-амино-2-пропилпентановой кислотой (Эрд): (СаСН3)Ьеи: (СаСН₃)Уа1: 1-аминоциклопропанкарбоновой кислотой (Ас₃с): 1-аминоциклопентанкарбоновой кислотой (Ас₅с) и 1-аминоциклогексанкарбоновой кислотой (Ас₆с): Хее¹⁴ и ХГГ¹⁵ являются Агд или Ьук: й представляет собой А8и-С1и-NΗ₂ или -ХН₂.

Даже более предпочтительными являются пептидные аналоги. имеющие формулу (I). в которой вариабельные остатки имеют значение. приведенное в следующей таблице.

- 2 011325

	Хаа'	I Ψ	хьь⁴	Хее'	хаа¹¹	Хее'⁴	X'⁵	К
1	МрЬе	СО-ΝΗ	РЬе	А1Ь	А1а	Аг§	Ьуз	Αδη-Ο1η-ΝΗ₂
2	РЬе	СО-ΝΗ	(рГ)РЬе	АЛ	А1а	Агц	Ьуз	Α5η-Ο1η-ΝΗ₂
3	РЬе	СНг-ΝΗ	(рГ)РЬе	А1Ь	А1а	Аге	Ьуз	Α3π-Ο1η-ΝΗ₂
4	РЬе	СН₂-О	(рР)РЬе	А1Ь	А1а	Аге	Ьуз	Α8π-αΐη-ΝΗ₂
5	ΝρΗβ	СО-ΝΗ	РЬе	А1Ь	А1а	Аге	Ьуз	-νη₂
6	РЬе	СО-ΝΗ	(ρΓ)ΡΙιε	А1Ь	А1а	Аг§	Ьуз	-νη₂
7	РЬе	СП--КН	(рГ)РЬе	АЛ	А1а	Аге	Ьуз	-νη₂
8	РЬе	СН₂-0	(рР)Рке	АЛ	А1а	Аге	Ьуз	-νη₂
9	МрЬе	СО-ΝΗ	РЬе	А1Ъ	А1Ь	Аге	Ьуз	Α5η-Ο1η-ΝΗ₂
10	РЬе	СО-ΝΗ	(рР)РЬе	А1Ь	А1Ь	Аг§	Ьуз	Α5η-61η-ΝΗ₂
И	РЬе	ΟΗ₂-ΝΗ	(рР)РЬе	ΑΪΒ	А1Ь	Аге	Ьуз	Α5Π-ΰ1η-ΝΗ₂
12	РЬе	СН₂-О	(рР)РЬе	А1Ь	А1Ь	Аге	Ьуз	Α5η-ΟΚ-ΝΗ₂
13	Νρΐιβ	СО-ΝΗ	РЬе	А1Ъ	А1Ь	Аге	Ьуз	-νη₂
14	РЬе	СО-ΝΗ	(рР)РЬе	А1Ь	А1Ь	Аге	Ьуз	-νη₂
15	РЬе	СН₂-ЫН	(рР)РЬе	А1Ь	А1Ь	Аге	Ьуз	-νη₂
16	РЬе	СНг-О	(рР)РЬе	АЛ	А1Ь	Аге	Ьуз	-νη₂
17	ΝρΗβ	СО-ΝΗ	РЬе	Ка	А1а	Аге	Ьуз	Λδη-ίϋη-ΝΙ Ιτ
18	РЬе	СО-ΝΗ	(рР)РЬе	Ка	А1а	Аге	Ьуз	Α5Π“€ί1π-ΝΗ₂
19	РЬе	СНг-ΝΗ	(рР)РЬе	Ка	А1а	Агд	Ьуз	Α8η-Ο1η-ΝΗ₂
20	РЬе	СН₂-О	(рР)РЬе	Ка	А1а	Аге	Ьуз	Α8η-αΐη-ΝΗ₂
21	Νρΐιβ	СО-ΝΗ	РЬе	1уа	А1а	Агд	Ьуз	-ΝΗ₂
22	РЬе	СО-ΝΗ	(рР)РЬе	1уа	А1а	Аг§	Ьуз	-νη₂
23	РЬе	СН₂-ЫН	(рР)РЬе	1уа	А1а	Аге	Ьуз	-νη₂
				γ	Л 1	*	Т .,·η
			КН¹ Р	ινα	та	414 £	^У О	1'4 12
25	ΝρΗε	СО-ΝΗ	РЬе	Ка	А1Ь	Агд	Ьуз	Α5η-Ο1η-ΝΗ₂
26	РЬе	СО-ΝΗ	(рР)РЬе	1уа	А1Ь	Аге	Ьуз	Αδη-ΟΙη-ΝΗζ
27	РЬе	СНг-ΝΗ	(рР)РЬе	Ка	АПз	Агд	Ьуз	Α8η-Ο1η-ΝΗ₂
28	РЬе	СН₂-О	(рР)РЬе	Ка	Л1Ь	Агд	Ьуз	Αβπ-ΟΙπ-ΝΗϊ
29	Ирке	СО-ΝΗ	РЬе	Ка	А1Ь	Аге	Ьуз	-νη₂
30	РЬе	СО-ΝΗ	(рР)РЬе	Ка	А1Ь	Аге	Ьуз	-νη₂
31	РЬе	СНг-ΝΗ	(рР)РЬе	Ка	А1Ь	Агд	Ьуз	-νη₂
32	РЬе	сн₂-о	(рР)РЬе	Ка	А1Ь	Аге	Ьуз	-νη₂
33	ΝρΙιβ	СО-ΝΗ	РЬе	А1Ь	Ка	Аге	Ьуз	Α3η-Ο1ιι-ΝΗ₂
34	РЬе	СО-ΝΗ	(рР)РЬе	А1Ь	Ка	Аге	Ьуз	ΑΜ1-61η-ΝΗ₂
35	РЬе	СН₂-Н11	(рР)РЬе	АЛ	Ка	Агд	Ьуз	Α3Π-Ο1η-ΝΗ₂
36	РЬе	СН₂-0	(рР)РЬе	АЛ	Ка	Аге	Ьуз	Α3η-Ο1η-ΝΗ₂
37	ЫрЬе	СО-ΝΗ	РЬе	АЛ	Ка	Агд	Ьуз	-ΝΗ₂
38	РЬе	СО-ΝΗ	(рР)РЬе	А1Ь	Ка	Агд	Ьуз	-νη₂
39	РЬе	СН₂-ЫН	(рР)РЬе	А1Ь	Ка	Аге	Ьуз	-νη₂
40	РЬе	СН₂-0	(рР)РЬе	А1Ь	Ка	Аге	Ьуз	-νη₂
41	ЧрЬе	СО-ΝΗ	РЬе	АЛ	А1а	Агд	Ьуз	Α5η-Ο1η-ΝΗ₂
42	РЬе	СО-ΝΗ	(рЫО₂)РЬе	АЛ	А1а	Агд	Ьуз	Αίη-ΟΙη-ΝΗ.
43	РЬе	0Η₂-ΝΗ	(рЫО₂)РЬе	А1Ь	А1а	Аге	Ьуз	Α&η-01η-ΝΗ₂
44	РЬе	СН₂-О	(рИО₂)РЬе	Айз	А1а	Аге	Ьуз	Αί5Π-Ο1ι>ΝΗ₂
45	ΝρΗβ	СО-ΝΗ	РЬе	АЛ	А1а	Агд	Ьуз	-νη₂
46	РЬе	СО-ΝΗ	(ρΝΟ₂)ΡΕβ	А1Ъ	А1а	Аге	Ьуз	-νη₂
47	РЬе	СНг-ΝΗ	(ρΝΟ₂)ΡΗβ	А1Ь	А1а	Аг£	Ьуз	-νη₂
48	РЬе	СН₂-О	(рИО₂)РЬе	А1Ь	А1а	Агд	Ьуз	-νη₂
49	ΝρΗβ	СО-ΝΗ	РЬе	ΑίΒ	А1Ь	Агд	Ьуз	Αδπ-Ο1η-ΝΗ₂
50	РЬе	СО-ΝΗ	(рИОг)РЬе	А1Ь	АЛ	Агд	Ьуз	Α3π-Ο1η-ΝΗ₂
51	РЬе	СНг-ΝΗ	(рКСЬ)1‘.11е	АЛ	А1Ь	Агд	Ьуз	Α5η-Ο1η-ΝΗ₂
52	РЬе	СН₂-О	(р1ЧО₂)РЬе	АЛ	АЛ	Агд	Ьуз	Α3η-Ο1η-ΝΗ₂
53	ΝρΙιε	СО-ΝΗ	РЬе	А1Ь	А1Ь	Агд	Ьуз	-ΝΗ₂
54	РЬе	СО-ΝΗ	(рЫО₂)РЬе	А1Ь	АЛ	Агд	Ьуз	-νη₂
55	РЬе	СНг-ΝΗ	/ρΝΟ,)Ρ1ικ	АЛ	АЛ	Ате	Ьуз	-νη₂
56	РЬе	СН₂-0	(рЫОз)Рке	АЛ	АЛ	Агд	Ьуз	-νη₂
57	Νρΐιε	СО-ΝΗ	РЬе	Ка	А1а	Аге	Ьуз	Αδη-Ο1η-ΝΗ₂
58	РЬе	СО-ΝΗ	(ρΝΌ₂)Ρ1ιε	Ка	А1а	Агд	Ьуз	Αδη-Ο1η-ΝΗ₂
59	РЬе	0Η-.-ΝΗ	(рИОДРЬе	Ка	А1а	Агд	Ьуз	Α8η-Ο1η-ΝΗ₂
60	РЬе	СН₂-0	(рЫО₂)РЬ.е	Ка	А1а	Агд	Ьуз	Α8π-61ρ-ΝΗ₂
61	ΝρΗβ	СО-ΝΗ	РЬе	Рта	А1а	Агд	Ьуз	-νη₂
62	РЬе	СО-ΝΗ	(ρΝΟ₂)ΡΗβ	Ка	А1а	Агд	Ьуз	-νη₂
63	РЬе	0Η₂-ΝΗ	(ρΝΟ₂)Ρ1ιβ	Ка	А1а	Агд	Ьуз	-νη₂
64	РЬе	СН₂-0	(ρΝΟ₂)ΡΚε	Ка	А1а	Аг®	Ьуз	-νη₂
65	МрЬс	СО-ΝΗ	РЬе	Ка	А1Ь	Аге	Ьуз	Α5η-θ!η-ΝΗ2
66	РЬе	СО-ΝΗ	(ρΝΟ₂)Ρ1ιε	Ка	АЛ	Агд	Ьуз	Α3π-ΟΙη-ΝΗ₂
67	РЬе	СЩ-ΝΗ	(рНО₂)Рке	Ка	А1Ь	Агд	Ьуз	Α5η-Ο1η-ΝΗ₂
68	РЬе	СН₂-0	(ρΝΟ₂)ΡΗβ	Ка	АЛ	Агд	Ьуз	Α5η-61η-ΝΗ₂
69	ΝρΗε	СО-ΝΗ	РЬе	Ка	А1Ь	Агд	Ьуз	-ΝΗ₂
70	РЬе	СО-ΝΗ	(ρΝΟ₂)ΡΗε	Ка	АЛ	Агд	Ьуз	-νη₂
71	РЬе	СНг-ΝΗ	(ρΝΟ₂)Ρ1ιβ	Ка	А1Ь	Агд	Ьуз	-νη₂
72	РЬе	СН₂-0	(рКЮ₂)РЬе	Ка	А1Ь	Агд	Ьуз	-νη₂
73	ИрЬе	СО-ΝΗ	РЬе	АЛ	Ка	Аге	Ьуз	Ακη-ΟΙη-ΝΗτ
74	РЬе	СО-ΝΗ	(ρΝΟ₂)ΡΗε	АЛ	Ка	Агд	Ьуз	Λδη-ΟΙη-ΝΠ,
75	РЬе	СН₂-ЫН	(ρΝΟ₂)Ρ1ιβ	АЛ	Ка	Агд	Ьуз	Α5Π-αΐη-ΝΗ₂
76	РЬе	СН₂-О	(рЫО₂)РЬе	А1Ь	К а	Агд	Ьуз	АзпАИшМН»
77	КрЬе	СО-ΝΗ	РЬе	А1Ь	Ка	Агд	Ьуз	-νη₂
78	РЬе	СО-ΝΗ	(рИО₂)РЬе	АЛ	Ка	Агд	Ьуз	-νη₂
79	РЬе	СЩ-ΝΗ	(р\’О₂)РЬе	АЛ	Ка	Агд	Ьуз	-νη₂
80	РЬе	СН₂-О	(рКО>)РЬе	А1Ь	К а	Агд	Ьуз	-νη₂

