CN1634980A - 孤啡肽的类似物 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一类孤啡肽的类似物，以及这类化合物的制备方法。本发明的制备方法是采用氨基酸氮Fmoc保护的固相多肽合成方法，或者采用氨基酸氮Boc保护的固相多肽合成方法。本发明的孤啡肽的类似物是：H2N－Aa1－Gly－Gly－Aa4－Thr－Gly－Aa7－Arg－Lys－Ser－Aa11－Arg－Lys－Aa14－Aa15－Asn－Gln－COOH。
Description
技术领域
本发明涉及一类新的化合物，具体讲是一类孤啡肽的类似物，以及这类化合物的制备方法。
背景技术
孤啡肽(Orphanin FQ/Nociceptin，NC)，是阿片受体(OP4)的内源性配基。经研究，孤啡肽有相当广泛的生物学活性。它能影响细胞和离子通道，如：抑制Ca2+通道，激活K+通道，抑制腺苷酸环化酶的生成。在神经系统中，它在脊髓和脊髓上水平影响痛阈；它具有抗焦虑样作用；它可以调节自发运动的活性；它能刺激食欲；并与药物滥用和癫痫有关。在心血管系统和肾功能方面，它能诱导产生低血压和心率过缓；并具有利尿和抗尿钠排泄作用。它还影响胃肠道功能，抑制胃肠道的活动。在呼吸系统中，它能抑制气管和支气管的收缩。
由此，研究者认为OP4受体的配体具有如下的药用前景：(a)OP4受体的激动剂可以作为抗焦虑、刺激食欲、鞘内镇痛、抑制药物滥用、抗癫痫、高钠血征和水潴留征等的治疗药物。(b)OP4受体的拮抗剂可以减低食欲、镇痛(单独或与阿片肽联合使用)。
孤啡肽是一个以羧基结尾的17肽。其中1、4位氨基酸为L型苯丙氨酸(L-Phenylalanine，L-Phe)，7、11位氨基酸为L型丙氨酸(L-Alanine，L-Ala)，14位氨基酸为L型亮氨酸(L-Leucine，L-Leu)，15位氨基酸为L型丙氨酸(L-Alanine，L-Ala)。其结构参见下式：
H2N-Phe-Gly-Gly-Phe-Thr-Gly-Ala-Arg-Lys-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Ala-Asn-Gln-COOH
研究还发现，孤啡肽作为阿片受体(OP4)的内源性配基易被酶水解。如何解决这一问题，可以使孤啡肽延长作用时间、抗体内酶解，并增强效价。
发明内容
本发明提供一类新的经改造的孤啡肽类似物，这类化合物可以克服现有孤啡肽的不足，不易被酶解。
本发明的第二个目的是提供前述新化合物的制备方法。
孤啡肽的类似物，其特征是
H2N-Aa1-Gly-Gly-Aa4-Thr-Gly-Aa7-Arg-Lys-Ser-Aa11-Arg-Lys-Aa14-Aa15-Asn-Gln-COOH
其中1位氨基酸(Aa1)、4位氨基酸(Aa4)、7位氨基酸(Aa7)、11位氨基酸(Aa11)、14位氨基酸(Aa14)和15位氨基酸(Aa15)被不同于孤啡肽相应位置的氨基酸的其它类型氨基酸所取代。
更为具体地讲，本发明的化合物中：
其1位氨基酸(Aa1)为L型苯丙氨酸，4位氨基酸(Aa4)为对氟苯丙氨酸，7位氨基酸(Aa7)为α甲基丙氨酸，11位氨基酸(Aa11)为α甲基丙氨酸；14位氨基酸(Aa14)为L型精氨酸，15位氨基酸(Aa15)为L型赖氨酸。
或者其1位氨基酸(Aa1)为N-苄基甘氨酸，4位氨基酸(Aa4)为对氟苯丙氨酸；7位氨基酸(Aa7)为α甲基丙氨酸；11位氨基酸(Aa11)为α甲基丙氨酸；14位氨基酸(Aa14)为L型精氨酸，15位氨基酸(Aa15)为L型赖氨酸。
或者其1位氨基酸(Aa1)为N-苄基甘氨酸，4位氨基酸(Aa4)为L型苯丙氨酸、7位氨基酸(Aa7)为α甲基丙氨酸、11位氨基酸(Aa11)为α甲基丙氨酸、14位氨基酸(Aa14)为L型亮氨酸、15位氨基酸(Aa15)为L型丙氨酸。
