NO325831B1

NO325831B1 - Farmasoytiske komponenter innbefattende humant paratyroidhormon.

Info

Publication number: NO325831B1
Application number: NO20026055A
Authority: NO
Inventors: Yoshiharu Minamitake; Tetsu Ono; Koji Kawanishi; Yuji Suzuki
Original assignee: Asubio Pharma Co Ltd
Priority date: 2000-06-30
Filing date: 2002-12-17
Publication date: 2008-07-28
Also published as: NZ523457A; CN1440294A; US20050107292A1; CA2414966A1; KR20030016315A; EP1297842A1; EP1297842A4; NO20026055L; US7087248B2; IL153678A0; BR0112381A; AU6788701A; TWI293563B; NO20026055D0; AR032461A1; WO2002002136A1; MXPA02012947A; CN100518819C; MY136546A; AU2001267887B2

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører farmasøytiske komponenter innbefattende humant paratyroideahormon.

Oppfinnelsens område

Den foreliggende oppfinnelsen angår en farmasøytisk komponent basert på humant paratyroidhormon som har en utmerket stabilitet og som sørger for tilfredshet hos brukeren når den blir anvendt som en komponent i en farmasøytisk sammensetning. I et ytterligere aspekt angår denne oppfinnelsen en farmasøytisk sammensetning basert på humant paratyroidhormon for intranasal administrering som er egnet for langvarig bruk.

Bakgrunn for oppfinnelsen

Peptidene til humant paratyroidhormon (som heretter henvises til som "hPTH") er biologisk aktive peptider som er ansvarlige for benmetabolisme og har en sterk aktivitet i utvikling av ben (Aurbach et al., Recent Progr. Horm. Res., 1972, vol. 28, s. 35). hPTH er et peptid som typisk er sammensatt av 84 aminosyrerester (hPTH(1-84)). Et derivat, hPTH(1-34), fra hPTH(1-84) sammensatt av 34 aminosyrerester angitt som aminosyre nr. 1-34 av hPTH(1-84) har også blitt kjent til å ha den samme farmakologiske aktiviteten som hPTH(1-84) (Tregear et al., Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem., 1974, vol. 355, s. 415). Aminosyresekvensene til hPTH(1-84) og hPTH(1-34) er gitt som henholdsvis SEKV ID NR:1 og 2 i sekvenslisten.

Kalsitonin og bisfosfonat eller terapeutiske agenser anvendt for behandlingen av osteoporose viser deres terapeutiske effekter ved å inhibere benresorpsjon, mens hPTH(1-84) og hPTH(1-34) stimulerer bendannelse eller benmetabolisme involvert i bendannelsen. Derfor har det blitt forventet at disse peptidene kan fungere som en ny terapeutisk agens for osteoporose (Lane et al., J. Clin. In vest., 1998, vol. 102, s. 1627-1633).

Når hPTH(1-34) gis subkutant til mennesker ved en bestemt dose én gang i uken, har det blitt rapportert at det vil øke benmineralinnholdet, mens når den samme agensen gis på liknende måte ved en dose som er en femtedel av den tidligere dosen, men én gang daglig i fem dager etter hverandre, vil den også øke benmineraltettheten (BMD) signifikant (Sone et al., Miner Electrolyte Metab., 1995, vol. 21, s. 232-235). I dyreforsøk har det blitt vist at hPTH, når det blir gitt subkutant ved en bestemt dose én gang i uken, vil forårsake mindre BMP i ben enn det som er observert når det blir gitt oppdelt (Tawaragi et al., Osteoporosis International, vol. 6, suppl. 1,1996, s. 245). Dette indikerer at en maksimal terapeutisk effekt av hPTH vil bli oppnådd når hPTH gis daglig ved en liten dose over en lang periode, enn når det gis ved en stor dose for en kort periode med et langt intervall mellom suksessive doser. Hvis en liten dose av hPTH gitt kontinuerlig over en lang periode vil føre til en terapeutisk effekt som er lik eller bedre enn den observert for en stor dose gitt intermitterende for en kort periode, vil denne fremgangsmåten også være fordelaktig med hensyn til små doser av hPTH trolig er fri for de uønskede medisinske hendelsene på fordøyelses- og kardiovaskulære organer som er kjent for høydoseadministreringer av hPTH.

Dessuten vil injeksjoner ikke egne seg for behandling av osteoporosepasienten som vanligvis vil trenge en langvarig behandling, fordi pasienten dermed må motta behandlingen under nærvær av en lege; føle en mer eller mindre smerte i løpet av behandling; og det vil være en belastning for pasienten å besøke legens kontor regelmessig for behandling.

Med henblikk på dette er det behov for et nasalt legemiddel som gjør det mulig for pasienten å lett ta det daglig hjemme over en lang periode uten at overdreven smerte og belastning pålegges pasienten.

For at et nasalt legemiddel skal bli trygt anvendt kontinuerlig over en lang periode, er det imidlertid absolutt nødvendig at legemidlet skal bli absorbert jevnt gjennom neseslimhinnen; ikke ha noen irriterende effekt på neseslimhinnen; og gi en utmerket tilfredshet hos brukeren, fordi neseslimhinnen er veldig sensitiv for den irriterende effekten av en medisin eller et additiv derav. Særlig for et legemiddel som er fremstilt fra hPTH som forventes å tilveiebringe en terapeutisk effekt ved anvendelse over en lang periode, er en utmerket tilfredshet hos brukeren veldig viktig når det er ment å bli anvendt for intranasal administrering. For å fremstille et nasalt legemiddel som er akseptabelt selv når det blir anvendt kontinuerlig over en lang periode, er det viktig å selektere den aktive agensen i form av et medikament eller av dets salt, og egnede additiver, for å bestemme deres effektive konsentrasjoner og for å optimalisere kombinasjonen av disse. Faktorene som er ansvarlige for hvor tilfreds brukeren av et nasalt legemiddel er innbefatter lukten og den irriterende aktiviteten til legemidlet. Derfor er medikamentene eller additivene anvendt for et nasalt legemiddel og deres konsentrasjoner veldig begrenset.

Det fins et kommersielt tilgjengelig produkt fremstilt fra hPTH, dvs. en injeksjon inneholdende en 5-acetat av hPTH(1-34), som anvendes som en diagnostisk agens for å undersøke den funksjonelle aktiviteten til biskjoldkjertelen (hvis generiske navn er teriparatidacetat og som er fremskaffet av Asahi Kasei Kogyo Corp.). Imidlertid er det ikke tilgjengelig noe intranasalt legemiddel basert på hPTH som vil være tilfredsstillende for brukeren med hensyn på lukt og irritasjon.

Offentliggjort japansk patent nr. 64-16799 beskriver at når hPTH(1-34) er renset, blandes det med eddiksyre som anvendes for rensingsfremgangsmåten, og eddiksyreinnholdet i individuelle produkter varierer mye fra produksjonsomgang til produksjonsomgang, som gjør det vanskelig å oppnå produkter inneholdende samme eddiksyremengde, og at introduksjon av eddiksyre til produktet vil føre til en redusert aktivitet av produktet.

Det samme dokumentet beskriver videre en fremgangsmåte egnet for å bedre stabiliteten til hPTH(1-34), der en frysetørket sammensetning av hPTH(1-34) basert på anvendelsen av vinsyre blir benyttet. Imidlertid er vinsyre så sur at en agens som inneholder den ikke vil være egnet for intranasal administrering.

Offentliggjort japansk patent nr. 2-111 beskriver en pulveraktig sammensetning for intranasal administrering basert på en vannløselig organisk syre som har blitt utviklet for å bedre den nasale absorpsjonen av hPTH(1-34) et biologisk aktivt peptid slik som hPTH(1-34). Sammensetningen vil imidlertid ikke være egnet for langvarig bruk, fordi den vil direkte irritere neseslimhinnen, avhengig av typen og mengden av sameksisterende organisk syre.

Som diskutert ovenfor har ikke noe intranasalt legemiddel basert på hPTH blitt utviklet som er akseptabelt selv når det blir anvendt over en lang periode og sørger for en utmerket tilfredshet hos brukeren, så vel som god stabilitet og absorpsjon.

Beskrivelse av oppfinnelsen

Denne oppfinnelsen har som mål å tilveiebringe en farmasøytisk komponent basert på hPTH som er svært stabil, når den blir anvendt som en komponent i en farmasøytisk sammensetning, og gir en utmerket tilfredshet hos brukeren. I ytterligere andre aspekter har denne oppfinnelsen som mål å tilveiebringe en farmasøytisk sammensetning for intranasal administrering basert på hPTH som vil tillate langvarig bruk.

For å oppfylle målet med å tilveiebringe en farmasøytisk sammensetning for intranasal administrering som beskrevet ovenfor, har oppfinnerne heri studert hardt og funnet at en hPTH-fremstilling fremstilt konvensjonelt er utilfredsstillende, fordi den vil gi en sur lukt og irritasjon ved administrering til neseslimhinnen, og at denne ulempen skyldes eddiksyre som anvendes i rensingsfremgangsmåten og eksisterer i veldig liten mengde som konstituenten i et salt av hPTH eller et adherent stoff. Basert på dette funnet fremstilte de en farmasøytisk komponent hvis eddiksyreinnhold er redusert sammenlignet med den tidligere komponenten, vurderte den og fant overraskende at komponenten av interesse er svært stabil, gir en utmerket tilfredshet hos brukeren når den er inkorporert i en farmasøytisk sammensetning, og kan trygt bli kombinert med de egnede mengdene av funksjonelle komponenter som vil bli tilsatt for forbedringen av absorpsjon og stabilitet, så vel som med en bærer og et hjelpestoff som vanligvis anvendes i løpet av fremstilling av medisiner. Dermed oppnådde de denne oppfinnelsen.

Foreliggende oppfinnelse vedrører følgelig farmasøytisk komponent for intranasal administrering, kjennetegnet ved at den omfatter et humant paratyroidhormonpeptid eller derivat derav, og eddiksyre, hvor det humane paratyroidhormonpeptidet er et peptid omfattende aminosyrerestene betegnet som aminosyre nr. 1-84 (hPTH(1-84)) eller et peptid omfattende aminosyrerestene betegnet som aminosyre nr. 1-34 (hPTH(1-34)),

kjennetegnet ved at

dersom det humane paratyroidhormonpeptidet er hPTH (1-84), er innholdet av eddiksyre mellom 0,1 vekt-% og 4,5 vekt-% med hensyn til vekten av hPTH (1-84), og

dersom det humane paratyroidhormonpeptidet er hPTH (1-34), er innholdet av eddiksyre mellom 1,0 vekt-% og 7,3 vekt-% med hensyn til vekten av hPTH (1-34).

For å si det mer spesifikt, angår den foreliggende oppfinnelsen en farmasøytisk komponent innbefattende hPTH og eddiksyre, hvis innhold holdes lavere enn en bestemt kjemisk ekvivalent med hensyn til vekten av hPTH. I et ytterligere annet aspekt angår denne oppfinnelsen en farmasøytisk komponent ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 3, kjennetegnet ved at den farmasøytiske komponenten er en lyofilisert sammensetning.

Kort beskrivelse av figurene

Figur 1 viser et reversert fase HPLC-kromatogram fremskaffet fra en hPTH(1-34) fremstilling med eddiksyreinnhold på 9,5 % etter at den har blitt lagret ved 40 °C i seks måneder. Figur 2 viser et reversert fase HPLC-kromatogram fremskaffet fra en hPTH(1-34) fremstilling med eddiksyreinnhold på 2,9 % etter at den har blitt lagret ved 40 °C i seks måneder. Figur 3 viser mengdene av dekomposisjonsproduktene (biproduktene) B, C og D etter at hPTH(1-34) fremstillinger inneholdende forskjellig eddiksyreinnhold har blitt lagret ved 80 °C i 15 timer. Figur 4 viser renhetsnivåene av hPTH(1-34) i hPTH(1-34) fremstillingene inneholdende forskjellig eddiksyreinnhold etter at fremstillingene har blitt lagret ved 80 °C i 15 timer. Figur 5 viser et reversert fase HPLC-kromatogram av en hPTH(1-84) fremstilling med eddiksyreinnhold på 12,3 % etter at den har blitt lagret ved 80 °C i 15 timer. Figur 6 viser mengdene av dekomposisjonsprodukter (biprodukter) etter at hPTH(1-84) fremstillinger inneholdende forskjellig eddiksyreinnhold har blitt lagret ved 80 °Ci 15 timer. Figur 7 viser renhetsnivåene av hPTH(1-84) i hPTH(1-84) fremstillingene inneholdende forskjellig eddiksyreinnhold etter at fremstillingene har blitt lagret ved 80 °Ci 15 timer.

Beskrivelse av utførelsene

I henhold til denne oppfinnelsen inkluderer hPTH peptider som er involvert i benmetabolisme, har en sterk stimulerende effekt på dannelsen av ben og har en aktivitet som øker konsentrasjonen av kalsium i serum, dvs. en naturlig type hPTH(1-84) omfattende 84 aminosyrerester og dets derivater.

For eksempel kan hPTH inkludere hPTH(1-84) (Biochemistry 17, 5723 (1978);

Kimura et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., vol. 114, s. 493, 1983), hPTH(1-38) (offentliggjort japansk patent nr. 57-81448), hPTH (1-34) (offentliggjort japansk patent nr. 9-29600; Takai et al., Peptide Chemistry, s. 187,1979), hPTH(1-34)NH2 (offentliggjort japansk patent nr. 58-96052), [Nle<8,18>]hPTH(1-34) og [Nie8,18, Tyr<34>]hPTH(1-34) (offentliggjort japansk patent nr. 55-113753), [Nle<8,18>]hPTH(1-34)NH2 (offentliggjort japansk patent nr. 61-24598), [Nie<8,18>, Tyr34]hPTH(1-34)NH2 (offentliggjort japansk patent nr. 60-34996), hPTH(1-37) (japansk patentpresentasjon [Kohyo] nr. 5-505594), hPTH(2-84), hPTH(3-84), hPTH(4-84), hPTH(5-84), hPTH(6-84), hPTH(7-84) og hPTH(8-84) (japansk patentpresentasjon [Kohyo] nr. 4-505259) osv. Disse hPTH'ene kan bli fremskaffet med fremgangsmåtene basert på genetiske modifiseringsteknikker eller kjemiske synteseteknikker som er beskrevet i dokumentene ovenfor, eller

med fremgangsmåtene som er ekvivalente med foregående.

Når et fysiologisk aktiv peptid blir renset basert på den genetiske modifiseringsteknikken eller kjemiske synteseteknikken, anvendes generelt kolonnekromatografi. Fordi hPTH er et basisk peptid, vil det imidlertid bli adsorbert til resin som utgjør en kolonne hvis det ukontrollert blir tilsatt kolonnen. For å forebygge adsorpsjonen av hPTH og øke dets løselighet, anvendes en syre som et elueringsmiddel. For at et peptid skal fungere som et materiale i en farmasøytisk sammensetning, må peptidet bli inkorporert i en frysetørket sammensetning som vil fungere som et startmateriale for fremstilling av den farmasøytiske sammensetningen. For å imøtekomme dette kravet må syren være flyktig, hvilket begrenser antallet anvendelige syrer.

La oss anta, for å illustrere, at for eksempel saltsyre anvendes for det foreliggende formålet. Den er svært sur selv ved en lav konsentrasjon, forårsaker gjerne bireaksjoner slik som hydrolyse og er svært etsende. Derfor er ikke saltsyre egnet for det foreliggende formålet. Hvis en organisk syre anvendes for det foreliggende formålet, kan den bli valgt blant trifluoreddiksyre, maursyre og eddiksyre som har et lavt kokepunkt. Det er imidlertid ikke ønskelig å inkorporere trifluoreddiksyre i en farmasøytisk sammensetning med hensyn på sikkerhet. Maursyre har også begrenset anvendelse pga. dens reduserende aktivitet og er ikke kompatibel med et peptid slik som hPTH.

