NO326922B1

NO326922B1 - Anvendelse av en forste loselig og en andre loselig ligand for fremstilling av en farmasoytisk belanding.

Info

Publication number: NO326922B1
Application number: NO19984369A
Authority: NO
Inventors: Alejandro A Aruffo; Jeffrey A Ledbetter; Peter S Linsley; Christian P Larsen; Diana L Hollenbaugh; Thomas C Pearson
Original assignee: Bristol Myers Squibb Co
Priority date: 1996-03-20
Filing date: 1998-09-18
Publication date: 2009-03-16
Also published as: AU2331097A; DE69713499T3; US5916560A; US20090186037A1; EP0892643B2; DE69713499T2; ES2177967T3; IL125928A0; JP2001518066A; IL125928A; EP0892643A1; EP0892643B1; US20020031510A1; US20050202011A1; DK0892643T4; ATE219376T1; AU710998B2; WO1997034633A1; ES2177967T5; PT892643E

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører anvendelse av en første løselig og en andre løselig ligand for fremstilling av en farmasøytisk blanding

Oppfinnelsens bakgrunn

CD28 uttrykkes på flesteparten av T-cellelinjer og plasmaceller (June, C.H. et al., Immunol. Today 11,211 -16 (1990); Damle t al., Proe. Nati. Acad. Sei 78:5096-6001 (1981)). Liganden for CD28 er B7, som uttrykkes på aktiverte B-celler (Linsley, P.S. et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 87, 5031-35 (1990); Linsley, P.S. et al., J. Exp. Med. 173, 721.730(1991).

CD40 er et medlem av tumor nekrosefaktdr-reseptor (TNFR) familien som tilhører type I membranbundne signalreseptorer. Selv om proteinet opprinnelig ble identifisert som et antigen på B-celler, blir CD40 uttrykket av alle antigen-presenterende celler (APC), deriblant dendrittiske celler, monocytter og B-celler.

Liganden for CD40 er gp39, som binder til CD40 og således kan aktivere B-celler. Gp39 er også kjent som CD40L, TRAP og T-BAM. Gp39 er et type II celle-overflateprotein som har signifikant homologi med TNF og er forbigående uttrykket på aktiverte T-celler. I tillegg til T-celler blir gp39 uttrykket av basofiler, mastceller og eosinofile celler.

CD28 og CD40 reaksjonsveier spiller essensielle roller i påbegynning og for-sterking av T-avhengige immunresponser (Bluestone, J.A. Immunity 2, 555-9 (1995);

Banchereau J., et al. Own. Rev. Immunol. 12, 881-922 (1994); Durie, F.H., et al. Science 261,1328-30 (1993); Foy, T.M. et al. J. Exp. Med. 178,1567-75 (1993); Van den Eertwegh, A.J.M., et al. J. Exp. Med. 178,1555-65 (1993)).

CD28/B7 interaksjoner gir viktige «sekundære signaler» som er nødvendig for optimal aktivering av T-celler, og IL-2 produksjon (Jenkins, M.K., et al., J. Immunol. 147, 2461-6 (1991); Schwartz, R.H. Cell 71,1065-8 (1992); Boussiotis, V.A., et al. J. Exp. Med. 178,1753-1763 (1993)), mens CD40/gp39 signaler gir kostimulering for aktivering av B-celler, makrofager, endotelceller, og aktivering av T-celler (Grewal, I.S., et al. Nature 378, 617-620 (1995); van Essen, D., et al., Nature 378, 620-623

(1995); Hollenbaugh, D., et al. J. Exp. Med. 182,33-40 (1995); Armitage, R.J., et al.

Nature 357, 80-2 (1992); Cayabyab, M., et al. J. Immunol. 152,1523-31 (1994);

Noelle, R., et al. Proe. Nati. Acad. Sei. USA 89, 6550-6554 (1992); Alderson, M. et

al. J. Exp. Med. 178, 669-674 (1993)).

Vertsimmunresponser fremkaller ofte frastøting av transplanterte vev og organer. Således er inhibisjon av disse immunresponser kritisk for å oppnå vellykket vevstransplantasjon. Det har vært studier som har vært rettet på å blokkere enten CD28 eller CD40 reaksjonsveiene, imidlertid har blokade av en enkelt av disse reaksjonsveier alene ikke vært tilstrekkelig til å tillate transplantasjon av meget immunogene allotransplantater (Turka, L.A., et al. Proe. Nati. Acad. Sei. USA 89, 11102-11105 (1992); Parker, D.C. et al. Proe. Nati. Acad. Sei. USA 92, 9560-9564

(1995); Larsen, CP. et al. Transplantation 61, 4-9 (1996)). Monoterapiene som blokkerer enten CD28 eller CD40 reaksjonsveiene resulterte kun i beste tilfeller kort-varig, og noen ganger lengervarende perioder der de transplanterte vev overlevet. Ingen av disse blokader kunne alene gi en generell forbedring av transplantatover-levelse.

De sterke immunresponser overfor xenotransplantater av organer har virket som en kraftig hindring mot å benytte denne teknikk i kliniske transplantasjoner (Platt J.L., Curr. Opin. Imm. 8, 721-728 (1996)). Tidligere eksperimentelle forsøk på å forlenge overlevelsen av xenotransplantater av hud har krevet enten bestråling av hele kroppen etterfulgt av blandet xeno/syngen rekonstituering (Ildstad ST., Sachs D.H., Nature, 307:168-170 (1984)), eller rigorøs tilvenning med thymektomi kombinert med anti-T-celle antistoff som fjerner T-celler (Pierson III R.N., Winn H.J., Russel P.S., Auchincloss Jr. H., J. Exp. Med., 170:991-996 (1989); og Sharabi Y, Aksentijevich I., Sundt III T.M., Sachs D.H., Sykes M., J. Exp. Med., 172:195-202

(1990). Disse strategier har nylig blitt benyttet for å fremme akseptering av hudtransplantater over en diskordant xenogenbarriere (Zhao Y., Swenson K., Sergio J., Am. J.S., Sachs D.H., Sykes M., Nat. Med., 2(11):1211-1216 (1996)). Imidlertid presenterer den potensielle sykelighet som er assosiert med behandlingsopplegg som fjerner celler et betydelig hinder for å introdusere disse strategier til bruk i klinisk transplantasjon av faste organer. Således ville utvikling av strategier som ikke fjerner celler med henblikk på å forlenge overlevelse av xenotransplantater i betydelig grad fremme klinisk bruk av disse teknikker.

For øyeblikket er det et behov for å frembringe metoder som kan gi langtids-toleranse av transplanterte vev fra vertens side, noe som ville øke overlevelsesrate ved transplantasjon. For å få til dette er det nødvendig å sikre tilstrekkelig immuno-logisk svekkelse i mottageren av transplantatet.

Vi har funnet at hemming av T-avhengige immunresponser som resulterer fra blokade av enten CD28 eller CD40 signaler er potent, men ikke komplett. Data beskrevet her demonstrerer at samtidig blokade av disse reaksjonsveier gir en uventet inhibisjon av akutt og kronisk forkastelse av transplantert vev in vivo. Uavhengig blokade av disse reaksjonsveier ved bruk av et løselig CTLA4-molekyl eller antistoff som gjenkjenner og binder til gp39 var uten evne til å gi selv minimal forlengelse av overlevelsestid til primært transplantert hudvev.

Den foreliggende oppfinnelse inkluderer oppdagelsen at samtidig blokade av CD28 og CD40 signaler fremmet langtidsoverlevelse av helt allogene likesom xenogene hudtransplantater. Forlengelse av hudallotransplantatoverlevelse ble eliminert med cyklosporin A (CyA), noe som antyder at dette er en aktiv prosess som krever intakt signaloverføring via TcR/CD3 komplekset og/eller andre CyA følsomme reaksjonsveier. Videre fremmet CTLA4-lg/MR1 langtidsakseptering av primært vaskularisert hjertetransplantatvev, og hemmet utvikling av kronisk vaskulær forkastelse.

Effekten demonstrert i de to transplantasjonsmodeller som benyttes her indikerer at CD28 og CD40 gir interrelaterte og likevel uavhengig signalveier som behøves for dannelse av effektive T-celleresponser.

Sammendrag av oppfinnelsen

Den foreliggende oppfinnelse vedrører anvendelse av en effektiv mengde av en kombinasjon av en første løselig ligand som hindrer et CTLA4 antigen på en CTLA4-positiv celle og/eller et CD28 antigen på en CD28-positiv celle fra binding av et B7 antigen, og en andre løselig ligand som hindrer et gp39 antigen på en gp39-positiv celle fra binding av et CD40 antigen for fremstilling av en farmasøytisk blanding for å hemme transplantatforkastelse mediert av CTLA4-positive, CD28-positive og gp39-positive celleinteraksjoner med B7-positive og CD40-positive celler, hvor transplantatet er et primært vaskularisert transplantat.

Oppfinnelsen vedrører videre ovennevnte anvendelse for fremstilling av en farmasøytisk blanding for å hemme akutt og kronisk transplantatforkastelse eller for å hemme kronisk vaskulær transplantatforkastelse mediert av CTLA4-positive, CD28-positive og gp39-positive celleinteraksjoner med B7-positive og CD40-positive celler, hvor transplantatet er et primært vaskularisert transplantat.

Liganden hindrer at et endogent molekyl (f.eks antigen) på en celle utvalgt fra gruppen som består av gp39 og CD40 fra å binde dets endogene ligand, og hindrer av at et endogent molekyl på en celle utvalgt fra gruppen som består av CTLA4, DC28 og B7 binder dets endogene ligand. Ved å hindre slike molekyler fra å binde deres ligander blokkeres to uavhengige signalreaksjonsveier, noe som hemmer immunresponsen som er ansvarlig for forkastelse av transplantert vev.

Videre frembringer oppfinnelsen anvendelse av en effektiv mengde av en kombinasjon av en første løselig ligand som hemmer CTLA4 antigen på en CTLA4 - positiv celle og/eller et CD28 antigen på en CD28-positiv celle fra binding av et B7 antigen og en andre løselig ligand som hindrer et CD40 antigen og CD40-positive celler fra binding av et gp39 antigen for fremstilling av en farmasøytisk blanding for inhibering av transplantatforkastelse mediert av CTLA4-positive, CD28-positive og gp39-positive celleinteraksjoner med B7-positive og CD40-positive celler, hvor transplantatet er et primært vaskularisert transplantat.

Oppfinnelsen vedrører videre anvendelse ifølge krav 4, av en effektiv mengde av en kombinasjon av en første løselig ligand som hemmer CTLA4 antigen på en CTLA4 -positiv celle og/eller et CD28 antigen på en CD28-positiv celle fra binding av et B7 antigen og en andre løselig ligand som hindrer et CD40 antigen og CD40-positive celler fra binding av et gp39 antigen for fremstilling av en farmasøytisk blanding for inhibering av akutt eller kronisk transplantatforkastelse eller for inhibering av kronisk vaskulær transplantatforkastelse mediert av CTLA4-positive, CD28-positive og gp39-positive celleinteraksjoner med B7-positive og CD40-positive celler, hvor transplantatet er et primært vaskularisert transplantat.