或者是1位氨基酸(Aa1)为L型苯丙氨酸，4位氨基酸(Aa4)为L型苯丙氨酸、7位氨基酸(Aa7)为α甲基丙氨酸，11位氨基酸(Aa11)为α甲基丙氨酸，14位氨基酸(Aa14)为L型精氨酸，15位氨基酸(Aa15)为L型赖氨酸。
或者是1位氨基酸(Aa1)为N-苄基甘氨酸，4位氨基酸(Aa4)为L型苯丙氨酸、7位氨基酸(Aa7)为α甲基丙氨酸，11位氨基酸(Aa11)为α甲基丙氨酸，14位氨基酸(Aa14)为L型精氨酸，15位氨基酸(Aa15)为L型赖氨酸。
或者是1位氨基酸(Aa1)为L型苯丙氨酸，4位氨基酸(Aa4)为对氟苯丙氨酸、7位氨基酸(Aa7)为L型丙氨酸、11位氨基酸(Aa11)为L型丙氨酸、14位氨基酸(Aa14)为L型精氨酸、15位氨基酸(Aa15)为L型赖氨酸。
或者是1位氨基酸(Aa1)为N-苄基甘氨酸，4位氨基酸(Aa4)为对氟苯丙氨酸、7位氨基酸(Aa7)为L型丙氨酸、11位氨基酸(Aa11)为L型丙氨酸、14位氨基酸(Aa14)为L型精氨酸、15位氨基酸(Aa15)为L型赖氨酸。
或者是1位氨基酸(Aa1)为L型苯丙氨酸，4位氨基酸(Aa4)为对氟苯丙氨酸、7位氨基酸(Aa7)为α甲基丙氨酸、11位氨基酸(Aa11)为α甲基丙氨酸、14位氨基酸(Aa14)为L型亮氨酸、15位氨基酸(Aa15)为L型丙氨酸。
或者是1位氨基酸(Aa1)为N-苄基甘氨酸，4位氨基酸(Aa4)为对氟苯丙氨酸、7位氨基酸(Aa7)为α甲基丙氨酸、11位氨基酸(Aa11)为α甲基丙氨酸、14位氨基酸(Aa14)为L型亮氨酸、15位氨基酸(Aa15)为L型丙氨酸。
关于本发明所述类似物可参见表1：
表1 NC类似物的序列
| [p(F)Phe4，Aib7，Aib11]NCNH2 | Phe-Gly-Gly-p(F)Phe-Thr-Gly-Aib-Arg-Lys-Ser-Aib-Arg-Lys-Leu-Ala-Asn-Gln-NH2 |
| [p(F)Phe4，Arg14，Lys15]NCNH2 | Phe-Gly-Gly-p(F)Phe-Thr-Gly-Ala-Arg-Lys-Ser-Ala-Arg-Lys-Arg-Lys-Asn-Gln-NH2 |
| [Aib7，Aib11，Arg14，Lys15]NCNH2 | Phe-Gly-Gly-Phe-Thr-Gly-Aib-Arg-Lys-Ser-Aib-Arg-Lys-Arg-Lys-Asn-Gln-NH2 |
| [p(F)Phe4，Aib7，Aib11，Arg14，Lys15]NCNH2 | Phe-Gly-Gly-p(F)Phe-Thr-Gly-Aib-Arg-Lys-Ser-Aib-Arg-Lys-Arg-Lys-Asn-Gln-NH2 |
| [Nphe1，Aib7，Aib11]NCNH2 | Nphe-Gly-Gly-Phe-Thr-Gly-Aib-Arg-Lys-Ser-Aib-Arg-Lys-Leu-Ala-Asn-Gln-NH2 |
| [Nphe1，p(F)Phe4，Aib7，Aib11]NCNH2 | Nphe-Gly-Gly-p(F)Phe-Thr-Gly-Aib-Arg-Lys-Ser-Aib-Arg-Lys-Leu-Ala-Asn-Gln-NH2 |
| [Nphe1，p(F)Phe4，Arg14，Lys15]NCNH2 | Nphe-Gly-Gly-p(F)Phe-Thr-Gly-Ala-Arg-Lys-Ser-Ala-Arg-Lys-Arg-Lys-Asn-Gln-NH2 |
| [Nphe1，Aib7，Aib11，Arg14，Lys15]NCNH2 | Nphe-Gly-Gly-Phe-Thr-Gly-Aib-Arg-Lys-Ser-Aib-Arg-Lys-Arg-Lys-Asn-Gln-NH2 |
| [Nphe1，p(F)Phe4，Aib7，Aib11，Arg14，Lys15]NCNH2 | Nphe-Gly-Gly-p(F)Phe-Thr-Gly-Aib-Arg-Lys-Ser-Aib-Arg-Lys-Arg-Lys-Asn-Gln-NH2 |