- 3 011325

Среди этого даже более предпочтительными являются соединения, в которых ψ является СО-ΝΗ, или СНг-ΝΗ, или СН₂-О; Хаа¹ является РЬе или Νρΐιο: ХЬЬ⁴ является РЬе, или (рР)РЬе, или (ρΝΟ2)Ρ1κ; Хсс⁷ и Хбб являются А1а; 2-амино-2-метилпропионовой кислотой (А1Ь); 2-амино-2-метилмасляной кислотой (На); Xее¹⁴ является Агд; ХГГ¹⁵ является Бух; В является Αχη-Ο1η-ΝΗ2 или -ΝΗ₂, представленные следующими формулами:

a) Н-МрЬе-О1у-О1у-РЬе-Т11г-О1у-А1Ь-Аг2-Ьу5-8ег-А1а-Аг8-Су8-Ат8-Еу8-А8п-С1п-МН;;

b) Н-РЬе-С1у-О1у-(рР)Рйе-ТЬг-С1у-А1Ь-Аг£-Еуй-8ег-А1а-Аг§-Ьу5-Аг£-Еуз-А8п-С1п- νη₂

c) Н-РЬе-'1^г(СН2-МН)-С1у-61у-(рР)РЬе-Т11г-61у-А1Ь-Агй-Еу8-8ег-А1а-Аг§-Еу8-Ап'-

Ενχ-Αϊπ-ΟΙη-ΝΗι

б) Н-РЬе-У(СН2-О)-О1у-01у-(рР)РЬе-Тйг-О1у-А1Ь-Аг§-Еуй-8ег-А1а-Аг§-Еу8-Аг§-Еу5Α8η-61η-ΝΗ₂

е) Н-РЬе-О1у-С1у-(рНО₂)Р11е-Т}1г-О1у-А1Ь-Аг§-Еу5-8ег-А1а-Аге’Еу5-Агё-Еу5-А5ПΟ1η-ΝΗ₂

ί) Н-Р11е-'Р(СН₂-КН)-{';]у-С1у-(рГ']О2)Р11с-'ГЬг-('т]у-А1Ь-А.г2-1,уя-8ег-А1а-Аг8-1.уз-Аг2Εγ8-Α5η-Ο1η-ΝΗ₂ ₈) Н-РЬе-Ф(СН₂-О)-О1у-О1у-(рНО₂)РЬе-ТЬг-О1у-А1Ъ-Аг8-Еуз-8ег-А1а-Аг8-Еу5-Аг8Εγ3-Α8η-Ο1η-ΝΗ₂

Ь) Н-НрЬе-СИу-Сг1у-РЬе-'ТЪг-<л1у-А1Ь-Аг8-Еуз-8ег-А1а-Аг8-Еу8-Аг8-Еу8-Ь1Н2

1) Н-РЬе-Сг[у-Ст1у-|'рР)Р11е-Т11г-Ст1у-А1Ь-Аг2-Еу5-8ег-А1а-Аг8-Еу8-Аг8-Еуз-МН₂

I) Н-РЬе-Ф(СН2-МН)-О1у-О1у-(рГ)РЬе-Т11г-О1у-А1Ь-Аг8-Еу8-8ег-А1а-Аг8-Еу5-Аг8-

Буз-ЫН;»

т) Н-РЬе-'Р(СН₂-0)-О1у-О1у-(рР)РЬе-ТЬт-О1у-А1Ь-Аг8-Еу8-5ег-А1а-Аг8-Еу8-Аг8Еуз-ЫН₂

п) Н-Рке-С1у-С1у-(рМО₂)РЬе-Ткг-С]у-А1Ь-Аг8-Еу5-8ег-А1а-Аг8-Еу8-Аг£-Еу5-НН₂

о) Н-РЬе-¥(СН2-НН)-61у-61у-(рНО2)Рке-ТЬг-О1у-А1Ь-Аг8-Еу5-8ег-А1а-Ат8-Еуз-Аг8··

Еу.ч-ΝΤΕ

р) Н-Р11е-¹1фСН₂-0)-О1у-С11у-(рЬЮ₂)Р11.е-ТЬг-<31у-А1Ь-Аг8-Еу8-8ег-А1а-Аг£-Еу8-Аг8Еуз-ИН₂ аа) Н-НрЬе-С1у-С1у-РЬе-Т11г-С1у-А1Ь-Аг8-Еу8-8ег-А1Ь-Аг8-Еуз-Аг8-Еу8-А8п-О1пνη₂

ЬЬ) Н-РЬе-01у-О1у-(рР)Р11е-Т11г-6)у-А1Ь-Аг8-Бу5-8ег-А1Ь-Аг8-Еу5-Аг8-Еу5-А8п-61пνη₂ сс) Н-РЬе-Ф(СН₂-НН)-С1у-С1у-(рР)РЬе-Т11г-С1у-А1Ь-Аг§-Еу5-8ег-А1Ь-Аг8-Еу8-Аг8Еуз-А5п-СИп-Ь1Н₂ бб) Н-РЬе-^(СН₂-О)-С1у-О1у-(рР)РЬе-1Ъг-О1у-А1Ь-Аг8-Еу8-8ег-А1Ь-Аг8-Еу8-Аг8Бу з-Азп-ΟΙη-Ν Н₂ ее) Н-РЬе-О1у-61у-(рХО₂)РЬе-ТЬг-О1у-А1Ь-Аг§-Еу8-8ег-А1Ь-Аг8-Еу8-Аг8-Еу5-АзпΟ1η-ΝΗ₂

Я) Н-РЬс-'1^,(СН₂-МН)-С1у-Ст1у-(рНО2)РЬе-Т11г-С11у-А1Ь-Агц-Еуз-8ег-А1Ь-Аге-Еу5Аг§-Еуз-А5п-О1п-ХН₂

88) Н-Рйе-^(СН₂-О)-С1у-С1у-(рМО₂)Р11е-Т11г-С1у-А1Ь-Аг8-Еу5-8ег-А1Ъ-Аг£-Буз-Аг^Буз-Азл-СИп-ЬТЬ

Ы1) Н-МрЬе-С1у-С1у-РЬе-Тйг-О1у-А1Ь-Аг§-Еу5-8ег-А1Ъ-Аг£-Еу5-Аг§-Еу5-МН2

й)Н-РЬе-С1у-С1у-(рР)РЬе-Тйг-61у-А1Ь-Аг8-Еу5-8ег-А1Ь-Аг£-Еуз-Аг8-Еу5-НН₂

II) Н-РЬе-Ф(СН₂-МН)-С1у-С1у-(рР)Рйе-Т11г-С1у-А1Ъ-Аг8-Еуз-8ег-А1Ь-Аг8-Еу5-Аг8- 4 011325

ЕузА’Нг пип) Н-Рйе-Ф(СН₂-О)-С1у-<31у-(рР)Рке-Т1и-Сг1у-А1Ь-Аг£-Еу5-Зег-А1Ь-Аге-Еу8-Аг£Ьу5-ГЧН₂ пп) Н-РИе-61у-Ст1у-(рКО₂)Р11е-Т11г-О1у-А1Ъ-Аг2-Ьу5-8ег-А1Ъ-Аг§-Ьу5-Агд-Еуз-МН₂ оо) Н“Р11е-Т(СН₂-№1)-&1у-<}1у-(рНО₂)РИе-ТЬг-С||у-А1Ь-Агд-Еуъ-8сг-А|Ь-Аг«-1,укАге-Ьуз-ΝΗ;!

