TWI293563B - Medicinal components comprising human parathyroid hormone and medicinal compositions for nasal administration containing the components - Google Patents

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經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1293563 A7 B7 五、發明説明（1 ) 本發明係有關具有良好安定性，且，做爲醫藥組成物 使用時爲一良好使用感之人體副甲狀腺醫藥用成份者。又 ，本發明係有關長期用於人體副甲狀腺激素之經鼻投服用 醫藥組成物者。 先行技術中，人體副甲狀腺激素胜肽（以下稱 h P T Η )係相關骨代謝者，具強力骨形成效果生理活性 胜肽者（Aurbach等，Recent Progr，Horm · Res ·，1 972年，28 卷，口.35)。11?丁11係於生體內一般以8 4個胺基酸殘 基所構成之胜肽者（以下稱h Ρ Τ Η ( 1〜8 4 ))。又 ，公知者hPTH之胺基酸號碼1〜3 4之3 4個胺基酸 殘基所構成之hPTH衍生物（以下稱hPTH (1〜3 4))亦具有與hPTH (1〜84)相同藥理作用者（ Tregear等，Hoppe-Seyler's Z .，Physiol Chem，1974, vol . 3 5 5，p415) 。hPTH (1 〜84)及 hPTH (1 〜3 4 )之胺基酸配列於配列表中分別以配列號碼：1及2示 之。 針對做爲治療骨質疏鬆劑使用之降血鈣素、雙磷酸酯 、等抑制骨吸收後發揮其治療效果者，該h Ρ Τ Η ( 1〜 84) 、hPTH (1〜34)係藉由促進骨形成與伴隨 其促進骨代謝後被期待做爲新穎之骨質疏鬆治療藥者（ Lane等，J · Clin . Invest, 1 998, vol . 1 02，ρ 1 627〜1 633 ) ο hPTH (1〜34)每週1次以下皮下投於人體後 可增加骨鹽量，而報告指出以同用量之5分之1連續5天 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐) UUL-----^裝------訂------0 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) -4- 1293563 Α7 Β7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明説明（2 ) 分次以皮下投用者亦可有意增加骨鹽量（Sone等，Miner Electrolyte Metab, 1995, vol . 21，p232〜235 )。又，2 分 次以皮下投用後增加骨鹽量比1週1次以皮下投用之骨鹽 量增加較多者於動物實驗中顯示（Tawaargi等，Osteoporosis International, vol . 6，suppl 1，1996，p245)，因此， h P T H之治療效果被推測以少量連日投用者最能發揮其 效果者。又，投用高用量hPT Η時，由可預見之消化器 、循環器副作用面觀之，亦以少量用量，分次投用者較可 期期待其藥效者。 又，注射劑係於醫師之管理下使用者，同時，考量疼 痛等伴隨之痛苦，患者被迫上醫院、負擔大之面考量，做 爲必須長期治療之治療骨質疏鬆劑者並不理想。 因此，爲開發一種無痛，且，在家可連日簡便經鼻投 服又無負擔之製劑被期待之。 惟，鼻粘膜容易由藥劑、添加物之刺激而受傷害，因 此，長期連續投用之經鼻藥劑務必顯示良好經鼻吸收之外 ，同時，對鼻粘膜無刺激，且，投用時使用感良好者。特 別是，使用感之良好度以可期待長期投用後其治療效果佳 之類h Ρ ΤΗ藥物之經鼻藥者爲極重要者。因此，調製可 顯示長期連續投用之經鼻藥時，其藥劑及其鹽類、添加物 等種類、濃度，此等組合之最適點爲極重要者，由做爲影 響使用感之要素例如：臭味、刺激性面觀之，所使用之藥 劑、添加物種類、濃度均被限制之。 針對h Ρ T Η，做爲副甲狀腺機能診斷藥（醋酸 (請先閱讀背面之注意事' 裝丨| :寫本頁) 訂 i· 本紙張尺度適用中.國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） -5- 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1293563 A7 ____B7_五、發明説明（3 ) teliparatide : —般名，旭化成工業股份公司製）者有 h P T Η ( 1〜3 4 )之5醋酸鹽注射劑，惟，其臭味、 刺激性無法滿足使用感之經鼻藥。 又’特開昭6 4 — 1 6 7 9 9號公報記載有關 h Ρ Τ Η ( 1〜3 4 )之精製品藉由精製步驟混入醋酸後 醋酸含量因製造群變化大不難取得具一定醋酸含量之製品 ，且降低其活性。 同公報指出以改善h Ρ Τ Η ( 1〜3 4 )之安定性做 爲課題者可使用酒石酸之hPTH (1〜34)的凍結乾 燥組成物。惟，酒石酸之酸性度高，不適於鼻腔內之投用 〇 針對h Ρ Τ Η ( 1〜3 4 )，以生理活性胜肽做爲經 鼻藥使用時之吸收性做爲課題，特開平2 - 1 1 1號公報 記載使用水溶液有機酸之經鼻投服用粉末組成物者。惟， 依有機酸之種類、或其含量，此等成份直接刺激鼻粘膜， 不適於鼻腔內投用。 如此，做爲可長期使用之h Ρ Τ Η經鼻藥者，除安定 性及吸收性之外，更可滿足良好使用感之處方設計之製劑 截至目前尙未被開發。 〔發明開示〕 本發明係以提供一種具有良好安定性，且，被做爲醫 藥組成物使用時具良好使用感之h Ρ ΤΗ醫藥用成份爲目 的者。又，本發明係以提供一種可長期使用之h Ρ Τ Η經 (請先閲讀背面之注意事_ J# -項再填· 裝-- 寫本頁) 訂 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） -6- 1293563 A7 B7 五、發明説明（4 ) 鼻投服用醫藥組成物爲目的者。 因此，本發明者以提供經鼻投用醫藥組成物做爲課題 進行精密硏討後發現h P TH於鼻腔內投用時產生酸臭與 刺激無法滿足使用感，而其原因係於製造步驟時存在微量 之h P T Η之鹽或附著物的醋酸所致者，因此，將醋酸含 降低後取得之醫藥用成份後，進行評定此結果發現該成份 具有驚人之良好安定性，且，該成份用於醫藥組成物時使 用感極爲良好，更做成製劑化時，比一般所使用載體、賦 形劑等成份更具有適於配合以改善吸收、固體安定化等做 爲目的之各種其他機能性成份之良好配合變化特性者，進 而完成本發明。 亦即，本發明係有關針對h Ρ Τ Η與h Ρ Τ Η以化學 當量以下之醋酸所成爲其特徵之醫藥用成份者。又，本發 明係以h Ρ Τ Η做爲有效成份之醫藥組成物者，針對 h Ρ ΤΗ與h Ρ ΤΗ以含有化學當量以下之醋酸所成之醫 藥用成份爲其特徵之經鼻投用醫藥組成物者。 〔發明實施之形態〕 本發明之h Ρ TH係有關骨代謝，具有強力骨形成效 果，提昇血淸鈣之作用的胜肽類者，具8 4個胺基酸殘基 之天然型hPTH (1〜84)或其衍生物者。 例如：h Ρ Τ Η (1 〜8 4 ) (Biochemistry 17, 5723( 1 978)、Kimura 等，Biochem · Biophys · Res · Commun, vol. 114，p493，1983) 、h P TH ( 1 〜3 8 ) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） -----0 裝— (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 ί· 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1293563 A7 B7 五、發明説明（5 ) (特開昭57 — 81448號公報）、hPTH(l〜 34)(特開平 9 — 29600 號公報、Takai 等、Peptide Chemistry 1 979，pl87) 、hPTH(l 〜34)NH 2 (特 開昭58-96052號公報）、〔Nle8·18〕 hPTH(l 〜34)、〔Nle8.18，Try34〕 hPTH(l〜34)(特開昭55-113753號公 報）、〔N 1 e 8 · 1 8，T r y 3 4〕h P T Η ( 1 〜3 4 )Ν Η 2 (特開昭6 1 - 2 4 5 9 8號公報）、 〔N1 e818，Try34〕hPTH (1 〜34) Ν Η 2 (特開昭6 0 — 3 4 9 9 6號公報）、h Ρ Τ Η ( 1〜 37)(特表平 5 — 505594 號公報）、hPTH( 2 〜84)、hPTH(3 〜84)、 hPTH(4 〜84)、hPTH(5 〜84)、 hPTH(6 〜84)、hPTH(7 〜84)、 hPTH(8〜84)(特表平4 — 505259號公報 )等例。如此h Ρ Τ Η可藉上述文獻及公報所載基因工學 技術之方法或藉由化學合成技術之方法，或依此等方法爲 基準之方法進行製造之。 通常，生理活性胜肽依基因工學技術或化學合成技術 被製造時，藉由柱體層析法進行精製者’而，hPTH類 之鹽基性胜肽因於柱體樹脂被吸附’爲迴避吸附目的或提 昇溶解性爲目的下，以酸做爲溶出液使用之。又，做爲製 劑目的下爲取得胜肽，該胜肽務必做爲凍結乾燥組成物之 醫藥用原體，做爲溶出液所使用之酸被限定爲揮發性者等 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事_ 1· ，項再填- 寫本頁) 裝· 訂 .1· 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -8 - 1293563 A7 ___B7_ 五、發明説明（6 ) ，可使用之酸者。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 例如，鹽酸等無機酸即使低濃度酸性度仍高，產生水 解等副作用，又，酸本身因具腐鈾性而不理想。有機酸其 沸點低，三氟醋酸、蟻酸、醋酸爲對象，惟，三氟醋酸由 安全面考量不適做爲醫藥用成份，且，蟻酸具還原性被限 制使用，hPTH類之胜肽爲不適者。 