Søkerenes oppdagelse inkluderer videre anvendelse av en effektiv mengde av en kombinasjon av en første løselig ligand som hindrer et B7 antigen på B7-positive celler fra binding av CTLA4 antigen på en CTLA4-positiv celle og/eller et CD28 antigen på en CD28-positiv celle, og en andre løselig ligand som hindrer et gp39 antigen på en gp39-positiv celle fra binding av et CD40 antigen for fremstilling av en farmasøytisk blanding for å hemme transplantatforkastelse mediert av CTLA4-positive, CD28-positive og gp39-positive celleinteraksjoner med B7-positive pg CD40-positive celler, hvor transplantatet er et primært vaskularisert transplantat.

Oppfinnelsen vedrører videre anvendelse ifølge krav 7, av en effektiv mengde av en kombinasjon av en første løselig ligand som hindrer et B7 antigen på B7-positive celler fra binding av CTLA4 antigen på en CTLA4-positiv celle og/eller et CD28 antigen på en CD28-positiv celle, og en andre løselig ligand som hindrer et gp39 antigen på en gp39-positiv celle fra binding av et CD40 antigen for fremstilling av en farmasøytisk blanding for å hemme akutt eller kronisk transplantatforkastelse eller for å hemme kronisk vaskulær transplantatforkastelse mediert av CTLA4-positive, CD28-positive og gp39-positive celleinteraksjoner med B7-positive og CD40-positive celler, hvor transplantatet er et primært vaskularisert transplantat.

Den foreliggende oppfinnelse frembringer også anvendelse av en effektiv mengde av en kombinasjon av en første løselig ligand som hemmer et B7 antigen på en B7-positiv celle fra binding av et CTLA4 antigen på en CTLA4-positiv celle og/eller et CD28 antigen på en CD28-positiv celle, og en andre løselig ligand som hindrer et CD40 antigen på CD40-positive celler fra binding av et gp39 antigen, for fremstilling av en farmasøytisk blanding som hemmer transplantatforkastelse mediert av CTLA4-positive, CD28-positive og gp39-positive celleinteraksjoner med B7-positive og CD40-positive celler, hvor transplantatet er et primært vaskularisert transplantat.

Oppfinnelsen vedrører videre anvendelse ifølge krav 10, av en effektiv mengde av en kombinasjon av en første løselig ligand som hemmer et B7 antigen på en B7-positiv celle fra binding av et CTLA4 antigen på en CTLA4-positiv celle og/eller et CD28 antigen på en CD28-positiv celle, og en andre løselig ligand som hindrer et CD40 antigen og CD40-positive celler fra binding av et gp39 antigen, for fremstilling av en farmasøytisk blanding som hemmer akutt og kronisk transplantatforkastelse eller som hemmer kronisk vaskulær transplantatforkastelse mediert av CTLA4-positive, CD28-positive og gp39-positive celleinteraksjoner med B7-positive og CD40-positive celler, hvor transplantatet er et primært vaskularisert transplantat.

Binding av den B7-positive celle til den første løselige ligand blokkerer reaksjonen av B7-antigenet med endogent CTLA4 eller CD28. I tillegg blokkerer binding av gp39-antigenet til den andre løselige ligand reaksjonen med gp39-antigenet med endogent CD40. Denne blokade av både gp39 og B7 reaksjonsveiene hemmer immunresponser.

Binding av både den første og den annen løselig ligand til deres reseptorer hemmer immunresponsen som medieres av gp39 og B7 reaksjonsveiene ved å hindre et endogent molekyl på en celle utvalgt fra gruppen som består av gp39 og CD40 antigener fra å binde til dets endogene ligand og ved å hindre et endogent molekyl på en celle utvalgt fra gruppen som består av CTLA4, CD28 eller B7 fra å binde dets ligand.

Oppfinnelsen vedrører videre anvendelse ifølge et hvilket som helst av krav 1 til 26, for hemming av forkastelse av autotransplantater, isotransplantater, allotransplantater, xenotransplantater og hemming av kronisk transplantat vaskulopati.

Kort beskrivelse av figurene

Fig. 1 er et søylediagram som viser at samtidig blokade av CD28 og CD40 signaler senker alloimmunresponser i knehaselymfeknuten in vivo. Fig. 2A er et linjediagram som viser at CTLA4-lg/MR1 behandling forlenger overlevelse av hjerteallotransplantat, sammenlignet med CTLA4-lg eller MR1 gitt separat. Fig. 2B er et fotografi av et histologisk snitt som viser CTLA4-lg-behandlet hjerteallotransplantat ved dag 62, som har utbredt infiltrasjon av lymfocytter, interstitiell fibrose og alvorlig fortykkelse av intima i kransarterier og fibrose som er typisk for kronisk forkastelsesreaksjon (venstre figur 100 x forstørret; høyre figur 400 x forstørret). Fig. 2C er et fotografi av et histologisk snitt som viser et hjerteallotransplantat behandlet med MR1 ved dag 62, med mindre lymfocyttinfiltrasjon og interstitiell fibrose, men alvorlig kransarterieåresykdom som er karakteristisk for kronisk forkastelsesreaksjon (venstre bilde 100 x forstørret; høyre bilde 400 x forstørrelse). Fig. 2D er et fotografi av et histologisk snitt som viser hjerteallotransplantat behandlet med CTLA4-lg/MR1 ved dag 58, uten lymfocyttinfiltrasjon, fibrose eller kransarterielesjoner i intima (venstre bilde 100 x forstørret; høyre bilde 400 x forstørret). Fig. 2E er et fotografi av et histologisk snitt som viser normale ikke-transplanterte BALB/c hjerter (venstre bilde 100 x forstørret; høyre bilde 400 x forstørret). Fig. 3A er et fotografi av gelstriper farvet med etidiumbromid som viser intratransplantat ekspresjon av immun mediatortranskripter ved hjelp av RT-PCR i ubehandlede, MR1 behandlede, CTLA4-lg behandlede, og MR1/CTLA4-lg behandlede hjerteallotransplantater. Fig. 3B er en serie av søylediagrammer som viser gjennomsnitts intensitetene av PCR-produktbåndene standardavvik. Fig. 4A er en linjetegning som viser resultatene fra mus behandlet enten bare med MR1, CTLA4-lg og behandlet med en kombinasjon av MR1 og CTLA4-lg. Fig. 4B viser resultater fra mus behandlet med CyA, CyA og CTLA4-lg, samt CyA og MR1. Fig. 4C viser effektene av perioperativ behandling med YTS191 og MR1 alene, MR1 og CTLA4-lg, og YTS191 og CTLA4-lg på primære hudallotransplantater. Fig. 4D er et fotografi som viser normalt utseende av et BALB/c hudtransplantat på en mottaker behandlet med CTLA4-lg/MR1. Fig. 4E er et fotografi som viser et kontroll allotransplantat som holder på å forkastes. Fig. 4F er et fotografi av et histologisk snitt av et hudtransplantat méd friskt utseende av et akseptert transplantat 100 dager etter transplantasjon som viser vel-bevarte overhuds hårrøtter og tilliggende strukturer. Fig. 4G er et fotografi som viser et BALB/c hudtransplantat på en ubehandlet mottager 8 dager etter transplantasjon. Transplantatet viser utstrakt infiltrasjon av lymfocytter. Fig. 5A er en serie med figurer som viser effektene in vitro av å bruke bare MR1, bare CTLA4-lg, og en kombinasjon av MR1/CTLA4-lg på tre ulike celle-populasjoner. Fig. 5B er en serie av søylediagrammer som viser effektene in vivo av å bruke bare MR1, bare CTLA4-lg, og en kombinasjon av MR1/CTLA4-lg. Fig. 6A er et søylediagram som viser vekt av de immuniserte knehaselymfe-knuter sammenlignet med den kontralaterale knute i C3H-mus som respons til immunisering i fotputen med miltceller fra bestrålte (2000 RADS) rotter (Sprague-Dawley). Humant IgG (stiplet), CTLA4-lg (grå), MR1 (hvit), CTLA4-lg/MR1 (svart), normal ikke-immunisert knute (skravert). Fig. 6B er en tegning som viser in vitro proliferasjon av lymfeknuteceller etter oppsamling av lymfe fra knehasen fem dager etter immunisering. Humant IgG (stiplet), CTLA4-lg (grå), MR1 (hvit), CTLA4-lg/MR1 (sort), normal ikke-immunisert knute (skravert). Fig. 6C er et søylediagram som viser at samtidig blokade av CD40 og CD28 reaksjnsveiene fører til markert hemming av cytokinproduksjon av IL-2. Humant IgG (stiplet), CTLA4-lg (grå), MR1 (hvit), CTLA4-lg/MR1 (svart), normal ikke-immunisert knute (skravert). Fig. 6D er et søylediagram som viser at samtidig blokade av CD40 og CD28 reaksjnsveiene fører til markert hemming av cytokinproduksjon av INFg. Humant IgG (stiplet), CTLA4-lg (grå), MR1 (hvit), CTLA4-lg/MR1 (svart), normal ikke-immunisert knute (skravert). Fig. 7A er tegning som viser at C3H mottagere behandlet med CTLA4-lg (500 u.g) på dag 0, 2, 4 og 6 kombinert med MR1 (500 u.g) på dag 0, 2, 4 og 6 hadde forlenget overlevelse av hjerteallotransplantater fra Sprague-Dawley rotter. Fig. 7B er et fotografi av et ubehandlet hjerte xenotransplantat på dag 6 som viser utbredt vevsdestruksjon (400X). Fig. 7C er et fotografi av et hjerte xenotransplantat behandlet med CTLA4-lg ved dag 20 som viser lymfocyttinfiltrasjon, destruksjon av muskelceller og blodåresykdom i kransarterie (400X). Fig. 7D er et fotografi av et hjerte xenotransplantat behandlet med MR1 ved dag 20 som viser lymfocyttinfiltrasjon, destruksjon av muskelceller og blodåresykdom i kransarterie (400X). Fig. 7E er et fotografi av et normalt ikke-transplantert Sprague-Dawley rottehjerte (400X). Fig. 7F er et fotografi av et hjerte xenotransplantat behandlet med CTLA4-lg/MR1 ved dag 20, som i hovedsak er uten lymfocyttinfiltrasjon og fibrose (400X). Fig. 7G er et fotografi av et hjerte xenotransplantat behandlet med CTLA4-lg/MR1ved dag 122, som viser utmerket bevaring av både muskelceller og blodårestrukturer (400X). Fig. 8A er serie med tegninger som viser forlengelse av overlevelse av Sprague-Dawley rottehud xenotransplantater i C3H mus behandlet med MR1 og CTLA4-lg tilført sammen med den perioperative periode, sammenlignet med xenotransplantat mottagere behandlet enten med bare MR1 eller bare CTLA4-lg og ubehandlede kontroller. Fig. 8B er en serie med tegninger som viser ingen signifikant endring i xeno-transplantasjonoverlevelse etter kronisk behandling (som begynner etter den vanlige 4-dose behandling) med enten kombinasjonen av CTLA4-lg/MR1 eller MR1. Fig. 8C er et fotografi som viser det sunne utseende til et hudtransplantat fra en Sprague-Dawley rotte på en stor C3H-mottager behandlet méd CTLA4-lg/MR1 100 dager etter transplantering. Fig. 8D er et fotografi som viser et kontroll xenotransplantat med hud som holder på å avstøtes 10 dager etter transplantasjon. Fig. 8E er et fotografi av et hematoksylin-eosinfarvet histologisk snitt fra et akseptert transplantat behandlet med CTLA4-lg/MR1 50 dager etter transplantasjon som viser vel bevart histologisk arkitektur (400X). Fig. 8F er et fotografi av et histologisk snitt farvet med hematoksylin-eosin fra et Sprague-Dawley hudtransplantat på en ubehandlet C3H-mottager 8 dager etter transplantasjon, som fremviser utbredt infiltrasjon av lymfocytter (400X). Fig. 9A er et spredningsplott som viser nedgang i den stimulerte xenoantistoffrespons i serum samlet opp fra C3H-mottagere 55 dager etter hud xenotransplantater fra Sprague-Dawley rottedonorer. Kontrollmus som ikke hadde fått behandling hadde tydelig påvisbart IgG xenoantistoff. Behandling med enten bare CTLA4-lg eller MR1 blokkerte delvis responsen av xenoantistoffet. Kombinasjonen av CTLA4-lg og MR1 forhindret nesten totalt den stimulerte xenoantistoffrespons. Hvert resultatpunkt representerer analysen av en individuell mottager. Fig. 9B er et spredningsplott som viser nedgang i stimulert xenoantistoffrespons i serum samlet fra C3H-mottagere 20 dager etter hjerte xenotransplantater fra Sprague-Dawley rottedonorer.

Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen

Definisjoner

Alle vitenskapelige og tekniske begreper benyttet i denne søknad har betydninger som er vanlig brukt i faget unntatt dersom annet blir spesifisert. Som benyttet i denne søknad har de følgende ord eller fraser betydningene som spesifiseres.

Som brukt her inkluderer «monoklonale antistoff rettet mot gp39» eller «anti-gp39» MR1. Anti-gp39 er også kjent i litteraturen som en anti-CD40 ligand. Eksempler på MR1 inkluderer, men er ikke begrenset til monoklonale antistoffer rettet mot gp39 fra mus; antistoff rettet mot gp39 fra andre arter slik som aper, sauer, mennesker er også inkludert. 1 tillegg inkluderer «monoklonale antistoffer rettet mot gp39» eller «anti-gp39» ethvert antimolekyl, fragment av dette, eller rekombinant bindingsprotein som gjenkjenner og binder gp39.

Som benyttet her betyr «tilførsel» oral tilførsel, tilførsel som stikkpiller, lokal kontakt, intravenøs, intraperitoneal, intramuskulær eller subkutan tilførsel, eller implantasjon av en langsomt frisettende formulering slik som en miniosmotisk pumpe til individet.

Som benyttet her inkluderer «farmasøytisk akseptabel bærer» ethvert material som når det kombineres med antistoffet bevarer antistoffets immunogenisitet og ikke er reaktivt med individets immunsystemer. Eksempler inkluderer, men er ikke begrenset til enhver av de vanlige farmasøytiske bærere slik som en fosfatbufferet saltvannsløsning, vann, emulsjoner slik som olje/vannemulsjon, og ulike typer av våt-gjø rende midler. Andre bærere kan også inkludere sterile løsninger, tabletter som inkluderer dekkede tabletter og kapsler.

Slike bærere vil typisk inneholde eksipienter slik som stivelse, melk, sukker, visse typer leire, gelatin, stearinsyre eller salter av denne, magnesium eller kalsium-stearat, talkum, vegetable typer eller oljer, gummier, glykoler eller andre kjente eksipienter. Slike bærere kan også inneholde smaks- eller farvetilsetningsstoffer eller andre ingredienser. Blandinger som omfatter slike bærere blir formulert med velkjente konvensjonelle metoder.

Som benyttet her inkluderer «transplantert vev» autotransplantater, isotransplantater, allotransplantater og xenotransplantater. Eksempler på transplantert vev inkluderer, men er ikke begrenset til faste organtransplantater slik som hjerte, lever eller nyre, hudtransplantater, bukspyttkjertel øyceller, benmargstransplantater eller cellesuspensjoner.

Som benyttet her benytter «B7» B7-1 (også kalt CD80), B7-2 (også kalt CD86), B7-3, og B7-familien, f.eks en kombinasjon av B7-1, B7-2 og/eller B7-3.

For at oppfinnelsen beskrevet her kan bli bedre forstått blir den følgende beskrivelse gitt.

Den fremstilte farmasøytiske blandingen hemmer avstøtning av et transplantert vev. Et endogent molekyl på en celle utvalgt fra gruppen som består av gp39 og CD40 hindres fra å binde dets endogene ligand. Det tillates at man hindrer et endogent molekyl på en celle utvalgt fra gruppen som består av CTLA4, CD28 og B7 fra å binde dets endogene ligand. Når disse molekyler forhindres fra å binde deres endogene ligander blokkeres to uavhengige signalreaksjonsveier. Blokaden av disse to uavhengige signalreaksjonsveier hemmer immunresponsen som fører til forkastelse av transplantert vev.

I et eksempel fra oppfinnelsen blir endogent gp39 antigen hindret fra å binde dets endogene ligand. Dette eksempel omfatter trinnene å skape kontakt mellom en gp39-positiv celle med en løselig ligand som gjenkjenner og binder gp39-antigenet (f .eks ved bruke av løselige ligander slik som MR1 eller andre antistoff som binder gp39, og løselige CD40 molekyler).

Dette eksempel omfatter det ytterligere trinn at det endogene CTLA4 antigen forhindres fra å binde dets endogene ligand. Dette omfatter trinnet å skape kontakt mellom en B7-positiv celle med en løselig ligand som gjenkjenner og binder B7-antigenet slik som CTLA4-lg (US patent nr. 5.434.131, utstedt 18. juli 1995), BB-1 monoklonale antistoff eller andre antistoff som er rettet mot B7.

Binding av den gp39-positive celle til dens løselige ligand blokkerer reaksjonen av endogent gp39-antigen med endogen CD40. Binding av den B7-positive celle til dens løselige ligand blokkerer reaksjonen av det endogene B7-antigen med endogen CTLA4 og CD28. Denne kombinerte blokade hemmer immunresponsen.

I et annet eksempel blir endogent CD40-antigen forhindret fra å binde dets endogene ligand. Dette eksempel omfatter trinnet å skape kontakt mellom en CD40-positiv celle med en løselig ligand som gjenkjenner og binder CD40-åntigenet. Passende ligander inkluderer antistoff rettet mot CD40 eller løselig gp39 (sgp39).

Dette eksempel omfatter det ytterligere trinn at det endogene CTLA4-antigen forhindres fra å binde dets endogene ligand. Dette omfatter trinnet å skape kontakt mellom en B7-positiv celle med en løselig ligand som gjenkjenner og binder B7-antigenet. Eksempler på denne løselige ligand inkluderer CTLA4-lg, løselige CD28 molekyler og antistoff rettet mot B7.

Bindingen av den CD40-positive celle til dens løselige ligand blokkerer reaksjonen av endogent CD40-antigen med endogent gp39. Bindingen av den B7-positive celle til dens løselige ligand blokkerer reaksjonen av B7-antigenet med endogent CTLA4. Den kombinerte blokade hemmer immunresponsen.

I ytterligere et annet eksempel blir endogent gp39-antigen hindret fra å binde dets endogene ligand som beskrevet over. Eksempelet omfatter det ytterligere trinn at det endogene CD28-antigen blir hindret fra å binde dets endogene ligand. Dette trinn omfatter å skape kontakt mellom B7-positiv celle med en løselig ligand som gjenkjenner og binder B7-antigenet. Eksempler inkluderer CTLA4-lg, løselige CD28 molekyler og antistoff rettet mot B7 slik som BB-1.

Binding av den gp39-positive celle til dens løselige ligand blokkerer reaksjonen av gp39-antigenet med endogent CD40. Binding av den B7-positive celle til dens løselige ligand blokkerer reaksjonen av B7-antigenet med endogent CD28. Denne kombinerte blokade hemmer immunresponsen.

I et annet eksempel blir endogent CD40-antigen forhindret fra å binde dets endogene ligand som beskrevet over. Eksempelet gir det ytterligere trinn at det endogene B7-antigen blir forhindret fra å binde dets endogene ligand. Dette omfatter å skape kontakt mellom en CD28-positiv celle med en løselig ligand som gjenkjenner og binder CD28-antigenet. Eksempler på slike løselige ligander inkluderer løselig B7-molekyler og antistoff rettet mot CD28.

Binding av den CD40-positive celle til den løselige ligand blokkerer reaksjonen mellom CD40-antigenet med endogent gp39. Bindingen av dens CD28-positive celle til den løselige ligand blokkerer reaksjonen av B7-antigenet med endogent CD28. Denne kombinerte blokade hemmer immunresponsen.

I ytterligere et annet eksempel blir endogent CD40-antigen forhindret fra å binde dets ligand som beskrevet over. Dette eksempelet gir det ytterligere trinn at det endogene B7-antigen blir forhindret fra å binde dets endogene ligand som omfatter å skape kontakt mellom en CTLA4-positiv celle med en løselig ligand som gjenkjenner og binder CTLA4-antigenet. Eksempler på slike løselige ligander inkluderer løselige B7-molekyler og antistoff rettet mot CTLA4.

Binding av den CD40-positive celle til den løselige ligand blokkerer reaksjonen mellom CD40-antigenet og endogent gp39. I tillegg blokkerer bindingen av den CTLA4- eller CD28-positive celle til den løselige ligand reaksjonen mellom CTLA4-antigenet og endogent B7. Denne kombinerte blokade hemmer immunresponsen.

I et videre eksempel blir endogent CD40-antigen forhindret fra å binde dets ligand som beskrevet over. Dette eksempel gir videre det ytterligere trinn at endogent B7-antigen blir forhindret fra å binde dets endogene ligand som omfatter å skape kontakt mellom en CD28-positiv celle med en løselig ligand som gjenkjenner og binder CD28-antigenet. Eksempler på slike løselige ligander inkluderer løselige B7-molekyler og antistoff rettet mot CD28.

Binding av den CD40-positive celle til den løselige ligand blokkerer reaksjonen av gp39-antigenet med endogent CD40. Videre blokkerer bindingen av den CD28-positive celle til den løselige ligand reaksjonen mellom CD28-antigenet og endogent B7. Denne kombinerte blokade hemmer immunresponsen.

I et ytterligere eksempel blir endogent CD40-antigen også forhindret fra å binde dets ligand som beskrevet over. Dette eksempel gir det ytterligere trinn at det endogene B7-antigen blir forhindret fra å binde dets endogene ligand, som omfatter å skape kontakt mellom en CTLA4-positiv celle og en løselig ligand som gjenkjenner og binder CTLA4-antigenet.

Bindingen av den CD40-positive celle til den løselige ligand blokkerer reaksjonen mellom gp39-antigenet og endogent CD40. I tillegg blokkerer bindingen av den CTLA4-positive celle og den løselige ligand reaksjonen mellom CTLA4-antigenet og endogent B7. Denne kombinerte blokade hemmer immunresponsen.

Et annet eksempel omfatter at en B7-positiv celle først får kontakt med en første løselige ligand som gjenkjenner og binder til B7-antigenet, og å skape kontakt mellom en gp39-positiv celle og en annen løselige ligand som gjenkjenner og binder gp39-antigenet.

Bindingen av den B7-positive celle til den første løselige ligand blokkerer reaksjonen av B7-antigenet med endogent CTLA4 eller CD28. Videre blokkerer bindingen av gp39-antigenet til den andre løselige ligand reaksjonen mellom gp39-antigenet og endogent CD40. Kombinasjonen av denne blokade hemmer immunresponsen.