本发明的制备方法，是采用氨基酸氮Fmoc保护的固相多肽合成方法，或者采用氨基酸氮Boc保护的固相多肽合成方法。
实验表明本发明的孤啡肽类似物可有效地延长作用时间、抗体内酶解，并有更强的效价。
附图说明
附图1为本发明的一种OP4受体激动剂对小鼠结肠收缩作用的影响曲线，其中：横坐标为浓度负对数，纵坐标为收缩率，图中带有棱形块的曲线为H2N-Phe-Gly-Gly-p(F)Phe-Thr-Gly-Aib-Arg-Lys-Ser-Aib-Arg-Lys-Arg-Lys-Asn-Gln-COOH对小鼠结肠收缩影响曲线，带有方形块的曲线为孤啡肽对小鼠结肠收缩的影响曲线。
附图2为本发明的一种OP4受体拮抗剂对小鼠结肠收缩作用的影响曲线，其中：横坐标为浓度负对数，纵坐标为收缩率，图中带有棱形块的曲线为孤啡肽对小鼠结肠收缩的影响曲线，其余曲线为不同浓度的OP4受体拮抗剂，(H2N-Nphe-Gly-Gly-p(F)Phe-Thr-Gly-Aib-Arg-Lys-Ser-Aib-Arg-Lys-Arg-Lys-Asn-Gln-COOH)对NC引起的小鼠结肠收缩影响曲线，其中：带有×形块的曲线所用浓度为0.01μM(微摩尔，以下同)，带有三角块的曲线所用浓度为0.1μM，带有方形块的曲线所用浓度为1μM。
具体实施方式
以下结合实施例解说：
实施例1：
[p(F)Phe4，Aib7，Aib11，Arg14，Lys15]NCNH2采取氨基酸氮Fmoc保护策略合成
I取Rink-Amide-MBHA-Resin(100-200mesh，1％DVB，S＝0.4mmol/g resin)500mg，按如下的方法进行：(1)用DMF洗涤树脂三遍(以下简记为DMF×3)；(2)用20％piperidine/DMF处理三遍(以下简记为20％piperidine/DMF×3)，时间为4min；(3)DMF×3；(4)Fmoc-Gln(Trt)-OH acid(2.5eq.)/HBTU(2.5eq.)/HOBt(2.5eq.)/DIPEA(5eq.)in DMF 1h；(5)DMF×3，中间各过程采用茚三酮检验；
II上步反应后的肽树脂按如下的方法进行：(1)DMF×3；(2)20％piperidine/DMF×3，4min；(3)DMF×3；(4)加入相应氨基酸及缩合剂进行缩合反应(Fmoc-Asn(Trt)-OH acid(2.5eq.)/HBTU(2.5eq.)/HOBt(2.5eq.)/DIPEA(5eq.)inDMF 1h)；(5)DMF×3，中间各过程采用茚三酮检验；
III上步反应后的肽树脂按如下的方法进行：(1)DMF×3；(2)20％piperidine/DMF×3，4min；(3)DMF×3；(4)Fmoc-Lys(Boc)-OH acid(2.5eq.)/HBTU(2.5eq.)/HOBt(2.5eq.)/DIPEA(5eq.)in DMF 1h；(5)DMF×3，中间各过程采用茚三酮检验；
IV上步反应后的肽树脂按如下的方法进行：(1)DMF×3；(2)20％piperidine/DMF×3，4min；(3)DMF×3；(4)Fmoc-Arg(Pbf)-OH acid(2.5eq.)/HBTU(2.5eq.)/HOBt(2.5eq.)/DIPEA(5eq.)in DMF 1h；(5)DMF×3，中间各过程采用茚三酮检验；
V上步反应后的肽树脂按如下的方法进行：(1)DMF×3；(2)20％piperidine/DMF×3，4min；(3)DMF×3；(4)Fmoc-Lys(Boc)-OH acid(2.5eq.)/HBTU(2.5eq.)/HOBt(2.5eq.)/DIPEA(5eq.)in DMF 1h；(5)DMF×3，中间各过程采用茚三酮检验；