Derimot er eddiksyre mest egnet til å fungere som et materiale for en farmasøytisk sammensetning på grunn av dens sikkerhet og kjemiske egenskaper, og den har blitt anvendt som en absolutt nødvendig syre for det siste rensetrinnet av et basisk peptid. For eksempel har rensingsprosessen basert på reversert fase høytrykksvæskekolonnekromatografi (reversert fase HPLC) eller størrelseseksklusjonskolonnekromatografi blitt utført ved å anvende et eluat inneholdende eddiksyre med et fordelaktig resultat. I løpet av fremgangsmåten tilsettes eddiksyre ved en konsentrasjon som er tilstrekkelig for å hindre at hPTH blir adsorbert til kolonnen, og derfor inneholder en prøve eluert fra en vandig løsning av eddiksyre, en målpeptidfraksjon og en frysetørket sammensetning fremstilt derfra eddiksyre ved en høyere konsentrasjon enn når eddiksyre bare eksisterer som konstituenten i et salt av de basiske aminosyrerestene, dvs. at eddiksyre ikke bare eksisterer som konstituenten i hPTH-salt, men som et adherent stoff.

Eddiksyre som eksisterer i en farmasøytisk komponent basert på hPTH har to former: den eksisterer som konstituenten i et salt av hPTH og et adherent stoff. Siden eddiksyre er en flyktig substans, er det vanskelig å holde innholdet av eddiksyre i en frysetørket sammensetning på et konstant nivå, fordi eddiksyreinnholdet i en frysetørket sammensetning varierer avhengig av frysetørkingstilstanden, konsentrasjonen av eddiksyre i den opprinnelige løsningen før frysetørking, med hensyn til konsentrasjonen av hPTH foreliggende i den opprinnelige løsningen.

Den farmasøytiske komponenten i denne oppfinnelsen innbefatter hPTH og eddiksyre, der innholdet av eddiksyre som konstituenten i et salt av hPTH og et adherent stoff er redusert. Denne komponenten, fordi den har et redusert innhold av eddiksyre, forbedrer stabiliteten til hPTH og sørger for tilfredshet hos brukeren, når den er inkorporert i en farmasøytisk sammensetning for intranasal administrering og blir anvendt for dette.

I den farmasøytiske komponenten i denne oppfinnelsen er eddiksyre med et redusert innhold definert som eddiksyre der innholdet er redusert til å bli mindre enn en bestemt spesifisert kjemisk ekvivalent.

Fordi hPTH(1-34) inneholder ni basiske aminosyrerester (inkludert tryptofanrest), kan ett molekyl av det binde til maksimalt ni molekyler av monovalent syre (eddiksyre og andre) for å danne et salt. Det inneholder imidlertid også fire sure aminosyrerester som kan binde til de basiske restene for å danne et salt i det samme molekylet. Derfor, med hensyn til hPTH(1-34) i denne oppfinnelsen, betraktes de gjenværende fem basiske aminosyrerestene som tilgjengelig for binding med eddiksyre, hvorfra den forventede vekten av eddiksyre som binder med ett molekyl av hPTH(1-34) eller en kjemisk ekvivalent av eddiksyre til hPTH(1-34) er avledet. Eddiksyreinnholdet kan bli fremskaffet ved å anvende likning I: vekten av eddiksyre x 100 (%)/vekten av humant paratyroidhormonpeptid, på vekten av eddiksyre og humant paratyroidhormonpeptid. Den kjemiske ekvivalenten av eddiksyre til hPTH(1-34) er ca. 7,3 % (vektprosent med mindre noe annet er oppgitt) som eddiksyreinnholdet.

Siden hPTH(1-84) inneholder 19 basiske aminosyrerester (inkludert tryptofan) og 12 sure aminosyrerester, er det ved fremstilling av en hPTH(1-84) fremstilling i henhold til denne oppfinnelsen likeledes antatt at de sju basiske overskuddaminosyrerestene er tilgjengelige for binding med eddiksyre i ett molekyl av hPTH(1-84), som vil gi den forventede vekten av eddiksyre som binder i

til ett molekyl av hPTH eller en kjemisk ekvivalent av eddiksyre til hPTH(1-84). Eddiksyreinnholdet kan bli fremskaffet ved å anvende likning I, den kjemiske ekvivalenten av eddiksyre til hPTH(1-84) er ca. 4,5 % som eddiksyreinnholdet.

I henhold til denne oppfinnelsen betyr eddiksyre i en mengde som er mindre enn dens kjemiske ekvivalent ikke mengden av eddiksyre som et adherent stoff, men bare mengden som konstituent i et salt av hPTH hvis vektprosent er mindre enn den kjemiske ekvivalenten.

Den foreliggende oppfinnelsen tilveiebringer en stabil farmasøytisk komponent basert på hPTH ved å kontrollere eddiksyreinnholdet derav, og en farmasøytisk sammensetning for intranasal administrering inneholdende den farmasøytiske komponenten.

Videre tilveiebringer den foreliggende oppfinnelsen en farmasøytisk komponent basert på hPTH, der eddiksyreinnholdet er kontrollert slik at det holdes på et spesifisert nivå, og en farmasøytisk sammensetning for intranasal administrering inneholdende den farmasøytiske komponenten.

Siden et peptid generelt er ustabilt i en løsning, anvendes dets frysetørkede produkt som et materiale for en farmasøytisk komponent. Hvis et peptid slik som hPTH, som eksisterer som et salt inneholdende eddiksyre eller en flyktig substans som konstituenten i saltet, løses opp i vann eller i fortynnet eddiksyre, og det frysetørkede produktet derav anvendes som et materiale for å fremstille en farmasøytisk komponent, vil ikke eddiksyreinnholdet i komponenten holde seg på et konstant nivå, hvilket er et problem. Denne oppfinnelsen muliggjør fremstilling av en vandig løsning av hPTH med et redusert eddiksyreinnhold og muliggjør dermed produksjonen av en stabil hPTH-basert farmasøytisk komponent som konsekvent inneholder en spesifikk mengde av eddiksyre. Derfor er denne oppfinnelsen fordelaktig også ut i fra aspektet om produksjonsstabilitet.

For en farmasøytisk komponent i henhold til denne oppfinnelsen holdes eddiksyreinnholdet med hensyn til vekten av hPTH lavere enn den kjemiske ekvivalenten. For den hPTH(1-34)-baserte komponenten holdes for eksempel eddiksyreinnholdet lavere enn ca. 7,3 % med hensyn til vekten av hPTH(1-34), mer foretrukket ca. 6,0 % eller lavere, spesielt ca. 4,0 % eller lavere med hensyn på stabilitet og anvendelse, eller mer foretrukket ca. 4 0 % eller lavere, spesielt ca. 3,0 % eller lavere med hensyn på produksjonsstabilitet. Det er ikke fordelaktig at eddiksyreinnholdet blir holdt på et altfor lavt nivå med hensyn på produksjonsstabilitet, siden komponenten, selv om den vil gi en utmerket stabilitet og tilfredshet hos brukeren, gjerne vil være uløselig ved en høy pH: hPTH(1-34) har et isoelektrisk punkt på 8,2 (pl = 8,2). Innholdet av eddiksyre holdes fortrinnsvis på ca. 0,5 % eller høyere, spesielt ca. 1,0 % eller høyere. I tillegg holdes eddiksyreinnholdet for hPTH(1-84)-basert komponent lavere enn ca. 4,5 %, fortrinnsvis ca. 3,0 % eller lavere med hensyn på stabilitet og anvendelse, mer foretrukket ca. 0,1 % eller høyere med hensyn på produksjonsstabilitet.

Den farmasøytiske komponenten i denne oppfinnelsen kan bli fremstilt med enhver offentlig kjent fremgangsmåte eller med enhver fremgangsmåte som er ekvivalent med den foregående. Reduksjon av innholdet av eddiksyre som eksisterer som konstituenten i et salt av hPTH eller som et adherent stoff under et spesifisert nivå kan bli oppnådd ved å introdusere en kjent fremgangsmåte slik som dialyse, elektrodialyse, ionebytterkromatografi, størrelseseksklusjonskolonnekromatografi, reversert fase HPLC osv. inn i rensingsfremgangsmåten av hPTH som har blitt fremskaffet med en genetisk modifiseringsbasert teknikk eller en kjemisk syntesebasert teknikk.

Når overskuddet av eddiksyreinnholdet blir redusert med en fremgangsmåte slik som dialyse, elektrodialyse, ionebytterkromatografi osv., kan justering av eddiksyreinnholdet til ethvert ønsket nivå bli oppnådd ved å direkte monitorere pH i hPTH-løsningen, eller konsentrasjonen av eddiksyre i løsningen, slik at en hPTH-løsning inneholdende eddiksyre ved en ønsket konsentrasjon kan bli fremskaffet.

Justering av eddiksyreinnholdet i en vandig løsning av hPTH kan for eksempel bli oppnådd basert på forholdet av eddiksyreinnholdet i løsningen til løsningens pH.

Dialyse kan skje på følgende måte: en vandig løsning av hPTH som har blitt fremstilt med en genetisk modifiseringsbasert eller kjemisk syntesebasert teknikk, eller den samme vandige løsningen hvor pH har blitt justert til pH 5-9 ved tilsetning av en alkalisk løsning slik som en vandig løsning av natriumhydroksid eller ammoniakk, plasseres i en dialysemembran i form av en sylinder som vil la lavmolekylære komponenter passere; løst stoff i løsningen blir utsatt for dialyse basert på enkel diffusjon; og eddiksyreinnholdet fjernes med denne prosessen. For eksempel oppnås en løsning av hPTH(1-34) (eddiksyreinnhold på 2 %) ved å utsette en startløsning for dialyse inntil løsningen utenfor dialysemembranen har en phi på ca. 6,5.

Elektrodialyse kan skje på følgende måte: en vandig løsning av hPTH som har blitt fremstilt med en genetisk modifiseringsbasert eller kjemisk syntesebasert teknikk, eller den samme vandige løsningen hvor phi har blitt justert til pH 5-9 ved tilsetning av en alkalisk løsning slik som en vandig løsning av natriumhydroksid eller ammoniakk, får sirkulere mellom to dialysemembraner eksponert for et elektrisk felt som vil la komponenter med en molekylvekt på 300 eller mindre passere; og eddiksyreioner vil migrere til katoden for å akkumulere der, mens frie hPTH-basiske ioner vil migrere til anoden for å akkumulere der; og eddiksyreioner med en lav molekylvekt får passere gjennom membranene til utsiden, mens frie hPTH-basiske ioner med en høy molekylvekt får sirkulere i dialysesystemet. Det vil være mulig å produsere en løsning av hPTH inneholdende en ønsket konstant mengde av eddiksyre, ved å monitorere pH eller ionestyrke til dialyseløsningen og dermed sjekke det reduserte eddiksyreinnholdet. For eksempel vil en hPTH(1-34) løsning (eddiksyreinnhold på ca. 2 %) bli fremskaffet ved å benytte elektrodialyse på en startløsning inntil pH i dialyseløsningen er ca. 6,5.

I ionebytterkromatografi adsorberes eddiksyre ved binding til et basisk ionebytterresin for å bli fjernet. For eksempel overføres en vandig løsning av hPTH som har blitt fremstilt med en genetisk modifiseringsbasert eller kjemisk syntesebasert teknikk til en basisk ionebytterresinkolonne laget av et kvaternært eller sekundært ammoniumresin; eddiksyre kan bli bundet til resinet via ion-til-ion binding; og en uadsorbert fraksjon som passerer gjennom kolonnen samles opp for å gi en hPTH-løsning med et redusert eddiksyreinnhold. Det er mulig å oppnå en hPTH-løsning med et spesifisert eddiksyreinnhold, ved å forandre mengden av ionebytterresin med hensyn til vekten av hPTH i løsningen. For å for eksempel oppnå en hPTH(1-34) løsning (med eddiksyreinnhold på ca. 2 %), kan et resin med en tilstrekkelig stor vekt bli anvendt til å forandre pH i eluatet til ca. pH 6,5.

Størrelseseksklusjonskolonnekromatografi kan skje på følgende måte: en vandig løsning av hPTH som har blitt fremstilt med en genetisk modifiseringsbasert eller kjemisk syntesebasert teknikk, eller den samme vandige løsningen hvor pH har blitt justert til pH 5-9 ved tilsetning av en alkalisk løsning slik som en vandig løsning av natriumhydroksid eller ammoniakk, overføres til en kolonne; en vandig løsning inneholdende et organisk løsningsmiddel slik som acetonitril anvendes for eluering; og eddiksyre blir dermed fjernet. Det er mulig å oppnå en hPTH-løsning med et spesifisert eddiksyreinnhold ved å forandre pH i den vandige løsningen av hPTH som skal bli overført til en kolonne. For å for eksempel oppnå en hPTH(1-34) løsning (med eddiksyreinnhold på ca. 2 %), overføres en vandig løsning av hPTH som har blitt justert til å ha en pH på ca. 6,5 til en kolonne, og en fraksjon bestående av hPTH(1-34) eluat samles opp.

I reversert fase HPLC blir det anvendt en vandig løsning av hPTH som har blitt fremstilt med en genetisk modifiseringsbasert eller kjemisk syntesebasert teknikk, eller den samme vandige løsningen hvor pH har blitt justert til phi 5-9 ved tilsetning av en alkalisk løsning slik som en vandig løsning av natriumhydroksid eller ammoniakk. Løsningen overføres til en C18- eller C4-kolonne initialisert med vann; og vann anvendes for eksempel som et eluat for å eluere uorganiske salter. Deretter får en vandig løsning inneholdende et organisk løsningsmiddel slik som acetonitril strømme gjennom for å eluere hPTH adsorbert til kolonnen; og en hPTH-løsning med et redusert eddiksyreinnhold blir dermed fremskaffet.

Det er mulig å oppnå en hPTH-løsning med et spesifisert eddiksyreinnhold ved å justere pH i en vandig løsning av hPTH som skal bli tilsatt en kolonne. Det er også mulig å oppnå en hPTH-løsning med et spesifisert eddiksyreinnhold ved å fremstille en hPTH-løsning med et altfor lavt eddiksyreinnhold, for eksempel det laveste nivået som er tillatt av fremgangsmåten, og deretter tilsette en nødvendig mengde av eddiksyre for å tilveiebringe en hPTH-løsning med et spesifisert eddiksyreinnhold. En hPTH(1-34) løsning som eddiksyre har blitt fjernet overdrevent fra blir for eksempel fortynnet med vann til 10 mg/ml; eddiksyre settes til løsningen inntil løsningens pH er pH 6,5; og en hPTH(1-34) løsning (med eddiksyreinnhold på ca. 2 %) blir dermed fremskaffet.

En vandig løsning av hPTH fremskaffet med fremgangsmåten beskrevet ovenfor blir frysetørket med en konvensjonell fremgangsmåte, for å fremstille en farmasøytisk komponent i denne oppfinnelsen.

Den farmasøytiske komponenten i denne oppfinnelsen kan inkludere vannløselige organiske syrer, eller fortrinnsvis minst én valgt fra sitronsyre, adipinsyre og glykolsyre, for å bedre den mukosale absorpsjonen av komponenten. En farmasøytisk komponent som videre inkluderer en slik organisk syre vil sørge for en høy stabilitet og vil også sørge for en utmerket tilfredshet hos brukeren, når den blir administrert på annen måte enn parenteralt, eller spesielt ved nasal administrering.

Følgelig kan den farmasøytiske komponenten i denne oppfinnelsen bli anvendt som en komponent i en farmasøytisk sammensetning for intranasal administrering egnet for langvarig bruk.

Videre har den farmasøytiske sammensetningen i denne oppfinnelsen for intranasal administrering en egenskap av å være kompatibel med vidt varierte funksjonelle komponenter, så vel som med en bærer, hjelpestoff, viskositetsøkende middel, preserveringsmiddel, stabilisator, antioksidant, bindemiddel, desintegrerende middel, fuktighetsgivende middel, smøremiddel, farge, smaksstoff, corrigens, suspensjonsdannende agens, emulgeringsmiddel, løseliggjørende middel, bufferagens, toniserende middel, detergent, beroligende middel, svovelinneholdende reduserende agens osv. Den farmasøytiske sammensetningen i denne oppfinnelsen tolererer bra tilsetningen av ulike funksjonelle komponenter som kan bli introdusert for å bedre absorpsjon, stabilitet av fast stoff osv., ettersom hva som er egnet.