Det er mulig å hemme en immunrespons i et individ. Individer nevnt her omfatter et dyr slik som et menneske, en hund, en katt, en sau, en hest, en mus, en gris eller en ku. Det omfatter å tilføre en første løselige ligand til individet, som gjenkjenner og binder B7-antigenet (f .eks løselig CTLA4 eller CD28 molekyler f .eks. CTLA4lg og CD28lg fusjonsproteiner deponert i American Type Culture Collection (ATCC) i Rockville Maryland under betingelsene i henhold til Budapest-avtalen av 31. mai 1991 og tildelt tilgangsnr. 68629 og 68828, henholdsvis) og en annen løselig ligand som gjenkjenner og binder gp39-antigenet (f.eks monoklonale antistoff rettet mot gp39 (MR1) eller løselige CD40-molekyler). Bindingen av de første og andre ligander til deres reseptorer hemmer immunresponsen som medieres av CTLA4-, CD28- og gp39-celle interaksjoner med B7- og CD40-positive celler.

Det er mulig å hemme transplantatforkastelse i et individ. Ved tilførsel til individet av en effektiv mengde av en kombinasjon av en første løselige ligand som gjenkjenner og binder B7-antigenet på B7-positive celler, og en annen løselig ligand som gjenkjenner og binder gp39-antigenet på gp39-positive celler. Bindingen av B7-positive celler med den første løselige ligand og gp39-positive celler med den andre løselige ligand ødelegger interaksjoner mellom endogene CTLA4-, CD28- og gp39-celle intraksjoner med B7-positive celler og gp39-positive celler slik at transplantatforkastelse blir hemmet.

Den første løselige ligand kan være et rekombinant bindingsmolekyl som har minst en del av det ekstracellulære domene til CTLA4. Den ekstracellulære del av CTLA4 blir koplet til en ikke-CTLA4 proteinsekvens. Ikke-CTLA4 proteinsekvensen kan være i det minste en del av et immunglobulinmolekyl.

I et spesifikt eksempel fra oppfinnelsen er liganden et CTLA4-lg fusjonsprotein, f.eks CTLA4-lg fusjonsproteinet som er deponert i American Type Culture Collection (ATCC) i Rockville, Maryland, etter reglene fra Budapest-avtalen av 31. mai 1991 og gitt ATCC tilgangsnummer: 68629. Alternativt kan liganden være et CD28lg/CTLA4-lg fusjonsproteinhybrid (US patent nr. 5.434.131, utstedt 18. juli 1995).

I en alternativ utførelse kan den første løselige ligand være et monoklonalt antistoff som er reaktivt med B7-antigenet, f.eks antistoffet kan være anti-BB1 monoklonalt antistoff (Clark et al., Human Immunol. 16:100-113 (1986); Yokochi et al., J. Immunol. 128:823 (1981); Freeman et al. (J. Immunol. 143(8):2714-2722 (1989); og Freedman et al., J. Immunol 139:3260 (1987)).

I en annen utførelse kan liganden være et CD28lg/CTLA4-lg fusjonsproteinhybrid med en første aminosyresekvens som tilsvarer en del av den ekstracellulære domene til CD28-reseptoren koplet sammen med en andre aminosyresekvens som tilsvarer en del av det ekstracellulære domene til CTLA4-reseptoren og en tredje aminosyresekvens som tilsvarer hengsel, CH2 og CH3 regionene til humant immun-globulin Cg1.

I en utførelse av oppfinnelsen kan den andre løselige ligand for gp39-antigenet være et monoklonalt antistoff som er reaktivt med gp39-antigenet, f.eks det MR1-antimuse monoklonale antistoffet eller det antihumane gp39-antistoff (US patent nr. 5.474.771, utstedt 12. desember 1995).

I et eksempel er det første bindingsdomene en ligand som gjenkjenner og binder gp39-antigenet. Eksempler inkluderer CD40 og monoklonale antistoff rettet mot gp39. I et annet eksempel er det første bindingsdomene en ligand som gjenkjenner og binder CD40-antigenet. Eksempler inkluderer gp39 og monoklonale antistoff rettet mot CD40.

I et eksempel er det andre bindingsdomene en ligand som gjenkjenner og binder CTLA4. Eksempler inkluderer B7 og monoklonale antistoffer rettet mot CTLA4. I et annet eksempel er det andre bindingsdomene en ligand som gjenkjenner og binder CD28-antigenet. Eksempler inkluderer B7 og monoklonale antistoff rettet mot CD28. I et annet eksempel er det andre bindingsdomene en ligand som gjenkjenner og binder B7-antigenet. Eksempler inkluderer CTLA4, CD28 og monoklonale antistoff rettet mot B7.

Løselige ligander kan tilføres både før, under og etter transplantasjon. Løselige ligander kan tilføres per os, gjennom hud, intravénøst, intramuskulært, intraperitonealt eller ved subkutan tilførsel.

Den mest effektive tilførselsmåte og dosekontroll av den foreliggende oppfinnelses molekyler avhenger av lokalisering av vev eller sykdom som skal behandles, alvoret og forløpet av den medisinske tilstand, individets helse og respons til behandling, og den behandlende leges avgjørelser. Således må dosene av disse molekyler titreres individuelt for hver pasient.

Som et eksempel blir relasjonene mellom doser for dyr med ulike størrelser og av ulike dyrearter samt mennesker basert på mg/m<2> overflateområdet beskrevet av Freireich, E.J., et al. Cancer Chemother., Rep. 50 (4):219-244 (1966). Justeringer i dosetilførselen kan gjøres for å optimalisere hemningen av immunresponsen som fører til transplantatforkastelse, f.eks kan doser bli oppdelt og tilført en gang om dagen eller dosen kan reduseres proposjonalt avhengig av situasjonen (f.eks flere delte doser kan tilføres daglig eller blir proposjonalt redusert avhengig av den spesifikke terapeutiske situasjon).

Det synes klart at dosen av blandingen som er nødvendig for å oppnå et passende klinisk resultat kan reduseres videre med optimalisering av tidsplan for tilførsel.

Fordeler ved oppfinnelsen

Til tross for de mange fremskritt i klinisk immunosuppresjon forblir kronisk vaskulær forkastelse den viktigste årsak til transplantasjonssvikt, som det ikke finnes noen effektiv terapi mot. Eksperimentene beskrevet her viser at blokade av CD28/CTLA4/B/ og gp39/CD40 reaksjonsveiene hemmer utvikling av kronisk transplantat blodåresykdom i transplanterte vev. Disse resultater viser at immun-responsene mot allogene og xenogene transplantater kan hemmes uten cellegift-behandling. Sammenlignet med bruk av løselige CTLA4-molekyler alene gir bruken av løselige CTLA4-molekyler sammen med en løselig ligand som gjenkjenner og binder gp39 dramatisk forlenget immunsuppresjon.

De følgende eksempler blir presentert for å illustrere den foreliggende oppfinnelse og i å hjelpe en med normal kunnskap i faget i å utføre og bruke oppfinnelsen.

Eksempel 1

Resultatene i dette eksempel viser at samtidig blokade av CD28 og CD40 signaler fjerner alloimmunresponser i knehaselymfeknute in vivo.

Metode

C3H/Hej hannmus (The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) ble immunisert subkutant med 2 x 10<6> BALB/c splenocytter i 50 ml sterilt saltvann i den venstre fotputen og 50 ml sterilt normalt saltvann i den høyre fotputen på dag 0 og deretter behandlet intraperitonealt med MR1 (250 mg), CTLA4-lg (250 mg), eller begge reagenser på dag 0, 2 og 4.

Musene ble avlivet på dag 5, lymfeknutene i knehasene ble samlet ved hjelp av et operasjonsmikroskop (20 x forstørrelse) og den ferske vekt av hver knute ble bestémt til den nærmeste 0,1 mg med en analytisk vekt (Model A-160, Denver Instrument Company, Arvada, CO).

Diskusjon

Fem dager etter subkutan immunisering med allogene splenocytter gjennom-gikk de drenerende lymfeknuter i knehasen på hver side av antigenprovokasjon en

>5 gangers økning i vekt sammenlignet med den kontralaterale knute i ubehandlede kontrollmus. Behandling med enten CTLA4-lg eller MR1 resulterte i en 50-60%

hemning av denne respons, mens samtidig tilførsel av CTLA4-lg og MR1 fjernet lymfeknuteforstørrelsen som svar på antigenprovokasjon. Resultatene representerer gjennomsnitt + standard avvik for 3 individuelle mus i hver gruppe. Lignende resultater ble oppnådd i 3 uavhengige eksperimenter.

Kontrollmus fremviste en 4-6 gangers økning i vekten av knuten som drenerte den immuniserte fot sammenlignet med knuten som drenerte den kontralaterale fot som ble injiserte med sterilt saltvann (fig. 1). Denne økning i vekt ble akkompagnert av en dramatisk ekspansjon av de lymfocyttrike parakortikale (T-celle) og kortikale (B-celle) regioner. Når de ble tilført alene ga CTLA4-lg og MR1 hver delvis hemning av denne respons (henholdsvis 57% og 56% hemning). Kombinasjonen av CTLA4-lg/MR1 fjernet lymfeknuteekspansjonen (98% hemning, fig. 1) og forhindret ekspansjon av de parakortikale og lymfoide follikler.

Eksempel 2

Dette eksempel viser prolongering av overlevelse av hjerte allotransplantat og hemning av blodåresykdom assosiert med kronisk forkastelse.

Metode

C3H/Hej hannmus ble transplantert med primært vaskulariserte BALB/c hjerte allotransplantater ved 8-12 ukers alder ved hjelp av mikrokirurgiske teknikker (Corry, R.J., Winn, H.J. & Russell, P.S. Transplantation 16, 343-350 (1973)).

Forkastelse ble definert som tap av følbar hjertekontraksjoner med direkte visuell bekreftelse ved operasjon. Ved spesifikke tidspunkter etter transplantasjonen ble de transplanterte hjerter skåret ut, fiksert i formalin og innstøpt i parafin. Vevssnitt (5 mm) ble farvet med Massons Trichrome eller hematoksylin-eosin. Hvert histologisk preparat ble studert av en hjerteplantasjonspatolog (KJW) som ikke hadde informasjon om behandlingstypen.

Diskusjon

l fig. 2A ble C3H/Hej mottagere behandlet med CTLA4-lg (200 mg/dose) på dagene 0, 2,4 og 6 kombinert med MR1 (250 mg/dose) på dagene 0, 2 og 4, og hadde langtidsoverlevelser av BALB/c hjerte allotransplantater (gjennomsnittlig overlevelsestid (MST) >70 dager, n = 7). Kontrollgruppene inkluderte mottagere

behandlet med: Bare CTLA4-lg (MST = 50 dager n = 12); bare MR1 (MST =70 dager, n = 12); dg ingen behandling (MST = 12 dager, n = 7).

Alle mottagere ble fulgt i 70 dager med unntak av tre mus som hadde intakte transplantater i hver eksperimentell gruppe, som ble avlivet med henblikk på histologisk analyse 58-63 dager etter transplantasjon.

I fig. 2B viser CTLA4-lg-behandlede hjerte allotransplantater ved dag 62 utstrakt lymfocyttinfiltrasjon, interstitiell fibrose og alvorlig fortykkelse av intimia i kransarterier og fibrose som er i overensstemmelse med kronisk forkastelsesreaksjon.