рр) Н-Р11с-Т(СН>-0)-01у-С1у-(рМ0₂)Рке-Ткг-С)1у-Л1Ь-Ап’-Еуз-8ег-А1Ь-Ат'ц-Еуя-Аг£Ьуз-ЫНг ааа) Н-Мр11е-Ст1у-СИу-Р!1с-Ткг-Ст1у-Л1Ь-/\г@-Еуз-8ег-1уа-Аг§,-Еуз-Аг§-Еуз-Азп-С11пΝΗ₂

ЬЬЬ) Н-РЬе-О1у-С1у-(рР)РИе-1Ъг-С1у-А1Ь-Агд-Ьу5-8ег-1уа'Агд-Ьу8-Агд-Еу8-Азп-С1пΝΗ₂ ссс) Н-РЬе-Ф(СН2-1Ш)-С1у-С}1у-(рГ)РЬе-ТЬг-СНу-А1Ь-Аг£-Ьу5-8ег-1уа-Аг§-Еу8-Аг§Ьуз-Азп-ОЬ-МНг бс1б) Н-РЬе-'Р(СН₂-О)-О1у-Ст1у-('рР)Р1|с-ТИ1'-С11у-Л1Ь-Лгд-Т,у$-8сг-1уа-Аг2-Т,у8-АгцЕуз-Азп-СИп-МРЕ еее) Р1-Р11е-С1у-О1у-(рЭО2)Ркс-ТЬг-01у-А1Ь-Аг§-Еуз-8ег-1уа-Аге-Еу:-:-Агу,-Еу$:-А8пΟΙη-ΝΗπ ίϊϊ) Н-РЬе-Ф(СН₂-МН)-С1у-61у-(рЫО₂)Рке-ТЬг-С1у-А|Ь-Агд-Еуз-8ег-1уа-Аг§-Еу8Аг^-Еуз-Азп-Сбп-АП-Е £££>) Н-Рке-^лР(С1-Е-О)-С1у-Сг1у-(рН0₂)Р11е-Т11г-С1у-А1Ь-Аг8-Еуз-5ег-1уа-Агд,-Еуз-Агд·· Еуз-АзП’СИп'МНт

ЬЫ1) Н-кр11с-<а1у-61у-Рке-'Г111'-С1у-А1Ь-Агц-Еуз-8сг-1уа-Агд-Еуз-Агц-1у'8-МН₂ ίϊί) Н-Р11е-Сг|у-Ст1у-(рР')Р11с-Т11г-С11у-А1Ь-Агц-Т.уя-8ег-1уа-Аг«;-Еу8-Агд-Еуз-НН₂

111) Н-РЪе-^(СН₂-ПН)-01у-01у-(рР)Рйе-Тйг-О1у-А1Ъ-Аг_ё-Еуз-8ег-1уа-Аг_ё-Еуз-Аг₈-

Еуз-НРр штт) РЕРЬе-Ф(СН₂-О)-С1у-СНу-(рР)Рйе-ТЬГ’(Э1у’А1Ь-Аг£-Еу5-8ег-1уа-Аг£-Еуз-Аг8Еуз-ΝΙΡ, ппп) Н-Р11е-С1у-С1у-(рПО₂)Рке-Т1юС4у-А1Ь-Агд-Еу5-8ег-1та-Аг£-Еу8-Аг(М-У8-КН:.

ооо) Н-Рке-4^г(СН2-МН)-О1у-61у-(рМО₂)РИе-ТЬг-а1у-А1Ь-Агё-Еуз-5ег-1уа-Аге-ЕузΑπζ-Ενδ-ΝίΕ ррр) Н-РЬе-Ф(СН2-О)-О1у-С1у-(рМО2)И1е-Т11г-О1у-А1Ь-Аг£-Еуз-8ег-!уа-Аг8-Еу5-Аг£Ьуз-МНз

Пептидные аналоги согласно изобретению могут быть синтезированы с помощью различных способов, известных из литературы, например 8сйгоебег е! а1. Тйе Рерйбез, νοί. 1, Асабет1с Ргезз, 1965; Вобапкхку е! а1. Рерббе 8уи1йе818, 1п1ег8с1еисе РиЬйзйег, 1966; Вагапу & МетПе1б. Тйе рерббез; Аиа1у818, 8уи1йе818, Вю1оду, 2, Асабетк Ргезз, 1980; Е. А!йегои & В.С. 8йеррагб, 8ойб Рйазе Рерйбе 8уи1йе818, 1ВЬ Ргезз а! ОхРогб Ипщегзйу Ргезз 1989; 1. 1опез, Тйе Сйетка1 8уи1йе818 оГ Рерйбез, С1агебои Ргезз, ОхРогб 1994. Эти способы включают синтез пептидов на твердой фазе или синтез пептидов в растворимой фазе, синтетические методы органической химии или любую комбинацию вышеупомянутых. Выбор плана синтеза, очевидно, зависит от состава данного пептида. Предпочтительно используются синтетические методы, основанные на соответствующих комбинациях твердофазного синтеза и классических способов в растворимой фазе, включая низкую себестоимость производства, особенно в промышленном масштабе. Подробно указанные методы включают:

ί) синтез в растворе фрагментов пептидной цепи последовательным сочетанием Ν-защищенных аминокислот, соответствующим образом активированных, с аминокислотой или С-защищенной пептидной цепью с выделением промежуточных продуктов, последующим селективным снятием защиты Ν- и С-терминальных концов указанных фрагментов и их повторным сочетанием до тех пор, пока не будет

- 5 011325 получен необходимый пептид. При необходимости боковые цепи являются незащищенными;

ίί) твердофазный синтез пептидной цепи от С-терминального конца к Ν-терминальному концу на нерастворимой полимерной подложке. Пептид убирается из смолы гидролизом с помощью безводной плавиковой кислоты или трифторуксусной кислоты с одновременным снятием защиты с боковых цепей.

В конце синтеза пептиды могут быть очищены и выделены обработкой подходящими растворителями и с помощью хроматографических методов, таких как высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ).

Пептидные аналоги согласно изобретению действуют на рецептор ΝΟΡ как: ί) полные агонисты, когда они представляют собой структуру [Ρ^ψΉΟ-ΝΗ^^²], ίί) частичные агонисты, когда они представляют собой структуру [ΡΗο'ψ(ΟΗ2-ΝΗ)01ν²| или [Рйе¹ ψ(ί.’Η2-Ο)61ν²|. и ίίί) чистые антагонисты, когда они представляют собой структуру ^рйе^(СО^Н)О1у²].

Кроме того, настоящее изобретение относится к фармацевтическим композициям, содержащим пептидные аналоги, описанные здесь, возможно в комбинации с фармацевтически приемлемыми переносчиками и эксципиентами. Композиции данного изобретения могут быть введены оральным или парентеральным путем или через респираторный, ректальный, интраспинальный, интратекальный, внутрипузырный или местный путь в качестве инъецируемого препарата, капсулы, таблетки, гранулы, раствора, суспензии, сиропа, суппозитория, назального спрея, крема, мази, геля, контролирующих высвобождение препарата или другого. Принципы и способы приготовления фармацевтической композиции хорошо известны специалистам в данной области и описаны, например, в РетшдЮп'х Рйагтасеи1тса1 8с1епсе8, 18(П Εάίίίοη, Маск РиЫщЫпд Сотрапу, Еайоп, Ра, 1990. Фармацевтические композиции согласно изобретению будут содержать эффективные количества пептидов (или их производных), как правило, содержащихся в пределах между 0,001 и 100 мг, предпочтительно между 0,01 и 10 мг. Ежедневные дозы будут изменяться в зависимости от типа патологии/дисфункции, возраста, пола и веса тела пациента, общего состояния здоровья и других переменных, которые необходимо оценить по обстоятельствам.

Учитывая профиль активности, показанный пептидами изобретения в биологических тестах, фармацевтические композиции, содержащие указанные пептиды, могут применяться для лечения дисфункций, условий или патологических состояний, включая неврологические и нейросенсорные дисфункции. Желательно получить сильную и длительную активацию рецептора ΝΟΡ для лечения страха, анорексии, гипертензии, тахикардии, расстройств задержки воды, гипонатриемии, застойной сердечной недостаточности, гладкомышечных двигательных дисфункций в желудочно-кишечном, респираторном и мочеполовом трактах (особенно недержания мочи, следующего за неврогенной дисфункцией мочевого пузыря), воспалительных состояний или периферического или спинального обезболивания, особенно для лечения хронической боли или даже более в контроле кашля. Кроме того, возможно использовать антагонисты для лечения памяти, настроения, двигательной активности (например, болезни Паркинсона), расстройств потребления пищи (например, булимии), или, более обобщенно, для лечения пациентов, страдающих ожирением. Высокая молекулярная масса этих соединений и присутствие среди них остатков, которые могут быть положительно заряжены при физиологическом значении рН, делают невероятным то, что они могут преодолевать гематоэнцефалический барьер. Указанные соединения могут оказывать центральное действие после местного введения, даже если они показывают преимущественно периферическое распределение. Например, агонистические соединения могут вызывать обезболивание на уровне центральной нервной системы после интратекального или интраспинального введения.

Экспериментальная часть

1. Пептидный синтез.

1.1. Общая схема синтеза.