另外，弱酸爲安全性及化學性質兩者兼具之醋酸做爲 醫藥用成份爲最適者，爲鹽基性胜肽最終精製中所不可缺 之酸者。例如，利用逆相高速液體柱體層析法（逆相 HP L C )、分子篩柱體層析法之精製步驟中，含有醋酸 之溶出液爲理想使用者。hPTH係使用不與柱體吸附之 濃度的醋酸，因此，醋酸水溶液所溶出之試料及胜肽分畫 以及此等凍結乾燥組成物中形成鹽基性胺基酸殘基與鹽之 量以上的醋酸做爲與h P TH之鹽或附著物進行殘留之。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 亦即，醋酸係於h P T Η醫藥用成份中以與h P 丁 Η 之鹽或附著物之兩者形態存在之。因此，由於醋酸爲揮發 性物質，將依凍結乾燥條件之不同，凍結乾燥原液中之醋 酸濃度或h Ρ ΤΗ濃度之不同，而不易做成一定之醋酸含 量於醋酸含量組成物中者。 本發明醫藥用成份係由減少做爲與h Ρ T Η之鹽或奸寸 著物存在之醋酸含量的h Ρ ΤΗ與醋酸所成者，藉由該成 份可提昇h Ρ T Η之安定性及醫藥組成物使用時之良好使 用感，此乃藉由醋酸之減量所取得者。 本發明醫藥用成份中被減量之醋酸係以化學當量以下 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公董) ^ -9 - 1293563 Α7 Β7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明説明（7 ) 之醋酸者被定義之。 hPTH (1〜34)於分子中含有9殘基（含色胺 酸基殘基）之鹽基性胺基酸，因此，最大可形成9分子之 1價酸（醋酸等）與鹽者，而，hPTH (1〜34)分 子中之酸性胺基酸殘基4殘基可於hPTH (1〜3 4) 之分子內形成鹽者，因此，本發明之hPTH (1〜34 )中’以鹽基性胺基酸殘基5殘基做爲醋酸之化學當量者 。又，於針對h P T Η之醋酸量以式I :醋酸重量X 1 0 0 ( % )/ h Ρ Τ Η之胜肽重量所示之醋酸含量使用 •後’針對h Ρ Τ Η ( 1〜3 4 )之醋酸之化學當量約爲 7. 3% (重量％，以下相同）。 同樣’ hPTH (1〜84)係藉由含19殘基（含 色胺酸殘基）之鹽基性胺基酸，含1 2殘基之酸性胺基酸 後’本發明h Ρ Τ Η ( 1〜8 4 )中，以鹽基性胺基酸殘 基7殘基做爲醋酸之化學當量。又，針對hPTH (1〜 8 4 )之醋酸量中使用式I所示之醋酸含量後，針對 hPTH (1〜84)之醋酸化學當量約爲4 . 5%者。 亦即’本發明中所謂化學當量以下之醋酸者係指做爲 附著存在之醋酸量除外，更與h Ρ TH形成鹽之醋酸量以 下之醋酸者謂之。 本發明係提供一種抑制醋酸含量後，爲安定之 h Ρ Τ Η醫藥用成份及含該醫藥用成份之經鼻投用醫藥組 成物者。 又，本發明係提供一種抑制醋酸含量後，具有一定醋 (請先閱讀背面之注意事 1· ▼項再填· 裝— 寫本頁) 訂 1· 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） -10- 1293563 A7 B7 五、發明説明（8 ) 酸含量h P TH之醫藥用成份及含有該醫藥用成份之經鼻 投用醫藥組成物者。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁} 通常胜肽於溶液中爲不安定者，因此，做爲醫藥用原 體者以凍結乾燥品用於醫藥用成份者，惟，以h P T Η類 之揮發性醋酸做爲鹽成份之胜肽由其水溶液，稀醋酸溶液 進行凍結乾燥後取得之醫藥用成份其醋酸含量未定，因此 造成製造上問題點。本發明係利用減少醋酸量之h Ρ Τ Η 水溶液進行製造者故可提供一種安定，且具一定醋酸含量 之h Ρ ΤΗ醫藥用成份者，由製造安定性面觀之極爲有利 者。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本發明醫藥用成份中醋酸含量係針對h Ρ Τ Η爲化學 當量以下者。例如：hPTH (1〜34)時之醋酸含量 針對hPTH (1〜34)約爲7 · 3%以下者，由安定 性及使用面以約6 · 0 %以下者宜，特別以約3 · 0 %以 下爲更佳。又，醋酸含量小則h P 丁 Η呈安定，使用感良 好，而hPTH (1〜34)之等電點爲ρ 1=8 . 2， 高pH之hPTH (1〜34)爲不溶化，因此醋酸減量 過度於製造上亦不利，仍以約0 · 5 %以上，特別約 1 · 0%以上者宜。另外，hPTH (1〜84)時之醋 酸含量針對hPTH (1〜84)約爲4 . 5%以下者宜 ’由安全性與使用性約以3 · 0 %以下較佳，由製造安定 性面觀之約以0 . 1 %以上爲更佳。 本發明醫藥用成份係依公知之方法或依此爲基準之方 法可製造者。亦即，做爲與h Ρ TH之鹽或附著物含有之 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -11 - 1293563 A7 __ B7_ 五、發明説明（9 ) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 醋酸減量於基因工學技術、化學合成技術取得之h P T Η 精製步驟中可適用透析、電氣透析、離子交換層析法、分 子篩柱體層析法、逆相Η P L C等之已知方法後進行之。 又，以透析、電氣透析、離子交換層析法等方法去除 醋酸時’溶液之ρ Η或直接測定醋酸含量後可任意調整醋 酸含量之hPTH溶液。 例如：藉由針對h P 丁 Η水溶液與ρ Η之關係，進行 調整醋酸含量。 透析時係於低分子I留分之筒狀透析膜中藉由基因工學 技術或化學合成技術所取得之h Ρ Τ Η水溶液或封入將該 水溶液以氫氧化鈉水溶液、氨水溶液等鹼調成ρ Η爲5〜 9之h Ρ Τ Η水溶液後，針對水單純擴散後進行透析後去 除醋酸。醋酸含量約爲2 %之h Ρ 丁 Η ( 1〜3 4 )係使 透析外液之Ρ Η持續透析至約6 · 5爲止取得者。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 又，電氣透析時，將基因工學技術或化學合成技術取 得之h Ρ Τ Η水溶液、或該水溶液以氫氧化鈉水溶液、氨 水溶液等鹼調成ρ Η爲5〜9之h Ρ Τ Η水溶液循環加入 電場分子量3 0 0餾分之透析膜間後，於陽極側聚集醋酸 離子，於陰極側聚集h Ρ Τ Η游離鹽基後，分子量小之醋 酸離子通過膜後於系外去除之，使分子量大之h Ρ Τ Η游 離鹽基於透析系中進行循環。測定透析液之ρ Η或離子強 度後，去除醋酸量進行監控後，可製造具一定醋酸含量之 hPTH。例如：醋酸含量約2%之hPTH (1〜34 )係使透析液ρ Η持續進行電氣透析至約6 . 5爲止取得 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） -12- 1293563 Α7 Β7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明説明（10) 〇 又，離子交換層析法係時係結合吸附醋酸於鹽基性離 子交換樹脂中後去除醋酸。例如：於4級銨樹脂或2級銨 樹脂等鹽基性離子交換樹脂柱體中添加基因工學技術或化 擧合成技術取得之h P T Η水溶液後，使醋酸樹脂進行離 子性結合，通過柱體取非吸附分畫後可製造減少醋酸含量 之hPTH者。針對hPTH改變離子交換樹脂量後，可 製造具有一定醋酸含量之h P T Η者。如：醋酸含量約2 %2hPTH (1〜34)係使溶出液之pH選擇約爲 6 . 5之樹脂量後取得者。 又，分子篩柱體層析法中，於分子篩柱體中添加基因 工學技術或化學合成技術取之h P T Η水溶液，或於該水 溶液中添加以氫氧化鈉水溶液、氨水溶液等鹼調成ρ Η爲 5〜9之h Ρ Τ Η水溶液後，以含有乙腈等有機溶媒水溶 液進行溶出後，將醋酸以無機鹽去除之。調整添加於柱體 之h Ρ ΤΗ水溶液ρ Η後，可製造具一定醋酸含量之 h Ρ Τ Η。例如：醋酸含量約2 %之h Ρ Τ Η ( 1〜3 4 )係調整添加於柱體之h Ρ Τ Η水溶液ρ Η約爲6 · 5後 ，聚集h Ρ Τ Η ( 1〜3 4 )溶出分晝後取得。 更且，逆相HP L C中，係藉由基因工學技術或化學 合成技術取得之h Ρ Τ Η水溶液，或使該水溶液以氫氧化 鈉水溶液、氨水溶液等鹼進行調整ρ Η爲5〜9。將此溶 液以水於初期化C 1 8，C 4等逆相Η P L C中加入後， 以水做爲溶出液，溶出無機鹽成份。之後，使於含乙腈等 (請先閲讀背面之注意事_ J· 項再填· 裝-- :寫本頁) 訂 i· 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） -13- 1293563 A7 B7 五、發明説明（11 ) 有機溶媒水溶液所吸附之h P T Η進行溶出後，取得醋酸 含量減低之hPTH。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 調整添加於柱體之h P T Η水溶液p Η後，可製造含 有一定醋酸含量之h Ρ ΤΗ。又，過度使醋酸界限量之去 除後，添加醋酸之後，亦可取得具一定醋酸含量之 h Ρ T Η。例如以水將過度去除醋酸之h Ρ T Η ( 1〜 3 4 )溶液濃度稀釋成1 〇 m g /2，添加醋酸至ρ η約 6.5後，取得醋酸含量約2%之hPTH(1〜34) 溶液。 依常法將上述各方法等取得之h Ρ T Η水溶液進行凍 結乾燥後，可取得本發明醫藥用成份。 本發明之醫藥用成份係以改善吸收等爲目的者，亦可 含至少1種水溶液有機酸，較佳者爲檸檬酸、己二酸及二 醇酸者，更可含與hPTH之鹽，或附著物，或做爲添力口 物含有者。更含有此等有機酸之醫藥用成份係具有良好安 定性，用於注射以外之投用經路用之藥劑，特別是本發明 之經鼻投用醫藥組成物時，使用感亦極佳。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 因此，本發明醫藥用成份可做爲長期使用之經鼻投用 醫藥組成物之成份使用者。 