I fig. 2C viser MR1 -behandlet hjerte allotransplantat ved dag 62 mindre lymfocyttinfiltrasjon og interstitiell fibrose, men alvorlig blodåresykdom i kransarterier karakteristisk for kronisk forkastelse.

I fig. 2D viser CTLA4-lg/MR1 behandlede hjerte allotransplantater ved dag 58 i tydelig kontrast til de foregående at de er bemerkelsesverdig fri for lymfocytt-infiltrasjoner, fibrose og, av størst betydning, lesjoner i kransarterienes intima. Parenchymet og blodårene i disse transplantatene var så og si identiske med normale ikke-transplanterte BALB/c hjerter.

I fig. 2E vises normale utransplanterte BALB/c hjerter.

Lignende histologiske resultater ble funnet i tre allotransplantater i eksperimentell gruppe. C3H/Hej (H-2k) mottagere behandlet med enten bare CTLA4-lg, bare MR1 eller CTLA4-lg/MR1 viste alle forlenget overlevelse av BALB/c (H-2d) hjerte allotransplantater når de var sammenlignet med ubehandlede kontroller (fig. 2A). Imidlertid var forskjeller tydelige når de ble studert histologisk 58-62 dager etter transplantasjon.

Alllotransplantater fra CTLA4-lg-behandlede mottagere viste utstrakt lymfocyttinfiltrasjon, interstitiell fibrose og alvorlig fortykning av kransåreintima, og med fibrose i overensstemmelse med kronisk forkastelse (fig. 2B). Mens allotrans-plantatet behandlet med MR1 viste mindre lymfocyttinfiltrasjon og interstitiell fibrose hadde disse transplantater også alvorlig koronar blodåresykdom av type karakteristisk for kronisk forkastelse (fig. 2C).

I markert kontrast til dette var allotransplantat fra CTLA4-lg/MR1 behandlede mottagere bemerkelsesverdig fri for lymfocyttinfiltrasjon, fibrose, og av størst betydning, lesjoner av intima i koronararteriene (fig. 2D). Faktisk var parenchymet og blodårene til disse transplantater så og si identiske med de som ble funnet i normale BALB/c hjerter (fig. 2E).

Eksempel 3

Dette eksempel viser blokade av T-cellecytokin og kostimulatorisk molekyl-transkriptekspresjon.

Metode

8 dager etter transplantasjon ble hjertetransplantatene fjernet og total RNA ble preparert fra vev ved hjelp av TRIzol reagens (GIBCO BRL. Gaithersburg, MD). cDNA ble syntetisert ved hjelp av 5 mg totalt RNA templat med et Superscript Preamplification System (GIBCO BRL, Gaitherburg, MD) i et sluttvolum på 20 ml. PCR-reaksjoner ble utført. PCR-produkter ble visualisert og etidiumbromidfarvede 1 % agarosegeler (BIO-RAD, Hercules, CA), 2% NuSieve GTG agarose (FMC BioProducts, Rockland, ME) geler. Gelbilder ble lagret ved hjelp av et UVP gel-dokumentasjonssystem 5000. Intensitet av bånd ble kvantifisert ved hjelp av Gelreader analysis software (National Center for Supercomputing Applications, Urbana, IL).

I fig. 3A ble ekspresjon av immunmediatortranskripter i transplantatet målt ved hjelp av RT-PCR i ubehandlede, MR1-behandlede, CTLA4-lg-behandlede og MR1/CTLA4-lg-behandlede hjerteallotransplantater.

Tre allotransplantater fra hver behandlingsgruppe og kontrollgruppen ble analysert 8 dager etter transplantasjon. Normalt hjertevev (N) og et syngent hjertetransplantat (S) 8 dager etter transplantat ble inkludert til sammenligning.

I fig. 3B fremvises grafisk gjennomsnitt av PCR-produkt båndintensiteter standard avvik.

Diskusjon

Ingen konsistent endring i ekspresjonen av f-cellecytokintranskriper for IL-2, IL-4, IL-10 og IFNg eller kostimulatoriske molekyltranskripter (B7-1 og B7-2) ble påvist mellom kontroll allotransplantatene (fig. 3A ubehandlet) og MR1 -behandlede allotransplantater (fig. 3A), mens CTLA4-lg delvis hemmet ekspresjon av IL-4 transkripter.

Allotransplantater fra mottagere behandlet med CTLA4-lg/MR1 viste en sterk nedgang i ekspresjon av både Th1 cytokin (IL-2 og IFNg) og Th2 cytokin (IL-3 og IL-10) transkripter. Imidlertid ble intratransplantat B7-1 og B7-2 kostimulatoriske molekyltranskripter bare redusert moderat i mottagere som var behandlet med CTLA4-lg/MR1.

PCT-reaksjoner med templat preparert uten revers transkriptase ga ingen produkter, selv ikke for det introløse GADPH-gen (fig. 3A, GADPH, ingen RT), noe som bekreftet fravær av kontaminerende genomisk DNA.

Intratransplantat B7-1 og B7-2 kostimulatoriske molekyltranskripter var bare svakt redusert i mottagere som var behandlet med CTLA4-lg/MR1 (fig. 3), noe som antyder at CD28/B7-ua<y>hengige eller CD40/gp39-uavhengige faktorer, slik som GMCSF (Larsen, C.P., et al. J. Immunol. 152, 5208-5219 (1994)), kan ha viktige regulerende effekter på ekspresjon av intratransplantat B7. Således gir MR1-mediert blokade av CD40 reaksjonsveien ikke bare hemming av T-celle beslektet hjelp for effektor APC, men forsterker evnen av CTLA4-lg i å hemme T-celle aktiveringstranskriptekspresjon innenfor allotransplantater. Disse resultater er i overensstemmelse med de fra våre in vitro studier som indikerer at mens bare MR1 har kun en moderat negativ virkning på celleproliferasjon i allogene blandede leukocyttreaksjoner potensierer det sterkt den inhibitoriske effekt av suboptimale konsentrasjoner av CTLA4-lg.

Eksempel 4

Dette eksempel demonstrerer forlengelse av musehud allotransplantatover-levelse ved bruk av C3H /HeJ-mus som mottok allotransplantater av fulltykkelseshud fra BALB/c-mus.

Metode

Segmenter av enten fulltykkelses hale- eller ørehud, omtrent 1 cm<2> i størrelse, ble transplantert til den posteriørlaterale brystkassevegg på mottagende mus og festet på denne plass med et kroppsomspennende plaster. Transplantatene ble deretter fulgt visuelt hver dag. Forkastelse ble definert som det komplette tap av synlig overhudstransplantatvev. Behandlingsprotokollene for MR1 og CTLA4-lg var som beskrevet overfor hjertetransplantatmottagerene i fig. 1. CyA (Sandoz, East Hanover, NJ) i en konsentrasjon på 50 mg/ml ble tilført i en hastighet på 0,5 ml/t (ca 20 mg/kg/dag) i 14 dager ved hjelp av en osmotisk pumpe (Alzet Model nr. 2002, Alza, Palto Alto, CA) som ble implantert i underhuden i mottagerens ryggområde samtidig med hudtransplantasjon, og fjernet 21 dager etter transplantasjon (Pereira, G.M., Miller, J.F. & Shevach, E.M. J. Immunol. 144, 2109-2116 (1990)). Etter avliving ble hudtransplantatet skåret ut, fiksert i formalin og innstøpt i parafin. Vevssnitt (5 mm) ble farvet med hematoksylin-eosin.

I fig. 4A vises at C3H/HeJ mottagere som var behandlet enten med bare MR1 (MST = 13 dager, n = 5) eller bare med CTLA4-lg (MST = 12 dager, n = 7) totalt forkastet MHC-ulike BALB/c hudtransplantater med den samme hastighet som ubehandlede kontrolldyr (MST = 13 dager, n = 5). I motsetning til dette fremviste allotransplantatene en markert forlenget overlevelse (MST >50, n = 15) når MR1 og CTLA4-lg ble tilført sammen i den perioperative periode.

I fig. 4B fremviser mus behandlet med bare CyA (MST = 30 dager, n = 4), CyA pluss CTLA4-lg (MST = 30 dager, n = 5) eller CyA og MR1 (MST = 32 dager, n = 4) alle sammen lignende og svakt forøket overlevelse av hudtransplantat. Overraskende nok ble den positive effekt av CTLA4-lg/MR1 på hudtransplantatoverlevelse borte ved samtidig tilførsel av cyklosporin (MST = 34 dager, n = 4).

I fig. 4C ble C3H mottagere av hudtransplantater fra BALB/c ikke behandlet (MST 10d, n = 3) eller behandlet med MR1 (MST 13d, n = 3), YTS191.1 (MST 14, n = 6), YTS191.1 og MR1 (MST 16d, n = 6), YTS191.1 og CTLA4-lg (MST 19d, n = 5) eller CTLA4-lg og MR1 (MST>50d, n = 22). Foreløpig har mer enn 53 blitt behandlet med CTLA4-lg/MR1. Av disse døde 2 på dag 13 og 21. Alle andre har forblitt friske gjennom hele eksperimentet uten tegn på vekttap, infeksjon eller ondartet sykdom.

Det sunne utseende på et BALB/c hudtransplantat på en C3H/HeJ mottager behandlet med CTLA4-lg/MR1 50 dager etter transplantasjon (fig. 4D), er i sterk kontrast med et kontrolltransplantat som holder på å frastøtes (fig. 4E). På hematoksylin-eosin farvede snitt viser det aksepterte transplantat 100 dager etter transplantasjon velbevart epidermis, hårrøtter og tilstøtende strukturer (fig. 4F), som er forskjellig fra et BALB/c hudtransplantat på en ubehandlet C3H/Hej mottager 8 dager etter transplantasjon som viser et utstrakt infiltrat av lymfocytter (fig. 4G).

Diskusjon

Effektene av CTLA4-lg og MR1, alene eller i kombinasjon, ble analysert på primære hudallotransplantatoverlevelse i mus (fig. 4). Til sammenligning ble mottagere også behandlet med CyA alene eller CyA kombinert enten med CTLA4-lg eller MR1. C3H/HeJ mottagere behandlet enten med bare MR1 eller bare CTLA4-lg avstøtte BALB/c hudtransplantater som var MHC-uforlikelige med den samme hastighet som ubehandlede kontroller (fig. 4A).

Mus behandlet bare med CyA, CyA pluss CTLA4-lg eller CyA og MR1 fremviste alle en beskjeden forlengelse av hudtransplantatoverlevelse (fig. 4B). Imidlertid ble alle disse allotransplantater tilslutt forkastet uten noen synlig virkning mellom medikamentene og CyA.

Som en rigorøs analyse av evnen som CD40/CD28 blokade har i å avbryte alloimmune responser studerte vi effektene av perioperativ behandling med CTLA4-lg og MR1, enten alene eller i kombinasjon, med henblikk på overlevelse av primære hudallotransplantater i mus. Til sammenligning ble mottagere også behandlet med CyA, et anti-CD4 monoklonalt antistoff (mAb) YTS191.1, eller med hvert av disse midlene kombinert med CTLA4-lg eller MR1 (fig. 4B og 4C). C3H/HeJ-mottagere behandlet enten med MR1, CTLA4-lg eller YTS191.1 alene avstøtte MHC-uforlikelige BALB/c hudtransplantater i hovedsak med samme hastighet som ubehandlede kontroller (fig. 4B og 4C). Mus behandlet med YTS191.1 og MR1, YTS191.1 og CTLA4-lg, bare CyA, CyA pluss CTLA4-lg, eller CyA og MR1 fremviste moderat forlenget overlevelse av hudtransplantater (fig. 4B og 4C). Imidlertid ble alle disse allotransplantater tilslutt avstøtt.