Пептиды изобретения были получены твердофазным синтезом с использованием смолы 4-(2',4'-диметоксифенил-Етос-аминометилфеноксиацетамидонорлейцил-смолы (смола Ршк-Апибе МВНА). Етос аминокислоты (флуоренилметоксикарбонил) конденсировали с использованием [О-(7-азабензотриазол-1ил)-1,1,3,3-тетраметилурониумэкзафторфосфата] (ΗΑΤϋ) в качестве реактива для активации карбоксильной функции. Етос группы удаляли применением 20% пиперидина в ЭМЕ (диметилформамид) и смолу, связанную с защищенным пептидом, обрабатывали реактивом К для того, чтобы получить необработанный пептид. Соединения, содержащие модифицированную пептидную связь между первыми двумя аминокислотными остатками |Ρ1κ'ψ(ί.Ή₂-ΝΗ)ΟΚ²| или [Рйе^(СН2-О)О1у²], получали конденсацией Вос-Рйе-СНО на защищенном пептиде (2-17), или (2-16), или (2-15), связанном со смолой в течение последней стадии синтеза, таким образом восстанавливая ίη δίΐιι промежуточное имино-производное с ΝαΒΗ3ί.’Ν или конденсируя фрагмент Вос-[Рйе^(СН₂-О)О1у²]-ОН (который был получен следующими способами, сообщенными в литературе: Ва1Ьош е! а1., 1. Сйет. 8ос. Реткш Ттапк I, 1998, рд 1645-1651) на защищенном пептиде (3-17), или (3-16), или (3-15), связанном со смолой в течение последней стадии синтеза с использованием ΗΑΤϋ в качестве конденсирующего вещества.

Аналитический контроль как неочищенного, так и конечного продукта был сделан посредством аналитической высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) на приборе Весктапп БуЧет Со1б 168 с использованием колонки А111есй С-18 (150x4,6 мм, 5 мкм). Соединения проанализировали с

- 6 011325 применением бинарной элюирующей системы, состоящей из растворителя А: 35 мМ ЫаНгРОд (рН 2,1), и растворителя В: 59 мМ ЫаН₂РО₄ (рН 2,1)-ацетонитрил (60:40 об./об.), программируя градиент согласно физико-химическим свойствам анализируемых соединений, при скорости потока 1 мл/мин и при длине волны 220 нм. Нечищеный пептид очищали с использованием системы препаративной ВЭЖХ \Уа1сг Эс11а Ргер 4000 с колонкой радиального наполнения \Уа1сг ЭеИа-ЬС 40 мм (30x40 см, С18, 300 А, 15 мкм), которую элюировали той же подвижной фазой, которую использовали для аналитической ВЭЖХ, и с градиентом, программируемым согласно аналитическому профилю неочищенных продуктов реакции. Молекулярная масса конечного соединения была получена электрораспылительной масс-спектрометрией с применением ΖΜΌ2000 микромасс-спектрометра.

Для промежуточных соединений некоторых пептидов был выполнен спектроскопический анализ ЯМР ¹Н на приборе Вгикег 200 МГ ц.

1.2. Методика.

Пептидные аналоги Ь), с) и 6), описанные выше, были получены согласно методикам, описанным здесь ниже.

Смолу К1пк-Ат16е МВНА (0,65 ммоль/г, 0,2 г) обработали пиперидином (20%) в ΌΜΡ и конденсировали с Ртос-С1п(Тг1)-ОН, активируя карбоксильную функцию с НАТи. Следующие Ртос аминокислоты были последовательно соединены в удлиняющуюся пептидную цепь: Ртос-А§п(Тг1)-ОН, РтосЬу§(Вос)-ОН, Ртос-Агд(Ртс)-ОН, Ртос-Ьу8(Вос)-ОН, Ртос-Агд(Ртс)-ОН, Ртос-А1а-ОН, Ртос-8ег(1Ви)ОН, Ртос-Ьу8(Вос)-ОН, Ртос-Агд(Ртс)-ОН, Ртос-А1Ь-ОН, Ртос-С1у-ОН, Ртос-Тйг(1Ви)-ОН, Ртос(рР)Рйе-ОН, Ртос-С1у-ОН, Ртос-С1у-ОН, Ртос-Рйе-ОН. Все Ртос аминокислоты (4 экв.) были соединены в удлиняющуюся пептидную цепь с применением НАТИ (4 экв.) и диизопропилэтиламина (4 экв.) в ΌΜΓ; реакция сочетания была выполнена за 1 ч. Для того, чтобы оптимизировать выход синтеза и облегчить очистку соединений, требовалось двойное сочетание с ацилированием в течение 1 ч А1Ь остатка. Для удаления групп Ртос на каждой стадии использовали пиперидин (20%) в ΌΜΓ. После снятия защиты последней группы Να-Ртос пептидную смолу отмывали метанолом и высушивали под вакуумом, чтобы получить [(рР)Рйе⁴,А1Ь⁷,Агд¹⁴,Ьу8¹⁵]-№ОРР(1-17)-й1пк-Ат16е МВНА-защищенную смолу. Эту защищенную пептидную смолу обрабатывали реактивом К (ТРА/Н₂О/фенол/этандитиол/тиоанизол 82,5:5:5:2,5:5; об./об.; 10 мл/0,2 г смолы) в течение 1 ч при комнатной температуре. После фильтрования использованной смолы растворитель концентрировали под вакуумом и остаток поместили в эфир. Необработанный пептид очищали посредством предварительной ВЭЖХ с обращенной фазой и после лиофилизации получали белый порошок.

Синтез [Рйе¹ψ(СН2-NН)61у²,(рР)Рйе⁴,А^Ь⁷,А^д¹⁴,^у8¹⁵]-N/ОР^-NН2 (пептид с) выполняли, начиная с промежуточного соединения [(рР)Рйе⁴,А1Ь⁷,Агд¹⁴,Ьу8¹⁵]-№ОРР-(2-17)-смолы, синтезированного, как описано выше. Это промежуточное соединение (0,2 г, 0,65 ммоль/г, 0,13 ммоль) ресуспендировали и подвергали набуханию в метаноле, содержащем 1% (об./об.) уксусную кислоту (2 мл). Через 20 мин добавляли раствор, содержащий Вос-Рйе-СНО (0,065 г, 0,26 ммоль) и NаВНзСN (0,033 г, 0,52 ммоль), солюбилизированные в метаноле (0,8 мл), и реакционную смесь перемешивали в течение 1,5 ч. Затем смолу отмывали метанолом и обрабатывали реактивом К, как описано выше. Синтез [Рйе^(СН2-О)61у²,(рР)Рйе⁴,А1Ь⁷,Агд¹⁴, Гу5¹⁵^/ОЕО^Н2 (пептид 6) выполняли, начиная с промежуточного соединения [(рР)Рйе⁴,А1Ь⁷,Агд¹⁴, Ьу8¹⁵]-№ОРР(3-17)-смолы, синтезированного, как описано выше. Этот полупродукт (0,2 г, 0,65 ммоль/г, 0,13 ммоль) ацилировали на последней стадии Вос-Рйе^(СН₂-О)]61у-ОН (4 экв., 0,16 г, 0,52 ммоль), активируя карбоксильную функцию с помощью НАТИ при тех же самых условиях, описанных для нормальных стадий ацилирования. Впоследствии смолу отмывали метанолом и обрабатывали реактивом К, как описано выше.

2. Фармакологические тесты.

2.1. Материалы и методы.

Соединения были проверены ίη уйго на мембранах ооцитов хомяка, экспрессирующих человеческий рекомбинантный рецептор NОР (СНО^от) (эксперименты по связыванию с рецептором и эксперименты по стимуляции связывания СТРу8). и на уак беГегепх мыши после электрической стимуляции. Условия, использованные для изучения эффектов соединений в биологических экспериментах (уак беГегепк мыши), описаны у Вщош е1 а1. (Νηιιηνη 8сйт1ебеЬещ5 Агсй. Рйагтасо1. 359, 160-7, 1999), тогда как условия, использованные для изучения эффектов на СНО^от клетках, описаны у Мс Эопа1б е1 а1. (Νηιιηνη 8сйт1е6еЬещ5 Агсй. Рйагтасо1, 367, 183-187, 2003). В каждой серии экспериментов активность новых соединений сравнивали с активностью природных пептидов Ν/ОРО.

2.2. Результаты.

В экспериментах по связыванию с рецептором доказано, что все проверенные соединения полностью способны к замещению меченного тритием Ν/ОРО из человеческих рекомбинантных рецепторов NОР. Соединения показали очень разную аффинность к рецептору (рК₁) в зависимости от различных химических модификаций. Вообще, соединения со структурой [Рйе^(СО-КН)С1у²] показали более высокую аффинность, чем те, которые имеют структуру [Рйе^(СН₂-КН)С1у²], и чрезвычайно более высокую аффинность, чем имеющие структуру ^рйе^(СО-КН)С1у²]. Кроме того, соединения, имеющие комби

- 7 011325 нированные модификации [(рР)РДе⁴,А1Ь⁷,Агд¹⁴,Ьук¹⁵], показали аффинность больше, чем те, которые имеют единственные модификации.

В функциональных тестах со стимуляцией связывания СТР','8 и в тестах с ингибированием судороги, вызванной электрической стимуляцией уак беГегепк мыши, соединения, имеющие структуру [Рйе¹щ(СО-ИН)С1у²], повторяли эффекты Ν/Орр. и в частности вызывали похожие максимальные эффекты, следовательно, действовали как полные агонисты, тогда как соединения, имеющие структуру [Ρ^ψ^Η^ΝΗ)^^²], действовали как частичные агонисты, так как их максимальные эффекты были ниже, чем с Ν/ОРЦ. Наконец, соединения, имеющие структуру [Νρ^ψ^Ο-ΝΗ^^²], не вызывали какого-либо эффекта сами по себе, но действовали как конкурентные антагонисты Ν/ОРЦ.