又，本發明經鼻投用醫藥組成物具有良好配合變化特 性，因此於製劑化時通常被使用之載體，賦形劑、增粘劑 、保濕劑、安定化劑、防止氧化劑、結合劑、崩散劑、濕 潤劑、潤滑劑、著色劑、芳香劑、矯味劑、懸浮劑、乳化 劑、溶解補助劑、緩衝劑、等張化劑、單面活性劑、無痛 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐1 -14 - 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1293563 A7 B7五、發明説明（12 ) 化劑、含硫還原劑、等成份比原者更適於做爲改善吸收、 固體安定化劑等目的之各種其他機能性成份之配合者。 做爲載體、賦形劑之例者係爲水溶液或難溶性者，如 :糖類、多糖類、糊精類、纖維素類、合成或半合成高分 子類、胺基酸類、聚胺基酸類、蛋白質類、磷酯質類等例 者。 做爲糖類（單糖類、寡糖類）者如：D-甘露糖醇、 葡萄糖、乳糖、果糖、肌醇、蔗糖、麥芽糖等例，多糖類 之例如：葡聚糖、支鏈澱粉、褐藻酸、透明質酸、果膠、 植酸、植酸鈣鎂、等例。又，做爲糊精類者如：^ -環糊 精、/3 -環糊精、r -環糊精、糊精、羥基丙基澱粉、羥 乙基澱粉等例。 更且，做爲纖維素類之例者如：甲基纖維素、乙基纖 維素、羥乙基纖維素、羥丙基纖維素、羥丙基甲基纖維素 、羧甲基纖維素鈉等例。 做爲合成及半合成高分子類者如：聚乙烯醇、羧基乙 烯聚合物、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮（PVP)、聚丙 烯酸鈉、聚乳酸等例。 做爲胺基酸類之例者如：甘胺酸、牛磺酸等例、聚胺 基酸類之例如：聚谷胺酸、聚天冬胺酸、聚甘胺酸、聚白 胺酸等例。 做爲蛋白質類之例如：明膠等例。其他如：殼質、殼 聚糖等例。 此等載體、賦形劑中又以蔗糖、甘露糖、α -環糊精 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 4 項再填· 裝* 訂 -I# -15- 1293563 A7 B7 五、發明説明（13 ) 、/3 -環糊精、糊精、D -甘露糖醇、肌醇、乳糖、葡聚 糖、甲基纖維素、羥丙基纖維素、聚乙烯醇、R酵素特別 理想者。 除此之外，亦可使用山梨糖醇酸、氯化苄烷胺、氯化 十六基吡啶鹽、氯化苄乙氧胺或對羥基苯甲酸甲酯、對羥 基苯甲酸乙酯、對羥基苯甲酸丙酯、對羥基苯甲酸丁酯、 對羥基苯甲酸異丁酯等對羥基苯甲酸類、阿拉伯膠、山梨 糖醇、硬脂酸鎂、滑石、二氧化矽、結晶纖維素、澱粉、 磷酸鈣、植物油、羧甲基纖維素、月桂硫酸鈉、水、乙醇 、甘油、單糖漿等者。 做爲界面活性劑之例者如：非離子界面活性劑，如： 山梨糖醇酐單辛酸酯、山梨糖醇酐月桂酸酯、山梨糖醇酐 單棕櫚酸酯等山梨糖醇酐脂肪酸酯；甘油單辛酸酯、甘油 單肉豆蔻酸酯、甘油單硬脂酸酯等甘油脂肪酯；癸甘油單 硬脂肪酯、癸甘油二硬脂酸酯、癸甘油基單亞油酸酯、等 聚甘油脂肪酸酯；聚環氧乙烷山梨糖醇酐單月桂酸酯、聚 環氧乙烷山梨糖醇酐單油酸酯、聚環氧乙烷山梨糖醇酐單 硬脂酸酯、聚環氧乙烷山梨糖醇酐單棕櫚酸酯、聚環氧乙 烷山梨糖醇酐三油酸酯、聚環氧乙烷山梨糖醇酐硬酯酸等 聚環氧乙烷山梨糖醇酐脂肪酸酯；聚環氧乙烷山梨糖醇四 硬酯酸酯、聚環氧乙烷山梨糖醇四油酸酯等之聚環氧乙烷 山梨糖醇脂肪酸酯；聚環氧乙烷甘油單硬脂酸酯等之聚環 氧乙烷甘油脂肪酸酯；聚乙二醇二硬脂酸酯等聚乙二醇脂 肪酸酯；聚環氧乙烷月桂醚等聚環氧乙烷烷基醚；聚環氧 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Μ規格（2i〇X297公董） (請先閱讀背面之注意事項再填、 寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 16- 1293563 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 _ 五、發明説明（14) 乙烷聚環氧丙烷二醇醚、聚環氧乙烷聚環氧丙烷丙醚、聚 環氧乙烷聚環氧丙烷十六醚等聚環氧乙烷聚環氧丙烷烷基 醚；聚環氧乙烷壬苯醚等聚環氧乙烷烷苯醚；聚環氧乙烷 箆麻子油、聚環氧乙烷硬化箆麻子油（聚環氧乙烷氫箆麻 子油）等聚環氧乙烷硬化箆麻子油；聚環氧乙烷山梨糖醇 蜜蠛等聚環氧乙烷蜜臘衍生物；聚環氧乙烷含水羊毛脂衍 生物；聚環氧乙烷硬脂酸醯胺等聚環氧乙烷脂肪酸醯胺等 之具有H L B爲6〜1 8者；陰離子界面活性劑，如：十 六基硫酸鈉、月桂基硫酸鈉、、油基硫酸鈉等碳原子數1 〇〜1 8之具烷基的烷基硫酸鹽；聚環氧乙烷月桂基硫酸 鈉等之聚環氧乙烷之平均附加莫耳數爲2〜4者，烷基碳 原子數爲1 0〜1 8之聚環氧乙烷烷醚硫酸鹽；月桂基硫 琥珀酸酯鈉等之烷基碳原子數爲8〜1 8之烷磺琥珀酸酯 鹽；天然系界面活性劑，例如：卵磷脂、甘油磷脂質；鞘 髓磷脂等鞘髓磷脂質；碳原子數12〜18之脂肪酸蔗糖 脂肪酸酯等做爲典型例者。本發明製劑中，可組合此等界 面活性劑1種或2種以後進行添加。 做爲含硫還原劑者如：正-乙醯半胱胺酸、正-乙醯 均半胱胺酸、硫辛酸、硫二甘醇、硫乙醇胺、硫甘油、硫 山梨糖醇、硫二醇酸及其鹽、硫代硫酸鈉、谷光甘肽、以 及具碳原子數爲1〜7之硫鏈烷酸等氫硫基者等例。 又，做爲氧化防止劑之例如：赤山糖糖酸、二丁基羥 甲苯、丁基羥基茴香醚、α -生育酚、醋酸生育酚、l -抗壞血酸及其鹽、L -抗壞血酸棕櫚酸鹽、L -抗壞血酸 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） ' _17_ (請先閲讀背面之注意事 4 項再填* 裝-- :寫本頁) 訂 1293563 A7 _B7__ 五、發明説明（15) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 硬脂酸鹽、亞硫酸氫鈉、亞硫酸鈉、沒食子酸三戊酯、沒 食子酸丙酯或乙二胺四醋酸二鈉（EDTA)、焦磷酸鈉 、偏磷酸鈉等螯合劑例。 本發明醫藥組成物中各成份比例以h P T Η約爲 0 · 01〜20%者宜，較佳者爲0 · 05〜10%，必 要時可添加有機酸，使用時以0 · 05〜99 · 5%者宜 ，較佳者爲0 . 1〜9 9 . 0 %，又，製劑化時常用之載 體、賦形劑等成份可於必要時進行添加，使用時以 0·01〜99.5%者宜。又，必要時可添加其他各種 機能性成份，使用時以0 . 0 5〜9 9 · 5 %者宜。 本發明經鼻投用醫藥組成物之調製可依公知之方法爲 基準進行之。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 例如：直接將減少醋酸量之h Ρ Τ Η醫藥用成份做爲 醫藥組成物使用者亦可，又，減少醋酸量之h Ρ Τ Η醫藥 用成份中，於必要時亦可配合添加製劑化時常用之載體、 賦形劑等成份，有機酸或各機能性成份後，做爲醫藥用成 份使用之。配合時可藉由取代有機酸醋酸之外，添加進行 之，例如：於h Ρ Τ Η醫藥用成份中將必要時於製劑化常 用之載體、賦形劑等成份，有機酸或各種機能性成份所成 之混合物共溶於蒸餾水後，進行凍結乾燥後，取得均勻的 組成物者。 或h Ρ ΤΗ醫藥用成份與必要埘製劑化常用之載體、 賦形劑等成份先溶於蒸餾水後進行凍結乾燥後，必要時合 倂有機酸或各種機能性成份後進行溶解後，藉由凍結乾燥 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -18- 1293563 A7 B7 五、發明説明（16 ) 後，取得均勻組成物者亦可。 或h P T Η醫藥用組成份與有機酸或各種機能性成份 先溶於蒸餾水後進行凍結乾燥之後，必要時合倂製劑化常 用之載體、賦形劑等成份後進行溶解之後，藉由凍結乾燥 後，亦可取得均勻的組成物。 本發明醫藥用成份可依投用方法進行各種劑型之製劑 化，可進行製劑化成可於直腸、鼻腔、口腔等粘膜投用之 劑型者。又，本發明經鼻投用醫藥組成物以經鼻藥之形態 投用者宜。 理想本發明經鼻投用醫藥組成物例如：做爲凍結乾燥 組成物提供之本發明醫藥用成份爲含於凍結乾燥部，於此 添加溶解液部之用時溶解型製劑例者。 做爲該有機酸及吸收促進劑之檸檬酸、己二酸以及二 醇酸等有機酸可於凍結乾燥部中以h Ρ Τ Η之鹽或附著或 添加物做成本發明醫藥用成份、或添加於溶解液部中被溶 解後使用亦可。 又’本發明經鼻投用醫藥組成物之投用可依公知之方 法爲基準進行者，例如，本發明經鼻投服用醫藥組成物係 做爲經鼻藥使用之製劑者，於置入該醫藥組成物之容器中 裝置噴霧器’將噴嘴先端置於鼻腔內進行噴霧，藉由噴霧 可適用於鼻腔內投用之方法等者。 本發明醫藥組成物之投用量依其疾病種類、患者年齡 、體重、症狀、及投用經路有所不同，一般如h Ρ Τ Η ( 1〜3 4 )之經鼻投用時，可分爲1日1次或數次連續投 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公羡） KLI·-----^裝-- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 J· 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -19- 1293563 A7 B7 五、發明説明（17) 用者，1次以hPTH (1〜34)爲10〜5000 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) # g之範圍者進行投用爲宜。又，一旦停藥後，亦可依症 狀進行再度投與之。 〔實施例〕 藉由以下實施例進行本發明更詳細之說明，惟，本發 明並非限於此實施例者。 本實施例中所使用之試驗法與機器並無特別被記載限 定下，可使用以下所載者。 1 ·藉由hPTH之HPLC進行分析 於胜肽含量與分解（副產）物之檢索下以以下之機器 及條件進行實施逆相Η P L C。 機器：島津L C — 9 Α系統 柱體·· YMC PROTEIN-RP ( 4 . xl50mm)

柱體溫度：4 0 °C 溶出液·· 0 · 1 %三氟醋酸中，使乙腈濃度於3 0分 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 鐘內由2 5 %至4 0 %呈直線變化之 流速：1 m L /分 檢出：U V ( 2 1 0 n m )