VI上步反应后的肽树脂按如下的方法进行：(1)DMF×3；(2)20％piperidine/DMF×3，4min；(3)DMF×3；(4)Fmoc-Arg(Pbf)-OH acid(2.5eq.)/HBTU(2.5eq.)/HOBt(2.5eq.)/DIPEA(5eq.)in DMF 1h；(5)DMF×3，中间各过程采用茚三酮检验；
VII上步反应后的肽树脂按如下的方法进行：(1)DMF×3；(2)20％piperidine/DMF×3，4min；(3)DMF×3；(4)Fmoc-Aib-OH acid(2.5eq.)/HBTU(2.5eq.)/HOBt(2.5eq.)/DIPEA(5eq.)in DMF 1h；(5)DMF×3，中间各过程采用茚三酮检验；
VIII上步反应后的肽树脂按如下的方法进行：(1)DMF×3；(2)20％piperidine/DMF×3，4min；(3)DMF×3；(4)Fmoc-Ser(But)-OH acid(2.5eq.)/HBTU(2.5eq.)/HOBt(2.5eq.)/DIPEA(5eq.)in DMF 1h；(5)DMF×3，中间各过程采用茚三酮检验；
VIIII上步反应后的肽树脂按如下的方法进行：(1)DMF×3；(2)20％piperidine/DMF×3，4min；(3)DMF×3；(4)Fmoc-Lys(Boc)-OH acid(2.5eq.)/HBTU(2.5eq.)/HOBt(2.5eq.)/DIPEA(5eq.)in DMF 1h；(5)DMF×3，中间各过程采用茚三酮检验；
X上步反应后的肽树脂按如下的方法进行：(1)DMF×3；(2)20％piperidine/DMF×3，4min；(3)DMF×3；(5)Fmoc-Arg(Pbf)-OH acid(2.5eq.)/HBTU(2.5eq.)/HOBt(2.5eq.)/DIPEA(5eq.)in DMF 1h；(6)DMF×3，中间各过程采用茚三酮检验；
XI上步反应后的肽树脂按如下的方法进行：(1)DMF×3；(2)20％piperidine/DMF×3，4min；(3)DMF×3；(4)Fmoc-Aib-OH acid(2.5eq.)/HBTU(2.5eq.)/HOBt(2.5eq.)/DIPEA(5eq.)in DMF 1h；(5)DMF×3，中间各过程采用茚三酮检验；
XII上步反应后的肽树脂按如下的方法进行：(1)DMF×3；(2)20％piperidine/DMF×3，4min；(3)DMF×3；(4)Fmoc-Gly-OH acid(2.5eq.)/HBTU(2.5eq.)/HOBt(2.5eq.)/DIPEA(5eq.)in DMF 1h；(5)DMF×3，中间各过程采用茚三酮检验；
XIII上步反应后的肽树脂按如下的方法进行：(1)DMF×3；(2)20％piperidine/DMF×3，4min；(3)DMF×3；(4)Fmoc-Thr(But)-OH acid(2.5eq.)/HBTU(2.5eq.)/HOBt(2.5eq.)/DIPEA(5eq.)in DMF 1h；(5)DMF×3，中间各过程采用茚三酮检验；
XIIII上步反应后的肽树脂按如下的方法进行：(1)DMF×3；(2)20％piperidine/DMF×3，4min；(3)DMF×3；(4)Fmoc-Phe(4-F)-OH acid(2.5eq.)/HBTU(2.5eq.)/HOBt(2.5eq.)/DIPEA(5eq.)in DMF 1h；(5)DMF×3，中间各过程采用茚三酮检验；
XV上步反应后的肽树脂按如下的方法进行：(1)DMF×3；(2)20％piperidine/DMF×3，4min；(3)DMF×3；(4)Fmoc-Gly-OH acid(2.5eq.)/HBTU(2.5eq.)/HOBt(2.5eq.)/DIPEA(5eq.)in DMF 1h；(5)DMF×3，中间各过程采用茚三酮检验；