Для упрощения, табл. 1 представляет результаты, полученные с соединениями [(рР)РЬе⁴,А1Ь⁷,Атд¹⁴, Ьук¹⁵]М/ОРО-МН2(иРР-112), [РЬеМСН2-МН)61у²,(рР)РЬе⁴,А1Ь⁷,Агё¹⁴,Ьук¹⁵]М/ОРО-МН2(иРР-113), [ЫрДе¹, А1Ь⁷,Агд¹⁴,Ьук¹⁵]Н/ОРР-МН₂(иРР-111) и с исходным пептидом Ν/Орр.

Таблица 1

Биологическая активность [(рР)РЬе⁴,А1Ь⁷,Агд¹⁴,Ьук¹⁵]М/ОРО-МН2 (ИРР-112), [РДе^(СН2НН)61у²,(рР)Рйе⁴,А1Ь⁷,Агё¹⁴,Ьук¹⁵]Н/ОРР-МН2 (ИРР-113), АрКе/АЕ 4дк '|\/(ОР0-\1 Р (ИРР-111) и исходного пептида Ν/ОРЦ

	Мембрана клеток СНОнмор	ϊ-ύιχ <1е/егеп8 мыши
	Связывание с рецептором	Стимуляция после связывания ОТР78	Ингибирование судороги, вызванной электрической стимуляцией
		Агонист	Антагонист	Агонист	Антагонист
	РК,	РЕС50	Е-спах	рАг	рЕСзо	Ещах	рА₂
Ν/ορς	9,50	9,04	100 ±9%	ΝΏ	7,39	-84±3%	Νϋ
ирр-112	10,55	10,55	118 ±9%	Νϋ	9,48	- 85 ± 2%	Νϋ
ирр-пз	10,26	9,72	79 ± 3%	Νϋ	Непостоянные агонистические эффекты	9,28
игр-ίίί	9,75	Неактивный	8,68	Неактивный	7,46

Результаты представляют собой среднее значение из 4-6 определений. ΝΌ: не определено, так как соединение дает агонистические эффекты.

Как подчеркнуто в табл. 1, соединение ИРР-113 ведет себя как частичный агонист рецептора ЫОР, вызывая максимальные эффекты, которые ниже, чем Ν/ОРр, и в анализе СТР'8, и в исследовании ингибирования судороги, вызванной электрической стимуляцией уак беГегепк мыши. Доказано, что ИРР-111 является прямым и сильным антагонистом, селективным для рецептора ЫОР. Анализ 8сЫ1б (выполненный и в экспериментах СТР','8, и на системе уак беГегепк мыши) показывает, что соединение действует как конкурентный антагонист рецептора ЫОР с величиной активности (выраженной как рА₂) 8,68 и 7,46, соответственно (см. табл. 1).

2.3. Селективность соединения ИРР-112.

Эффекты ИРР-112 опосредованы активацией рецептора ЫОР, как показано тем фактом, что действие данного пептида на уак беГегепк мыши не изменялось в присутствии налоксона (неселективного антагониста классических опиоидных рецепторов, но не рецептора ЫОР), но, оказывается, эффективно антагонизировалось посредством ИРР-101, который является селективным антагонистом рецептора ЫОР ([Nρйе¹,А^д¹⁴,^ук¹⁵]N/ΟР^-NΗ₂, Са1о е! а1., Вг. 1. РДаттасоР 136, 303-311, 2002). ИРР-101, использованный в конкуренции с ИРР-112, показал значение силы (рА₂ 6,81), сходное с полученным, когда он использовался в конкуренции с эндогенным агонистом Ν/ОРЦ (рА₂ 6,91). Это показывает, что 3 молекулы (Ν/ОРО, ИРР-112 и ИРР-101) взаимодействуют с одним и тем же рецептором: рецептором ЫОР. Затем, это показано результатами, полученными на тканях нокаутной мыши (КеГ. №кЫ, М. е! а1., иптекДашеб посюерДуе гекропке апб б1кгеди1аДоп оГ йеагпщ аЬШ1у ш ш1се 1аскшд 1Де посюерДп/отрДашпРО тесер!от. ЕтЬо. 1. 16 (8): 1858-64, 1997) по гену рецептора ЫОР (ЫОР^-/-) (см. табл. 2).

Таблица 2

Эффекты агониста Ν/ОРО и ИРР112 и агониста ИОР, О-Реп²,О-Реп⁵энкефалина (ОРОРЕ) на уак беГегепк дикого типа (ЫОР^+/+) и нокаутной мыши по рецептору ЫОР (ЫОР^-/-)

	ΝΟΡ ^+/+	ΝΟΡ
Соединение	рЕС5о	Етах	рЕС$о 1 Е_тах
Ν/ΟΡΟ	7,47	84±4%	<6 -
ирр-112	8,94	93±3%	<6 -
ОРОРЕ	8,40	93±3%	8,20 \| 91 ±5%

Ингибирующее действие на сокращение, вызванное электрической стимуляцией, вызываемое ИРР112 (сходное с тем, которое найдено с Ν/ОРО), исчезало в уак беГегепк, выделенных из мыши ЫОР^-/-, подтверждая, что биологические действия ИРР-112 существуют только вследствие взаимодействия с рецептором ЫОР.

Соединение [О-Реп²,О-Реп⁵]энкефалин, ОРОРЕ (КеГ. ЫГе 8сГ 1983; 33 8ирр1. 1: 447-50), селектив

- 8 011325 ный агонист ΌΟΡ, использовали в качестве положительного контроля. Этот контроль показывает, какие ткани, полученные от нокаутной мыши по рецептору ΝΟΡ, нормально реагируют на ингибирующий стимул, который не использует рецептор ΝΟΡ.

2.4. Фармакологические тесты на селективность соединений согласно изобретению.

Соединения были проверены ίη νίίτο на мембранах ооцитов хомяка (СНО), экспрессирующих человеческий рекомбинантный рецептор ΝΟΡ (СНО_№ОР), как в параграфе 2.1, согласно Ме Ωοιηιΐά οί а1. (Ναιιηνη 8сйш1ебеЬегд8 Лгей. Ρΐιαηηαοοί. 367, 183-187, 2003).

Исследования на селективность этих соединений для рецептора ΝΟΡ были выполнены посредством исследований рецепторного связывания на мембранах клеток СНО, трансфицированных человеческими рекомбинантными опиоидными рецепторами мю (МОР), дельта (ΌΟΡ) и каппа (ΚΟΡ) типов, с использованием того же самого метода, как для ΟΗΟ_ΡΝΟΡ. Исследования селективности были выполнены посредством конкурентных экспериментов согласно методам, описанным у Мс Ωοηαίά еί а1. (Ναιιηνη §сйш1ебеЬегд8 Агс11. Ρ1ι;·ιπη;·κο1. 367, 183-187, 2003). Чтобы измерить ρΚ₁ для Ν/ΟΡΟ, в качестве радиолиганда был использован меченный тритием Ν/ΟΡΟ, тогда как [³Н]-дипренорфин был использован для классических опиоидных рецепторов. Активность новых соединений сравнили с активностью природного пептида Ν/ΟΡρ.

В экспериментах по рецепторному связыванию, выполненному на мембранах трансфицированных клеток СНО, υΡΡ-111, υΡΡ-112 и υΡΡ-113 показали более высокую селективность (>100 раз) для рецептора ΝΟΡ, чем рецепторов МОР, ΚΟΡ и ΌΟΡ (см. табл. 3).

Таблица 3

Аффинность (ρΚ₁) υΡΡ-112, υΡΡ-113 и υΡΡ-111 для рецепторов ΝΟΡ, ΜΟΡ, ΌΟΡ и ΚΟΡ, трансфицированных в клетки СНО (ВеГ. Мс Όοηη1ά еί а1. (Маииуи ЗсйштебеЬегдк Агсй. ΡΗα^α^Ι. 367, 183-187, 2003)

		рк,
Рецепторы (стандартные лиганды, использованные на один рецептор)	ΝΟΡ (Ν/ОГр)'	МОР (ΌΑΜΟΟ)²'³	ΌΟΡ (Иа11ппбо1е)³	КОР (Νογ-ΒΝΙ)³
Стандартные лиганды	9,50	8,43	9,97	9,90
СРР-172	10,55	7,13	6,37	8,36
ирр-из	10,26	6,45	5,69	7,55
ирр-111	7,75	<5,0	<5,0	6,17

Данные представляют собой среднее значение 4 экспериментов.

¹ В качестве меченного тритием лиганда использовали [³Η]Ν/ΟΡρ.

² ΌΑΜΟΟ означает [^-Α1а(2),N-ΜеΡие(4),61у-ο1(5)]энкефалин.

³ В качестве меченного тритием лиганда использовали [³Н]дипренорфин.

3. Исследования эффективности ίη νίνο полного агониста соединения υΡΡ-112.

Соединение υΡΡ-112, которое является полным агонистом, было протестировано на мыши ίη νίνο в различных исследованиях:

1) тест на отдергивание хвоста согласно экспериментальным протоколам, описанным в Ο;·ι1ο еί а1., (Вг. 1. Ρ1κιπικκο1. 125, 373-378, 1998) апб Κίζζί еί а1. (С1ш. ΡΙκιοι-π-κοΡ 18, 56, 2004);

2) измерение потребления пищи у сытых животных, как описано Κίζζί еί а1. (Nа^ί^οηа1 Οοη§ΐΌ55 οί 1йе Iίа1^аи §οс^еίу οί Nеи^ο8с^еисе аЫ (οίηΐ Iίа1^аи-§чеά^8Й Nеи^ο8с^еисе Мее1шд§, 15с1па (ΝηροΚ) 1-4 ΟΛο^γ 2005);

3) тест для измерения спонтанной двигательной активности, как описано Κίζζί еί а1. (№шпуп 8сйш1ебеЬегд8 Агсй. Ρ1κιπικκο1. 363, 161-165, 2001.