Bæreren eller hjelpestoffet kan inkludere substanser som er godt eller lite løselig i vann slik som sukker, polysakkarider, dekstriner, celluloser, syntetiserte eller semisyntetiserte polymerer, aminosyrer, polyaminosyrer, proteiner og fosfolipider.

Sukker (monosakkarider, oligosakkarider) kan for eksempel inkludere D-mannitol, glukose, laktose, fruktose, inositol, sukrose, maltose osv., mens polysakkaridene kan inkludere dekstran, pullulan, algininsyre, hyaluronsyre, pektinsyre, fytinsyre, fytin osv. Dekstrinene kan inkludere oc-syklodekstrin, p-syklodekstrin, y-syklodekstrin, dekstrin, hydroksypropylstivelse, hydroksyetylstivelse osv.

Cellulosene kan inkludere metylcellulose, etylcellulose, hydroksyetylcellulose, hydroksypropylcellulose, hydroksypropylmetylcellulose,

natriumkarboksymetylcellulose osv.

De syntetiserte eller semisyntetiserte polymerene kan inkludere polyvinylalkohol, karboksyvinylpolymer, polyetylenglykol, polyvinylpyrrolidon (PVP), natriumpolyakrylat, polyaktinsyre osv.

Aminosyrene kan inkludere glysin og taurin, mens polyaminosyrene kan inkludere polyglutaminsyre, polyaspartinsyre, polyglysin, polyleucin osv.

Proteinene kan inkludere gelatin og andre. I tillegg kan kitin og kitosan bli inkludert.

Av disse bærerne eller hjelpestoffene er spesielt sukrose, maltose, oc-syklodekstrin, p-syklodekstrin, dekstrin, D-mannitol, inositol, laktose, dekstran, metylcellulose, hydroksypropylcellulose, polyvinylalkohol, pullulan osv. foretrukket. Foruten dem: sorbinsyre; benzalkoniumklorid; cetylpyridiniumklorid; benzetoniumklorid; parabener slik som metylparaoksybenzoat, etylparaoksybenzoat, propylparaoksybenzoat, butylparaoksybenzoat og andre; akasiegummi; sorbitol; magnesiumstearat; talkum; kisel; mikrokrystallinsk cellulose; stivelse; kalsiumfosfat; vegetabilsk olje; karboksymetylcellulose; natriumlaurylsulfat; vann; etanol; glyserin; og sirup.

Typiske eksempler på overflateaktive midler er nevnt nedenfor. Blant disse kan ett eller en kombinasjon av flere enn to av disse overflateaktive midlene bli satt til formuleringen i oppfinnelsen.

Ikke-ioniske overflateaktive midler kan inkludere sorbitanestere av fettsyrer, for eksempel sorbitanmonokaprilat, sorbitanmonolaurat, sorbitanmonopalmitat osv., og glyserolestere av fettsyrer, for eksempel glyserylmonokaprilat, glyserylmonomyristat, glyserylmonostearat osv., og polyglyserolestere av fettsyrer, for eksempel dekaglyserylmonostearat, dekaglyseryldistearat, dekaglyserylmonolinoleat osv., og polyoksyetylensorbitanestere av fettsyrer, for eksempel polyoksyetylensorbitanmonolaurat, polyoksyetylensorbitanmonooleat, polyoksyetylensorbitanmonostearat, polyoksyetylensorbitanmonopalmitat, polyoksyetylensorbitantrioleat, polyoksyetylensorbitantristearat osv., og polyoksyetylensobitolestere av fettsyrer, for eksempel

polyoksyetylensobitoltetrastearat, polyoksyetylensobitoltetralaurat osv., og polyoksyetylenglyserolestere av fettsyrer slik som

polyoksyetylenglyserylmonostearat og polyetylenglyserolestere av fettsyrer slik som polyetylenglyseryldistearat, og polyoksyetylenalkyleter slik som polyoksyetylenlauyleter, og polyoksyetylenpolyoksypropylenalkyleter, for eksempel polyoksyetylenpolyoksypropylenglykoleter,

polyoksyetylenpolyoksypropylenpropyleter,

polyoksyetylenpolyoksypropylencetyleter osv., og polyoksyetylenalkylfenyleter slik som polyoksyetylennonylfenyleter og polyoksyetylenlakseroljer, for eksempel polyoksyetylenlakserolje, polyoksyetylen-hydrogenert lakserolje og polyoksyetylen gule bivoksderivater slik som polyoksyetylensorbitol gul bivoks, og polyoksyetylenlanolinderivater slik som polyoksyetylenlanolin, og

polyoksyetylenamid av fettsyrer med HLB 6 til 18 slik som

polyoksyetylenstearylamid.

Anioniske overflateaktive midler kan inkludere alkylsulfat (C10 til Ci8) salter, for eksempel natriumcetylsulfat, natriumlaurylsulfat, natriumoleylsulfat osv., og polyoksyetylenalkyletersulfatsalter hvor gjennomsnittlig mol av tilsatt etylenoksid er 2 til 4 og karboner i alkylgrupper er 10 til 18, slik som natriumpolyoksyetylenlauryletersulfat, og alkylsulfosuksinatestersalter hvor lengden av alkylgrupper er 8 til 18 slik som natriumlaurylsulforavsyreester.

Naturlig forekommende overflateaktive midler kan inkludere lecitin, glyserollipidfosfat og sfingolipider slik som sfingomyelin, og sukroseestere av fettsyrer (C12 til Ci8).

Svovelinneholdende reduserende agenser kan inkludere N-acetycystein, N-acetyhomocystein, tioktinsyre, tioetanol, tioetanolamin, tioglyserol, tiosorbitol tioglykolsyre og dens salter, natriumtiosulfat, glutation og tioalkansyrer (Ci til C7) som har sulfhydrylgruppe.

Antioksidanter kan inkludere erysorbinsyre, dibutylhydroksytoluen, butylhydroksyanisol, alfatokoferol, tokoferolacetat, L-askorbinsyre og dens salter, L-askorbylpalmitat, L-askorbylstearat, natriumbisulfitt, natriumsulfitt, triamylgallat, propylgallat, og chelaterende agenser, for eksempel kalsiumdinatriumedetat (EDTA), natriumpyrofosfat, natriummetafosfat osv.

For en farmasøytisk sammensetning i denne oppfinnelsen kan hPTH forekomme ved ca. 0,01 - 20 %, fortrinnsvis ved ca. 0,05 -10 %, og en organisk syre kan bli tilsatt slik det passer seg. Innholdet av sistnevnte før anvendelse er ca. 0,05 - 99,5 %, fortrinnsvis ca. 0,1 - 99,0 %. En bærer eller hjelpestoff som vanligvis blir tilsatt i løpet av fremstilling av et medisinsk produkt kan bli tilsatt der det er egnet eller kan for eksempel forekomme ved ca. 0,01 - 99,5 % før anvendelse. Andre ulike funksjonelle komponenter kan bli tilsatt der de er egnet eller kan for eksempel forekomme ved ca. 0,05 - 99,5 % før anvendelse.

Fremstilling av den farmasøytiske sammensetningen for intranasal administrering av denne oppfinnelsen kan bli oppnådd med enhver kjent fremgangsmåte.

For eksempel kan en hPTH-basert farmasøytisk komponent der eddiksyreinnholdet har blitt redusert bli benyttet som en farmasøytisk sammensetning. Til en hPTH-basert farmasøytisk komponent der eddiksyreinnholdet har blitt redusert, kan det alternativt bli tilsatt, der det passer seg slik, en bærer eller et hjelpestoff som vanligvis blir tilsatt i løpet av fremstilling av et farmasøytisk produkt, og en organisk syre og andre ulike funksjonelle komponenter, og den resulterende forbindelsen kan bli anvendt som en farmasøytisk komponent. Tilsetning av en organisk syre kan skje for å erstatte eddiksyre eller kun for tilsetning. For eksempel får en hPTH farmasøytisk komponent tilsatt en egnet bærer eller et hjelpestoff som vanligvis blir tilsatt i løpet av fremstilling av en farmasøytisk fremstilling, en organisk syre og ulike funksjonelle komponenter; en resulterende blanding blir løst i destillert vann; løsningen blir frysetørket; og en enhetlig sammensetning blir dermed fremskaffet.

Alternativt blir en hPTH farmasøytisk komponent og en bærer eller et hjelpestoff som vanligvis anvendes i løpet av fremstilling av en farmasøytisk fremstilling løst i destillert vann; en organisk syre og ulike funksjonelle komponenter settes deretter til løsningen; den resulterende løsningen frysetørkes; og en enhetlig sammensetning blir dermed fremskaffet. Som ytterligere en variant blir en hPTH farmasøytisk komponent, en organisk syre og ulike funksjonelle komponenter løst i destillert vann; løsningen frysetørkes; en ønsket mengde av den frysetørkede forbindelsen løses etter behov i kombinasjon med en bærer eller et hjelpestoff som vanligvis anvendes i løpet av fremstilling av en farmasøytisk fremstilling; og en enhetlig sammensetning blir dermed fremskaffet.

Den farmasøytiske komponenten i denne oppfinnelsen kan ha ulike doseringsformer avhengig av dens forventede administreringsvei: den kan ha en form egnet for å bli overført til slimhinnen i endetarmen, nesehulen, munnhulen osv. Den farmasøytiske sammensetningen for intranasal administrering av denne oppfinnelsen er fortrinnsvis gitt i en form egnet for intranasal anvendelse.

Et foretrukket eksempel på den farmasøytiske sammensetningen for intranasal administrering av denne oppfinnelsen kan forekomme som en løselig form tilgjengelig etter behov, der en frysetørket del inneholder en farmasøytisk sammensetning i denne oppfinnelsen fremskaffet frysetørket og en del med løsningsmiddel festet til førstnevnte.

En organisk syre slik som sitronsyre, adipinsyre eller glykolsyre som tilsettes for å fremme absorpsjon kan forekomme som konstituenten i et salt av hPTH, et adherent stoff eller et additiv. Alternativt kan den organiske syren bli løst i delen med løsningsmiddel.

Administrering av en farmasøytisk sammensetning for intranasal administrering av denne oppfinnelsen kan bli oppnådd med enhver kjent fremgangsmåte. For eksempel er spraying av en farmasøytisk sammensetning for intranasal administrering av denne oppfinnelsen egnet: sammensetningen kan bli plassert i en beholder; en nebulisator festes til beholderen; spissen på munnstykket føres inn i nesehulen; og den farmasøytiske sammensetningen sprayes.

Dosen av en farmasøytisk sammensetning i denne oppfinnelsen kan variere avhengig av sykdommen, alderen og vekten til pasienten, hvor alvorlig sykdommen er og veien som sammensetningen administreres via. Hvis for eksempel en hPTH-basert sammensetning gis nasalt, kan den bli gitt én gang daglig eller flere ganger daglig med hver dose redusert i forhold til dette, suksessivt for en periode. En enkel dose av hPTH(1-34)-basert sammensetning forekommer fortrinnsvis i området på 10 - 5.000 ing. I løpet av behandling kan en såkalt "wash-out" bli innsatt, og behandling kan deretter bli gjenopptatt.

Eksempel

Den foreliggende oppfinnelsen vil bli beskrevet i detalj nedenfor ved hjelp av eksempler.

Testfremgangsmåtene og instrumentene anvendt i eksemplene er basert på det

som er beskrevet nedenfor, med mindre noe annet er nevnt.

1. Analyse av hPTH med HPLC

Bestemmelse av innholdet av et studert peptid i en sammensetning og undersøkelse om noen dekomposisjonsprodukter (biprodukter) foreligger i sammensetningen ble oppnådd med reversert fase HPLC, ved å anvende instrumentene og betingelsene spesifisert nedenfor.

Instrument: LC-9A system fra Shimadzu Ltd.

Kolonne: YMC Protein-RP (4,6 mmø x 150 mm)

Kolonnetemperatur: 40 °C

Eluat: konsentrasjonen av acetonitril i 0,1 % trifluoreddiksyre varieres lineært fra 25 % til 40 % i løpet av 30 minutter.

Strømningshastighet: 1 ml/min

Deteksjon: UV (210 nm)

Injeksjonsmengde: 50 \ i\

2. Analyse av eddiksyre

Innholdet av eddiksyre i dialyseløsninger og i frysetørkede sammensetninger ble bestemt med ionebytterkromatografi under betingelsene som er spesifisert nedenfor.

Instrument: LC-91 system fra Shimadzu Ltd.

Kolonne: IC-A1 fra Shimadzu (4,6 mmø x 100 mm)

Kolonnetemperatur: 40 °C

Eluat: 1:1 blanding av 0,84 % vandig løsning av ftalsyre og 0,58 % vandig løsning av trishydroksymetylaminometan

Strømningshastighet: 1,5 ml/min

Deteksjon: elektrisk konduktivitetsdetektor

Injeksjonsmengde: 10 id

3. Masseanalyse

Bestemmelse av mengdene av hPTH, dekomposisjonsprodukter (biprodukter) av hPTH og deres enzymatiske kuttinger ble oppnådd med instrumentene under betingelser som er spesifisert nedenfor.

Instrument: MAT TSQMS fra Finnigan

lonekilde: ESI

Deteksjonsinnstilling: positiv

Sprayspenning: 4,5 kV

Kapillær temperatur: 250 °C

Mobil fase: (1:1) blanding av 0,2 % eddiksyre og metanol

Strømningshastighet: 0,2 ml/min

Scanningsområde: m/z 550-850

4. Sekvensering av aminosyrer

Bestemmelse av aminosyresekvensene til dekomposisjonsprodukter (biprodukter) av hPTH og deres enzymatiske kuttinger ble oppnådd med følgende instrumenter:

Instrument: type 477A sekvenseringsmaskin fra PerkinElmer

5. Bestemmelse av aminosyresammensetning

Bestemmelse av aminosyresammensetningene til hPTH,

dekomposisjonsprodukter (biprodukter) av hPTH og deres enzymatiske kuttinger ble oppnådd med følgende instrumenter:

Instrument: type L-8500 aminosyreanalysemaskin fra Hitachi

6. Oppbevaring av prøver (stabilitetstest)

Testprøvene ble lagret på et oppbevaringssted under betingelsene som er spesifisert nedenfor.

Instrument: LH-30-14 fra Nagano Science Co. Ltd.

Temperaturinnstilling: 1) 40 ± 1 °C, 2) 60 + 1 °C, 3) 80 ± 2 °C

7. Frysetørking

Instrument: RL-903BS fra Kyowa Vacuum Engineering, Ltd.

Rør: 15 ml glassrør

Referanseeksempel 1: Fremstilling av hPTH(1-34) (1)

Ekspresjonsplasmidet pG117S4HPPH34 (offentliggjort japansk patent nr. 9-29660) inneholdende et gen som koder for et kimærisk protein av hPTH(1-34), oppnådd ved å koble et DNA-f ragment som koder for et derivat av p-galaktosidase avledet fra E. co//'med et DNA-fragment som koder for hPTH(1-34) via intervensjonen av et DNA-fragment som koder for en linker inneholdende et kuttemotiv (Lys-Arg) av Kex2 protease eller et prosesseringsenzym, ble introdusert i cellene til M25-stamme E. coli (W3110/ompT: Sugimura et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., vol. 153,1988, s. 753-759). De transformerte cellene fra M25-stamme E. coli ble kultivert på et medium inneholdende 2 % gjærekstrakt i en 201 kulturtank.