XVI上步反应后的肽树脂按如下的方法进行：(1)DMF×3；(2)20％piperidine/DMF×3，4min；(3)DMF×3；(4)Fmoc-Gly-OH acid(2.5eq.)/HBTU(2.5eq.)/HOBt(2.5eq.)/DIPEA(5eq.)in DMF 1h；(5)DMF×3，中间各过程采用茚三酮检验；
XVII上步反应后的肽树脂按如下的方法进行：(1)DMF×3；(2)20％piperidine/DMF×3，4min；(3)DMF×3；(4)Fmoc-Phe-OH acid(2.5eq.)/HBTU(2.5eq.)/HOBt(2.5eq.)/DIPEA(5eq.)in DMF 1h；(5)DMF×3，中间各过程采用茚三酮检验；
XVIII全长的肽树脂合成完成后，抽干，在室温下用Reagent K试剂(TFA/phenol/H2O/thioanisole/ethanedithiol，82.5∶5∶5∶5∶2.5)切割两小时(15mL/gresin)。将树脂过滤后，溶液在真空下浓缩，浓缩液用冷乙醚沉淀。粗肽使用Waters600 system制备型反相HPLC纯化。使用HPLC检测纯度＞95％。肽使用质谱鉴定(MS，electrospray)。高分辨质谱(ESI-MS)m/z：652.0373(M+3H)/3；m/z489.2817(M+4H)/4；C84H141N32O21F，计算值：1953.0933
实施例2：
[Nphe1，p(F)Phe4，Aib7，Aib11，Arg14，Lys15]NCNH2采取氨基酸氮Fmoc保护策略合成
本实施例中反应步骤I至XVI和合成过程与实施例1相同；
XVII上步反应后的肽树脂按如下的方法进行：(1)DMF×3；(2)20％piperidine/DMF×3，4min；(3)DMF×3；(4)Boc-N-benzyl-Gly-OH acid(2.5eq.)/HBTU(2.5eq.)/HOBt(2.5eq.)/DIPEA(5eq.)in DMF 1h；(5)DMF×3，中间各过程采用茚三酮检验；
XVIII全长的肽树脂合成完成后，抽干，在室温下用Reagent K试剂(TFA/phenol/H2O/thioanisole/ethanedithiol，82.5∶5∶5∶5∶2.5)切割两小时(15mL/gresin)。将树脂过滤后，溶液在真空下浓缩，浓缩液用冷乙醚沉淀。粗肽使用Waters600 system制备型反相HPLC纯化。使用HPLC检测纯度＞95％。肽使用质谱鉴定(MS，electrospray)。高分辨质谱(ESI-MS)m/z：652.0373(M+3H)/3；m/z489.2817(M+4H)/4；C84H141N32O21F，计算值：1953.0933
实施例3：
[p(F)Phe4，Aib7，Aib11，Arg14，Lys15]NCNH2采取氨基酸氮Boc保护策略合成
I取MBHA-Resin(100-200mesh，1％DVB，S＝0.4mmol/g resin)500mg，按表2所示步骤由C端向N端逐个缩合各个被保护的氨基酸，每步反应完成后，经负压作用过滤去除各试剂：
表2
| 步骤 | 试剂 | 试剂用量(ml) | 重复次数 | 混合时间(分) |
| 1 | DCM | 10 | 2 | 5 |
| 2 | 33％TFA/DCM | 10 | 1 | 10 |
| 3 | 33％TFA/DCM | 10 | 1 | 40 |
| 4 | DCM | 10 | 2 | 3 |
| 5 | MeOH | 10 | 2 | 3 |
| 6 | 10％TEA/DCM | 10 | 1 | 5 |
| 7 | MeOH | 10 | 2 | 3 |
| 8 | 10％TEA/DCM | 10 | 1 | 5 |
| 9 | MeOH | 10 | 2 | 2 |
| 10 | DCM | 10 | 2 | 2 |
| 茚检 | ||||
| 11 | Aa/DCM | 1 | 5 | |
| 12 | 1M DCC/DCM | 1 | 120 | |
| 13 | 50％MeOH/DCM | 10 | 2 | 3 |