注入量：5 0 // L 2 .醋酸分析 於下記離子交換Η P L C條件下求出透析液與凍結乾 燥品中之醋酸量。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐1 ' 一 -20- 1293563 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7_五、發明説明（18 ) 機器：島津LC 一 9A系統 柱體：Shimadzu IC-A1 (4 · 6mm4 xlOOmm) 柱體溫度：4 0 °C 溶出液：Ο · 84%苯二酸水溶液和Ο . 5 8%三羥 基甲基胺基甲烷水溶液之1 : 1混合物 流速：1 · 5 m L /分 檢出：電氣傳導度檢出器 注入量：1 0 // L 3·質量分析 於下記機器及條件下求取hPTH、hPTH之分解 (副產）物以及其酵素消化物之質量。 機器：finigum MAT TSQMS 離子源：E S I 檢出離子型態：ρ o s i t i v e 噴霧電壓：4 . 5kV 毛細管溫度：2 5 0 °C 移動相：Ο · 2酢酸•甲醇混液（1 : 1 ) 流液：0 . 2 m L /分 掃描範圍：m/z 550〜850 4 .胺基酸配列分析 於h Ρ T Η之分解（副產）物及其酵素消化物之胺基 酸配列分析中使用下記機器。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） '" ' -— LL — ^-----φ 裝II (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 • 21 - 1293563 A7 _____ Β7_ 五、發明説明（19) 機器·帕金埃爾默公司 4 7 7 A型Sequencer (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 5 ·胺基酸組成分析 於h P T Η之分解（副產）物及其酵素消化物胺基酸 組成分析中使用下記機器。 機器：日立製作所製 L-8500型胺基酸分析器 6 ·試料之保存（安定性試驗） 於以下保存庫以各溫度條件下進行保存。 機器·長Sr科學，LH - 30 — 14 設定溫度·· 1 ) 4 0 ± 1 t：、2 ) 6 0 ± 1 °C、

3 ) 8 0 ± 2 °C 7.凍結乾燥 機器：共和真空技術股份公司製 RL-903BS 小瓶：1 5 m«玻璃小瓶 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 〔參考例1 h P T Η ( 1〜3 4 )之製造（1 )〕 含原於大腸菌之石-半乳糖苷酶衍生物進行編碼之 DNA與編碼hPTH(1〜34)之DNA經處理程序 酵素Ke x2蛋白酶之切斷動機（Ly s - A I* g)之磷 化所編碼D N A所接續之h P T Η ( 1〜3 4 )的嵌合體 蛋白質編碼基因所含有之發現胞質遺傳體 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） -22- 1293563 A7 B7____ 五、發明説明（20) PG117S4HPPH34 (特開平 9 — 29660 號 公報）導入大腸菌M2 5株（W3 1 1 0/〇mpT = Sugimura 等、Biochem . Biophys · Res · Commun ·，v〇l .153，1 988，p753-7 59 )，使形質轉變之大腸菌M 2 5株 使用含有2%酵母萃取液，於2 0 L培養槽內進行培養之 〇 菌體濃度呈0 D 6 6 (D = 1 2爲止持續培養後，將取得 菌體以含ImM EDTA之10mM三鹽緩衝液（pH 8.2)中，利用高壓勻槳器（1^11〖〇11-0&11丨11)進行搗碎 後，經過離心分離，洗淨後，取得含嵌合體蛋白質封入體 約爲1 0 0 g之6 2 5 J懸浮液。於含4 0 g封入體之 2 5 0 4懸浮液中加入1 〇 0 J之1 Μ三鹽酸緩衝液（ pH8.2)，5 0J 5 M NaCl，5 0 0m«脫離 子水，以及9 0 0 g尿素後，於3 0 t下攪拌後，溶解封 體。 以脫離子水將此溶液稀釋至5 1後，添加5 0 4之 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 hiI·-----裝-- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1· 2 5 0 m M CaC 12之後，添加Kex2蛋白酶之胺基 酸號碼1〜6 6 0所成之K e X 2蛋白酶之衍生物 Kex2 - 660 (特開平 10 — 229884 號公報） 爲2 0 k U /J以上後，緩慢攪拌2小時後，由嵌合體蛋 白質切取hPTH(l〜34)。以醋酸調整反應液pH 爲6 · 4後，更以脫離子水將反應液稀釋成2倍，使未反 應之嵌合體蛋白質與/3 -半乳糖甘酶衍生物進行沈澱後， 藉由離心分離取得含6 . 7g之hPTH (1〜34)上 本紙張尺度適用中關家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐) — " -23- 1293563 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7五、發明説明（21 ) 淸液。此上淸液以醋酸調整P Η爲5 · 0，預先以1 0 m Μ酸酸鈉緩衝液吸附平衡化之陽離子交換樹脂（S Ρ豐 珍珠，東曹股份公司製）後，以1 0 m Μ醋酸鈉緩衝液洗 淨後，於0·4Μ NaCl取得含6·Og之hPTH (1〜3 4 )之分畫。 於此分畫中加入醋酸爲3 v / v %後，加入預先以3 v / v %醋酸進行平衡化之低壓逆相〇D S ( Soken ODS-W ，綜硏化學股份公司製）柱體後，以含有3 v / v %醋酸 之30v/v%乙腈溶出hPTH(l〜34)。於減壓 下濃縮含hPTH (1〜34)之此溶出液後，加入逆相 Η P L C 柱體（Tskge 10D S120T、5 5mmx 600mm，東曹股 份公司製）後，以流速爲4 0 / m i η，6 0分鐘內使 5 ν/ν%醋酸中之乙腈濃度由1 6%至3 2%呈直線變 化之，溶出hPTH (1〜34)後，取得4g含 hPTH (1〜34)之精製分畫。 合倂同法處理6 0 g殘餘封入體後取得之5 g含 h Ρ T Η ( 1〜3 4 )之精製分畫後，減壓下餾去乙腈後 ，以5ν/ν%之醋酸調整hPTH(1〜34)濃度爲 1 0 m g /J。此溶液各以1 5 m«塡入玻璃小瓶後，凍結 乾燥後，取得9g之hPTH (1〜34) ( 1 5 0 m g x 6 0支）。此物質之分子量、胺基酸組成此如以下所示 ，此物質被確定爲hPTH (1〜34)者。 ESI— MS :4117.7(理論値 4117.8 )、6 N鹽酸水解後之胺基酸組成比：A s X ; 4 . 0 ( 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁} -24- 1293563 A7 B7 五、 發明説明（22 ) 4)，ser;2.6(3) j G 1 x ; 4 · 9 ( 5 )， G 1 y ; 1 . Ο ( 1 )，Val;3.0(3)，Met ;2·〇(2)，Ile;l.〇(l)，Leu;5， phe;l.l(l)，Lys;30(3)，His; 3.0(3) ，Arg;2.0(2) ，Trp;未檢出 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 〔參考例2、hPTH (1〜34)之製造（2)〕 使用與參考例1相同之生產菌，於2 0 0 1培養槽 中進行培養。持續培養菌體濃度爲〇〇66。= 1 6 0爲止 ’取得菌體於含ImM EDTA之1 OmM三鹽酸緩衝 液（p Η 8 · 2 )中，利用高壓勻槳器進行搗碎後’經過 離心分離，洗淨後，取得含5 k g嵌合體蛋白質封入體之 1 0 1懸浮液。 於含2 k g封入體之4 · Ο 1懸浮液中加入1 · 6 1 1 Μ三鹽酸緩衝液（P Η 8 · 2 ) 、0 . 8 1 5 M NaCl 、15 1脫離子水以及13kg尿素後 ，3 0 °C下進行攪拌後，使封入體進行溶解。 將此溶液以脫離子水稀釋成8 Ο 1後，加入0 · 8 1 250mM之CaC 12後，於本溶液中加入Kex2 —660 (特開平10 — 229884號公報）爲10 k u / me以上後，緩慢攪拌1小時後，由嵌合體蛋白質切 取hPTH(l〜34)。以醋酸調整反應液爲pH 6 . 3，更以脫離子水將反應液稀釋成2倍，使未反應之 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 1· 裝_ 訂 «· -25- 1293563 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7五、發明説明（23) 嵌合體蛋白質與/5 -半乳糖甘酶衍生物進行沈澱後，藉由 壓榨過濾取得含hPTH (1〜3 4)之上淸液。 以醋酸調整此上淸液爲p Η 5 · 0，於預先以1 〇 mM酸酸鈉緩衝液進行平衡之陽離子交換樹脂（P〇ros 5〇HS 、PerSeptive Biosystems (美國）柱體（5 1 )進行吸附 後，以1 0 m Μ酸酸鈉緩衝液洗淨後，於N a C 1濃度斜 度進行溶出，收集含h P T Η ( 1〜3 4 )之分畫。於水 溶液中加入醋酸爲3 ν / ν %後，加入預先以3 ν / ν % 醋酸平衡化之低壓逆相〇D S ( SokenODS-W、綜硏化學股 份公司製）柱體（5 1 )中後，以含有3v/v%醋酸 之30v/v%乙腈溶出hPTH(l〜34)。 於減壓下濃縮含h P T Η ( 1〜3 4 )之此溶出液後 ，以0 · 2 2 // m之濾器進行過濾後，加入逆相Η P L C 柱體（TSK 0 D S 8 0 T s 20//m，105 mm I D x 55〇mm，東槽股份公司製），於3v / v %醋酸存在下，於乙腈濃度斜度溶出下進行精製之。 於減壓下，合倂溶出分畫後餾去乙腈後，取得含7 0 g純 度 99.6% 之 hPTH(l 〜34) ，10.4 1 之 h P T Η ( 1〜3 4 )溶液。又，針對殘餘之3 k g封入 體中2 k g利用同法進行精製後，取得含7 8 g純度 99.6% 之 hPTH(l 〜34) 、11.6 1 之 hPTH (1 〜34)溶液。 