В каждом исследовании активности υΡΡ-112 и Ν/ΟΡΡ были измерены как эквиэффективные дозы. Так как υΡΡ-112 показывает активность выше приблизительно в 100 раз, пептид υΡΡ-112 использовали в дозах, содержащихся в интервале между 0,001 и 0,1 нмоль, и Ν/ΟΡΡ использовали в дозах, содержащихся в интервале между 0,1 и 10 нмоль.

В аналгезиометрическом тесте на отдергивание хвоста у мышей υΡΡ-112 в эквиэффективных дозах повторяет эффекты природного лиганда Ν/ΟΡΡ, хотя он показывает свое действие в течение более длительного периода (>120 мин).

υΡΡ-112 в интервале доз между 0,001-0,1 нмоль вызывает проноцицептивные эффекты, если вводится через интрацеребровентрикулярный (и.ц.в.) путь, тогда как он вызывает антиноцицептивные эффекты при введении интратекально (и.т.) (см. фиг. 1). Указанные эффекты (сходные с теми, которые най- 9 011325 дены с Ν/ΟΕΟ) опосредуются активацией рецептора ΝΟΡ, так как они отсутствуют у ΝΟΡ^-/- мышей.

Ν/ΟΕΟ и υΕΡ-112 в эквиэффективных дозах были проверены в тесте на потребление пищи накормленными животными. Оба соединения вызывали значительное увеличение потребления пищи, и также в данных анализах доказано, что ИЕР-112 является в 100 раз более сильным, чем Ν/ΟΕΟ. В этом тесте гиперфагические эффекты Ν/ΟΕΟ и ИЕР-112 существуют исключительно благодаря активации рецептора ΝΟΡ, потому что такие эффекты присутствуют у ΝΟΡ^+/+ мышей, но отсутствуют у ΝΟΡ^-/- мышей.

Для того, чтобы исследовать продолжительность действия υΕΡ-112 ίη νίνο, были выполнены эксперименты на мышах, которые сравнили с продолжительностью (от 17 ч 30 мин до 7 ч 30 мин следующего дня) эффекта эквиэффективных доз Ν/ΟΕΟ (10 нмоль) и υΕΡ-112 (0,1 нмоль), при введении обоих соединений и.ц.в., на спонтанную двигательную активность. Оба пептида ингибировали двигательную активность, но эффект Ν/ΟΕΟ заканчивался через 60 мин после и.ц.в. инъекции, тогда как эффект, вызванный υΕΡ-112, заканчивался после приблизительно 6 ч (см. фиг. 2).

4. Метаболическая стабильность Ν/ΟΕΟ и новых производных соединений υΕΡ-111, υΕΡ-112 и υΕΡ-113 в гомогенатах мозга и в плазме.

Образцы плазмы и ткани мозга были получены от самцов мышей 8^188 (Μοτίηί, Веддю Ειηίΐία. Иа1у, 25-30 г). Животное, умерщвленное с помощью анестезии эфиром, перфузировали физиологическим раствором гепарина, введенного через иглу, помещенную в левый желудочек. Затем кровь извлекали и центрифугировали при 14000/д в течение 2 мин при комнатной температуре. После отделения от осадка отбирали аликвоты плазмы и хранили при -80°С. После изъятия крови животное далее перфузировали с физиологическим раствором в течение 2 мин перед выемкой мозга. Ткань мозга гомогенизировали в 5 объемах (в./об.) ТП8/НС1 (50 мМ, рН 7,4, 0°С) с ультра-Тиггах Цапке Кипке1, 81аи£еп, ΕΚ.6) 3 раза в течение 15 с каждый. Супернатант, полученный центрифугированием (3000/д в течение 15 мин при 4°С), сливали и затем хранили при -80°С.

Содержание белка в препаратах, определенное способом Брэдфорд, как описано в Апа1. Вюсйеш., 72, 248-254, 1976, было приблизительно 8 мкг/мкл для гомогената мозга и 17 мкг/мкл для плазмы.

Аликвоту 100 мкл раствора каждого пептида (3 мг/500 мкл Тп8) инкубировали (при конечной концентрации 6 мкг/мкл) с гомогенатом мозга или плазмой (450 мкл) в общем объеме 1 мл, содержащем буфер ТП8/НС1 50 мМ рН 7,4. Инкубацию аликвот выполняли при 37°С в течение различных периодов вплоть до 240 мин. В различные периоды инкубации отбирали аликвоту раствора (100 мкл), а деградацию блокировали добавлением 4,5% ΊΤΆ раствора (200 мкл). После центрифугирования (3000 об./мин в течение 15 мин) аликвоту (100 мкл) супернатанта вводили в хроматограф ВЭЖХ с обращенной фазой. Анализ ВЭЖХ был выполнен на колонке Кгоша811 100-5С18 (4,6/250 мм) с использованием хроматографической системы Весктап 8у81еш Со1Т оснащенной УФ-детектором с переменной длиной волны.

Экспериментальные условия для элюирования включали градиентный анализ с водой (растворитель А) и ацетонитрилом (растворитель В), оба содержащие 0,1% ТΕА, при скорости потока 0,7 мл/мин. Следующий протокол был использован для градиентного анализа, выбранного на основе физико-химических характеристик аналита: линейный градиент от 5 до 40% В за 20 мин; линейный градиент от 40 до 60% В за 5 мин; линейный градиент от 60 до 5% В за 5 мин. Элюат проверяли при 220 нм. Период полувыведения (Т_1/2) получили посредством линейной регрессии по методу наименьших квадратов, изображая на диаграммах площади пиков каждого производного как функцию времен инкубации, с использованием по меньшей мере 5 точек для каждого анализа.

Данные показаны в табл. 4 как среднее ± стандартное отклонение и получены по меньшей мере из 3 отдельных экспериментов.

Таблица 4

Т_1/2 (мин) Ν/ΟΕΟ и производных в плазме и ткани мозга мыши

	Плазма	Мозг
Ν/ΟΡ0	64 ± 1	3,2 ± 1,8
игр-ш	137±4	11,0± 1,9
игр-иг	167 ±9	11,3 ± 1,4
ЦРР-113	110 ± 10	12,3 ± 0,8

Ν/ΟΕΟ показал полупериод выведения из плазмы около 1 ч, который очень отличался от полупериода выведения, полученного с гомогенатом мозга, который составлял около 3 мин. Все исследованные пептиды согласно изобретению показали значительно более длинный период полувыведения по сравнению с природным пептидом. В частности, плазменный Т_1/2 υΕΡ-111 и υΕΡ-113 приблизительно вдвое длиннее, чем Ν/ΟΕΟ, тогда как Т_1/2 υΕΡ-112 почти в 3 раза длиннее, чем Ν/ΟΕΟ.

Более длинные полупериоды выведения, показанные производными, по сравнению с Ν/ΟΕΟ были более выражены в гомогенате мозга, чем в плазме. Фактически, Т_1/2 всех производных были более чем в 3 раза длиннее, чем значение, показанное Ν/ΟΕΟ (3 мин) в ткани мозга.

Эти данные показали, что химические модификации последовательностей υΕΡ-111, 112 и 113 уве

- 10 011325 личивают их активность как агонистов или антагонистов по сравнению с Ν/ΟΡΡ: такие модификации изменяют их эффективность на рецептор ΝΟΡ и определяют значительное уменьшение чувствительности к деградации пептидазами, присутствующими и в плазме и в ткани мозга. Эта важная характеристика является, безусловно, определяющей в пролонгировании действия данных молекул ίη νίνο, как хорошо показано для ИРР-112 в серии экспериментов, суммированных в разделе 3 (исследования ίη νίνο).

5. Кинетика ингибирующего эффекта ИРР-112 на ναδ бсГсгсщ мыши.

При электрическом стимулировании ναδ бсГсгсщ мыши как кинетика действия ИРР-112, так и обратимость эффектов после отмывки были намного медленнее, чем с Ν/ΟΡΡ (см. фиг. 3). Это было показано посредством ингибирующего эффекта на сокращение ναδ бсГсгсщ. вызванное электрической стимуляцией. Вместе с данными метаболической стабильности это может объяснить более длительное действие ίη νίνο ИРР-112 по сравнению с эндогенным лигандом Ν/ΟΡρ.

6. Биологическая активность некоторых соединений формулы I у мыши ναδ бсГсгсщ после электрической стимуляции.

Табл. 5 суммирует результаты, полученные на ναδ бсГсгсщ мыши после электрической стимуляции, в присутствии серии соединений формулы I, несущих различные химические модификации в положении 7 и 11, модели агониста Ν/ΟΡΡ-ΝΗ₂. Эти данные показывают, что различные аминокислотные замещения не изменяют эффективность соединений, которые действуют как полные агонисты, но в некоторых случаях (например, |Λο₅ο^ιι|Ν/ΟΡΡ-ΝΗ2 и |Ο/Ρ-Ινα^ιι|Ν/ΟΡΡ-ΝΗ2) увеличивают активность по сравнению с исходной последовательностью. Следует заметить, что увеличение активности, полученное как результат этих отдельных модификаций (в 2 раза по сравнению с исходной последовательностью), ниже, чем увеличение активности, полученной в результате комбинированной модификации в различных положениях, как в соединении ИРР-112 (табл. 1), активность которого возрастает более чем в 100 раз.