| 14 | MeOH | 10 | 2 | 3 |
| 15 | DCM | 10 | 2 | 3 |
| 16 | 10％TEA/DCM | 10 | 1 | 2 |
| 17 | DCM | 10 | 1 | 3 |
| 18 | MeOH | 10 | 1 | 3 |
| 茚检 | ||||
| 19 | DCM | 10 | 1 | 3 |
| 20 | 25％Ac2O/DCM | 10 | 1 | 20 |
| 21 | DCM | 10 | 2 | 2 |
| 22 | MeOH | 10 | 2 | 2 |
每进入下一个氨基酸缩合循环用Kaiser试剂检验游离氨已确定缩合和脱保护是否完全。按上述反应步骤由C端氨基酸逐个向N端延伸肽链后得到目的肽链树脂，将树脂从反应器中移出后进行真空干燥。
II将干燥的肽树脂置于反应器中，加入苯甲醚(1ml/g树脂)，反应器外使用液氮/冰水冷浴，通入无水HF液体(5ml/0.1mmol肽)，冰浴下反应2小时。移去冰浴，真空泵除去HF，将反应物用无水乙醚洗涤3次，使用10％、20％、30％的乙酸梯度抽提粗肽3次，去离子水稀释后冷冻干燥。
III粗肽使用Waters 600 system制备型反相HPLC纯化。使用HPLC检测纯度＞95％。肽使用质谱鉴定(MS，electrospray)。高分辨质谱(ESI-MS)m/z：652.0373(M+3H)/3；m/z 489.2817(M+4H)/4；C84H141N32O21F，计算值：1953.0933
本发明的其他类似物的全合成过程与以上实施例相同并能得到类似的结果。
对本发明的类似物进行药理实验：1电刺激引起的小鼠输精管收缩实验，2是小鼠结肠收缩实验。实验结果统计分析，并用计算机软件处理，统计的各项指标都用均数±标准差(
x±S)表示。具体的实验结果如下：
1、mVD(电刺激引起的小鼠输精管收缩)实验
实验动物为昆明系小鼠，雄性，体重30±2g。将受试小鼠颈椎脱臼处死，剖腹取两侧输精管，放入盛有Krebs氏液(Krebs氏液在使用前临时配制，其配方：NaCl 6.9g，KCl 0.35g，KH2PO4 0.16g，NaHCO3 2.1g，葡萄糖1.98g，溶于1000ml的双蒸水中，再缓慢的加入CaCl2 0.28g，)的小蜡盘中，用眼科镊子小心地将输精管上的脂肪、血管等结缔组织剥离，以避免实验时影响药物的透入而导致实验的失败。用棉球轻轻地将管中的精液排出，使之成为一根空心管。用零号手术线将经前处理的输精管两端绑紧，一端绑在电极的小钩上，然后将输精管连同电极迅速地放入盛有Krebs氏液的恒温35℃、通有95％O2和5％CO2混合气体的麦氏浴管中，将另一端手术线悬挂在肌肉张力换能器上，加300mg的静息张力，开始平衡。前0.5hr每5min换一次Krebs氏液，后1hr每15min换一次Krebs氏液口，平衡1.5hr后开始实验。对样本给予一定强度的电刺激(刺激参数为：波宽1ms，频率6次/min，负载电压60V)，记录4次基础收缩强度。在实验中每组受试样本数大于5，其中对比组注入药物为孤啡呔，而给药组注入药物参见表3，按累积浓度单独给药：每隔6min加入浓度依次递增的待测药品，加药后孵育5min，再给予电刺激，记录收缩强度，与基础收缩强度比较，求出抑制百分率。具体结果见表3。
表3 NC及其类似物对电刺激引起的小鼠输精管收缩的作用
| agonist | antagonist | ||
| pEC50(CL95％) | Emax | pA2 | |
| NC | 7.50(0.21) | 78±4％ | - |
| [p(F)Phe4，Aib7，Aib11]NCNH2 | 8.42(0.25) | 76±3％ | - |
| [p(F)Phe4，Arg14，Lys15]NCNH2 | 9.01(0.41) | 77±7％ | - |
| [Aib7，Aib11，Arg14，Lys15]NCNH2 | 8.49(0.27) | 78±5％ | - |