I motsetning til dette fremviste hudtransplantatene på mottagere som var behandlet både med MR1 og CTLA4-lg i den perioperative periode markert forlenget overlevelse. Visuell undersøkelse av disse allotransplantater 50 dager etter transplantasjon viste at transplantatene hadde sunt utseende, de var vel vaskularisert, bløte og hadde korte, hvite hår (fig. 4D). Histologisk viste de aksepterte transplantater vel bevart overhud, hårrøtter og tilstøtende strukturer (fig. 4F9. Overraskende nok var den positive virkning av CTLA4-lg/MR1 på overlevelse av hudtransplantater fjernet ved samtidig tilførsel av cyklosporin (fig. 4B).

Den påfallende potens denne effekt hadde var mest tydelig i den primære hudallotransplantasjonsmodell. Hverken CTLA4-lg eller MR1, alene eller med CyA, ga signifikant forlenget overlevelse av hudallotransplantater. Bare kombinasjonen av CTLA4-lg og MR1 produserte over 50 dags overlevelse av fullstendig MHC-uforlikelige hudallotransplantater. En lignende forlengelse i denne strenge test på inhibisjon av alloimmunresponsen har tidligere kun blitt observert ved bruk av aktive strategier som benytter fjernelse av immunceller og/eller hematopoietiske chimerr (Mayumi, H. & Good, R.A. J. Exp. Med. 169, 213-238 (1990); Ildstad, S.T. & Sachs, D.H., Nature 307,168-170(1984); llstad, S.T., et al. J. Exp. Med. 162,231-44

(1985); Cobbold, S.P., Martin, G., et al. Nature 323,164-166 (1986); Qin, S., et al.

Science 259, 974-977 (1993))!

Eksempel 5

For å studere effekten av blokade av CD28 og CD40 reaksjonsveiene på T-celleproliferasjon studerte vi den primære allogene blandet leukocyttreaksjonen ved å bruke T-celler fra både lek-begrensede due cytokrom c-reaktive (pcc-TCRTg) og Ld-alloreaktive (2C) T-cellereseptortransgené mus (REF HED og LOH). CTLA4-lg, et fusjonsprotein som binder til ligandene for CD28 og dets homolog CTLA4, ga effektiv inhibisjon av proliferasjon av alle disse tre T-celle populasjoner (fig. 5A).

I motsetning ga blokade av CD40 reaksjonsveien med hamster anti-gp39 monoklonalt antistoff, MR1, bare en moderat (omtrent 50%) hemning av proliferasjonen av C3H/HeJ T-celler som responderte til BALB/c dendrittceller, ga dramatisk inhibisjon (<3>85%) pcc-TCRTg T-celler i å reagere på cytokrom c, men hadde negliserbare virkninger på proliferasjon av 2C T-celler som responderte til Ld-bærende BALB/c dendrittceller (fig. 5A).

Videre ga samtidig blokade med disse midler hemning av T-celleproliferasjon i allogene blandet leukocyttreaksjoner og pcc-TCRTg T-celler, mens MR-1 ikke hadde noen effekt eller ga lett forøkning av proliferasjonen av 2C T-celler, når kombinert med CTLA4-lg (fig. 5A). Disse resultater indikerer at ikke alle T-celler er avhengig av CD40-signaler for klonal ekspansjon, og kan forklare den manglende evne som blokade av CD40 har i å gi komplett hemming av allotransplantat forkastelse.

Effekten som blokade av CD28 og CD40 har på T-celleresponser in vivo ble studert i C3H/HeJ (H-2k, MMTV-7)-immunsert med DBA/2(H-2d, MMTV-7+) miltceller i fotputene deres. Fem dager etter immunisering viste lymfeknutene i knehasene i kontrollmus behandlet med humant IgG en 4-6 ganger økning i vekt (fig. 5B). Dette ble fulgt av en 30 gangers økning i antall MMTV-7 superantigen-reaktive Vb+CD+4 T-celler og en mer enn 90 gangers økning i antall Vb-+CD+T-celleblaster inne i knehaselymfeknuten. Tilført alene ga CTLA4-lg eller MR1 delvis hemning av disse responser. I motsetning til dette ga kombinasjonen av CTLA4-lg/MR1 en så og si komplett inhibisjon av økningen i lymfeknutestørrelse og ekspansjonen og dannelsen av Vb+CD+4-T-celleblaster (fig. 5B).

Disse data viser at samtidig blokade av CD28 og CD40 reaksjonsveiene hemmer komplekse T-avhengige immunresponser in vitro og in vivo.

Eksempel 6

Dette eksempel viser at samtidig blokade av CD28 og CD40 reaksjonsveiene gir markert hemning av både den cellulære og antistoff responsen overfor xenoantigen, og langtidsakseptering av xenogene (rotte til mus) hjerte- og hudtransplantater uten behov for en celledrepende tilpassende behandling.

Metode

LYMFEKNUTEANALYSE. C3H (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) hannmus ble immunisert med 2 x 10<6> hann Sprague-Dawley (Harlan, Indianapolis, IN) bestrålte (2000 RADS) rotte miltceller i 50 uJ sterilt normalt saltvann i den venstre fotpute og med 50 jjl! av sterilt normalt saltvann i den høyre fotpute og deretter behandlet intraperitonealt (i.p.) med MR1 (500 u.g), CTLA4-lg (500 jxg) eller begge reagenser (500 |ig hver) på dagene 0, 2 og 4. På dag 5 ble knehaselymfeknutene fjernet, veiet og deretter løsnet fra hverandre, og vasket før de ble resuspendert i 600 |il av RPM11640 med 10% FBS (Mediatech, Herndon, VA). Hver resuspenderte lymfeknute ble deretter delt i fire like deler (150 ul hver). Tre av delene ble platet inn i en 96-brønns plate. <3>H-tymidin (1 uCi/brønn) (Amersham, Arlington Heights, IL) inkorporering ble målt etter 24 timers inkubering ved 37°C. Resultatene for hvert individuelt dyr representerer derfor gjennomsnittet av de 3 brønner pr knute. Den fjerde del ble inkubert i 24 timer ved 37°C og dannet en kilde for supematant for cytokinanalyse med ELISA. Hvert punkt på alle de grafiske figurer representerer gjennomsnitt ± standard avvik fra 5 mus pr gruppe. Eksperimentet ble gjentatt med lignende resultater.

CYTOKIN ELISA. Brødskive ELISA ble utført med parrede antistoff {anti-IL-2, anti-IFN-gamma, anti-IL-2 biotin, anti-IL-4-biotin, anti-IFN-gamma biotin (Pharmingen, San Diego, CA), anti IL4 (gave fra Peter Jensen)} og streptavidin-HRP

(Pierce, Rockford, IL). Kolorimetrisk deteksjon ble analysert med TMB substrat (Pierce). Data ble samlet ved å bruke SpectraMax plateleser og plottet som optisk tetthet (370 nm) +/- sem. Standard kurver for hvert cytokin ble produsert ved hjelp av rekombinant cytokin (rlL2, Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN; rlL4, R&D Systems, Minneapolis, MN; og rIFN-gamma, Biosource International, Camarillo, CA).

MUS. C3H/Hej (H-2k) og DBA/2 (H-2d) hannmus og Sprague-Dawley rotter ble kjøpt fra The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) og benyttet ved 8-12 ukers alder.

HJERTETRANSPLANTASJON. C3H/HeJ eller DBA mus ble transplantert med primært vaskulariserte Sprague-Dawley rottehjerte xenotransplantater og fulgt med henblikk på forkastelse som beskrevet i Larsen C.P., Alexander D.Z., Hollenbaugh D., et al., Transplantation, 61(1):4-9 (1996) og Corry R.J., Winn H.J., Russell P.S., Transplantation 16(4):343-350 (1973). Mottagére ble behandlet med 500 mg CTLA4-lg kombinert med 500 mg MR1 på dagene 0, 2 og 6. Kontrollgruppene inkluderte mottagere som var behandlet bare med CTLA4-lg, bare MR1 eller humant lg. Parafininnstøpte vevssnitt (5 urn) ble farvet med Massons Trichrome eller hematoksylin-eosin. Histologiske prøver ble analysert av en hjerte-transplantasjonspatolog (KJW) som ikke visste om behandlingstypen.

HUDTRANSPLANTASJON. Fullhudstransplantater (omtrent 1 cm<2>) fra Sprague-Dawley rotter ble transplantert på ryggsiden av brystkassen til C3H mottagermus, og overlevelse ble fulgt ved hjelp av visuell inspeksjon hver dag. Forkastelse ble definert som det komplette tap av synlig overhudstransplantatvev. Kontrollgrupper inkluderte mottagere behandlet med: Bare CTLA4-lg, bare MR1 og humant lg. To ytterligere mus i hver eksperimentell gruppe ble avlivet 20 dager etter transplantasjon med henblikk på histologisk analyse.

XENOANTISTOFF-ANALYSE. Serum ble samlet fra halevenen fra anesteserte dyr. Enkeltcellesuspensjoner fra lymfeknutene til en Sprague-Dawley rotte ble benyttet som målceller, og inkubert med mottagermusserum i 20 min ved 4°C. Cellene ble vasket og IgG xenoantistoff ble påvist ved hjelp av esel antimus IgG Biotin (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA) etterfulgt av streptavidin-PE (Southern Biotech, Birmingham, AL). Cellene ble analysert på en Becton-Dickinson FACscan ved hjelp av Cellquest Software.

Resultater

Som en første tilnærming for å bestemme effektene av CD28 og CD40 blokade for responsene overfor xenoantigen provokasjon in vivo benyttet i knehase lymfeknutemetoden som beskrevet hos Larsen C.P., Elwood E.T., Alexander D.Z., et al., Nature, 381:434-438 (1996). C3H/HeJ (H-2k) mus ble injisert med bestrålede miltceller fra Sprague-Dawley (SD) rotter. Fem dager etter immunisering i fotputen viste de drenerende lymfeknuter i knehasene hos kontrollmus som var behandlet med humant IgG en 5,2 gangers økning i vekt sammenlignet med kontralateral knute som var inokulert med sterilt saltvann (fig. 6A). CTLA4-lg ga delvis hemning av lymfeknuteøkningen. På samme måte ga MR1 delvis hemning av denne respons. I motsetning til dette ga kombinasjonen av CTLA4-lg/MR1 så og si total inhibisjon av xenoantigenindusert lymfeknuteøkning (fig. 6A).

Vi sammenlignet deretter ex vivo proliferasjon av lymfekhuteceller fra de ulike gruppene av xenoantigenbehandlede mus. Mens de enkelte behandlinger isolert bare ga delvis inhibisjon av proliferasjonen (fig. 6B) ga kombinasjonen av CTLA4-lg/- MR1 en så og si komplett hemning av den proliferative respons (302+/-235 CPM for kombinasjonen, sammenlignet med 143+/-145 for en normal ustimulert knute.

Videre ga kombinasjonsterapi en markert suppresjon av TH1 cytokiner (IL-2 og IFNg) til nivået i normale ustimulerte celler (fig. 6C og 6D). Nivåene av Th2 cytokinet IL4 var under deteksjonsnivået i alle prøver.