Таблица 5

Активность ряда соединений с общей формулой I, полученных с различными химическими модификациями в положении 7 и 11, при измерении на ναδ беГетепз мыши при электрической стимуляции

Соединение ^{р 50} Е_тах «X 95%)

Ν/ΟΡΡ-ΝΗ2	7.80 (7.74-7.86)	93 ± 2%
[Αο₃ο⁷]Ν/ΟΡς-ΝΗ2	7.08 (6.82-7.34)	98 ± 1%
[Αο₅ο⁷]Ν/ΟΡΡ-ΝΗ2	7.60 (7.40-7.80)	98 ± 1%
[Αο₆ε⁷]Ν/ΟΡρ-ΝΗ2	7.20 (6.86-7.54)	87 ± 1%
[(«Ме)П/Т.-Уа1⁷]Н/РРр-Ь’Н₂ (диастереомер 1)	7.26 (7.00-7.52)	88 ± 1%
[(оМе)О/Б-УаГ]№ОРр-РШ₂ (диастереомер 2)	7.56 (7.34-7.78)	95 ± 1%
[(оМе)О/Б-Беи⁷]№ОРр-МН₂ (диастереомер 1)	7.33 (7.04-7.62)	84 ± 1%
[(йМе)О/Б-Беи⁷]№Орр-МН₂ (диастереомер 2)	7.12 (7.02-7.22)	95 ± 2%
[1уа⁷ \|Ν/ΟΡρ-ΝΗ₂ (диастереомер 1)	7.83 (7.74-7.92)	91 ± 4%
[1уа⁷ \|Ν/ΟΓζ)-ΝΗ₂ (диастереомер 2)	7.62 (7.32-7.92)	88 ± 3%
[Οε₈ ⁷]Ν/ΟΓΟ-ΝΗ2	7.91 (7.53-8.27)	89 ± 2%
[Ορ§⁷]Ν/ΟΡΡ-ΝΗ2	7.90(7.71-8.11)	91 ±4%
[Αο₃ο^π]Ν/ΟΡΟ-ΝΗ2	7.78 (7.62-7.94)	91 ± 4%
[Αα₅ΰ¹¹]Ν/ΟΡρ-ΝΗ2	8.08 (7.93-8.23)	89 ± 4%
[Αο₆ο^Η]Ν/ΟΡΡ-ΝΗ2	7.79 (7.53-8.05)	89 ±4%
[(йМе)И/Б-Уа1^н]М/ОРр-ЫН₂ (диастереомер 1)	7.71 (7.37-8.05)	93 ± 2%
[(сА^О/Ь-УаР^И/ОРр-ИНг (диастереомер 2)	7.83 (7.67-7.99)	86 ± 4%
((оМрО/Е-Беи¹ ‘]Ν/ΟΡΡ-ΝΗ₂	7.87 (7.67-8.07)	91 ± 4%
[Ο/Ε-ΙνΗ^Π]Ν/ΟΡΡ-ΝΗ₂	8.12(7.78-8.46)	90 ±4%
[Ое_Е ^и1К/ОГр-И112	7.75 (7.43-7.89)	87 ± 4%
[Ορ₈ ^,1]Ν/ΟΡρ-ΝΗ2	7.53 (7.17-8.04)	86 ± 3%

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Пептид, имеющий общую формулу (I)

Хаа¹-(('-О1у²-О1у³-ХЬЬ‘^,-ТЬг⁵-О1у⁰-Хсс⁷-Агё^£-Ьу5⁹-8ег^|0-Хаа¹¹-Аг§¹²-Еуз¹³-Хее¹⁴-ХП¹⁵-К (I) в которой

Хаа¹ выбран из группы, состоящей из РЬе или Ν-бензил-глицина (ИрЬе);

ψ представляет собой связь между первыми двумя аминокислотными остатками и выбрана из группы, состоящей из ΟΟ-ΝΗ, и ΟΗ₂-ΝΗ, и СН₂-О;

ХЬЬ⁴ является РЬе или рХРЬе, где X выбран из группы, состоящей из Н, С1, Вг, I, Ρ, ΝΟ₂ и ΟΝ и

- 11 011325 р показывает пара-положение в фенильном кольце РЬе;

Хсс⁷ выбран из группы, состоящей из 2-амино-2-метилпропионовой кислоты (А1Ь); 2-амино-2-метилмасляной кислоты (На); 2-амино-2-этилмасляной кислоты (Эед); 2-амино-2-пропилпентановой кислоты (Орд); (СаСН₃)Ьеи; (СаСН₃)Уа1; 1-аминоциклопропанкарбоновой кислоты (Ас₃с); 1-аминоциклопентанкарбоновой кислоты (Ас₅с) и 1-аминоциклогексанкарбоновой кислоты (Ас₆с);

Χάά¹¹ выбран из группы, состоящей из А1а; 2-амино-2-метилпропионовой кислоты (А1Ь); 2-амино-2метилмасляной кислоты (Яа); 2-амино-2-этилмасляной кислоты (Эед); 2-амино-2-пропилпентановой кислоты (Орд); (СаСН₃)Ьеи; (СаСН₃)Уа1; 1-аминоциклопропанкарбоновой кислоты (Ас₃с); 1-аминоциклопентанкарбоновой кислоты (Ас₅с) и 1-аминоциклогексанкарбоновой кислоты (Ас₆с);

Хее¹⁴ и XII¹⁵ выбраны из группы, состоящей из Агд; Ьук; От; отоАгд; диаминомасляной кислоты; диаминопропионовой кислоты и Тгр;

Я представляет собой дипептид А8и-С1и-ХН₂ или А8п-О1и-ОН или аминокислоту Аки или с амидо (-НН₂), или с карбоксильной (-ОН) терминальной группой или амино (-ХН₂) или гидроксильной (-ОН) терминальной группой;

и его фармацевтически приемлемые соли.

2. Пептид по п.1, выбранный из группы, состоящей из

Хаа¹ Ψ хьь⁴ Хсс' хаа¹^ Хее'¹ ХИ¹²’ К 1 ИрЬе СО-ΝΗ РЬе Ай А1а Аг§ ЬуЗ Α3η-Ο1η-ΝΗ₂ 2 РЬе СО-ΝΗ (рР)РЬе Ай А1а Агв Ьуз Азп-С!1п-ЫН> 3 Рке СН-ΝΗ (рР)РЬе А1Ь А1а Агв Ьуз Α3Π-61η-ΝΗ₂ 4 РЬе СН₂-0 (рР)РЬе А1Ь А1а Агв Ьуз Α3η-61η-ΝΗ₂ 5 ΝρΗε СО-ΝΗ РЬе А1Ь А1а Агв Ьуз -νη₂ 6 РЬе СО-ΝΗ (рР)РЬе А1Ь А1а Агя Ьуз -νη₂ 7 РЬе СЩ-ΝΗ (рР)РЬе Ай А1а Агд Ьуз -νη₂ 8 РЬе СН₂-О (рР)РЬе Ай А1а Агв Ьуз -νη₂ 9 Ирке СО-ΝΗ РЬе Αίό А1Ь Агд Ьуз Α3π-61π-ΝΗ₂ 10 РЬе СО-ΝΗ (рР)РЬе Ай Ай Аг§ Ьуз Α3ΐι-αΐη-ΝΗ₂ 11 РЬе οη₂-νη (рР)РЬе Ай Ай Агв Ьуз Α3η-Οίη-ΝΗ2 12 РЬе СН1-0 (рР)РЬе Ай А1Ь Агв Ьуз Α3η-Ο1η-ΝΗ₂ 13 ΝρΙιβ СО-ΝΗ РЬе Ай Ай Аг£ Ьуз -νη₂ 14 РЬе СО-ΝΗ (рР)РЬе Ай Ай АГ£ Ьуз -νη₂ 15 РЬе СНз-ΝΗ (рЕ)РЬе Ай Ай Агк Ьуз -νη₂ 16 РЬе СН₂-О (рР)РЬе Ай Ай Аг§ Ьуз -νη₂ 17 ЫрЬе СО-ΝΗ РЬе На А1а Аг£ Ьуз Α3η-Ο1η-ΝΗ₂ 18 РЬе СО-ΝΗ (рр)РЬе [са А1а Агд Ьуз Αμι-ΟΙπ-ΝΗ? 19 РЬе ΟΗ₂-ΝΗ (рР)РЬе На А1а Агд Ьуз Ακη-ΟΙη-ΝΙΗ 20 РЬе СН₂-0 (рР)РЬе Па А1а Агд Ьуз Α8η-Ο1η-ΝΗ₂ 21 Ырке СО-ΝΗ РЬе Ка А1а Ьуз -νη₂ 22 РЬе СО-ΝΗ (рР)РЬе 1са А1а Агв Ьуз -νη₂ 23 РЬе ΟΗ₂-ΝΗ (рР)РЬе Ка А1а Агв Ьуз -νη₂ 24 РЬе СН₂-0 (рЕ)Рке 1уа А1а Агв Ьуз -νη₂ 25 КрЬе СО-ΝΗ РЬе Ка А1Ъ Агв Ьуз Αδη-Ο1η-ΝΗ₂ 26 РЬе СО-ΝΗ (рР)РЬе Ка Ай Аг§ Ьуз Азп-СНп-МНг 27 РЬе СНг-ΝΗ (рР)РЬе ка А1Ь Агв Ьуз Α3π-ΟΙπ-ΝΗ₂ 28 РЬе СН₂-0 (рГ)РЬе На А1Ъ Аг§ Ьуз Α3η-Ο!η-ΝΗ₂ 29 ΝρΗβ СО-ΝΗ РЬе На Ай Агв Ьуз -νη₂ 30 РЬе СО-ΝΗ (рР)РЬе На Ай Аг® Ьуз -νη₂ 31 РЬе СНг-ΝΗ (рР)РЬе ка А1Ь Агд Ьуз -νη₂ 32 РЬе СН₂-0 (рР)РЬе ка Ай Аг§ Ьуз -νη₂ 33 ΝρΗβ СО-ΝΗ РЬе А1Ь На Аг₈ Ьуз Азп-О1п-НН₂ 34 РЬе СО-ΝΗ (рГ)РЬе АЗЬ На Агв Ьуз Αδη-Ο1η-ΝΗ₂ 35 РЬе ΟΗ₂-ΝΗ (рР)РЬе А5Ь ка Агв Ьуз Αδη-ΟΙη-ΝΗί 36 РЬе СН₂-0 (рР)РЬе А1Ь На Агв Ьуз Α5η-Ο1η-ΝΗ₂ 37 1ЧрЬе СО-ΝΗ РЬе Ай ка Аг§ Ьуз -νη₂ 38 РЬе СО-ΝΗ (рР)РЬе Ай ка Агв Ьуз -νη₂ 39 РЬе СНз-ΝΗ (рР)РЬе Ай ка Агв Ьуз -νη₂ 40 РЬе СН₂-О (рР)РЬе Ай На Агв Ьуз -νη₂ 41 Ирке СО-ΝΗ РЬе Ай А1а Агв Ьуз Α$η-Ο1η-ΝΗ₂ 42 РЬе СО-ΝΗ (ρΝΟ₂)ΡΗε А1Ь А1а Агв Ьуз Αϊη-ΟΙη-ΝΠ, 43 РЬе ΟΗ₂-ΝΗ (рКОдРкс Ай А1а Агв Ьуз Α5η-Ο1η-ΝΗ₂ 44 РЬе СН₂-О ίρΝΟ_:.)ΡΙιβ Ай А1а Агв Ьуз Α3Π-Ο1η-ΝΗ₂ 45 ΝρΚε СО-ΝΗ РЬе Ай А1а Агв Ьуз -νη₂ 46 РЬе СО-ΝΗ (рЫОг)РЬе Ай А1а Аг§ Ьуз -νη₂ 47 РЬе СНг-ΝΗ (рЖ)₂)РЬе Ай А1а Аг® Ьуз -νη₂ 48 РЬе СН₂-0 (ρΝΟ₂)ΡΗε ΑίΒ А1а Агв Ьуз -νη₂ 49 Νρίκ СО-ΝΗ РЬе Ай Ай Агв Ьуз Αδη-Ο1η-ΝΗ₂ 50 РЬе СО-ΝΗ (рЫО2)РЬе Ай Ай Агв Ьуз Αδη-Ο1η-ΝΗ₂ 51 РЬе СНг-ΝΗ (рИО₂)РЬе Ай Ай Аг§ Ьу5 Азп-ΟΙπ-ΝΙ1₂ 52 РЬе СН₂-0 (рИО₂)РЬе Ай А1Ь Агв Ьуз Азп-СИп-ЫНг 53 ΝρΗε СО-ΝΗ РЬе Ай Ай Агв Ьу5 -νη₂ 54 РЬе СО-ΝΗ (рКСуРке Ай Ай Аг§ Ьуз -νη₂ 55 РЬе СН₂-ИН (рНОг)РЬе Ай Ай Агв Ьуз -νη₂ 56 РЬе СН₂-0 (ρΝΟ₂)Ρ1ιε А1Ъ Ай Агв Ьуз -νη₂ 57 Νρΐιε СО-ΝΗ РЬе ка А1а Агв Ьуз Αδη-ΟΙη-ΝΗί