| [p(F)Phe4，Aib7，Aib11，Arg14，Lys15]NCNH2 | 9.37(0.34) | 82±4％ | - |
| [Nphe1，Aib7，Aib11]NCNH2 | - | - | 7.14(0.51) |
| [Nphe1，p(F)Phe4，Aib7，Aib11]NCNH2 | - | - | 7.98(0.44) |
| [Nphe1，p(F)Phe4，Arg14，Lys15]NCNH2 | - | - | 7.75(0.17) |
| [Nphe1，Aib7，Aib11，Arg14，Lys15]NCNH2 | - | - | 8.01(0.23) |
| [Nphe1，p(F)Phe4，Aib7，Aib11，Arg14，Lys15]NCNH2 | - | - | 8.39(0.26) |
2、小鼠结肠收缩实验
A、采用昆明系小鼠，雄性，体重25-30g。颈椎脱臼处死，剪开腹腔，取出结肠后端置于Kerbs氏液(Krebs氏液的配方同上)营养液中，排出内容物，剪掉伴行血管，挂在浴管中，循环水浴温度为37℃，每10分钟换液一次，一小时后开始打药。实验中每组受试样本大于5，受试组中对比组所注入药物为孤啡呔，而给药组注入药物为[p(F)Phe4，Aib7，Aib11，Arg14，Lys15]NCNH2，先打低浓度的激动剂，作用3分钟后，换液洗去，之后每5分钟换液，换液3次，再打入高浓度的激动剂；最后以1uM碳酰胆碱(carbachol)引起的收缩做对照。本实验只列出[p(F)Phe4，Aib7，Aib11，Arg14，Lys15]NCNH2，其实验结果参见附图1。对本发明的其它激动剂类似物进行的相关实验表明，其实验结果类似。
B、试验动物及样本处理方法与A相同，受试组中对比组所注入药物为OP1受体激动剂NC，而给药组先注入药物[Nphe1，p(F)Phe4，Aib7，Aib11，Arg14，Lys15]NCNH2，15分钟后再注入不同浓度的OP4受体激动剂NC，低浓度的NC作用3分钟后，换液洗去，之后每5分钟换液，换液3次，再打入高浓度的NC；最后以1uM碳酰胆碱(carbachol)引起的收缩做对照。其实验结果参见附图2。对本发明的其它拮抗剂类似物进行的相关实验表明，其实验结果类似。
我们的结果显示：
1、所有p(F)Phe4对Phe4的替代都增加了活性。
2、所有包含Aib的肽比NC的活性高，由于Aib在肽链中比较容易形成α螺旋，故而支持了受体结合中NC在地址域采取了螺旋结构的理论。
3、这些结果显示引入Arg14，Lys15在没有改变类似物的药理学性质的基础上增加了类似物的生理活性，说明Arg14，Lys15位于NC的地址域，因而其可以改变类似物效价而不影响对受体的激活。
4、在所有1位含Nphe替换的类似物均为拮抗剂，说明此结构的调节彻底改变了受体的激活。
此外，这些稳定和加强配体与受体相互作用的因素之间一定程度上是可以叠加的。首先Phe4的的变化并不影响Aib7，Aib11和Arg14，Lys15的作用发挥，我们推测(pF)没有与配体上的氢原子生成氢键，因为如果形成链内氢键的话，根据计算机模型研究结果其有可能是与1-4位的的氢源形成氢键，这会对1-4位的结构产生较大影响而使得结合活性下降，因而Phe4上F原子可能与受体上某个位点形成了氢键，从而增强了配体与受体之间的作用；同时Aib7，Aib11的引入增加了类似物的生理活性，这一方面说明在NC的结合构象中5-13位有可能就是采取α-螺旋的结构，另一方面说明NC的C末端4个氨基酸残基的构象要求较低，发生的变动并不会影响受体与配体的相互作用。
这些充分说明NC与OP4受体相互作用时是个多位点的作用，各种稳定和加强这种结合的作用在某种程度上可以产生协同效应。
Claims (12)
1、孤啡肽的类似物，其特征是
H2N-Aa1-Gly-Gly-Aa4-Thr-Gly-Aa7-Arg-Lys-Ser-Aa11-Arg-Lys-Aa14-Aa15-Asn-Gln-COOH