Dyrkningen fortsatte til celletettheten var OD66o = 12. De høstede cellene ble revet i små deler med en høytrykkshomogenisator (Manton-Gaullin) i 10 mM Tris-HCI buffer (pH 8,2) supplementert med 1 mM EDTA, sentrifugert og vasket, for å produsere ca. 625 ml suspensjon inneholdende ca. 100 g inklusjonslegemer fylt med kimærisk protein. Til 250 ml suspensjon inneholdende 40 g inklusjonslegemer ble det tilsatt 100 ml av 1 M Tris-HCI buffer (pH 8,2), 50 ml av 5 M NaCI, 500 ml avionisert vann og 900 g urea, og blandingen ble agitert ved 30 °C for å tillate oppløsning av inklusjonslegemene.

Løsningen ble fortynnet med avionisert vann til 5 I, og til dette ble 50 ml av 250 mM CaCI2 tilsatt. Til løsningen ble det deretter tilsatt Kex2-660 som innbefatter aminosyrerester gitt aminosyre nr. 1 - 660 (offentliggjort japansk patent nr. 10-229884) som er et derivat fra Kex2 protease, inntil det eksisterte ved 20 kU/ml eller høyere. Blandingen ble rørt forsiktig i to timer, og hPTH(1-34) ble kuttet fra det kimæriske proteinet. Reaksjonsløsningen ble justert til pH 6,4 ved tilsetning av eddiksyre; den ble deretter fortynnet tofold med avionisert vann, og tillot dermed det kimæriske proteinet og p-galaktosidasederivatet å forbli ureagert til å presipitere; og utbyttet ble sentrifugert for å tilveiebringe en supernatant inneholdende 6,7 g hPTH(1-34). Supernatanten ble justert til pH 5,0 ved tilsetning av eddiksyre; løsningen ble overført til et kationbytterresin (SP Toyopearl fra Tosoh Corporation) tidligere ekvilibrert med 10 mM natriumacetat for å tillate at hPTH(1-34) blir adsorbert til resinet; resinet ble vasket med 10 mM natriumacetatbuffer; og 0,4 M NaCI ble anvendt for å gi en fraksjon inneholdende 6,0ghPTH(1-34).

Til denne fraksjonen ble det tilsatt eddiksyre til 3 volum/volumprosent; løsningen ble overført til en reversert fase ODS-lavtrykkskolonne (Soken ODS-W fra Soken Chemicals Co.) tidligere ekvilibrert med 3 volum/volumprosent eddiksyre; og 30 volum/volumprosent acetonitril inneholdende 3 volum/volumprosent eddiksyre ble anvendt til å eluere hPTH(1-34). Eluatet inneholdende hPTH(1-34) ble anriket under et redusert trykk; utbyttet ble overført til en kolonne for reversert fase HPLC (TSKge10DS120T med en størrelse på 55 mm x 600 mm fra Tosoh Corp.); og løsning av acetonitril i 5 volum/volumprosent eddiksyre fikk strømme ved 40 ml/min i 60 minutter, der konsentrasjonen av acetonitril ble variert lineært fra 16 % til 32 % i mellomtiden, for å eluere hPTH(1-34). Dermed ble en renset fraksjon inneholdende 4 g hPTH(1-34) fremskaffet. 60 g av de gjenværende inklusjonslegemene ble behandlet på lignende måte, og en annen renset fraksjon inneholdende 5 g hPTH(1-34) fremskaffet derfra ble kombinert med førstnevnte; blandingen fikk fjernet acetonitril under et redusert trykk; og utbyttet ble fortynnet med 5 volum/volumprosent eddiksyre slik at konsentrasjonen av hPTH(1-34) falt til 10 mg/ml. 15 ml av løsningen ble fordelt i hvert glassrør; og alle rørene inneholdende løsningen ble frysetørket for å tilveiebringe totalt 9 g hPTH(1-34) (150 mg x 60 rør).

ESI-MS: 4117,7 (teoretisk verdi er 4117,8). Aminosyresammensetning etter å ha blitt hydrolysen med 6 N saltsyre: Asx-4,0(4); Ser-2,6(3); Glx-4,9(5); Gly-1,0(1); Val-3,0(3), Met-2,0(2); lle-1,0(1); Leu-5; Phe-1,1(1); Lys-30(3); His-3,0(3); Arg-2,0(2); og Trp- ikke detektert (1).

Referanseeksempel 2. Fremstilling av hPTH-(1-34) (2)

Lignende levende mikrober som de anvendt i Referanseeksempel 1 ble kultivert i en 200 I kulturtank. Dyrkningen fortsatte til celletettheten var OD6eo = 160. De høstede cellene ble revet i små deler med en høytrykkshomogenator i 10 mM Tris-HCI buffer (pH 8,2) supplementer! med 1 mM EDTA, sentrifugert og vasket, for å gi ca. 10 I suspensjon inneholdende ca. 5 kg inklusjonslegemer fylt med det kimæriske proteinet.

Til 4,0 I supsensjon inneholdende 2 kg inklusjonslegemer ble det tilsatt 1,61 av 1 M Tris-HCI buffer (pH 8,2), 0,8 I av 5 M NaCI, 15 I avionisert vann og 13 kg urea, og blandingen ble agitert ved 30 °C for å muliggjøre oppløsning av inklusjonslegemene.

Løsningen ble fortynnet med avionisert vann til 801, og til denne ble det tilsatt 0,8 ml av 250 mM CaCI2. Deretter ble Kex2-660 tilsatt løsningen (offentliggjort japansk patent nr. 10-229884), inntil den forelå ved 10 kU/ml eller høyere. Blandingen ble forsiktig agitert i én time, og hPTH(1-34) ble separert med kutting fra kimærisk protein. Reaksjonsløsningen ble justert til pH 6,3 ved tilsetning av eddiksyre; den ble deretter fortynnet tofold med avionisert vann, og tillot dermed det kimæriske proteinet og p-galaktosidasederivatet å forbli ureagert til å presipitere; og utbyttet ble utsatt for trykkfiltrering for å tilveiebringe en supernatant inneholdende hPTH(1-34).

Supernatanten ble justert til pH 5,0 ved tilsetning av eddiksyre; løsningen ble overført til en kationbytter resinkolonne (5 I) (Poros 50HS fra PerSeptive Biosystems, USA) tidligere ekvilibrert med 10 mM natriumacetatbuffer for å tillate hPTH(1-34) å bli adsorbert til kolonnen; kolonnen ble vasket med 10 mM natriumacetatbuffer; og 0,4 M NaCI med en konsentrasjonsgradient ble anvendt for å tilveiebringe en fraksjon inneholdende hPTH(1-34). Til denne fraksjonen ble det tilsatt eddiksyre til 3 volum/volumprosent; løsningen ble overført til en reversert fase ODS-lavtrykkskolonne (51) (Soken ODS-W fra Soken Chemicals Co.) tidligere ekvilibrert med 3 volum/volumprosent eddiksyre; og 30 volum/volumprosent acetonitril inneholdende 3 volum/volumprosent eddiksyre ble anvendt for å eluere hPTH(1-34).

Eluatet inneholdende hPTH(1-34) ble anriket under et redusert trykk; utbyttet ble filtrert gjennom et 0,22 nm filter; filtratet ble overført til en kolonne for reversert fase HPLC (TSK ODS 80Ts 20 um, 105 mmID x 550 mm fra Tosoh Corp.); og acetonitiril med en konsentrasjonsgradient ble anvendt i nærvær av 3 volum/volumprosent eddiksyre for å eluere hPTH(1-34). Flere eluater som dermed ble fremskaffet ble slått sammen; og acetonitril ble fjernet fra løsningen via destillering under et redusert trykk, for å tilveiebringe 10,41 konsentrert hPTH(1-34) løsning inneholdende 70 g hPTH(1-34) ved 99,6 %. Av 3 kg med de gjenværende inklusjonslegemene ble 2 kg utsatt for den samme rensingsfremgangsmåten, for å tilveiebringe 11,6 I konsentrert hPTH(1-34) løsning inneholdende hPTH(1-34) ved 99,6 %.

Referanseeksempel 3. Fremstilling av hPTH(1-84)

Ekspresjonsplasmidet pGP#19 (offentliggjort japansk patent nr. 9-29660) inneholdende et gen som koder for et kimærisk protein av hPTH(1-84), fremskaffet ved å koble et DNA-fragment som koder for et derivat av (3-galaktosidase avledet fra E. coli med et DNA-fragment som koder for hPTH(1-84) via intervensjonen av et DNA-fragment som koder for en linker inneholdende et kuttemotiv (Lys-Arg) av Kex2 protease eller et prosesseringsenzym, ble introdusert i cellene til M25-stamme E. coli. De transformerte cellene fra M25-stamme E. coli ble kultivert ved 37 °C i en 3 I kulturtank. Dyrkningen fortsatte til turbiditeten (OD66o) til kulturløsningen var OD660 = 1. Deretter ble isopropyl beta-tiogalaktosid (IPTG) satt til 1,0 mM.

Dyrkningen fortsatte videre i fire timer. Cellene ble høstet med sentrifugering; og cellene ble deretter suspendert i TE (10 mM Tris og 1 mM EDTA ved pH 8,0). Cellene ble revet i små deler med en "French press", utsatt for en repetisjon av sentrifugering og resuspensjon, og vasket for å gi inklusjonslegemer. En suspensjon av inklusjonslegemene ble tilsatt for oppløsning i en løsning (pH 8,0) inneholdende 8,0 M urea og 10 mM Tris og sentrifugert; supernatanten ble satt på en Toyopearl-kolonne (Toso Corp.); og NaCI med en konsentrasjonsgradient på 0 - 0,4 M ble anvendt for å eluere anriket hPTH(1-84). Løsningen anriket på oppløsende inklusjonslegemer ble videre konsentrert med ultrafiltrering der alt over 10.000 MW ble fjernet. Utbyttet ble fortynnet for å tilveiebringe en løsning der konstituentene ble 50 mM for BisTris ved pH 6,8,1,0 mM for CaCI2 og 5 mg/ml for det kimæriske proteinet. Kex2-660 ble satt til 2 kU/ml, og reaksjon fikk fortsette ved 30 °C i én time for å separere hPTH(1-84) med kutting.

Reaksjonsløsningen ble justert til pH 5,0 ved tilsetning av eddiksyre; den ble deretter fortynnet tofold med avionisert vann, og tillot dermed det kimæriske proteinet og (3-galaktosidasederivatet å forbli ureagert til å presipitere; og utbyttet ble sentrifugert for å tilveiebringe en supernatant inneholdende hPTH(1-84). Til supernatanten ble det tilsatt eddiksyre til 3 volum/volumprosent; og løsningen ble overført til TSK gel ODS 80Ts (21 mmID x 250 mm, Tosoh Corporation) tidligere ekvilibrert med 3 volum/volumprosent eddiksyre til rensing. Fraksjoner inneholdende 98 % eller mer hPTH(1-84) ble slått sammen; løsningsmiddel ble fjernet fra den resulterende løsningen; og resten ble frysetørket for å tilveiebringe 500 mg hPTH(1-84). Molekylvekten og aminosyresammensetningen til denne substansen er som indikert nedenfor. Basert på disse resultatene ble substansen identifisert som hPTH(1-84).

ESI-MS: 9424,7 (teoretisk verdi er 9424,7). Aminosyresammensetning etter å ha blitt hydrolysen med 6 N saltsyre: Asx-10,1(10); Thr-1,1(1); Ser-6,3(7); Glx-11,0(11); Pro-2,9(3); Gly-4,1(4); Ala-7,0(7); Val-8,0(8); Met-1,9(2); lle-1,0(1); Leu-10; Phe-1,0(1); Lys-8,9(9); His-3,9(4); Arg-5,0(5); og Trp- ikke detektert (1).

Eksempel 1. Fjerning av eddiksyre fra hPTH(1-34) (1)

En mengde av fremstilling som korresponderer til 150 mg hPTH(1-34) fremskaffet i Referanseeksempel 1 ble løst i destillert vann (30 ml), for å gi en vandig løsning (pH 4,7) av hPTH(1-34) på 5 mg/ml. Denne løsningen ble dialysert mot destillert vann (100 ml) med en Gl micro acilyzer (Asahi Kasei Corp.) med en elektrodialysemembran AC-130-10 (Asahi Kasei Corp.). Dialysen fortsatte for fjerning av eddiksyre inntil pH i dialyseløsningen var pH 5,0. Den anrikede løsningen inneholdende 6,8 % eddiksyre ble frysetørket, og tørr masse som korresponderer til ca. 150 mg hPTH(1-34) ble fremskaffet med eddiksyreinnhold på 4,8 %.

En mengde av fremstilling som korresponderer til 150 mg hPTH(1-34) fremskaffet i Referanseeksempel 1 ble løst i destillert vann (30 ml), for å gi en vandig løsning (pH 4,7) av hPTH(1-34) på 5 mg/ml. Denne løsningen ble utsatt for elektrodialyse som i Eksempel (1); dialysen fortsatte for fjerning av eddiksyre inntil pH i dialyseløsningen var phi 5,5. Den anrikede løsningen inneholdende 4,6 % eddiksyre ble frysetørket, og tørr masse som korresponderer til ca. 150 mg hPTH(1-34) ble fremskaffet med eddiksyreinnhold på 3,8 %.

En mengde av fremstilling som korresponderer til 150 mg hPTH(1-34) fremskaffet i Referanseeksempel 1 ble løst i destillert vann (30 ml), for å gi en vandig løsning (pH 4,7) av hPTH(1-34) på 5 mg/ml. Denne løsningen ble utsatt for elektrodialyse som i Eksempel (1): dialysen fortsatte for fjerning av eddiksyre inntil pH i dialyseløsningen var pH 5,9. Den anrikede løsningen inneholdende 3,1 % eddiksyre ble frysetørket, og tørr masse som korresponderer til ca. 150 mg hPTH(1 -34) ble fremskaffet med eddiksyreinnhold på 2,9 %.

En mengde av fremstilling som korresponderer til 150 mg hPTH(1-34) fremskaffet i Referanseeksempel 1 ble løst i destillert vann (30 ml), for å gi en vandig løsning (pH 4,7) av hPTH(1-34) på 5 mg/ml. Denne løsningen ble utsatt for elektrodialyse som i Eksempel (1): dialysen fortsatte for fjerning av eddiksyre inntil pH i dialyseløsningen var pH 7,0. Den anrikede løsningen inneholdende 1,6 % eddiksyre ble frysetørket, og tørr masse som korresponderer til ca. 150 mg hPTH(1-34) ble fremskaffet med eddiksyreinnhold på 1,6 %.

Fra resultatene ovenfor ble det demonstrert at dekrementet av eddiksyreinnhold med frysetørking blir mindre ved å redusere eddiksyreinnholdet, og at med reduksjonen av eddiksyreinnhold blir det lille dekrementet av eddiksyreinnhold mindre. Følgelig er reduksjon av eddiksyreinnholdet i en hPTH-komponent nyttig for å fremstille en farmasøytisk hPTH-komponent inneholdende en spesifisert mengde av eddiksyre, hvilket har vært vanskelig å oppnå med konvensjonelle

teknikker.

Eksempel 2. Fjerning av eddiksyre fra hPTH(1-34) (2)

Til en løsning inneholdende fremstilling som korresponderer til ca. 150 mg hPTH(1-34) fremskaffet i Referanseeksempel 2 ble det tilsatt 5 N NaOH til pH 5,5. En fjerdedel av løsningen ble overført til en reversert fase ODS-lavtrykkskolonne (Soken ODS-W (800 ml) fra Soken Chemicals Co.) tidligere ekvilibrert med 5 volum/volumprosent vandig løsning av acetonitril, for å tillate hPTH(1-34) å bli adsorbert til kolonnen. 41 av 5 volum/volumprosent vandig løsning av acetonitril ble ført gjennom kolonnen for å eluere natriumacetat; og 50 volum/volumprosent vandig løsning av acetonitril ble deretter ført gjennom kolonnen for å eluere hPTH(1-34). Denne fremgangsmåten ble repetert for hver av de fire delene; de hPTH(1-34)-inneholdende fraksjonene av de fire delene ble slått sammen for å gi 8,2 I av nesten eddiksyrefri fraksjon inneholdende 122,5 g PTH(1-34) (1,13 % eddiksyreinnhold i hPTH(1-34)).