〔參考例3、hPTH (1〜84)之製造〕 一裝-- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 ΙΦ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -26- 1293563 A 7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明説明（24 ) 將原於大腸菌之；8 -半乳糖甘酶衍生物進行編碼之 DNA與編碼hPTH(1〜84)之DNA經處理程序 酵素Ke x2蛋白酶之切斷動機（Ly s - A r g)之磷 化所編碼D N A所接續之h Ρ Τ Η ( 1〜8 4 )嵌合體蛋 白質編碼基因所含有之發現胞質遺傳體p G P # 1 9 (特 開平9 — 29600號公報）導入大腸菌M2 5株後，於 3 1培養槽，3 7 °C下進行培養形質轉換之大腸菌 Μ 2 5株之菌落後，當培養液濁度（〇D 6 6 〇 )爲1時使 異丙基/5 -硫代半乳糖苷（I P T G )加至最終濃度爲 1 · 〇 m Μ 者。 更持續培養4小時後，藉由離心分離回收菌體後，懸 浮於 TE (10mM三、ImM EDTA、pH8 · 0 )。藉由french press進行搗碎菌體，重覆進行離心分離與 再懸浮後將封入體洗淨回收。將本封入體懸浮液溶於 8.0M尿素，10mM三pH8·0後，將其離心上淸 液負荷於1 0 0 ^£之QAE豐珍珠柱體（東曹股份公司製 )，藉由NaCIO〜0.4M濃度斜度溶出進行精製之 。精製封入體溶解液以排除界限分子量1 0，0 0 〇之超 速過濾膜進行濃縮。將此稀釋成反應液組成（5 0 m Μ BisTris ρΗ6·8，1·〇ιηΜ C a C 1 2 5mg/m£，嵌合體蛋白質）後，加入Ke x2 — 6 6 0呈21^11/^後，30°(：下反應1小時後，切取 hPTH(l 〜84)。 以醋酸調整反應液Ρ Η爲5 · 0，更以脫離子水稀釋 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -項再填办 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210x297公釐） -27- 1293563 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（25) 成2倍後，使未反應之嵌合體蛋白質及沒-半乳糖甘酶衍 生物進行凝聚沈澱。藉由離心分離取得含h P TH ( 1〜 8 4 )之上淸液，於此添加醋酸爲3 v/v%後，於以3 v / v %醋酸進行平衡化之T S K gel 0 D S 8 0 T S (21mm I D x 250mm，東曹股份公 司製）進行精製。收集純度9 8 %以上之餾份，去除溶媒 後，進行凍結乾燥後，取得5 0 0 m g之h P T Η ( 1〜 8 4 )。此物質之分子量、胺基酸組成比爲如下所示者， 此物質被確定爲hPTH (1〜84)者。 ESI-MS;9424·7(理論値9424·7 )、6 N鹽酸水解後的胺基酸組成比：A s X ; 1 0 . 1 (10) ，Thr;l.l(l) ，Ser;6.3(7 )，Glx;ll.〇(ll)，Pro;2.9(3) ，Gly;4.1(4) ，Ala :7.0(7)， V a 1 ； 8 . 0 ( 8 ) ，Met; 1.9(2) ，Ile :1.0(1) ，Leu;l〇，Phe; 1.0(1) ，Lys;8.9(9)，His;3.9(4)， A r g ; 5 . 0 ( 5 ) ，Trp;未檢出（1)。 〔實施例1、h P 丁 Η ( 1〜3 4 )之去除醋酸（1 )〕 (1 )將參考例1取得之凍結乾燥品h P T Η ( 1〜 3 4 ) 1 5 0 m g )溶於蒸餾水（3 0 J )後，調成5 m g /W ( p Η 4 . 7 )之水溶液。此溶液於室溫下，針 對蒸餾水（1 0 0 J )於裝置電氣透析膜A C — 1 3 0 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -28- 1293563 A 7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明説明（26 ) 1 0 (旭化成工業股份公司）之micro acilyzer G1 (旭化成 工業股份公司）進行電氣透析，使p Η呈5 · 0後去除醋 酸。由醋酸含量6 . 8%之透析液取得含1 5 Omg h P T Η ( 1〜3 4 )之含醋酸量4 · 8 %凍結乾燥品。 (2 )將參考例1取得之凍結乾燥品（h Ρ Τ Η ( 1 〜34) 15〇mg)溶於蒸靜水（3〇m£)後，調成5 mg/J (pH4 · 7)之水溶液。此溶液藉由實施例1 (1 )同法進行電氣透析，ρ Η呈5 · 5爲止去除醋酸。 由醋酸含量4 · 6%之透析液取得含有1 5 Omg之 h Ρ Τ Η ( 1〜3 4 )之醋酸含量3 · 8 %凍結乾燥品。 (3 )將參考例1取得之凍結乾燥品（h Ρ Τ Η ( 1 〜34) 1 50mg)溶於蒸餾水（302)後，調成5 m g / m£ ( ρ Η 4 · 7 )之水溶液。此水溶液與本實施例 (1 )同法進行電氣透析，pH呈5 · 9爲止去除醋酸。 由醋酸含量3·1%之透析液取得含15Omg之 h Ρ Τ Η ( 1〜3 4 )之醋酸含量2 · 9 %之凍結乾燥品 〇 (4 )參考例1取得之凍結乾燥品（h Ρ Τ Η ( 1〜 3 4 ) 1 5 0 m g )溶於蒸餾水（3 0 J )後，調成5 mg/2 (pH4 · 7)之水溶液。此水溶液與本實施例 (1)同法進行電氣透析，使pH呈7·0爲止去除醋酸 。由醋酸含量1 . 6%之透析液取得含1 5 Omg h Ρ Τ Η ( 1〜3 4 )之醋酸含量1 . 6 %之凍結乾燥品 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1· •項再填· 裝· 、訂 L0 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐) -29 - 1293563 A7 B7___ 五、發明説明（27 ) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 由以上結果，伴隨醋酸減量之凍結乾燥使醋酸減少量 變少，醋酸減量後藉由凍結乾燥可減少醋酸減量之差。因 此，醋酸的減量可有效用於不易具有一定醋酸含量之 h P TH醫藥用成份的製造。 〔實施例2、hPTH (1〜34)之醋酸去除（2)〕 於含參考例2取得約1 5 0 g之h P T Η ( 1〜3 4 )溶液中加入5Ν Na〇H後做成ρΗ5 · 5。將該溶 液之1 / 4負荷於預先以5 ν / ν %乙腈水溶液平衡化之 低壓逆相〇D S ( Soken ODS-W ( 8 0 0 )，綜硏化學股 份公司製）柱體後吸附h P T Η ( 1〜3 4 )，以4 1 5 ν/ν%乙腈水溶液溶出醋酸鈉後，以5 0 ν/ν%乙 腈水溶液溶出h Ρ Τ Η ( 1〜3 4 )。此重覆進行4次處 理全量後，取得8.2 1含122.5g hPTH( 1〜34)(回收率82%)之1.13%醋酸含量之脫 醋酸分晝。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 接著，於本分畫中加入蒸餾水調整成1 〇 m g /J之 hPTH (1〜34)後，·加入針對hPTH之醋酸含量 爲3 %之2 . 3 g醋酸後，充份進行攪拌。分柱此溶液呈 含有小瓶150mg之hPTH(1〜34)後，取得醋 酸含量2 · 1 %之凍結乾燥品。 〔實施例3、hPTH (1〜34)之醋酸去除（3)〕 (1 )將參考例1取得之凍結乾燥品（h Ρ Τ Η ( 1 〜3 4 ) 3 0 0 m g )溶於蒸餾水（3 0 2 )後，調製 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210Χ297公釐） -30- 1293563 A7 ______ B7__ 五、發明説明（28 ) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 10mg/4之水溶液。將此醋酸含量9 · 5%之溶液（ P Η 4 · 7 )以每2 2分柱於3支玻璃小瓶後，以F Z -6凍結乾燥器（Labokonco公司製）保持真空度爲〇· 13 m B a r以上，於1次乾燥（棚溫；—2 0 °C，1 2小 時）、2次乾燥（棚溫；2 5 t，4 8小時）下進行凍結 乾燥。2次乾燥完成後，以氮氣塡入凍結乾燥機庫內之同 時進行自動打栓。於各凍結乾燥小瓶中加入2 蒸餾水後 ’藉由離子交換HPLC定量醋酸含量。結果示於表1。 (2 )將參考例1取得之凍結乾燥品（h P T Η ( 1 〜34) 300mg)溶於蒸餾水（30J)後調製10 m g /2之水溶液。針對此溶液（p Η 4 . 7 )。 於裝置電氣透析膜AC— 130 - 10 (旭化成工業 股份公司）之micro acilaizer (旭化成工業股份公司）進行 電氣透析，pH呈5 . 0 (醋酸含量7 . 3%)爲止去除 醋酸。此透析液各以2 W分注3支玻璃小瓶後，與本實施 例（1 )同法進行凍結乾燥後，藉由離子交換Η P L C定 量醋酸含量。結果示於表1。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 (3 )將參考例1取得之凍結乾燥品（h Ρ Τ Η ( 1 〜3 4 ) 3 0 0 m g )溶於蒸餾水（3 0 J )後，調製 1 0 m g / 之水溶液。針對此溶液（Ρ Η 4 · 7 )於裝 置電氣透析膜AC - 1 3 0 - 1 〇 (旭化成工業股份公司 )之micro acilaizer (旭化成工業股份公司）進彳了電氣透析 ，pH呈5 . 5 (醋酸含量4 · 6%)爲止去除醋酸。此 透析液各以2 W分注於3支玻璃小瓶後，與本實施例（1 ^紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐了 " -31 - 1293563 A7 B7 五、發明説明（29 ) )同法進行凍結乾燥後’藉由離子交換Η P L C定量醋酸 含量。結果示於表1。