Det er viktig å merke seg at denne kraftige immunmodulering ikke er resultat av at celler dør. Strømningscytometrisk analyse av perifert blod hos behandlede mus viser ingen nedgang i CD4+ eller CD8+ T-celler, B-celler eller NK-celler. Disse data kommer fra en individuell analyse fra 3 mus pr gruppe behandlet enten med CTLA4-lg eller MR1 alene eller i kombinasjon på dagene 0,2, 4 og 6 som beskrevet

i metodedelen. Perifert blod ble samlet fra halenvenen på dagene 6 og 20. Resultatene av lymfeknuteanalysen antydet at samtidig blokade av B7/CD28 og CD40/gp39 reaksjonsveiene ville hemme forkastelsen av xenotransplantat. For å studere denne hypotesen analyserte vi en vaskularisert hjerte xenotransplantat-modell ved bruk av Sprague-Dawley rotter som givere og C3H/HeJ mus som mottagere. Behandling enten med CTLA4-lg (MST = 33 dager) eller MR1 (MST = 51 dager) hver for seg forlenget xenotransplantatoverlevelse i sammenligning med ubehandlede kontroller (MST = 6 dager) (fig. 7A). Imidlertid ga kombinasjonen av CTLA4-lg/MR1 en markert forlenging av overlevelse (MST = 104,5 dager).

Ved histologisk analyse 20 dager etter transplantasjon viste xenotransplanter behandlet enten bare med CTLA4-lg (fig. 7C) eller MR1 (fig. 7D) et kraftig lymfocytt-infiltrat med bevis for destruksjon av muskelceller og blodåresykdom, tilsvarende moderat til alvorlig cellulær forkastelse. I klar kontrast til dette var xenotransplantatene fra mottagere behandlet med CTLA4-lg/MR1 i all hovedsak uten lymfocyttinfiltrasjon, uten interstitiell fibrose og uten lesjoner i kransårenes intima (fig. 7F). CTLA4-lg/MR1 -behandlede hjerte xenotransplantater fremviste utmerket bevaring av både muskelceller og blodårestrukturer på dag 122 (fig. 7G). Ubehandlede xenotransplantater viste utstrakt vevsdestruksjon ved dag 6 (fig. 7B). Et normalt ikke-trahsplanter Sprague-Dawley rottehjerte er vist i fig. 7E.

Som en mer stringent test på evnen som blokade av CD40/CD28 har i å hemme xenogene immunresponser studerte vi effektene av korttidsblokade av DC28 og/eller CD40 på overlevelse av primære hud xenotransplantater hos mus.

C3H-mottagere behandlet enten med MR1 (MST = 11,5 dager, n = 4) eller CTLA4-lg (MST = 12 dager, n = 4) forkastet fullhudstransplantater fra Sprague-Dawley rotter med samme hastighet som ubehandlede kontroller (ubehandlede kontroller MST = 11,5 dager, n = 8) (fig. 8A). I motsetning til dette viste hud xenotransplantatene på mottagere som var behandlet med samtidig MR1 og CTLA4-lg i den perioperative periode markert forlenget overlevelse (MST = 53 dager, n = 25)

(fig. 8A). Totalt 25 mus mottok xenotransplantater og behandling med CTLA4-lg/- MR1. Med unntak av en mus som døde på dag 4 har alle de andre forblitt friske gjennom hele eksperimentet, uten tegn på vekttap, infeksjon eller ondartet utvikling.

Kronisk behandling (påbegynt etter det standard 4 dosers opplegg) med enten kombinasjonen av CTLA4-lg/MR1 (500 jig av begge midler hver uke til dag 100 eller forkastelse avhengig av hva som kommer først) eller MR1 (500 ug MR1 hver uke til dag 100 eller forkastelse) ga ingen signifikant endring i opplevelse av xenotransplantat (fig. 8B).

Xenotransplantat overlevelse etter samtidig MR1/CTL4-lg terapi var henholdsvis 52% og 21 % ved 50 og 100 dager etter transplantering. Xenotransplantatene som overlevde ved 50 (fig. 8E) og 100 (fig. 8C) dager etter transplantansjon syntes å være friske i utseende og fremviste en godt bevart histologisk arkitektur. I ubehandlede kontroller uten kombinasjonsterapi ble transplantatene raskt forkastet, og disse xenotransplantater viste markerte betennelsesinfiltrater (fig. 8D og 8F).

Lignende forlengelse av hud xenotransplantater fra Sprague-Dawley rotter ble også observert i DBA[H-2d]) mottagere (ubehandlede kontroller, MST = 14 dager, n = 5) sammenlignet med CTLA4-lg/MR1 MST = 86 dager, n = 5), noe som antyder at den kraftige effekten av kombinasjonsbehandling ikke er begrenset til en enkelt mottager musestamme.

Det progressive tap av hud xenotransplantater mellom 25 og 75 dager etter transplantasjon antydet at sensvikt av transplantatene kunne være forårsaket av subterapeutiske konsentrasjoner av CTLA4-lg og/eller MR1. For å studere denne mulighet ble mus etter standard 4-dose kombinasjonsopplegget behandlet hver uke enten med CTLA4-lg/MR1 kombinasjonen eller med bare MR1 i 100 dager eller til transplantattap oppstod. Ingen av disse kroniske behandlingsstrategier ga merkbar forbedret overlevelse av hud xenotransplantat, noe som antyder at transplantatsvikt i CTLA4-lg/MR1 -behandlede mus resulterer fra andre faktorer enn inadekvate medikamentnivåer, og at alternative reaksjonsveier som ikke er totalt hemmet av CTLA4-lg/MR1 kan være viktige i subakutt tap av xenotransplantat.

I tillegg til cellemediert effektormekanismer kan fremkalte xenoantistoffresponser også være viktig involvert i akselerert blodforkastelse av overens-stemmende xenotransplantater, Aksentijevich I., Sachs D.H., Sykes M., Transplantation, 53(5):1108-14 (1992). For å teste effekten av samtidig blokade på de fremkalte xenoantistoffresponser ble serumprøver fra C3H/HeJ-mus analysert med henblikk på antirotte-antistoff 55 dager etter at de mottok et Sprague-Dawley rotte hudtransplantat (fig. 9A) og 20 dager etter å ha mottatt et Sprague-Dawley rotte hjertetransplantat (fig. 9B). Behandling med enten bare CTLA4-lg eller MR1 senket IgG antistoff responsen, mens den samtidige kombinasjon av CD28/CD40 blokade så og si totalt eliminerte den fremkalte antistoffrespons overfor rotte xenoantigener. Således kunne hemning av både T-celleaktivering og antistoffproduksjon være funksjonelt viktig i overlevelse av xenotransplantater etter simultanblokade av B7/CD28 og CD40/gp 39 reaksjonsveiene.

Diskusjon

Kombinert blokade av CD28 og CD40 reaksjonsveiene gir markert hemning av immunresponene overfor xenoantigen. Potensen av denne kombinasjonsterapi var helt spesielt tydelig demonstrert i den primære hud xenotransplantasjonsmodell. Ingen av midlene, når benyttet alene førte til forlengelse av hud xenotransplantatets overlevelse. I motsetning ga samtidig kombinasjon av CTLA4-lg og MR1 en ko-operativ hemning av xenotransplantatforkastelsen. Disse unike funn baserer seg på hudtransplantasjonsmodellens stringens, siden behandling med bare CTLA4-lg tidligere har blitt vist å forlenge overlevelse av xenogene bukspyttkjerteløyer i en musemodell, Lenschow D., Zeng Y., Thistlethwaite J., et al., Science, 257:789-792

(1992). Langtidsoverlevelse av xenogene hudtransplantater har tidligere bare blitt observert ved bruk av kraftige celledrepende og/eller hematopoietisk chimerbaserte strategier, Ildstad S.T., Sachs D.H., Nature, 307:168-170 (1984), Zhao Y., Swenson K., Sergio J., Am J.S., Sachs D.H., Sykes M., Nat. Med., 2(11):1211-1216 (1996), Mayumi H., Good R.A., J. Exp. Med., 169(1 ):213-238 (1990), Cobbold S.P., Martin G., Zin S., Waldmann H., Nature, 323:164-166 (1986), Qin S., Cobbold S., Benjamin R., Waldmann H., J. Exp. Med., 169:779-794 (1989).

Observasjonen av samtidig blokade av CD28/CD40 reaksjonsveiene dramatisk kan forlenge overlevelse av xenotransplantater antyder at både antistoff og cellemedierte mekanismer involvert i ødeleggelse av xenotransplantatet kan effektivt bli hindret av denne strategi. Selv om årsaksforholdene ved akutt vaskulær xenotransplantatforkastelse forblir inkomplett definert er det evidens for at den frem-kalles, i hvertfall delvis, av utvikling av xenoreaktive antistoff (Cotterell A.H., Collins B.H., Parker W., Harland R.C., Platt J.L., Transplantation, 60(8):861-868 (1995)). Den raske ødeleggelse av ubehandlede kontroll hjerte xenotransplantater i vår modell, i fravær av et cellulært infiltrat, antyder en rolle for antistoff mediert forkastelse. Denne observasjon og lignende fra andre (Aksentijevich I., Sach D.H., Sykes M., Transplantation, 53(5):1108-14 (1992)), kombinert med den dokumenterte dramatisk hemning av den fremkalte xenoantistoffrespons etter blokade av CD28 og CD40 reaksjonsveiene (fig. 9A og 9B) støtter hypotesen at xenoresponser kan bli kontrollert tilstrekkelig ved hjelp av inhibisjon av disse to reaksjonsveier slik at utvikling av strategier som ikke baserer seg på celleødeleggelse med henblikk på xenotransplantasjon i uoverensstemmende kombinasjoner av arter.

Mens kombinert blokade av DC28 og CD40 reaksjonsveiene gir markert hemning av xenotransplantasjons-forkastningsresponsen ga denne blokade ikke generell og uendelig overlevelse av hjerte- eller hudtransplantater i vårt eksperimentelle system. Observasjonen at forlenget behandling ikke forbedret transplantat-overlevelse var overraskende. Dette antyder at inadekvat blokade av disse reaksjonsveier ikke er årsaken til «sen» transplantasjonssvikt, og antyder muligheten at alternative reaksjonsveier, slik som NK-celler eller andre celler som ikke krever CD28/CD40 kostimulering, kan fremme sen forkastelse av xenotransplantat. Evidens for at NK-celler bidrar til forkastelse av xenotransplantat støtter denne mulighet, Zhao Y., Swenson K., Sergio J., Am J.S., Sachs D.H., Sykes M., Nat. Med., 2(11)1211-1216 (1996), Malyguine A.M., Saadi S., Platt J.L, Dawson J.R., Transplantation, 61 (1 ):161 -164 (1996). I tillegg har vi vist at hemning av overens-stemmende hjerte og hud xenotransplantater ved hjelp av samtidig blokade av CD40 og CD28 reaksjonsveiene er assosiert med forebygging av den «sene» utvikling av de fremkalte xenoreaktive antistoffresponsene (fig. 9A og 9B) og vi har ikke ekskludert muligheten for å utviklingen av en antistoffrespons kan være assosiert med forsinket tap av transplantat.