- 12 011325

58 РЬе СО-ΝΗ (рМОДРЬе Ка А1а Лгц Ьуз Α3η-Ο1η-ΝΗ₂ 59 РЬе сн₂-ин 1рМО₂)РЬе Ιν<ι А1а Аг» Ьуз Α3η-Ο1η-ΝΗ₂ 60 РЬе СН₂-О ГрК'ОдРЬе Ка А1а Ага Ьуз Αδη-ΘΙη-ΝΗζ 61 ΝρΗβ СО-ΝΗ РЬе Ка А1а Ага Ьуз -νη₂ 62 РЬе СО-ΝΗ (рЫОг)РЬе Ка А1а Ага Ьуз -νη₂ 63 РЬе СНг-ΝΗ (рЫО₂)РЬе Ьа А1а Ага Ьуз -νη₂ 64 РЬе СН₂-О (рКОдРНе Ка А1а Аг§ [.уз -νη₂ 65 ИрЬе СО-ΝΗ РЬе 1уа АЛ Ага Ьуз Азп-ΟΙιι-ΝΗί 66 РЬе СО-ΝΗ (рХО₂)РЬе Руа АЛ Ага Ьуз Α5η-Ο1η-ΝΗ₂ 67 РЬе СНг-ΝΗ (рЧО₂)РЬе Ка А1Ь Аг§ Ьуз Луп-СИп-ЖЬ 68 РЬе СН₂-О (ρΝΟ₂)Ρ№ Ка А1Ь Аг§ Ьуз Α3η-Ο1η-ΝΗ₂ 69 ИрЬе СО-ΝΗ РЬе Ка А1Ь Ага Ьуз -νη₂ 70 РЬе СО-ΝΗ (рЫО₂)РЬе Ка А1Ь Ага Ьуз -νη₂ 71 РЬе СНг-ΝΗ (рЫО_г)РЬе Ка А1Ь Агд Ьуз -νη₂ 72 РЬе СН_г-О (рКО_г)РЬе Рта АЛ Ага Ьуз -νη₂ 73 ЫрЬе СО-ΝΗ РЬе АЛ Ιν.τ Ага Ьуз Азп-ίΛι-ΝΠ? 74 РЬе СО-ΝΗ (рМОг)РЬе АЛ Гта Ага Ьуз Α$η-<31η-ΝΗ2 75 РЬе СНг-ΝΗ (рЫО₂)РЬе АЛ Ка Аг§ Ьуз Αίη-ίίΙπ-ΝΗι 76 РЬе СН₂-О (рЫОг)РЬе АЛ Ка Ага Ьуз Α3η-Ο1η-ΝΗ₂ 77 ЫрЬс СО-ΝΗ РЬе А1Ь К а Ага Ьуз -νη₂ 78 РЬе СО-ΝΗ (рМОдРЬе АЛ К а Ага Ьуз -νη₂ 79 РЬе ОЬ-ΝΗ (рМ)₂)РЬе АЛ руа Ага Ьуз -νη₂ 80 РЬе СН₂-0 (р«О₂)РЬе АЛ 1уа Ага Ьуз -νη₂

и его фармацевтически приемлемые соли.

3. Пептид по п.1, в котором

Хаа¹ является РЬе;

ХЬЬ⁴ является (рХ)РЬе, где X выбран из группы, состоящей из Н, Р, ΝΟ₂, и р указывает пара-положение в фенильном кольце РЬе;

Хсс⁷ выбран из группы, состоящей из 2-амино-2-метилпропионовой кислоты (А1Ь), 1-аминоциклопентанкарбоновой кислоты (Ас₅с) и 2-амино-2-метилмасляной кислоты (1уа);

Хбб выбран из группы, состоящей из А1а; 2-амино-2-метилпропионовой кислоты (А1Ь); 1-аминоциклопентанкарбоновой кислоты (Ас₅с), 2-амино-2-метилмасляной кислоты (Ινα);

Хее¹⁴ является Агд;

ХГГ¹⁵ является Ьук и

В представляет собой дипептид Λ5η-Ο1η-ΝΗ₂. или Λ5Π-ΝΗ₂. или амино(-NΗ₂)группу;

и его фармацевтически приемлемые соли.
4. Пептид по п.3, в котором ψ является СО-ΝΗ;

Х является Р;

Хсс⁷ является 2-амино-2-метилпропионовой кислотой (А1Ь);

Хбб является А1а и

В представляет собой дипептид А8η-61η-NΗ₂;

и его фармацевтически приемлемые соли.
5. Пептид по п.3, в котором ψ является ΟΗ₂-ΝΗ;

Х является Р;

Хсс⁷ является 2-амино-2-метилпропионовой кислотой (А1Ь);

Хбб является А1а и

В представляет собой дипептид Акп-СШ-ХЩ;

и его фармацевтически приемлемые соли.
6. Пептид по п.2, в котором

Хаа¹ является Ν-бензилглицином (Νρίκ);

ψ является СО-ΝΗ;

ХЬЬ⁴ является РЬе;

Хсс⁷ выбран из группы, состоящей из 2-амино-2-метилпропионовой кислоты (А1Ь), или 2-амино-2метилмасляной кислоты (Па);

Хбб¹¹ выбран из группы, состоящей из А1а, или 2-амино-2-метилпропионовой кислоты (А1Ь), или 2амино-2-метилмасляной кислоты (Па) и

В представляет собой дипептид А8п-С1п-ХН₂ или амино (-ΝΗ₂) группу;

и его фармацевтически приемлемые соли.
7. Пептид по п.6, в котором

Хсс⁷ является 2-амино-2-метилпропионовой кислотой (А1Ь);

Хбб является А1а и

В представляет собой дипептид Акп-СШ-ХЩ;

и его фармацевтически приемлемые соли.

- 13 011325
8. Композиция, содержащая пептиды по пп.1-7.
9. Фармацевтическая композиция, содержащая в качестве активного начала пептиды по пп.1-7, объединенные с фармацевтически приемлемыми носителями и/или эксципиентами.
10. Фармацевтическая композиция по п.9, предназначенная для введения через оральный, местный, респираторный, ректальный, интраспинальный, интратекальный, внутрипузырный или парентеральный путь.
11. Фармацевтическая композиция по п.10, где введение производится через интратекальный и парентеральный пути.
12. Применение пептида по пп.1-7 для приготовления лекарственного средства, предназначенного для лечения или предупреждения неврологических и нейросенсорных дисфункций.
13. Применение пептида по пп.3-5 для приготовления лекарственного средства для лечения или предупреждения гипертензии, тахикардии, расстройств задержки воды, гипонатриемии, сердечной недостаточности, гладкомышечных двигательных дисфункций в желудочно-кишечном, респираторном и мочеполовом трактах, воспалительных состояний, периферического или спинального обезболивания, ведения хронической боли и ослабления кашля.
14. Применение по п.13, в котором указанная гладкомышечная двигательная дисфункция включает нейрогенное недержание мочевого пузыря или гиперактивность мочевого пузыря, респираторную дисфункцию.
15. Применение по п.12 для приготовления транквилизатора или лекарственного средства для лечения или предупреждения анорексии.
16. Применение пептида по пп.6-7 для приготовления лекарства для лечения нарушений памяти и настроения, двигательной активности и расстройств потребления пищи или для лечения ожирения.