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) (4 )將參考例1取得之凍結乾燥品（h Ρ Τ Η ( 1 〜34) 30〇mg)溶於蒸餾水（30m£)後調製ι〇 mg/ni之水溶液。針對此溶液（PH4 · 7 )於裝置電 氣透析膜AC—130-10 (旭化成工業股份公司）之 micro acilaizer (旭化成工業股份公司）進行電氣透析， pH呈6 · 3 (醋酸含量2 · 0%)爲止去除醋酸。將此 透析液各以2 2分注3支玻璃小瓶後’與本實施例（1 ) 同法進行凍結乾燥後，藉由離子交換Η P L C定量醋酸含 量。結果示於表1。 (5 )將參考例1取得之凍結乾燥品（h Ρ Τ Η ( 1 〜3 4 ) 3 0 0 m g )溶於蒸餾水（3 0 me )後，調製1 〇 m g / mC之水溶液。針對此溶液（P Η 4 · 7 )於裝置電 氣透析膜AC - 1 3 0 - 1 0 (旭化成工業股份公司）之 micro acilaizer (旭化成工業股份公司）進行電氣透析， P Η呈7 · 0 (醋酸含量1 _ 1 % )爲止去除醋酸。將此 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 透析液各以2 W分注3支玻璃小瓶後’與本實施例（1 ) 同法進行凍結乾燥後，藉由離子交換H p L c定量醋酸含 量。結果示於表1。 (6 )將參考例1取得之凍結乾燥品（h P T Η ( 1 〜34) 300mg)溶於蒸餾水（30m£)後，調製 l〇mg/me之水溶液。針對此溶液（PH4 · 7)於裝 置電氣透析膜AC - 1 3 0 - 1 〇 (旭化成工業股份公司 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -32- ^93563 A7 ___B7 五、發明説明（30) )之micro acilaizer (旭化成工業股份公司）進行電氣透析 ’ PH呈7 · 6 (醋酸含量0 · 5%)爲止去除醋酸。將 此透析液各以2 2分注於3支玻璃小瓶後，與本實施例（ 1 )同法進行凍結乾燥後，藉由離子交換Η P L C定量醋 酸含量。結果示於表1。 由表1證明，凍結乾燥前之醋酸含量變少，而凍結乾 燥後之醋酸含量減少量變小，又，凍結乾燥前之醋酸含量 愈少，藉由凍結乾燥後醋酸減少量組群間極少不均，顯示 醋酸之減量可有效用於不易具有一定醋酸含量之h Ρ ΤΗ 醫藥用成份之製造者。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 __ 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210x297公釐） -33 - 1293563

A B 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明説明（31 ) 表1 · 凍結乾燥前後醋酸含量之變化 透析液 凍結乾燥前 凍結乾燥後 平均 凍結乾燥前 pH 醋酸含量（％) 醋酸含量（％) (%) 後之差 4 . 7 9 . 5 6.7 6 . 5 6 . 6 6 . 6 2.9 5 . 0 7 . 3 5 . 5 5 . 4 5 . 5 5 . 5 ί 1.8 5.5 4.6 4.9 4 . 9 -0 . 3 4 . 9 4 . 8 6 . 3 2 . 0 2 . 1 〇 1 2 . 1 -0.1 Z .丄 2 1 7 . 1 . 1 0 . 8 0 . 8 0 . 8 0.8 0 . 3 7 . 6 0 . 5 0 . 4 0 . 4 0 . 1 0 . 4 0.5 Γιι.-----φ裝—— (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210Χ297公釐） -34- 1293563 A7 _B7 ___ 五、發明説明（32 ) 〔實施例4、1^?丁1_1(1〜3 4)之醋酸去除（4)〕 (1 )於2 0 0 1培養槽中進行培養與參考例1相 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 同之生產菌後，經過菌體搗碎、離心分離、洗淨後’取得 4·8kg之嵌合體蛋白質封入體。針對其中2·4kg ，藉由與參考例2相同之Kex 2—660切取 hPTH(1-34)後，藉由陽離子交換層析進行精製 ，於低壓後逆相〇D S層析進行脫鹽’以及逆相Η P L C 下進行最後精製。再與實施例2同法將本精製分畫以5 Ν 氫氧化鈉做成Ρ Η爲5 _ 5後，負荷於低壓逆相〇D S柱 體。通過5 ν / ν %乙腈水溶液後去除醋酸鈉後’以5 0 ν/ν%乙腈水溶液溶出hPTH(l — 34)，取得含 5 8 g hP ΤΗ (1 — 34)之醋酸含量1 · 2%之 5 . 4 1 hPTH(l — 34)溶液。使醋酸含量於 本溶液中呈3 %後，加入1 · 〇 g醋酸充份攪拌。分注此 溶液呈小瓶150mg之hPTH (1 — 34)含有之後 ，取得含57 · 8g hPTH (1 — 34)之醋酸含量 2 . 5 %之凍結乾燥品（小瓶3 8 5支）。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 (2 )將本實施例（1 )所得之凍結乾燥品（h P T H(l — 34) 150mg)溶於3m£之三氟乙醇，以 3 0 W二乙醚進行析出。取得粉末於鹼性蘇打顆粒之存在 下，乾燥器中，進行減壓乾燥2 4小時，取得含1 3 0 mg hPTH (1 - 34)之醋酸含量2 · 0%乾燥品 〇 (3 )於置有本實施例（1 )取得凍結乾燥品（ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -35- 1293563 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7五、發明説明（33 ) h P T Η ( 1 - 3 4 ) 1 5 0 m g之小瓶內側壁面以微注 射器在不接觸hPTH (1 — 34)下加入1 · 53//1 之醋酸。8 0 °C，5分鐘於小瓶中使醋酸揮發後，以螺旋 混合器振動小瓶，以小瓶內h P T Η ( 1 - 3 4 )做成細 粉末後，取得醋酸含量3.6%之11?丁11(1一34) 粉末。 (4 )於置有本實施例（1 )取得之凍結乾燥品（ h Ρ Τ Η ( 1 - 3 4 ) 1 5 0 m g )小瓶內側壁面以微注 射器在不接觸hPTH (1 - 34)下加入3 · 78//1 之醋酸。8 0 t，5分鐘於小瓶中使醋酸揮發後，以螺旋 混合器振動小瓶後，以小瓶內h Ρ Τ Η ( 1 - 3 4 )做成 細粉末後，取得醋酸含量5 . 1 %之h Ρ Τ Η ( 1 - 3 4 )粉末。 (5 )於置有本實施例（1 )取得之凍結乾燥品（ hPTH (1-34) 1 50mg)小瓶之內側壁面以微 注射器在不接觸hPTH (1 — 34)下加入5 · 28// 1之醋酸。8 0 °C，5分鐘下於小瓶內揮發醋酸後，以螺 旋混合器振動小瓶後，以小瓶內h Ρ Τ Η ( 1 - 3 4 )做 成細粉末後，取得醋酸含量6 · 2 %之h Ρ Τ Η ( 1 — 3 4 )粉末。 〔參考例4〕 (1 )於置有實施例4 ( 1 )取得之凍結乾燥品（ hPTH (1 — 34) 1 50mg)小瓶之內側壁面以微 I紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐) 一 ' -36- (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 1293563 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 ___B7_ 五、發明説明（34 ) 注射器在不接觸hPTH (1 - 34)下加入7 · 23 Μ 1醋酸。8 0 °C，5分鐘於小瓶內揮發醋酸，以螺旋混 合器振動小瓶，以小瓶內之h P T Η ( 1 — 3 4 )做成細 粉末後，取得醋酸含量7 · 5%之hPTH (1 — 34) 粉末。 (2 )於置有實施例4 ( 1 )取得之凍結乾燥品（ h P T Η ( 1 - 3 4 ) 1 5 0 m g )小瓶之內側壁面以微 注射器在不接觸hPTH (1 — 34)下加入9 . 48 β 1醋酸。8 0 °C，5分鐘於小瓶內揮發醋酸，以螺旋混 合器振動小瓶，以小瓶內之h P T Η ( 1 - 3 4 )做成細 粉末後，取得醋酸含量9 · 1%之hPTH (1 — 34) 粉末。 (3 )於置有實施例4 ( 1 )取得之凍結乾燥品（ hPTH(1—34)150mg)之小瓶之內側壁面以 微注射器在不接觸hPTH (1 - 34)下加入7 · 23 // 1醋酸。8 0 °C，5分鐘於小瓶內揮發醋酸後，以螺旋 混合器振動小瓶，以小瓶內之h P T Η ( 1 - 3 4 )做成 細粉末後，取得醋酸含量9 · 9%之hPTH (1 - 34 )粉末。 (4 )於置有實施例4 ( 1 )取得之凍結乾燥品（ h P T Η ( 1 — 3 4 ) 1 5 0 m g )小瓶之內側壁面以微 注射器在不接觸hPTH (1 - 34)下加入14 . 28 // 1醋酸。8 0 °C，5分鐘於小瓶內揮發醋酸後，以螺旋 混合器振動小瓶，以小瓶內之h P T Η ( 1 — 3 4 )做成 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） -37- 1293563 A7 B7 五、發明説明（35 ) 細粉末後，取得醋酸含量1 2 . 5 %之h P T Η ( 1 - 3 4 )粉末。 (5 )於置有實施例4 ( 1 )取得之凍結乾燥品（ hPTH(l - 34) 150mg)之小瓶之內側壁面以微 注射器在不接觸hPTH ( 1 — 3 4)下加入1 6 // 1醋 酸。8 0 °C，5分鐘於小瓶內揮發醋酸，以螺旋混合器振 動小瓶後，以小瓶內之h P T Η ( 1 一 3 4 )做成細粉末 後，取得醋酸含量13 . 7%之hPTH (1 — 34)粉 末。 (6 )於置有實施例4 ( 1 )取得之凍結乾燥品（ hPTH(1—34)150mg)之小瓶之內側壁面以 微注射器在不接觸hPTH ( 1 - 3 4 )下加入2 2 . 6 // 1醋酸。