Til denne fraksjonen ble det tilsatt destillert vann for å tilveiebringe en hPTH(1-34) løsning med 10 mg/ml; til denne løsningen ble det tilsatt 2,3 g eddiksyre slik at den resulterende løsningen inneholder 122,5 g PTH(1-34) med 3 % eddiksyreinnhold på 3 %; og blandingen ble rørt godt. Løsningen ble fordelt i rør slik at hvert rør inneholdt 150 mg hPTH(1-34); og hPTH(1-34) løsningen i rør ble frysetørket, som fremskaffet hPTH(1-34) med eddiksyreinnhold på 2,1 %.

Eksempel 3. Fjerning av eddiksyre fra hPTH(1-34) (3)

En mengde av fremstilling som korresponderer til 300 mg hPTH(1-34) fremskaffet i Referanseeksempel 1 ble løst i destillert vann (30 ml), for å gi en vandig løsning av hPTH(1-34) på 10 mg/ml. Denne løsningen (pH 4,7) inneholdende 9,5 % eddiksyre ble plassert i tre glassrør, 2 ml i hvert rør; og de ble plassert i en FZ-6 frysetørker (Laboconco Corp.) der det indre trykket ble holdt på 0,13 mBar eller lavere; og de ble utsatt for primær tørking (-20 °C i form av temperaturen på hyllen de stod på i 12 timer) og sekundær tørking (25 °C på hyllen i 48 timer) for frysetørking. På slutten av den sekundære tørkingen ble kammeret anvendt for frysetørking fylt med nitrogengass; og rørene ble automatisk stengt med kork. 2 ml destillert vann ble tilsatt hvert rør, og løsningens eddiksyreinnhold ble bestemt med ionebytter HPLC. Resultatene er vist i Tabell 1.

En mengde av fremstilling som korresponderer til 300 mg hPTH(1-34) fremskaffet i Referanseeksempel 1 ble løst i destillert vann (30 ml), for å gi en vandig løsning av hPTH(1-34) på 10 mg/ml. Denne løsningen (pH 4,7) ble utsatt for elektrodialyse ved å anvende en micro acilyzer (Asahi Kasei Corp.) med en elektrodialysemembran AC-130-10 (Asahi Kasei Corp.). Dialysen fortsatte for fjerning av eddiksyre til pH i dialyseløsningen ble pH 5,0 (eddiksyreinnholdet i løsningen utsatt for dialyse er 7,3 %). Den eddiksyrefjernede løsningen ble fordelt i tre glassrør, 2 ml i hvert rør; de ble frysetørket som i Eksempel (1); og eddiksyreinnholdet i hver prøve ble bestemt med ionebytter HPLC. Resultatene er vist i Tabell 1.

En mengde av fremstilling som korresponderer til 300 mg hPTH(1-34) fremskaffet i Referanseeksempel 1 ble løst i destillert vann (30 ml), for å gi en vandig løsning av hPTH(1-34) på 10 mg/ml. Denne løsningen (pH 4,7) ble utsatt for elektrodialyse ved å anvende en micro acilyzer (Asahi Kasei Corp.) med en elektrodialysemembran AC-130-10 (Asahi Kasei Corp.). Dialysen fortsatte for fjerning av eddiksyre til pH i dialyseløsningen ble pH 5,5 (eddiksyreinnholdet i løsningen utsatt for dialyse er 4,6 %). Den eddiksyrefjernede løsningen ble fordelt i tre glassrør, 2 ml i hvert rør; de ble frysetørket som i Eksempel (1); og eddiksyreinnholdet i hver prøve ble bestemt med ionebytter HPLC. Resultatene er vist i Tabell 1.

En mengde av fremstilling som korresponderer til 300 mg hPTH(1-34) fremskaffet

i Referanseeksempel 1 ble løst i destillert vann (30 ml), for å gi en vandig løsning av hPTH(1-34) på 10 mg/ml. Denne løsningen (pH 4,7) ble utsatt for elektrodialyse ved å anvende en micro acilyzer (Asahi Kasei Corp.) med en elektrodialysemembran AC-130-10 (Asahi Kasei Corp.). Dialysen fortsatte for fjerning av eddiksyre til pH i dialyseløsningen ble pH 6,3 (eddiksyreinnholdet i løsningen utsatt for dialyse er 2,0 %). Den eddiksyrefjernede løsningen ble fordelt

i tre glassrør, 2 ml i hvert rør; de ble frysetørket som i Eksempel (1); og eddiksyreinnholdet i hver prøve ble bestemt med ionebytter HPLC. Resultatene er vist i Tabell 1.

En mengde av fremstilling som korresponderer til 300 mg hPTH(1-34) fremskaffet i Referanseeksempel 1 ble løst i destillert vann (30 ml), for å gi en vandig løsning av hPTH(1-34) på 10 mg/ml. Denne løsningen (pH 4,7) ble utsatt for elektrodialyse ved å anvende en micro acilyzer (Asahi Kasei Corp.) med en elektrodialysemembran AC-130-10 (Asahi Kasei Corp.). Dialysen fortsatte for fjerning av eddiksyre til pH i dialyseløsningen ble pH 7,0 (eddiksyreinnholdet i løsningen utsatt for dialyse er 1,1 %). Den eddiksyrefjernede løsningen ble fordelt i tre glassrør, 2 ml i hvert rør; de ble frysetørket som i Eksempel (1); og eddiksyreinnholdet i hver prøve ble bestemt med ionebytter HPLC. Resultatene er vist i Tabell 1.

En mengde av fremstilling som korresponderer til 300 mg hPTH(1-34) fremskaffet i Referanseeksempel 1 ble løst i destillert vann (30 ml), for å gi en vandig løsning av hPTH(1-34) på 10 mg/ml. Denne løsningen (pH 4,7) ble utsatt for elektrodialyse ved å anvende en micro acilyzer (Asahi Kasei Corp.) med en elektrodialysemembran AC-130-10 (Asahi Kasei Corp.). Dialysen fortsatte for fjerning av eddiksyre til pH i dialyseløsningen ble pH 7,6 (eddiksyreinnholdet i løsningen utsatt for dialyse er 0,5 %). Den eddiksyrefjernede løsningen ble fordelt i tre glassrør, 2 ml i hvert rør; de ble frysetørket som i Eksempel (1); og eddiksyreinnholdet i hver prøve ble bestemt med ionebytter HPLC. Resultatene er vist i Tabell 1.

Med reduksjonen av eddiksyreinnhold i en prøve før frysetørking, er det tydelig fra Tabell 1 at dekrementet av eddiksyreinnhold med frysetørking blir mindre, og med reduksjonen av eddiksyreinnhold i prøver før frysetørking blir variasjonen i eddiksyreinnhold mellom prøvene eller produksjonsomganger etter frysetørking mindre. Følgelig er hPTH med lavt eddiksyreinnhold vist å være egnet for fremstilling av en farmasøytisk hPTH-komponent inneholdende en spesifisert mengde av eddiksyre, hvilket har vært vanskelig å oppnå med konvensjonelle teknikker.

Eksempel 4. Fjerning av eddiksyre fra hPTH(1-34)

Lignende levende mikrober som de anvendt i Referanseeksempel 1 ble kultivert i en 200 I kulturtank. Cellene ble revet i små deler, sentrifugert og vasket; og 4,8 kg inklusjonslegemer fylt med et kimærisk protein ble fremskaffet. 2,4 kg av dette ble utsatt for kutting med Kex2-660 som i Referanseeksempel 2 for å oppnå hPTH(1-34). Utbyttet deretter ble utsatt for rensing med kationbyttekromatografi, avsalting med reversert fase ODS kromatografi, og endelig rensing med reversert fase HPLC. Deretter, som i Eksempel 2, ble 5 N natriumhydroksid satt til den rensede fraksjonen til pH 5,5; og løsningen ble overført til en reversert fase ODS-lavtrykkskolonne. En 5 volum/volumprosent vandig løsning av acetonitril ble ført gjennom kolonnen for å fjerne natriumacetat; og 50 volum/volumprosent vandig løsning av acetonitril ble deretter ført gjennom kolonnen for å eluere hPTH(1-34). Dermed ble 5,41 løsning inneholdende 58 g PTH(1-34) fremskaffet (1,2 % eddiksyreinnhold i hPTH1(1-34)). Til denne løsningen ble det tilsatt 1,0 g eddiksyre, slik at den resulterende løsningen inneholder 58 g PTH(1-34) med 3 % eddiksyreinnhold; og blandingen ble rørt godt. Løsningen ble fordelt i rør, slik at hvert rør inneholdt 150 mg hPTH(1-34); og alle hPTH(1-34) løsningene i rør ble frysetørket som fremskaffet 57,8 g hPTH(1-34) med eddiksyreinnhold på 2,5 %

(385 rør).

En mengde av fremstilling som korresponderer til 150 mg hPTH(1-34) fremskaffet i Eksempel (1) ble løst i 3 ml trifluoretanol; og 30 ml dietyleter ble tilsatt for presipitering. Et pulver fremskaffet derfra ble utsatt for tørking i 24 timer under et redusert trykk i en desikkator i nærvær av natriumhydroksidpelleter, for å gi 130 mg hPTH(1-34) med eddiksyreinnhold på 2,0 %.

I røret inneholdende fremstilling som korresponderer til 150 mg hPTH(1-34), fremskaffet i Eksempel (1), ble det tilsatt 1,53 uJ eddiksyre langs innsiden av røret med en mikrosprøyte, mens man var forsiktig slik at den ikke kom i kontakt med hPTH(1-34). Fordamping av eddiksyre ble utført ved å plassere røret ved 80 °C i fem minutter; røret ble agitert med en vorteksblander; og hPTH(1-34) i røret ble til fint pulver, for å gi en hPTH(1-34) fremstilling med eddiksyreinnhold på 3,6 %.

I røret inneholdende fremstilling som korresponderer til 150 mg hPTH(1-34), fremskaffet i Eksempel (1), ble det tilsatt 3,78 |il eddiksyre langs innsiden av røret med en mikrosprøyte, mens man var forsiktig slik at den ikke kom i kontakt med hPTH(1-34). Fordamping av eddiksyre ble utført ved å plassere røret ved 80 °C i fem minutter; røret ble agitert med en vorteksblander; og hPTH(1-34) i røret ble til fint pulver, for å gi en hPTH(1-34) fremstilling med eddiksyreinnhold på 5,1 %.

I røret inneholdende fremstilling som korresponderer til 150 mg hPTH(1-34), fremskaffet i Eksempel (1), ble det tilsatt 5,28 uJ eddiksyre langs innsiden av røret med en mikrosprøyte, mens man var forsiktig slik at den ikke kom i kontakt med hPTH(1-34). Fordamping av eddiksyre ble utført ved å plassere røret ved 80 °C i fem minutter; røret ble agitert med en vorteksblander; og hPTH(1-34) i røret ble til fint pulver, for å gi en hPTH(1-34) fremstilling med eddiksyreinnhold på 6,2 %.

Referanseeksempel 4

I røret inneholdende fremstilling som korresponderer til 150 mg hPTH(1-34), fremskaffet i Eksempel 4(1), ble det tilsatt 7,23 uJ eddiksyre langs innsiden av røret med en mikrosprøyte, mens man var forsiktig slik at den ikke kom i kontakt med hPTH(1-34). Fordamping av eddiksyre ble utført ved å plassere røret ved 80 °C i fem minutter; røret ble agitert med en vorteksblander; og hPTH(1-34) i røret ble til fint pulver, for å gi en hPTH(1-34) fremstilling med eddiksyreinnhold på 7,5 %.

I røret inneholdende fremstilling som korresponderer til 150 mg hPTH(1-34), fremskaffet i Eksempel 4(1), ble det tilsatt 9,48 uJ eddiksyre langs innsiden av røret med en mikrosprøyte, mens man var forsiktig slik at den ikke kom i kontakt med hPTH(1 -34). Fordamping av eddiksyre ble utført ved å plassere røret ved 80 °C i fem minutter; røret ble agitert med en vorteksblander; og hPTH(1-34) i røret ble til fint pulver, for å gi en hPTH(1-34) fremstilling med eddiksyreinnhold på

9,1 %.

I røret inneholdende fremstilling som korresponderer til 150 mg hPTH(1-34), fremskaffet i Eksempel 4(1), ble det tilsatt 10,53 (il eddiksyre langs innsiden av røret med en mikrosprøyte, mens man var forsiktig slik at den ikke kom i kontakt med hPTH(1-34). Fordamping av eddiksyre ble utført ved å plassere røret ved 80 °C i fem minutter; røret ble agitert med en vorteksblander; og hPTH(1-34) i røret ble til fint pulver, for å gi en hPTH(1-34) fremstilling med eddiksyreinnhold på 7,5 %.

I røret inneholdende fremstilling som korresponderer til 150 mg hPTH(1-34), fremskaffet i Eksempel 4(1), ble det tilsatt 14,28 uJ eddiksyre langs innsiden av røret med en mikrosprøyte, mens man var forsiktig slik at den ikke kom i kontakt med hPTH(1-34). Fordamping av eddiksyre ble utført ved å plassere røret ved 80 °C i fem minutter; røret ble agitert med en vorteksblander; og hPTH(1-34) i røret ble til fint pulver, for å gi en hPTH(1-34) fremstilling med eddiksyreinnhold på 12,5%

I røret inneholdende fremstilling som korresponderer til 150 mg hPTH(1-34), fremskaffet i Eksempel 4(1), ble det tilsatt 16 uJ eddiksyre langs innsiden av røret med en mikrosprøyte, mens man var forsiktig slik at den ikke kom i kontakt med hPTH(1-34). Fordamping av eddiksyre ble utført ved å plassere røret ved 80 °C i fem minutter; røret ble agitert med en vorteksblander; og hPTH(1-34) i røret ble til fint pulver, for å gi en hPTH(1-34) fremstilling med eddiksyreinnhold på 13,7 %.

I røret inneholdende fremstilling som korresponderer til 150 mg hPTH(1-34), fremskaffet i Eksempel 4(1), ble det tilsatt 22,6 pJ eddiksyre langs innsiden av røret med en mikrosprøyte, mens man var forsiktig slik at den ikke kom i kontakt med hPTH(1-34). Fordamping av eddiksyre ble utført ved å plassere røret ved 80 °C i fem minutter; røret ble agitert med en vorteksblander; og hPTH(1-34) i røret ble til fint pulver, for å gi en hPTH(1-34) fremstilling med eddiksyreinnhold på 18,3%.

I røret inneholdende fremstilling som korresponderer til 150 mg hPTH(1-34), fremskaffet i Eksempel 4(1), ble det tilsatt 100 (il eddiksyre langs innsiden av røret med en mikrosprøyte, mens man var forsiktig slik at den ikke kom i kontakt med hPTH(1-34). Fordamping av eddiksyre ble utført ved å plassere røret ved 80 °C i fem minutter; røret ble agitert med en vorteksblander; og hPTH(1-34) i røret ble til fint pulver, for å gi en hPTH(1-34) fremstilling med eddiksyreinnhold på 72,5 %.

Eksempel 5. Fjerning av eddiksyre fra hPTH(1-84)

En mengde av fremstilling som korresponderer til 50 mg hPTH(1-84) fremskaffet med eddiksyreinnhold på 5,4 % i Referanseeksempel 3 ble løst i destillert vann (10 ml), for å gi en vandig løsning (pH 4,7) av hPTH(1-84) på 5 mg/ml. Denne løsningen ble dialysen" ved romtemperatur mot destillert vann (100 ml) med en Gl micro acilyzer (Asahi Kasei Corp.) med en elektrodialysemembran AC-130-10 (Asahi Kasei Corp.). Dialysen fortsatte for fjerning av eddiksyre til pH i dialyseløsningen ble pH 5,0. Den anrikede løsningen ble frysetørket, og fremstilling som korresponderer til ca. 50 mg hPTH(1-84) ble fremskaffet med eddiksyreinnhold på 3,9 %.