Evnen som kombinert CTLA4-lg/MR1 behandling har i å blokkere utvikling av transplantat blodåresykdom i hjerte xenotransplantater og i å forlenge hud xenotransplantater har signifikant klinisk relevans. Forbedring av teknikker som skal hemme effektene av naturlige på forhånd dannede xenoreaktive antistoff, kombinert med videre studie av CD28 og CD40 reaksjonsveiblokade, antyder muligheter for effektive nye strategier som kan fascilitere klinisk xenotransplåntasjon.

Claims

1. Anvendelse av en effektiv mengde av en kombinasjon av en første løselig ligand som hindrer et CTLA4 antigen på en CTLA4-positiv celle og/eller et CD28 antigen på en CD28-positiv celle fra binding av et B7 antigen, og en andre løselig ligand som hindrer et gp39 antigen på en gp39-positiv celle fra binding av et CD40 antigen for fremstilling av en farmasøytisk blanding for å hemme transplantatforkastelse mediert av CTLA4-positive, CD28-positive og gp39-positive celleinteraksjoner med B7-positive og CD40-positive celler, hvor transplantatet er et primært vaskularisert transplantat.

2. Anvendelse ifølge krav 1, av en effektiv mengde av en kombinasjon av en første løselig ligand som hindrer et CTLA4 antigen på en CTLA4-positiv celle og/eller et CD28 antigen på en CD28-positiv celle fra binding av et B7 antigen, og en andre løselig ligand som hindrer et gp39 antigen på en gp39-positiv celle fra binding av et CD40 antigen for fremstilling av en farmasøytisk blanding for å hemme akutt og kronisk transplantatforkastelse mediert av CTLA4-positive, CD28-positive og gp39-positive celleinteraksjoner med B7-positive og CD40-positive celler, hvor transplantatet er et primært vaskularisert transplantat.

3. Anvendelse ifølge krav 1, av en effektiv mengde av en kombinasjon av en første løselig ligand som hindrer et CTLA4 antigen på en CTLA4-positiv celle og/eller et CD28 antigen på en CD28-positiv celle fra binding av et B7 antigen, og en andre løselig ligand som hindrer et gp39 antigen på en gp39-positiv celle fra binding av et CD40 antigen for fremstilling av en farmasøytisk blanding for å hemme kronisk vaskulær transplantatforkastelse mediert av CTLA4-positive, CD28-positive og gp39-positive celleinteraksjoner med B7-positive og CD40-positive celler, hvor transplantatet er et primært vaskularisert transplantat.

4. Anvendelse av en effektiv mengde av en kombinasjon av en første løselig ligand som hemmer CTLA4 antigen på en CTLA4 -positiv celle og/eller et CD28 antigen på en CD28-positiv celle fra binding av et B7 antigen og en andre løselig ligand som hindrer et CD40 antigen og CD40-positive celler fra binding av et gp39 antigen for fremstilling av en farmasøytisk blanding for inhibering av transplantatforkastelse mediert av CTLA4-positive, CD28-positive og gp39-positive celleinteraksjoner med B7-positive og CD40-positive celler, hvor transplantatet er et primært vaskularisert transplantat.

5. Anvendelse ifølge krav 4, av en effektiv mengde av en kombinasjon av en første løselig ligand som hemmer CTLA4 antigen på en CTLA4 -positiv celle og/eller et CD28 antigen på en CD28-positiv celle fra binding av et B7 antigen og en andre løselig ligand som hindrer et CD40 antigen og CD40-positive celler fra binding av et gp39 antigen for fremstilling av en farmasøytisk blanding for inhibering av akutt eller kronisk transplantatforkastelse mediert av CTLA4-positive, CD28-positive og gp39-positive celleinteraksjoner med B7-positive og CD40-positive celler, hvor transplantatet er et primært vaskularisert transplantat.

6. Anvendelse ifølge krav 4, av en effektiv mengde av en kombinasjon av en første løselig ligand som hemmer CTLA4 antigen på en CTLA4 -positiv celle og/eller et CD28 antigen på en CD28-positiv celle fra binding av et B7 antigen og en andre løselig ligand som hindrer et CD40 antigen og CD40-positive celler fra binding av et gp39 antigen for fremstilling av en farmasøytisk blanding for inhibering av kronisk vaskulær transplantatforkastelse mediert av CTLA4-positive, CD28-positive og gp39-positive celleinteraksjoner med B7-positive og CD40-positjve celler, hvor transplantatet er et primært vaskularisert transplantat.

7. Anvendelse av en effektiv mengde av en kombinasjon av en første løselig ligand som hindrer et B7 antigen på B7-positive celler fra binding av CTLA4 antigen på en CTLA4-positiv celle og/eller et CD28 antigen på en CD28-positiv celle, og en andre løselig ligand som hindrer et gp39 antigen på en gp39-positiv celle fra binding av et CD40 antigen for fremstilling av en farmasøytisk blanding for å hemme transplantatforkastelse mediert av CTLA4-positive, CD28-positive og gp39-positive celleinteraksjoner med B7-positive og CD40-positive celler, hvor transplantatet er et primært vaskularisert transplantat.

8. Anvendelse ifølge krav 7, av en effektiv mengde av en kombinasjon av en første løselig ligand som hindrer et B7 antigen på B7-positive celler fra binding av CTLA4 antigen på en CTLA4-positiv celle og/eller et CD28 antigen på en CD28-positiv celle, og en andre løselig ligand som hindrer et gp39 antigen på en gp39-positiv celle fra binding av et CD40 antigen for fremstilling av en farmasøytisk blanding for å hemme akutt eller kronisk transplantatforkastelse mediert av CTLA4-positive, CD28-positive og gp39-positive celleinteraksjoner med B7-positive og CD40-positive celler, hvor transplantatet er et primært vaskularisert transplantat.

9. Anvendelse ifølge krav 7, av en effektiv mengde av en kombinasjon av en første løselig ligand som hindrer et B7 antigen på B7-positive celler fra binding av CTLA4 antigen på en CTLA4-positiv celle og/eller et CD28 antigen på en CD28-positiv celle, og en andre løselig ligand som hindrer et gp39 antigen på en gp39-positiv celle fra binding av et CD40 antigen for fremstilling av en farmasøytisk blanding for å hemme kronisk vaskulær transplantatforkastelse mediert av CTLA4-positive, CD28-positive og gp39-positive celleinteraksjoner med B7-positive og CD40-positive celler, hvor transplantatet er et primært vaskularisert transplantat.

10. Anvendelse av en effektiv mengde av en kombinasjon av en første løselig ligand som hemmer et B7 antigen på en B7-positiv celle fra binding av et CTLA4 antigen på en CTLA4-positiv celle og/eller et CD28 antigen på en CD28-positiv celle, og en andre løselig ligand som hindrer et CD40 antigen på CD40-positive celler fra binding av et gp39 antigen, for fremstilling av en farmasøytisk blanding som hemmer transplantatforkastelse mediert av CTLA4-positive, CD28-positive og gp39-positive celleinteraksjoner med B7-positive og CD40-positive celler, hvor transplantatet er et primært vaskularisert transplantat.

11. Anvendelse ifølge krav 10, av en effektiv mengde av en kombinasjon av en første løselig ligand som hemmer et B7 antigen på en B7-positiv celle fra binding av et CTLA4 antigen på en CTLA4-positiv celle og/eller et CD28 antigen på en CD28-positiv celle, og en andre løselig ligand som hindrer et CD40 antigen og CD40-positive celler fra binding av et gp39 antigen, for fremstilling av en farmasøytisk blanding som hemmer akutt og kronisk transplantatforkastelse mediert av CTLA4-positive, CD28-positive og gp39- positive celleinteraksjoner med B7-positive og CD40-positive celler, hvor transplantatet er et primært vaskularisert transplantat.

12. Anvendelse ifølge krav 10, av en effektiv mengde av en kombinasjon av en første løselig ligand som hemmer et B7 antigen på en B7-positiv celle fra binding av et CTLA4 antigen på en CTLA4-positiv celle og/eller et CD28 antigen på en CD28-positiv celle, og en andre løselig ligand som hindrer et CD40 antigen og CD40-positive celler fra binding av et gp39 antigen, for fremstilling av en farmasøytisk blanding som hemmer kronisk vaskulær transplantatforkastelse mediert av CTLA4-positive, CD28-positive og gp39-positive celleinteraksjoner med B7-positive og CD40-positive celler, hvor transplantatet er et primært vaskularisert transplantat.

13. Anvendelse ifølge krav 1-3 eller 4-6, hvor den første løselige liganden som hindrer CTLA4 antigen på CTLA4-positive celler og/eller CD28 antigen på CD28-positive celler fra binding av et B7 antigen er et antistoff reaktivt med CTLA4, et antistoff reaktivt med CD28, eller et løselig B7.

14. Anvendelse ifølge krav 7-9 eller 10-12, hvor den første løselige ligand som hemmer et B7 antigen på B7-positive celler fra binding av et CD28 antigen på CD28-psoitive celler og/eller et CTLA4 antigen på CTLA4-positive celler er et antistoff reaktivt med B7, et løselig CTLA4, eller løselig CD28.

15. Anvendelse ifølge krav 14, hvor det løselige CTLA4 er et rekombinant bindingsmolekyl som har minst en del av et ekstracellulært domene av CTLA4.

16. Anvendelse ifølge krav 15, hvor det ekstracellulære domene av CTLA4 er bundet til en ikke-CTLA4 proteinsekvens.

17. Anvendelse ifølge krav 16, hvor den ikke-CTLA4 proteinsekvensen er i det minste en del av et immunoglobulin.

18. Anvendelse ifølge krav 14, hvor det løselige CTLA4 er et CTLA4lg-fusjonsprotein.

19. Anvendelse ifølge krav 18, hvor CTLA4lg-fusjonsproteinet er CTLA4lg betegnet ATCC 68629.

20. Anvendelse ifølge krav 14, hvor det løselige CTLA4 er en CD28lg/CTLA4lg-fusjonsproteinhybrid.

21. Anvendelse ifølge krav 20, hvor CD28lg/CTLA4lg-fusjonsproteinhybriden omfatter en første aminosyresekvens som tilsvarer en del av det ekstracellulære domene av CD28 reseptor fusjonert med en andre aminosyresekvens som tilsvarer en del av det ekstracellulære domene av CTLA4 reseptor og en tredje aminosyresekvens tilsvarende til hengsel CH2 og CH3 regioner av humant immunoglobulin Cyl.

22. Anvendelse ifølge krav 14, hvor det løselige CD28 er et rekombinant bindingsmolekyl som har minst en del av det ekstracellulære domene av CD28.

23. Anvendelse ifølge krav 14, hvor det løselige CD28 er en CD28lg/CTLA4-fusjonsproteinhybrid.

24. Anvendelse ifølge krav 1 -3 eller 7-9, hvor den andre løselige liganden som hemmer gp39 antigen på gp39-positive celler fra binding til CD40 antigen er et antistoff reaktivt med gp39 eller et løselig CD40.

25. Anvendelse ifølge krav 4-6 eller 10-12, hvor den andre løselige liganden som hemmer et CD40 antigen på CD40-positive celler fra binding til et gp39 antigen er et antistoff reaktivt med CD40 eller løselig gp39.

26. Anvendelse ifølge krav 24, hvor antistoffet reaktivt med gp39 er et MR1 monoklonalt antistoff.

27. Anvendelse ifølge et hvilket som helst av krav 1 til 26, for hemming av forkastelse av autotransplantater, isotransplantater, allotransplantater og xenotransplantater.

28. Anvendelse ifølge krav 27, for hemming av kronisk transplantat vaskulopati.