8 0 °C，5分鐘於小瓶內揮發醋酸，以螺旋混 合器振動小瓶，以小瓶內之h P T Η ( 1 — 3 4 )做成細 粉末後，取得醋酸含量18 . 3%之hPTH (1 — 3 4 )粉末。 (7 )於置有實施例4 ( 1 )取得之凍結乾燥品（ h P T Η ( 1 - 3 4 ) 1 5 0 m g )之小瓶之內側壁面以 微注射器不接觸hPTH (1 - 34)下加入1 00//丄 醋酸。8 0 °C ’ 5分鐘於小瓶內揮發醋酸後，以螺旋混合 器振動小瓶後，以小瓶內之h P T Η ( 1 - 3 4 )做成細 粉末後，取得醋酸含量72·5%之hPTH(1—34 )粉末。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） II丨·-----^裝— (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 4 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -38- 1293563 A7 _B7____ 五、發明説明（36 ) 〔實施例5、hPTH (l — 84)之醋酸去除（1)〕 (1 )將參考例3取得之醋酸含重約5 · 4 %之凍結 乾燥品（h P T Η ( 1 — 8 4 ) 5 0 m g )溶於蒸觀水（ 1 OmC)後，進行調製5mg/J (pH4 · 7)之水溶 液。此溶液於室溫下，針對蒸餾水（1 〇 〇 2 )於裝置有 電氣透析膜A C - 1 3 0 - 1 〇 (旭化成工業股份公司） 之micro acilaizer-Gl(旭化成工業股份公司）下進丫了電熱h 析，P Η呈5 · 0爲止去除醋酸。由透析液取得5 〇 m g hPTH (1 - 84)之醋酸含量3 · 9%凍結乾燥品。 (2 )將參考例3取得之醋酸含量約5 . 4 %之凍結 乾燥品（h P T Η ( 1 - 8 4 ) 5 0 m g )溶於蒸餾水（ 1 〇m£)後，調製5mg/J (pH4 · 7)之水溶液。 此溶液與本實施例（1 )同法進行電氣透析’ P Η呈 6 · 0爲止去除醋酸。由透析液取得含5 Omg h P T Η ( 1 - 8 4 )之醋酸含量2 . 5 %凍結乾燥品。 (3 )將參考例3取得之醋酸含量約5 . 4 %之凍結 乾燥品（h Ρ Τ Η ( 1 - 8 4 ) 5 0 m g )溶於蒸餾水（ 1 0 J )後，調製5 m g /J ( p Η 4 · 7 )之水溶液。 此溶液與本實施例（1 )同法進行電氣透析，Ρ Η呈 7. 0爲止去除醋酸。由透析液取得含5 Omg之 h Ρ Τ Η ( 1 — 8 4 )醋酸含量1 · 3 %凍結乾燥品。 (4 )將參考例3取得之醋酸含量約5 . 4 %之凍結 乾燥品（h Ρ Τ Η ( 1 - 8 4 ) 5 0 m g )溶於蒸餾水（ 10mC)後，調製5mg/J(pH4 . 7)之水溶液。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) |裝- 訂 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -39 - 1293563 A7 B7 ___ 五、發明説明（37 ) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 此溶液與本實施例（1 )同法進行電氣透析’ P Η呈 8 · 0爲止去除醋酸。由透析液取得5〇mg h P T Η \ 1 一 8 4 )之醋酸含量〇 · 9 %凍結乾燥品。 〔實施例6、hPTH ( 1 — 84)之醋酸去除（2)〕 (1 )將參考例3取得約5 · 4 %醋酸含量之·凍結乾 燥品（hPTH(l — 84) lOOmg)溶於 500m£ 之三氟乙醇後，加入2 0 rii之二乙醚後進行沈Μ。將此於 濾器上進行濾取後，取得含9 0 m g h Ρ Τ Η ( 1 -8 4 )之醋酸含量1 · 6 %乾燥品。 (2 )於5m£小瓶中量取5 · 4 9mg之本實施例（ 1 )取得之乾燥品後，以微注射器加入〇 · 3 // 1之1 0 vo 1%醋酸/氯化亞甲基溶液後，取得醋酸含量2 · 2 %2hPTH(l — 84)成份。 (3 )於54小瓶中量取5 · 5 8mg之本實施例（ 1 )取得之乾燥品後，以微注射器加入〇 · 6 // 1之1 0 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 vo1%醋酸/氯化亞甲基溶液後’取得醋酸含量2·7 %2hPTH (1 — 84)成份。 (4)於52小瓶中量取4 · 9 6mg之本實施例（ 1 )取得之乾燥品後，以微注射器加入1 · 〇 # 1之1 0 v ο 1 %醋酸/氯化亞甲基溶液後，取得醋酸含量3 · 8 %2hPTH (1 — 84)成份。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -40- 1293563 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7五、發明説明（38 ) 〔參考例5〕 (1) 於52小瓶中量取5·05mg之實施例6 ( 1 )取得之乾燥品後，以微注射器加入1 · 7 // 1之1 〇 vo1%醋酸/氯化亞甲基溶液後，取得醋酸含量5·2 %2hPTHil-84)成份。 (2) 於52小瓶中量取5·59mg之實施例6 ( 1 )取得之乾燥品後，以微注射器加入2 · 5 // 1之1 〇 v ο 1 %醋酸/氯化亞甲基溶液後，取得醋酸含量6 · 4 %2hPTH (1 - 84)成份。 (3) 於5J小瓶中量取5·Olmg之實施例6( 1 )取得之乾燥品後’以微注射器加入3 · 0 # 1之1 〇 V ο 1 %醋酸/氯化亞甲基溶液後，取得醋酸含量8 · 0 %2hPTH (1 — 84)成份。 (4) 於5mM、瓶中量取5 · 48mg之實施例6 ( 1 )取得之乾燥品後，以微注射器加入4 · 4 // 1之1 0 v ο 1 %醋酸/氯化亞甲基溶液後’取得醋酸含量 10 · 2%之 hPTH (1 — 84)成份。 (5) 於5J小瓶中量取5.47mg之實施例6 ( 1 )取得之乾燥品後，以微注射器加入5 · 5 // 1之1 0 v ο 1 %醋酸/氯化亞甲基溶液後，取得醋酸含量 1 2 · 3 % 之 h P T Η ( 1 — 8 4 )成份。 (6) 於5W小瓶中量取5.10mg之實施例6 ( 1 )取得之乾燥品，以微注射器加入1 0 . 2 w 1之1 0 v ο 1 %醋酸/氯化亞曱基溶液後’取得醋酸含量. 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) -41 - 1293563 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7_____五、發明説明（39 ) 22 . 9%之 hPTH (1 — 84)成份。 (7 )於5 4小瓶中量取5 · 5 3 m g之實施例6 ( 1 )取得之乾燥品後，以微注射器加入1 6 · 6 // 1之 1 0 v ο 1 %醋酸/氯化亞甲基溶液後’取得醋酸含量 33 . 6%之 hPTH (1 — 84)成份。 〔試驗例1、h P T Η ( 1 — 3 4 )之安定性（1 )〕 針對去除與h Ρ Τ Η之鹽或做爲附著物含有之醋酸後 h Ρ Τ Η之安定性進行討論。 將塡充，密閉於玻璃小瓶中之含參考例1取得之 hPTH (1 — 34) 1 50mg 之醋酸含量 9 · 5% 之 凍結乾燥品於長野科學L Η - 3 0 - 1 4保管庫中’ 4 0 ± 1 °C之條件下保存6個月，於保存開始時’保存後進行 逆相Η P L C後，單離保存開始時存在之分解（副產）物 及保存後產生分解（副產）物後，進行檢測其結構°結果 示於表2。 又，圖1代表保存後逆相Η P L C層析法。於 h Ρ Τ Η ( 1 — 3 4 )頂點後方（保持時間1 3分鐘至 1 7分鐘）出現Β、C及D之根頂點。此等頂點面積％如 表2所示，分別呈Β ; 3 · 9%、C ; 6 · 9%、D ; 3 · 0%，合計爲 13 · 8% 造成 hPTH (1 — 34) 劣化之主因。且，進行分別頂點結構解析之結果’ B爲〔 Ν ε - acetyl- Lys13〕- hPTH (1 - 34)與〔 ^6—&。61¥1-乙7826〕—11?丁1~1(1一34)之混合 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） M.L-----•裝—I (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 1·. -42- 1293563 Α7 Β7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明説明（40) 物、C 爲〔Να— acetyl— Se r1〕— hPTH (1_ 34) 、〇 爲〔Νε — a c e t y 1 — Lys27〕一 hp 丁 η (1 -3 4 )者。 以下同樣針對實施例1 ( 3 )取得醋酸含量2 . 9 % 之h Ρ τ Η ( 1 - 3 4 )凍結乾燥品進行其安定性之討論 〇 將塡充、密閉玻璃小瓶含h Ρ Τ Η ( 1 - 3 4 )約 1 5 0 m g醋酸含重2 · 9 %之凍結乾燥品於長野科學 LH— 30 — 14保管庫，40± 1°C之條件下，保存6 個月’保存開始時，保存後進行逆相HPLC，單離保存 開始時所存在之分解（副產）物及保存後產生之分解（副 產）物，進行檢測其結構。結果如表3所示。 又，保存後逆相Η P L C層析法如圖2所示。圖2顯 示比較醋酸含量9 · 5%之hPTH (1 — 34)凍結乾 燥品後，其頂點B、C及D之面積均減少。又，如表3所 示，頂點B、C及D之面積總計其保存開始與醋酸含量 9 _ 5 %之h Ρ Τ Η ( 1 - 3 4 )凍結乾燥品相同爲 〇 · 2%，而保存後爲3 · 6%，比較醋酸含量9 · 5% 之h Ρ Τ Η ( 1 — 3 4 )凍結乾燥品1 3 · 8 %後明顯減 少。 因此，hPTH時，乙醯體爲主要分解物者，做爲鹽 或附著物存在之醋酸由於安定性降低，因此與h Ρ Τ Η之 鹽或做爲附著物存在之醋酸含量減低後，判定提昇 h Ρ Τ Η之安定性。亦即，藉由醋酸之減量後，提供具有 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 、τ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） -43 - 1293563 A7