En mengde av fremstilling som korresponderer til 50 mg hPTH(1-84) fremskaffet med eddiksyreinnhold på 5,4 % i Referanseeksempel 3 ble løst i destillert vann (10 ml), for å gi en vandig løsning (pH 4,7) av hPTH(1-84) på 5 mg/ml. Denne løsningen ble utsatt for elektrodialyse på samme måte som i Eksempel (1). Dialysen fortsatte for fjerning av eddiksyre til pH i dialyseløsningen ble pH 6,0. Den anrikede løsningen ble frysetørket, og fremstilling som korresponderer til ca.

50 mg hPTH(1-84) ble fremskaffet med eddiksyreinnhold på 2,5 %.

En mengde av fremstilling som korresponderer til 50 mg hPTH(1-84) fremskaffet med eddiksyreinnhold på 5,4 % i Referanseeksempel 3 ble løst i destillert vann (10 ml), for å gi en vandig løsning (pH 4,7) av hPTH(1-84) på 5 mg/ml. Denne løsningen ble utsatt for elektrodialyse på samme måte som i Eksempel (1). Dialysen fortsatte for fjerning av eddiksyre til phi i dialyseløsningen ble pH 7,0. Den anrikede løsningen ble frysetørket, og fremstilling som korresponderer til ca.

50 mg hPTH(1-84) ble fremskaffet med eddiksyreinnhold på 1,3 %.

En mengde av fremstilling som korresponderer til 50 mg hPTH(1-84) fremskaffet med eddiksyreinnhold på 5,4 % i Referanseeksempel 3 ble løst i destillert vann (10 ml), for å gi en vandig løsning (pH 4,7) av hPTH(1-84) på 5 mg/ml. Denne løsningen ble utsatt for elektrodialyse på samme måte som i Eksempel (1). Dialysen fortsatte for fjerning av eddiksyre til pH i dialyseløsningen ble pH 8,0. Den anrikede løsningen ble frysetørket, og fremstilling som korresponderer til ca.

50 mg hPTH(1-84) ble fremskaffet med eddiksyreinnhold på 0,9 %.

Eksempel 6. Fjerning av eddiksyre fra hPTH(1-84) (2)

En mengde av fremstilling som korresponderer til 100 mg hPTH(1-84) fremskaffet med eddiksyreinnhold på 5,4 % i Referanseeksempel 3 ble løst i 500 |il trifluoretanol; og 20 ml dietyleter ble tilsatt for presipitering. Presipitatet ble høstet med filtrering; og utbyttet ble utsatt for tørking i 24 timer under et redusert trykk i en desikkator i nærvær av natriumhydroksidpelleter, for å gi tørr masse som korresponderer til ca. 90 mg hPTH(1-84) fremskaffet med eddiksyreinnhold på 1,6 %.

En 5,49 mg tørr masse fremskaffet i Eksempel 6(1) ble veid ut nøyaktig og plassert i et 5 ml rør; og 0,3 (il 10 volumprosent eddiksyre/metylenklorid ble tilsatt med en mikrosprøyte, for å tilveiebringe fremstilling med eddiksyreinnhold på 2,2 %.

5.58 mg av tørr masse fremskaffet i Eksempel 6(1) ble veid ut nøyaktig og plassert i et 5 ml rør; og 0,6 \ i\ av 10 volumprosent eddiksyre/metylenklorid ble tilsatt med en mikrosprøyte, for å tilveiebringe fremstilling med eddiksyreinnhold på 2,7 %.

4,96 mg av tørr masse fremskaffet i Eksempel 6(1) ble veid ut nøyaktig og plassert i et 5 ml rør; og 1,0 (il av 10 volumprosent eddiksyre/metylenklorid ble tilsatt med en mikrosprøyte, for å tilveiebringe fremstilling med eddiksyreinnhold på 3,8 %.

Referanseeksempel 5

5,05 mg av tørr masse fremskaffet i Eksempel 6(1) ble veid ut nøyaktig og plassert i et 5 ml rør; og 1,7 (il av 10 volumprosent eddiksyre/metylenklorid ble tilsatt med en mikrosprøyte, for å tilveiebringe fremstilling med eddiksyreinnhold på 5,2 %.

5.59 mg av tørr masse fremskaffet i Eksempel 6(1) ble veid ut nøyaktig og plassert i et 5 ml rør; og 2,5 |il av 10 volumprosent eddiksyre/metylenklorid ble

tilsatt med en mikrosprøyte, for å tilveiebringe fremstilling med eddiksyreinnhold på 6,4 %.

5,01 mg av tørr masse fremskaffet i Eksempel 6(1) ble veid ut nøyaktig og plassert i et 5 ml rør; og 3,0 fxl av 10 volumprosent eddiksyre/metylenklorid ble tilsatt med en mikrosprøyte, for å tilveiebringe fremstilling med eddiksyreinnhold på 8,0 %.

5,48 mg av tørr masse fremskaffet i Eksempel 6(1) ble veid ut nøyaktig og plassert i et 5 ml rør; og 4,4 |il av 10 volumprosent eddiksyre/metylenklorid ble tilsatt med en mikrosprøyte, for å tilveiebringe fremstilling med eddiksyreinnhold på 10,2%.

5,47 mg av tørr masse fremskaffet i Eksempel 6(1) ble veid ut nøyaktig og plassert i et 5 ml rør; og 5,5 uJ av 10 volumprosent eddiksyre/metylenklorid ble tilsatt med en mikrosprøyte, for å tilveiebringe fremstilling med eddiksyreinnhold på 12,3%.

5,10 mg av tørr masse fremskaffet i Eksempel 6(1) ble veid ut nøyaktig og plassert i et 5 ml rør; og 10,2 uJ av 10 volumprosent eddiksyre/metylenklorid ble tilsatt med en mikrosprøyte, for å tilveiebringe fremstilling med eddiksyreinnhold på 22,9 %.

5,53 mg av tørr masse fremskaffet i Eksempel 6(1) ble veid ut nøyaktig og plassert i et 5 ml rør; og 16,6 \ i\ av 10 volumprosent eddiksyre/metylenklorid ble tilsatt med en mikrosprøyte, for å tilveiebringe fremstilling med eddiksyreinnhold på 33,6 %.

Eksperiment 1. Stabilitet av hPTH(1-34) (1)

hPTH-fremstillingen, hvorfra eddiksyre eksisterende som konstituenten i et salt av hPTH eller et adherent stoff hadde blitt fjernet, ble testet for dens stabilitet.

En mengde av fremstilling som korresponderer til ca. 150 mg hPTH(1-34) fremskaffet med eddiksyreinnhold på 9,5 % introdusert i et glassrør og hermetisk forseglet, som fremskaffet i Referanseeksempel 1, ble lagret i et LH-30-14 oppbevaringssted (Nagano Science Co.) ved 40 ± 1 °C i seks måneder. Før lagring ble noen rør og etter lagring ble de gjenværende rørene utsatt for reversert fase HPLC, for dermed å isolere dekomposisjonsprodukter (biprodukter) før lagring så vel som etter lagring for deres strukturelle analyse. Resultatene er vist i Tabell 2.

Reversert fase HPLC-kromatogram av prøven som har blitt lagret er vist i Figur 1. En høy topp som representerer hPTH(1-34) ble etterfulgt av tre topper (retensjonstid var 13 til 17 minutter) angitt som B, C og D. Prosentarealene til disse toppene er 3,9 % for topp B, 6,9 % for topp C og 3,0 % for topp D som indikert i Tabell 2. Totalen er 13,8 % eller en betydelig fraksjon som utgjør en hovedårsak for forringelsen av produktet. Strukturell analyse ble introdusert for å identifisere forbindelsene som er ansvarlige for respektive topper, og demonstrerte at topp B er representert av en blanding av [Ne-acetyl-Lys<13>]-hPTH(1-34) og [Ne-acetyl-Lys<26>]-hPTH(1-34), topp C med [Noc-acetyl-Ser<1>]-hPTH(1-34) og topp D med [Ne-acetyl-Lys<27>]-hPTH(1-34).

Deretter ble hPTH(1-34) fremstillingen med eddiksyreinnhold på 2,9 %, som ble fremskaffet i Eksempel 1 (3), studert for dens stabilitet på samme måte som ovenfor.

En mengde av fremstilling som korresponderer til ca. 150 mg hPTH(1-34) fremskaffet med eddiksyreinnhold på 2,9 % introdusert i et glassrør og hermetisk forseglet ble lagret i et LH-30-14 oppbevaringssted (Nagano Science Co.) ved 40 ± 1 °C i seks måneder. Før lagring ble noen rør og etter lagring ble de gjenværende rørene utsatt for reversert fase HPLC, for dermed å isolere dekomposisjonsprodukter (biprodukter) før lagring så vel som etter lagring for deres strukturelle analyse. Resultatene er vist i Tabell 3.

Reversert fase HPLC-kromatogram av prøven som har blitt lagret er vist i Figur 2. Fra Figur 2 er det tydelig, når den sammenlignes med figuren fra hPTH(1-34) med eddiksyreinnhold på 9,5 %, at alle arealene av toppene B, C og D er redusert. Arealene til toppene B, C og D er totalt 0,2 % som ligner den tilsvarende verdien observert i hPTH(1-34) med eddiksyreinnhold på 9,5 %. Postlagringsverdien til de aktuelle totale topparealene heri er 3,6 %, som er mye lavere enn den tilsvarende verdien (13,8 %) av hPTH(1-34) med eddiksyreinnhold på 9,5 %.

Det ble demonstrert ovenfor at acetyllegemer er hoveddekomposisjonsprodukter avledet fra hPTH, og at reduksjon av eddiksyreinnholdet som eksisterer som konstituenten i et salt av hPTH(1-34) eller et adherent stoff vil føre til en forbedret stabilitet av hPTH. Det vil si at reduksjon av eddiksyreinnholdet i en hPTH-fremstilling vil føre til fremstillingen av en hPTH-basert farmasøytisk komponent med en utmerket stabilitet.

Eksperiment 2. Stabilitet av hPTH(1-34) (2)

hPTH(1-34) fremstillinger fremskaffet i Eksempel 4 og Referanseeksempel 4, som inneholdt det respektive eddiksyreinnholdet som spesifisert i Eksempel 4 og Referanseeksempel 4, ble lagret ved 80 °C i 15 timer; til hver av fremstillingene ble det tilsatt 15 ml destillert vann med en sprøyte; og for hver fremstilling ble innholdet av dekomposisjonsprodukter (biprodukter) bestemt før og etter lagring. Resultatene er vist i Tabell 4. Innholdet (%) av acetyllegemer (B, C og D) i hver hPTH(1-34) fremstilling etter lagring er plottet som en funksjon av dens eddiksyreinnhold i Figur 3.

Fra Tabell 4 og Figur 3, med reduksjonen av eddiksyreinnhold, er det tydelig at dekomposisjonsprodukter B, C og D avledet fra acetyllegemer avtar.

Renheten til hPTH(1-34) fremstillinger ble plottet som en funksjon av deres eddiksyreinnhold i Figur 4. Fra Figur 4 er det tydelig at kurven har et sigmoid forløp med et vendepunkt på den kjemiske ekvivalenten (eddiksyreinnhold lik ca. 7,3 %), og hvis eddiksyreinnholdet holdes lavere enn den kjemiske ekvivalenten, blir stabiliteten til produktet raskt forbedret.

Det vil si at reduksjon av eddiksyreinnholdet i en hPTH-fremstilling vil føre til produksjonen av en hPTH-basert farmasøytisk komponent med en utmerket stabilitet.

Eksperiment 3. Stabilitet av hPTH(1-84)

hPTH(1-84) fremstillinger fremskaffet i Eksempel 6 og Referanseeksempel 5, som inneholdt det respektive eddiksyreinnholdet som spesifisert i Eksempel 6 og Referanseeksempel 5, ble lagret ved 80 °C i 15 timer; og hver av fremstillingene fikk stå urørt ved romtemperatur i ett minutt for å la metylenklorid fordampe og ble deretter forseglet. Disse hPTH(1-84) fremstillingene inneholdende det respektive eddiksyreinnholdet ble lagret ved 80 °C i 15 timer; 1 ml destillert vann ble satt til hver av fremstillingene med en sprøyte for oppløsning; og for hver fremstilling ble innholdet av dekomposisjonsprodukter (biprodukter) bestemt før og etter lagring. Resultatene er vist i Tabell 5. Reversert fase HPLC-kromatogram av prøven som har gjennomgått lagring er vist i Figur 5.1 tillegg er innholdet (%) av dekomposisjonsprodukter (biprodukter) av hver hPTH(1-84) fremstilling etter lagring plottet som en funksjon av dens eddiksyreinnhold i Figur 6.

Som vist i Figur 5 ble dekomposisjonsprodukter (biprodukter) angitt som R1 til R6 dannet som et resultat av lagring. Det ble demonstrert fra Tabell 5 og Figur 6 at andre dekomposisjonsprodukter enn det ene angitt som R5 øker som en funksjon av eddiksyreinnholdet.

Renheten til hPTH(1-84) fremstillinger etter lagring ble plottet som en funksjon av deres eddiksyreinnhold i Figur 7. Renheten til hPTH(1-84) fremstilling øker med reduksjonen av dens eddiksyreinnhold, og øker raskt når eddiksyreinnholdet faller lavere enn den kjemiske ekvivalenten (ca. 4,5 %). Fra resultatene ovenfor ble det indikert at hPTH(1-84) fremstillingen inneholder bestemte dekomposisjonsprodukter der innhold er uavhengig av innholdet av sameksisterende eddiksyre, for utviklingen av majoriteten av dekomposisjonsproduktene er nært involvert eddiksyre som eksisterer som konstituenten i et salt av hPTH(1-84) eller som et adherent stoff, som i hPTH(1-34). Det vil si at reduksjon av eddiksyreinnholdet i en hPTH-fremstilling vil føre til produksjonen av en hPTH-basert farmasøytisk komponent med en utmerket stabilitet.

Eksperiment 4. Sensorisk test (1)

For den hPTH-baserte farmasøytiske komponenten ble vurdering av brukerens tilfredshet utført ved å føre den inn i nesehulen.

hPTH(1-34) fremstillingen fremstilt som i Referanseeksempel 1 ble løst i 0,6 vekt/volumprosent vandig løsning av sitronsyre eller i vann til 10 mg/ml; løsningen ble overført til et glassrør med skrukork; et spraymunnstykke (50 jil) (Valois Co.) ble festet til røret; 50 uJ av løsningen ble sprayet inn i ett nesebor; og lukten og irritasjonen fremkalt med nesespraying ble vurdert (testpersonene var 12 friske, normale, voksne menn). Lukten ble rangert i fire nivåer som "sur lukt foreligger", "svak sur lukt foreligger", "en svak lukt detektert" og "ingen lukt detektert" i henhold til testpersonens luktopplevelse. Irritasjonen ble rangert i fire nivåer som "smertefullt irriterende", "veldig irriterende", "litt irriterende" og "veldig lite irriterende". Deretter ble lukten og irritasjonen skåret i henhold til deres rangering. Fysiologisk saltvann ble anvendt som kontroll. Resultatene er vist i Tabell 6.

Fra Tabell 6 er det tydelig at hPTH(1-34) fremstillingen løst i vandig løsning av sitronsyre og den vandige løsningen av hPTH(1-34) fremstilling fremkalte en sterk sur lukt som forårsaket ubehag hos testpersonen.

Deretter ble vandige løsninger av ulike organiske syrer fremstilt, for å identifisere faktorene ansvarlige for lukten og irritasjonen fremstillingen fremkaller når den anvendes i nesehulen. Den anvendte organiske syren inkluderer eddiksyre, sitronsyre og vinsyre; oksalsyre; malsyre; ftalsyre; askorbinsyre; adipinsyre; og glykolsyre.