其中1位氨基酸(Aa1)、4位氨基酸(Aa4)、7位氨基酸(Aa7)、11位氨基酸(Aa11)、14位氨基酸(Aa14)和15位氨基酸(Aa15)被不同于孤啡肽相应位置的氨基酸其它类型氨基酸所取代。
2、根据权利要求1所述的孤啡肽的类似物，其特征是1位氨基酸(Aa1)为L型苯丙氨酸，4位氨基酸(Aa4)为对氟苯丙氨酸，7位氨基酸(Aa7)为α甲基丙氨酸，11位氨基酸(Aa11)为α甲基丙氨酸；14位氨基酸(Aa14)为L型精氨酸，15位氨基酸(Aa15)为L型赖氨酸。
3、根据权利要求1所述的孤啡肽的类似物，其特征是1位氨基酸(Aa1)为N-苄基甘氨酸，4位氨基酸(Aa4)为对氟苯丙氨酸；7位氨基酸(Aa7)为α甲基丙氨酸；11位氨基酸(Aa11)为α甲基丙氨酸；14位氨基酸(Aa14)为L型精氨酸，15位氨基酸(Aa15)为L型赖氨酸。
4、根据权利要求1所述的孤啡肽的类似物，其特征是1位氨基酸(Aa1)为N-苄基甘氨酸，4位氨基酸(Aa4)为L型苯丙氨酸、7位氨基酸(Aa7)为α甲基丙氨酸、11位氨基酸(Aa11)为α甲基丙氨酸、14位氨基酸(Aa14)为L型亮氨酸、15位氨基酸(Aa15)为L型丙氨酸。
5、根据权利要求1所述的孤啡肽的类似物，其特征是1位氨基酸(Aa1)为L型苯丙氨酸，4位氨基酸(Aa4)为L型苯丙氨酸、7位氨基酸(Aa7)为α甲基丙氨酸，11位氨基酸(Aa11)为α甲基丙氨酸，14位氨基酸(Aa14)为L型精氨酸，15位氨基酸(Aa15)为L型赖氨酸。
6、根据权利要求1所述的孤啡肽的类似物，其特征是1位氨基酸(Aa1)为N-苄基甘氨酸，4位氨基酸(Aa4)为L型苯丙氨酸、7位氨基酸(Aa7)为α甲基丙氨酸，11位氨基酸(Aa11)为α甲基丙氨酸，14位氨基酸(Aa14)为L型精氨酸，15位氨基酸(Aa15)为L型赖氨酸。
7、根据权利要求1所述的孤啡肽的类似物，其特征是1位氨基酸(Aa1)为L型苯丙氨酸，4位氨基酸(Aa4)为对氟苯丙氨酸、7位氨基酸(Aa7)为L型丙氨酸、11位氨基酸(Aa11)为L型丙氨酸、14位氨基酸(Aa14)为L型精氨酸、15位氨基酸(Aa15)为L型赖氨酸。
8、根据权利要求1所述的孤啡肽的类似物，其特征是1位氨基酸(Aa1)为N-苄基甘氨酸，4位氨基酸(Aa4)为对氟苯丙氨酸、7位氨基酸(Aa7)为L型丙氨酸、11位氨基酸(Aa11)为L型丙氨酸、14位氨基酸(Aa14)为L型精氨酸、15位氨基酸(Aa15)为L型赖氨酸。
9、根据权利要求1所述的孤啡肽的类似物，其特征是1位氨基酸(Aa1)为L型苯丙氨酸，4位氨基酸(Aa4)为对氟苯丙氨酸、7位氨基酸(Aa7)为α甲基丙氨酸、11位氨基酸(Aa11)为α甲基丙氨酸、14位氨基酸(Aa14)为L型亮氨酸、15位氨基酸(Aa15)为L型丙氨酸。
10、根据权利要求1所述的孤啡肽的类似物，其特征是1位氨基酸(Aa1)为N-苄基甘氨酸，4位氨基酸(Aa4)为对氟苯丙氨酸、7位氨基酸(Aa7)为α甲基丙氨酸、11位氨基酸(Aa11)为α甲基丙氨酸、14位氨基酸(Aa14)为L型亮氨酸、15位氨基酸(Aa15)为L型丙氨酸。
11、根据权利要求1至10所述的任一孤啡肽的类似物的制备方法，其特征是用Rink-Amide-MBHA-Resin采用氨基酸氮Fmoc保护的固相多肽合成方法。
12、根据权利要求1至10所述的任一孤啡肽的类似物的制备方法，其特征是用MBHA-Resin采用氨基酸氮Boc保护的固相多肽合成方法。
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- 2004-10-10 CN CN 200410085313 patent/CN1634980A/zh active Pending
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