Det ble fremstilt 0,1 volum/volumprosent, 0,2 volum/volumprosent, 0,3 volum/volumprosent og 0,6 volum/volumprosent vandige løsninger av eddiksyre, og 0,6 vekt/volumprosent vandige løsninger av sitronsyre, vinsyre, oksalsyre, malsyre, ftalsyre, askorbinsyre, adipinsyre og glykolsyre. Løsningen ble sprayet inn i nesehulen; og lukten og irritasjonen ble vurdert på samme måte som ovenfor (testpersonene var fire friske, normale, voksne menn). Resultatene er vist i Tabell 6. Fra Tabell 6 er det tydelig at 0,3 volum/volumprosent eller mer konsentrerte vandige løsninger av eddiksyre fremkaller en sterk sur lukt, og den irriterende aktiviteten derfra øker også raskt når eddiksyrekonsentrasjonen blir 0,3 volum/volumprosent eller høyere.

I tillegg fremkaller ikke de vandige løsningene av andre organiske syrer noen detekterbar lukt, og irritasjonen fremkalt i nesehulen med den vandige løsningen av sitronsyre, sammen med de av askorbinsyre, adipinsyre og glykolsyre, er den samme som den fra fysiologisk saltvann.

hPTH(1-34) fremstillingen med eddiksyreinnhold på 9,5 % tilveiebrakt i Referanseeksempel 1 og mengden av eddiksyre i denne fremstillingen var omtrent den samme med de tilsvarende verdiene av hPTH(1-34) løsningen og av 0,1 volum/volumprosent vandig løsning av eddiksyre anvendt i denne testen.

Siden 0,6 vekt/volumprosent vandig løsning av sitronsyre ikke fremkaller noen detekterbar lukt, er det fra resultatene ovenfor indikert at lukten fremkalt med hPTH-fremstillingen løst i 0,6 vekt/volumprosent vandig løsning av sitronsyre kan skyldes eddiksyre som eksisterer som konstituenten i et salt av hPTH(1-34) eller som et adherent stoff til saltet i fremstillingen, selv om eddiksyre i hPTH-fremstillingen ikke ville fremkalle noen detekterbar lukt hvis den eksisterer som en vandig løsning, dvs. i kombinasjon med vann.

hPTH(1-34) fremstillingen med eddiksyreinnhold på 2,9 % fremstilt som i Eksempel 1 (3) ble løst i 0,4 vekt/volumprosent vandig løsning av sitronsyre til 5 mg/ml. På samme måte som ovenfor ble testløsningen anvendt i nesehulen, og lukten og irritasjonen fremkalt av dette ble vurdert (testpersonene var 12 friske, normale, voksne menn). Resultatene er vist i Tabell 6. Fra Tabell 6 er det indikert at reduksjon av eddiksyreinnholdet i fremstillingen vil inhibere lukten og irritasjonen av fremstillingen, og derfor vil fremstillingen med et redusert eddiksyreinnhold bli en farmasøytisk komponent som vil sørge for en utmerket tilfredshet hos brukeren, når den er inkorporert i en farmasøytisk sammensetning for praktisk anvendelse.

vekt/volumprosent vandig løsning av sitronsyre

Eksperiment 5. Sensorisk test (2)

(1) Fremstilling av testløsninger

En mengde av fremstilling som korresponderer til 300 mg hPTH(1-34) fremskaffet med eddiksyreinnhold på ca. 9,5 % i Referanseeksempel 1 ble løst i destillert vann (30 ml), for å gi en vandig løsning av hPTH(1-34) på 10 mg/ml. Løsningen (pH 4,7) ble utsatt for elektrodialyse for fjerning av eddiksyre ved å anvende en micro acilyzer (Asahi Kasei Corp.) med en elektrodialysemembran AC-130-10 (Asahi Kasei Corp.) til dialyseløsningen hadde en pH på 5,0 (eddiksyreinnhold på 7,3 %). En vandig løsning av hPTH(1-34) ble fremskaffet, der betydelige mengder av eddiksyre var fjernet.

En vandig løsning av hPTH(1-34) ble utsatt for elektrodialyse på lignende måte til pH 6,0 ble oppnådd (eddiksyreinnhold på 2,9 %), for å gi en vandig løsning av hPTH(1-34), der betydelige mengder av eddiksyre var fjernet. En lik vandig løsning av hPTH(1-34) ble lignende behandlet til pH 7,6 ble oppnådd (eddiksyreinnhold på 0,5 %), for å gi en vandig løsning av hPTH(1-34), der eddiksyre i stor grad var fjernet.

(2) Sensorisk test

Til 1,5 ml av hver testløsning fremstilt i dette testeksemplet (1), ble det tilsatt 1,5 ml vandig løsning inneholdende 270 mg renset sukrose, 12 mg sitronsyre og 0,3 mg benzalkoniumklorid, og blandingen ble anvendt som en testløsning for intranasal anvendelse. Løsningen ble overført i et glassrør med skrukork; og et spraymunnstykke (50 (il) (Valois) ble festet til testrøret (testpersonene var 5 friske, normale, voksne menn). Lukten ble rangert som "A: nesten ingen eddiksyrelukt detektert", "B: Svak eddiksyrelukt detektert" og "C: sterk eddiksyrelukt detektert". Irritasjonen ble rangert som "A: ingen opplevelse av irritasjon", "B: mer eller mindre opplevelse av irritasjon", og "C: sterk opplevelse av irritasjon". Deretter ble lukten og irritasjonen skåret i henhold til deres rangering. Resultatene er vist i Tabell 7.

Fra Tabell 7 er det indikert at reduksjon av eddiksyreinnholdet i fremstillingen vil inhibere lukten og irritasjonen av fremstillingen, og derfor vil fremstillingen med et redusert eddiksyreinnhold bli en farmasøytisk komponent som vil sørge for en utmerket tilfredshet hos brukeren egnet for langvarig bruk, når den er inkorporert i en farmasøytisk sammensetning for praktisk anvendelse.

Eksperiment 6. Effekter av ulike organiske syrer på stabiliteten til hPTH-fremstillinger

Fjerning av eddiksyreinnhold fra en hPTH-fremstilling kan bli oppnådd med elektrodialyse som nevnt tidligere, men det kan bli oppnådd ved å bytte ut eddiksyren med en annen organisk syre.

Hvis eddiksyrekomponenten i en hPTH-fremstilling byttes ut med en annen organisk syre, ble det vurdert hvordan den nylig introduserte organiske syren vil affisere stabiliteten til hPTH-fremstillingen.

Den organiske syren anvendt i denne testen inkluderte adipinsyre, sitronsyre og glykolsyre som er kjent som absorpsjonsstimulerende stoffer og hadde blitt funnet å gi god tilfredshet hos brukeren i Testeksempel 4. Den organiske syren som skulle bytte ut eddiksyre bundet med hPTH ble tilsatt ved en konsentrasjon lik den kjemiske ekvivalenten av eddiksyre. Et hPTH(1-34) molekyl inneholder ni basiske aminosyrerester og fire sure aminosyrerester, dvs. at et hPTH(1-34) molekyl har fem positive ladninger tilgjengelig for binding med syre, for å danne et salt med denne. Til ett mol hPTH(1-34) (MW. 4117,8) vil det derfor binde 5/2 mol adipinsyre (MW. 146,14), 5/3 mol sitronsyre (MW. 192,13) eller 5 mol glykolsyre (MW. 76,05) for å danne et salt. Adipinsyre, sitronsyre eller glykolsyre ble satt til hPTH-testfremstillingen, slik at det respektive molforholdet beskrevet ovenfor ble tilfredsstilt.

En hPTH(1-34) fremstilling med eddiksyreinnhold på 2,9 % fremskaffet i Eksempel 1(3) ble anvendt for å fremstille en vandig løsning av hPTH(1-34) på 5 mg/ml.

i

Til 2 ml av denne løsningen (10 mg hPTH(1-34) eller 2,43 ixmol) ble det tilsatt 888 u.g adipinsyre (2,43 x 5/2 (imol), 778 ug sitronsyre (2,43 x 5/3 (imol) eller 924 ug glykolsyre (2,43 x 5 umol). Hver løsning ble justert med destillert vann, slik at den resulterende løsningen inneholdt peptidet ved 1 mg/ml. Løsningen ble frysetørket for å tilveiebringe en frysetørket prøve inneholdende 10 mg hPTH(1-34). For prøver som dermed ble fremstilt, ble noen utsatt for reversert fase HPLC for å gi en prelagringsrenhet av hPTH; andre ble lagret ved 60 °C i tre uker; deretter ble de på lignende måte utsatt for reversert fase HPLC, for å gi en postlagringsrenhet av hPTH; og pre- og postlagringsrenhetsverdiene ble sammenlignet for å vurdere stabiliteten til hPTH-fremstillingen. En hPTH(1-34) fremstilling med eddiksyreinnhold på 2,9 % fremstilt i Eksempel 1 (3) ble anvendt som kontroll. Resultatene er vist i Tabell 8.

Mens postlagringsrenheten til hPTH-fremstillingen med eddiksyreinnhold på 2,9 % var 92,7 %, viste den samme fremstillingen, når den hadde fått tilsatt adipinsyre, sitronsyre eller glykolsyre før lagring, postlagringsrenhetsverdier på henholdsvis 92,0, 93,9 og 90,3 %. Det er indikert fra dette at en hPTH farmasøytisk komponent supplementer! med adipinsyre, sitronsyre eller glykolsyre vil være svært stabil og sørge for tilfredshet hos brukeren som en hPTH farmasøytisk komponent, der eddiksyreinnholdet som eksisterer som konstituenten i et salt av hPTH eller et adherent stoff har blitt redusert.

Det er også indikert at en farmasøytisk komponent kan bli fremskaffet ved å bytte ut eddiksyre som eksisterer i en hPTH-fremstilling som konstituenten i et salt eller et adherent stoff med en bestemt organisk syre, og den vil fungere som en farmasøytisk komponent på liknende måte som en hPTH-fremstilling der eddiksyreinnholdet har blitt redusert. Det er videre indikert at komponenten, som er svært stabil og vil sørge for en utmerket tilfredshet hos brukeren hvis den er inkorporert i en farmasøytisk sammensetning, også kompatibelt kan motta tilsetning av en organisk syre som kan bli tilsatt for å bedre absorpsjonen av komponenten.

Eksperiment 7. Test av absorpsjon gjennom neseslimhinnen

Når man designer en farmasøytisk sammensetning for intranasal administrering av fremstillingen, er absorpsjonen av fremstillingen gjennom neseslimhinnen en viktig faktor. Med henblikk på dette ble absorpsjonen av fremstillingen gjennom neseslimhinnen testet. Effektene av sitronsyre og askorbinsyre, som i Testeksempel 4 viste seg å føre til tilfredshet hos brukeren når de var tilsatt hPTH-fremstillingen, på den nasale absorpsjonen av hPTH ble vurdert ved å følge arealene under kurven (AUC) til en hPTH plasmakonsentrasjon-tid kurve og biotilgjengeligheten av hPTH.

hPTH(1-34) fremstilling med eddiksyreinnhold på 2,9 % fremstilt i Eksempel 1(3) ble løst i 0,3 og 0,6 vekt/volumprosent vandige løsninger av askorbinsyre og i 0,2, 0,3, 0,4 og 0,6 vekt/volumprosent vandige løsninger av sitronsyre, for å tilveiebringe hPTH-løsninger på 5 mg/ml. Likeledes ble en hPTH(1-34) fremstilling med eddiksyreinnhold på 0,9 % fremstilt i Eksempel 5(4) løst i 0,6 vekt/volumprosent vandig løsning av sitronsyre, for å gi en peptidløsning på 10 mg/ml. Som kontroll ble det anvendt en hPTH(1-34) fremstilling med eddiksyreinnhold på 2,9 % fremstilt i Eksempel 1(3) og en hPTH(1-34) fremstilling med eddiksyreinnhold på 0,9 % fremstilt i Eksempel 5(4), der begge var løst i fysiologisk saltvann.

Videre ble hPTH(1-34) fremstillinger med eddiksyreinnhold på 2,9 % fremstilt i Eksempel 1(3) løst i 0,3 vekt/volumprosent eller 0,6 vekt/volumprosent vandig løsning av sitronsyre; til denne løsningen ble det tilsatt camostatmesilat kjent som en inhibitor av proteinase til 0,3 vekt/volumprosent; og den resulterende løsningen ble anvendt for testen.

Sju til ni uker gamle Sprague-Dawley hannrotter (Crj:CD, Charles River Japan, Inc.) ble holdt i metallbur ved 22 ± 5 °C og 30 - 70 % relativ fuktighet med en mørke-lys syklus med intervaller på 12 timer, og de hadde fri tilgang på forpelleter og springvann. Dyrene (en gruppe på fem rotter) ble fastet i 24 timer før testing.

For intranasal administrering hadde rotten, mens den ble holdt under pentobarbital anestesi, en kanyle satt inn gjennom en femoral arterie; og 5 uJ testløsning eller 10 jil benzalkoniumklorid inneholdende sukrose ble administrert inn i nesehulen med en Pipetman (TM). Blod ble samlet opp via kanylen i et rør inneholdende en antikoagulant og proteinaseinhibitor; og blodet ble sentrifugert for å tilveiebringe plasma. Konsentrasjonene av hPTH(1-34) og hPTH(1-84) i plasma ble bestemt med RIA ved å anvende anti-PTH(1-34) antistoffer (Chemicon International Inc.).

For subkutan administrering mottok rotten den subkutane injeksjonen av testløsningen på 1 ml/kg på ryggen, og konsentrasjonen av hPTH i plasma ble bestemt på samme måte som i nasal administrering.

Biotilgjengeligheten av hPTH(1-34) og hPTH(1-84) ble fremskaffet ved beregning fra forholdene av plasmakonsentrasjonene henholdsvis tre (hPTH(1-34)) eller seks (hPTH(1-84)) timer etter subkutan administrering mot de korresponderende AUCene til en plasmakonsentrasjon-tid kurve. Resultatene er vist i Tabell 9.

Selv om biotilgjengeligheten av hPTH(1-34) tilført subkutant var 1,4 % når hPTH(1-34) ble anvendt alene, økte den til 5 til 10 %, eller 12 til 19 % når det ble anvendt som et løst stoff av 0,3 til 0,6 vekt/volumprosent askorbinsyre eller av 0,2 til 0,6 vekt/volumprosent sitronsyre.

Biotilgjengeligheten av hPTH(1-84) var ca. 30 % når det ble anvendt som et løst stoff av 0,6 vekt/volumprosent vandig løsning av sitronsyre.

Når hPTH(1-34) videre ble anvendt løst i en løsning supplementer! med camostatmesilat eller en proteinaseinhibitor, var dets biotilgjengelighet 27 til 31 %.

Fra dette ble det indikert at tilsetning av de organiske syrene til en liten konsentrasjon særlig forbedrer absorpsjonen av hPTH-fremstillinger gjennom neseslimhinnen. Det ble også oppdaget at tilsetning av absorpsjonsstimulerende stoff videre forbedrer den nasale absorpsjonen av hPTH-f remstillinger. Som konklusjon ble det demonstrert at en hPTH-basert farmasøytisk sammensetning som inkorporerer en hPTH-basert farmasøytisk komponent for intranasal anvendelse passende kan bli anvendt for dette, fordi den farmasøytiske komponenten er svært stabil og sørger for en utmerket tilfredshet hos brukeren når den blir administrert intranasalt, når eddiksyreinnholdet derav som eksisterer som konstituenten i et salt eller som et adherent stoff blir bevisst redusert.

Formuleringseksempel 1

40,5 g renset sukrose (japansk farmakopé) ble løst i 124,2 g renset vann (japansk farmakopé) for å fremstille 150 ml av en 27 vekt/volumprosent vandig løsning av renset sukrose. I tillegg ble en mengde av fremstilling som korresponderer til 1,5 g hPTH(1-34) fremskaffet med eddiksyreinnhold på 2,1 % (ti rør), som ble fremskaffet i Eksempel 2, løst i ca. 75 ml renset vann (japansk farmakopé) som en farmasøytisk komponent. Konsentrasjonen til hPTH(1-34) i løsningen ble bestemt med reversert fase HPLC til å være 20,4 mg/ml. 25,9 ml renset vann ble satt til 72,0 ml av løsningen for å justere konsentrasjonen til 15 mg/ml. 97 ml av 15 mg/ml hPTH(1-34) løsning dermed fremstilt ble tatt og blandet med 48,5 ml av 27 vekt/volumprosent vandig løsning av renset sukrose som ble fremstilt tidligere, for å oppnå ca. 145 ml hPTH(1-34) vandig løsning som har en konsentrasjon av renset sukrose på 9 vekt/volumprosent og en hPTH(1-34) konsentrasjon på 10 mg/ml. 3 ml av løsningen ble tilsatt i hvert av 47 rør og ble frysetørket i en frysetørker, Modell FZ-6 (Labconco Corporation), for å oppnå en stabil farmasøytisk sammensetning inneholdende 270 mg renset sukrose og 30 mg hPTH(1-34) per rør.

Formuleringseksempel 2

40,5 g renset sukrose (japansk farmakopé) ble løst i 124,2 g renset vann (japansk farmakopé) for å fremstille 150 ml av en 27 vekt/volumprosent vandig løsning av renset sukrose. I tillegg ble en mengde av fremstilling som korresponderer til 750 mg hPTH(1-34) fremskaffet med eddiksyreinnhold på 2,1 % (fem rør), som ble fremskaffet i Eksempel 2, løst som farmasøytisk komponent i 146 ml renset vann Qapansk farmakopé), for å oppnå en vandig løsning av hPTH(1-34) med en hPTH(1-34) konsentrasjon på 5,1 mg/ml. Videre ble 54 ml renset vann (japansk farmakopé) satt til den vandige løsningen og grundig agitert, for å justere hPTH(1-34) konsentrasjonen til 3,8 mg/ml (200 ml). 200 ml av den fremskaffede løsningen med en hPTH(1-34) konsentrasjon på 3,8 mg/ml ble blandet med 100 ml av 27 vekt/volumprosent vandig løsning av renset sukrose som ble fremstilt tidligere, for å oppnå ca. 300 ml av en hPTH(1-34) vandig løsning med en konsentrasjon av

renset sukrose på 9 vekt/volumprosent og en hPTH(1-34) konsentrasjon på 2,5 mg/ml. 3 ml av løsningen ble tilsatt i hvert av 90 rør og ble frysetørket i en frysetørker, Modell FZ-6 (Labconco Corporation), for å oppnå en stabil farmasøytisk sammensetning inneholdende 270 mg renset sukrose og 7,5 mg hPTH(1-34) per rør.

Formuleringseksempel 3

22,5 g mannitol (japansk farmakopé) ble løst i 124,2 g renset vann Qapansk farmakopé) for å fremstille 150 ml av en 15 % vandig løsning av mannitol. I tillegg ble en mengde av fremstilling som korresponderer til 1,5 g hPTH(1-34) fremskaffet med eddiksyreinnhold på 2,1 % (ti rør), som ble fremskaffet i Eksempel 2, løst i ca. 75 ml renset vann Qapansk farmakopé) som en farmasøytisk komponent. Konsentrasjonen til hPTH(1-34) i løsningen ble bestemt med reversert fase HPLC til å være 20,4 mg/ml. 25,9 ml renset vann ble satt til 72,0 ml av løsningen for å justere konsentrasjonen til 15 mg/ml. 97 ml av 15 mg/ml hPTH(1-34) løsning dermed fremstilt ble tatt og blandet med 48,5 ml av 15 % vandig løsning av mannitol som ble fremstilt tidligere, for å oppnå ca. 145 ml av hPTH(1-34) vandig løsning med en mannitolkonsentrasjon på 5 % og en hPTH(1-34) konsentrasjon på 10 mg/ml. 3 ml av løsningen ble tilsatt i hvert av 47 rør og ble frysetørket i en frysetørker, modell FZ-6 (Labconco Corporation), for å oppnå en stabil farmasøytisk sammensetning inneholdende 150 mg mannitol og 30 mg hPTH(1-34) per rør.

Formuleringseksempel 4

Som en farmasøytisk komponent ble 805 mg (pulvervekt) av et frysetørket produkt av hPTH(1-34) fremstilling med eddiksyreinnhold på 2,1 %, som ble fremskaffet i Eksempel 2, veid ut og løst i 360 ml renset vann (japansk farmakopé), for å oppnå en vandig løsning med en hPTH(1-34) konsentrasjon på 2 mg/ml bestemt med reversert fase HPLC. I tillegg ble 1 g mannitol (japansk farmakopé) veid ut og løst i 50 ml renset vann (japansk farmakopé) for å fremstille en vandig løsning av mannitol. 50 ml av den vandige løsningen av mannitol og 50 ml av den hPTH(1-34) vandige løsningen (2 mg/ml), som ble fremstilt tidligere, ble blandet godt. 1 ml av løsningen ble dispensert i hvert av rørene og ble frysetørket i en frysetørker, Modell FZ-6 (Labconco Corporation), for å oppnå en stabil farmasøytisk sammensetning inneholdende 1 mg hPTH(1-34) og 10 mg mannitol per rør.

Formuleringseksempel 5

Som en farmasøytisk komponent ble 805 mg (pulvervekt) av et frysetørket produkt av hPTH(1-34) fremstilling med eddiksyreinnhold på 2,1 %, som ble fremskaffet i Eksempel 2, veid ut og løst i 360 ml renset vann (japansk farmakopé), for å oppnå en vandig løsning med en hPTH(1-34) konsentrasjon på 2 mg/ml bestemt med reversert fase HPLC. I tillegg ble 5 g mannitol (japansk farmakopé) veid ut og løst i 50 ml renset vann (japansk farmakopé) for å fremstille en vandig løsning av mannitol. 50 ml av den vandige løsningen av mannitol og 50 ml av den hPTH(1-34) vandige løsningen (2 mg/ml), som ble fremstilt tidligere, ble blandet godt. 1 ml av løsningen ble dispensert i hvert av rørene og ble frysetørket i en frysetørker, Modell FZ-6 (Labconco Corporation), for å oppnå en stabil farmasøytisk sammensetning inneholdende 1 mg hPTH(1-34) og 50 mg mannitol per rør.

Formuleringseksempel 6

Som en farmasøytisk komponent ble ca. 11 mg (pulvervekt) av et frysetørket produkt av hPTH(1-34) fremstilling med eddiksyreinnhold på 2,1 %, som ble fremskaffet i Eksempel 2, veid ut, og vann for injeksjon (WFI) Qapansk farmakopé) ble tilsatt dertil for å justere volumet til 500 ml, for å oppnå en hPTH(1-34) vandig løsning på 20 rø/ml bestemt med reversert fase HPLC (løsning A). 5 g renset sukrose Qapansk farmakopé) og 100 mg benzetoniumklorid ble løst i WFI (japansk farmakopé), og et volum ble justert til 100 ml (løsning B). 30 ml av hver av løsningene A og B ble blandet. Den resulterende løsningen ble dispensert i hvert av rørene med 1 ml per rør og frysetørket i en frysetørker, Modell FZ-6 (Labconco Corporation), for å oppnå en stabil farmasøytisk sammensetning inneholdende 10 fig hPTH(1 -34), 25 mg renset sukrose og 0,5 mg benzetoniumklorid per rør.

Formuleringseksempel 7

Som en farmasøytisk komponent ble ca. 50 mg (pulvervekt) av et frysetørket produkt av hPTH(1-84) fremstilling med eddiksyreinnhold på 2,5 %, som ble fremskaffet i Eksempel 5(2), veid ut, og et injeksjonsløsningsmiddel (japansk farmakopé) ble tilsatt dertil, for å oppnå en hPTH(1-84) vandig løsning på 2 mg/ml bestemt med reversert fase HPLC (25 ml).

I tillegg ble WFI (japansk farmakopé) satt til 2 g renset sukrose (japansk farmakopé), for å oppnå 100 ml av en vandig løsning av renset sukrose. 20 ml av den hPTH(1-84) vandige løsningen (2 mg/ml) og 20 ml av den fremstilte vandige løsningen av renset sukrose (2 vekt/volumprosent) ble blandet. Den resulterende løsningen ble tilsatt i hvert av 35 rør med 1 ml per rør og ble frysetørket i en frysetørker, Modell FZ-6 (Labconco Corporation), for å oppnå en stabil farmasøytisk sammensetning inneholdende 1 mg hPTH(1-84) og 10 mg renset sukrose per rør.

Formuleringseksempel 8

Et tilhørende løsningsmiddel, anvendt for den farmasøytiske sammensetningen fremskaffet i de førnevnte Formuleringseksemplene 1 til og med 7 i en fremstilling som prepareres før bruk, ble fremstilt som følger: 0,35 g benzalkoniumklorid (japansk farmakopé) og 21,0 g sitronsyre (japansk farmakopé) ble veid ut og løst i 3500 ml renset vann. 3 ml av løsningen som dermed var fremskaffet ble dispensert i polypropylenbeholdere for å fremstille et tilhørende løsningsmiddel.

Formuleringseksempel 9

Et tilhørende løsningsmiddel, anvendt for den farmasøytiske sammensetningen fremskaffet i de førnevnte Formuleringseksemplene 1 til og med 7 i en fremstilling som prepareres før bruk, ble fremstilt som følger: 0,70 g benzetoniumklorid (japansk farmakopé) og 14,0 g sitronsyre (japansk farmakopé) ble veid ut og løst i 3500 ml renset vann. 3 ml av løsningen som dermed ble fremskaffet ble dispensert i polypropylenbeholdere for å fremstille et tilhørende løsningsmiddel.

Formuleringseksempel 10

Et tilhørende løsningsmiddel, anvendt for den farmasøytiske sammensetningen fremskaffet i de førnevnte Formuleringseksemplene 1 til og med 7 i en fremstilling som prepareres før bruk, ble fremstilt som følger: 0,35 g benzetoniumklorid (japansk farmakopé) og 21,0 g adipinsyre (japansk farmakopé) ble veid ut og løst i 3500 ml renset vann. 3 ml av løsningen som dermed ble fremskaffet ble dispensert i polypropylenbeholdere for å fremstille et tilhørende løsningsmiddel.

Formuleringseksempel 11

Et tilhørende løsningsmiddel, anvendt for den farmasøytiske sammensetningen fremskaffet i de førnevnte Formuleringseksemplene 1 til og med 7 i en fremstilling som prepareres før bruk, ble fremstilt som følger: 0,70 g cetylpyridiumklorid (japansk farmakopé) og 14,0 g adipinsyre Qapansk farmakopé) ble veid ut og løst i 3500 ml renset vann. 3 ml av løsningen som dermed ble fremskaffet ble dispensert i polypropylenbeholdere for å fremstille et tilhørende løsningsmiddel.

Formuleringseksempel 12

En mengde av fremstilling som korresponderer til 900 mg hPTH(1-34) fremskaffet med eddiksyreinnhold på 2,5 % i Eksempel 4(1) (seks rør) ble løst i 18 ml av en WFI (japansk farmakopé) (50 mg/ml) som en farmasøytisk komponent. I tillegg ble 12 g sitronsyre (japansk farmakopé) løst i et injeksjonsløsningsmiddel (japansk farmakopé), for å oppnå 1000 ml av en løsning (1,2 vekt/volumprosent vandig løsning av sitronsyre). Ved å anvende de resulterende løsningene, ble flytende medikamenter fremskaffet som følger: 1. Fremstilling med pH 3, hPTH(1-34) 5 mg/ml, 0,6 vekt/volumprosent sitronsyreløsning. 6 ml av 1,2 vekt/volumprosent vandig løsning av sitronsyre og 1,2 ml av 50 mg/ml hPTH(1-34) vandig løsning ble blandet, og pH i den resulterende løsningen ble justert til pH 3 ved å tilsette 95 pl av 1 N NaOH. Deretter ble WFI tilsatt løsningen for å lage et løsningsvolum på 12 ml. Løsningen som dermed ble fremskaffet ble filtrert gjennom et 0,22 u.m filter for å oppnå den farmasøytiske tittelsammensetningen. 2. Fremstilling med pH 3,5, .hPTH(1-34) 5 mg/ml, 0,6 vekt/volumprosent sitronsyreløsning. 6 ml av 1,2 vekt/volumprosent vandig løsning av sitronsyre og 1,2 ml av 50 mg/ml hPTH(1-34) vandig løsning ble blandet, og pH i løsningen ble justert til pH 3,5 ved å tilsette 210 (il av 1 N NaOH. Deretter ble en WFI tilsatt løsningen for å lage et løsningsvolum på 12 ml. Løsningen som dermed ble fremskaffet ble filtrert gjennom et 0,22 (im filter for å oppnå den farmasøytiske tittelsammensetningen. 3. Fremstilling med pH 4, hPTH(1-34) 5 mg/ml, 0,6 vekt/volumprosent sitronsyreløsning. 6 ml av 1,2 vekt/volumprosent vandig løsning av sitronsyre og 1,2 ml av 50 mg/ml hPTH(1-34) vandig løsning ble blandet, og pH i løsningen ble justert til pH 4,0 ved å tilsette 350 uJ av 1 N NaOH. Deretter ble WFI tilsatt løsningen for å lage et løsningsvolum på 12 ml. Løsningen som dermed ble fremskaffet ble filtrert gjennom et 0,22 jim filter for å oppnå den farmasøytiske tittelsammensetningen. 4. Fremstilling med pH 4,5, hPTH(1-34) 1 mg/ml, 0,4 vekt/volumprosent sitronsyreløsning. 4 ml av 1,2 vekt/volumprosent vandig løsning av sitronsyre, 0,24 ml av 50 mg/ml hPTH(1-34) vandig løsning og ca. 5 ml renset vann ble blandet, og pH i løsningen ble justert til pH 4,5 ved å tilsette 335 jil av 1 N NaOH. Deretter ble WFI tilsatt løsningen for å lage et løsningsvolum på 12 ml. Løsningen som dermed ble fremskaffet ble filtrert gjennom et 0,22 (im filter for å oppnå den farmasøytiske tittelsammensetningen.

Industriell anvendelighet

I henhold til denne oppfinnelsen er det fremskaffet en farmasøytisk komponent som, med redusert eddiksyreinnhold, er svært stabil og vil sørge for en utmerket tilfredshet hos brukeren når den er inkorporert i en farmasøytisk komponent for anvendelse.

Den farmasøytiske komponenten i denne oppfinnelsen kan tolerere tilsetningen av egnede mengder av ulike funksjonelle komponenter, så vel som en bærer eller et hjelpestoff som vanligvis anvendes i løpet av farmasøytisk fremstilling, kan bli inkorporert i farmasøytiske sammensetninger med vidt varierte doseringsformer, eller kan bli formet til vidt varierte doseringsformer.

I henhold til denne oppfinnelsen er det fremskaffet en farmasøytisk komponent for intranasal administrering som kan anvendes over en lang periode.

Claims

1. Farmasøytisk komponent for intranasal administrering, karakterisert ved at den omfatter et humant paratyroidhormonpeptid eller derivat derav, og eddiksyre, hvor det humane paratyroidhormonpeptidet er et peptid omfattende aminosyrerestene betegnet som aminosyre nr. 1-84 (hPTH(1-84)) eller et peptid omfattende aminosyrerestene betegnet som aminosyre nr. 1-34 (hPTH(1-34)), kjennetegnet ved at dersom det humane paratyroidhormonpeptidet er hPTH (1-84), er innholdet av eddiksyre mellom 0,1 vekt-% og 4,5 vekt-% med hensyn til vekten av hPTH (1-84), og dersom det humane paratyroidhormonpeptidet er hPTH (1-34), er innholdet av eddiksyre mellom 1,0 vekt-% og 7,3 vekt-% med hensyn til vekten av hPTH (1-34).

2. Farmasøytisk komponent ifølge krav 1, karakterisert ved at den farmasøytiske komponenten er en lyofilisert sammensetning.