B 五、發明説明（ 良好安定性之醫藥用成份。 表2 . hPTH (1 — 34)之安定性（醋酸含量： 9 . 5%、40 °C / 6個月保存） 頂點 分解(副產)物 開始時 保存後 (頂點面積％) (頂點面積％) XI [Met(0)8]-hPTH(l-34) 0 · 1%以下 0 . 1% X2 [Met(0)18]-hPTH(l-34) 0 . 1%以下 0 . 1% B* [Ν ε -AcLys13]-hPTH(l-34) 未檢出 3 . 9% [Νε -AcLys26]-hPTH(l-34) C [Να -AcSerJ-hPTHd-S^ 0.2% 6 . 9% D [Νε -AcLys7]-hPTH(l-34) 未檢出 3 . 0% 其他 未同定分解物 0 . 1% 4 . 9% hPTH(l-34) —— 99 · 6% 81 · 1% 總計 —— 100 . 0% 100.0% * :頂點B爲混合物 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -44- 1293563 A7 B7 五、發明説明（42 ) 表3 . h P T Η ( 1 - 3 4 )之安定件（醋酸含暈 2. 9%、40 °C / 8個月保存） 頂點 分館副產)物 開始時 (頂點面積％) 保存後

XI

[Met(0)8]-hPTH(l-34) 0.1% 0.1% X2 [Met(0)ls]-hPTH(l-34) 0 . 1% 0 . 1% 請 先 閲 讀 背 面 之 注 B* [Ν ε -AcLys13]4iPTH(l-34) [Νε -AcLys26]hPTH(l-34) 未檢出 1 . 4% 3

C

[Να -AcSerj-hPTHd-S^ 0.2% 1 . 0% 頁

D

[Νε -AcLys27]-hPTH(l-34) 未檢出 1 . 2% 其他 未同定分解物 0.1% 3 . 9% hPTH(l-34) 99 . 5 % 92 . 3% 總計 100 . 0% 100 .0% 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 氺··頂點B爲混合物 〔試驗例2、h P T Η ( 1 - 3 4 )之安定性（2 )〕 將具有實施例4及參考例4取得之各醋酸含量試料$ 別於8 0 °C下進行1 5小時保存後，以注射器加入1 5 ^ 蒸餾水溶解後，測定分解（副產）物與保存後純度。結果 如表4所示。又，各醋酸含量中保存後之乙醯體（B、C 、D)之生成量（％)如圖3所示。 表4及圖3顯示伴隨著醋酸含量之減少，其原於乙醯 化之分解物B、C、D亦降低。 又，各醋酸含量中保存後純度如圖4所示，而圖4顯 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） -45- 1293563 A7 B7五、發明説明（43 ) 示化學當量（醋酸含量約7 . 3%)於彎曲點其純度呈C 字形、化學當量以下其安定性急劇上昇。 亦即，藉由醋酸減量後，顯示提供具有安定性之醫藥 用成份。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -46- 1293563

A B 44 /(\ 明説 明發五 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製

(他迷篮 v「/gT\poool)#l抿你*NI(对 ε — ΐ) KHdM g β <ΓΠ m 72.5* g § 5.24 vr> ON oo On σ< CO 32.6 18.3* s s 2.75 OO oo r—i 12.4 65.2 Γ'" i g § CO ON Ψ" 1 i 6.92 CO r-H 2.58 CO oS in csi r-H § g CA oo r· i Csl vd oo r-H ON ......i oo ON σ< g § oo 4.80 oo in r-H 2.54 89.2 g § 2.19 4.92 i "·Η VO r-H ON ON OO g g Cs| CO un oo CN s r-H 2.22 92.6 <N vd g g 0.95 CO VO r-H 0.87 r-H r-H un ON g g ON 1.30 0.60 π·_Η 96.0 v〇 cn g s 0.64 § 0.40 〇 r-H 97.2 ΙΟ g g 0.43 0.28 0.27 0.93 r-H oo GN g g 0.15 0.09 0.16 0.74 98.9 分解(副 產)物 Xl(%) X2(%) B(%) C(%) D(%) 其他(％) hPTH(I- 34)(%) (寸 c—r-H)EJ.d^l〔=cohJovlcoKI〕 ：α (^co—I)HHPHxil〔TVHCDsCJv—^M〕：o 擊啦®^(1ε — τ)Η1ΡΗβ — coJsnM (寸 ειΐ)ΕΗΟΗιίι〔εΙαίί>,1ον—οϋζ〕 ：PQ (寸 ε 1 Τ ) H 1 d 文丨〔00一 ( ο ) PCDS〕 ：CXIX (对 ε 丨 ΐ ) E HCLHa — 〔 g ( o ) PCDS〕 ： 1 x 荛擦您·迷* 33_伥：a N 9 2 L.—*丨·-----•裝-- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 4 A Ns c 準 標 家 國 中 用 適 度 尺 張 紙 本 % -47- 1293563 Α7 Β7 五、發明説明（45 ) 〔試驗例3、h P T Η ( 1 — 8 4 )之安定性〕 將置入具有實施例6及參考例5取得各醋酸含量試料 之小瓶於室溫下放置1分鐘後，使氯化亞甲基進行蒸散後 進行打栓。具有此等各種醋酸含量之試料於8 0°C下保# 1 5小時後，以注射器加入1 2蒸餾水溶解後，測定分解 (副產）物與保存後純度。結果如表5所示。又，保存 1 5小時之逆相Η P L C層析法如圖5所示，更且，各醋 酸含量中保存後之分解（副產）物之生成量（％)如圖6 所示。 如圖5所示，藉由保存後，生成R 1至R 6所分解（副 產）物。又，由表5及圖6顯示R 5以外之分解（副產）物 伴隨醋酸含量之上昇而增加。 更且，各醋酸含量中保存後純度如圖7所示，而 h Ρ Τ Η ( 1 - 8 4 )之純度係伴隨醋酸含量之低下而提 高，化學當量（醋酸含量約4 · 5 % )以下時上昇。由以 上結果，顯示hPTH(1-84)時產生與醋酸含量無 關之分解（副產）物，而與h Ρ Τ Η ( 1 - 3 4 )相同大 部份做爲與h Ρ Τ Η之鹽或附著物存在之與醋酸枏關者， 亦即，藉由醋酸之減量後，顯示提供具有良好安定性之醫 藥用成份。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） {請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) Γ 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -48- 1293563 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明説明（ 46 ) 33.6 r—H oo 9.32 % Ή VO vd CO 口 12.2 VO σ< CO 22.9 〇 CO γ··"Ή \ i <N CO \ < On OO wS § CO ίο CO csi r-H oo oo ON uo 2.45 2.96 CO 4.70 ν·'·Η 〇 CN o s oo 5.03 2.28 2.86 4.82 3.33 73.6 七 LO rH § 6.82 3.80 2.22 2.59 4.62 2.76 77.2 \ ilil P 〇 00 <rn 6.60 4.05 r-H cn S 4.89 CO oo cs 76.7 iid in <N 5.46 VO o4 2.00 2.39 5.56 2.94 79.0 oo oo 4.55 UO oo T—( r- 4 r i m 00 1 < Γ-* 〇4 oo 寸 00 1 irH 4.38 CO oo OO f-H 2.18 4.48 VO MD r111 VO CO oo E CNl oi 2.52 0.24 g CO oo t—H 5 VO \ < oo oo 33 Olh v〇 § s c5 Q 2 0.88 5.68 0.68 92.8 伥 LO 分解(副 產)物 Rl(%) R2(%) R3(%) R4(%) R6(%) hPTH(l- 84)(%) Q (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） 訂 4 -49 - 1293563 A7 B7 五、發明説明（47 ) 〔試驗例4、官能性試驗（1 )〕 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 針對h P TH之醫藥用成份進行討論鼻腔內投用時之 使用感。 於0 · 6 v / v %檸檬酸水溶液或水中，溶解參考例 1取得之h P T Η ( 1 - 3 4 )凍結乾燥品（1 〇 m g / J )後，移至附螺絲之玻璃小瓶後，裝置Valoa公司製噴霧 噴嘴（5 0 A 1 )後，將5 〇 // 1噴入單鼻孔後，藉由鼻 腔內投用後，進行評定溴覺與刺激性（健康成人男性1 2 名）。有關溴覺其感應溴覺程度以「有酸臭味」、「稍有 酸臭味」、「幾乎沒有」、「沒有」分類進行評定之。又 ，刺激性係以「伴隨疼痛之刺激」、「強烈刺激」、「稍 有刺激」、「刺激極微」之4階段級數進行評定之。又， 做爲調整者使用生理食鹽水。其結果示於表6。 由表6顯示hPTH (1 — 34)之檸檬酸水溶液、 h P T Η ( 1 - 3 4 )之水溶液均呈現強烈酸臭、不快感 者。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 以下進行調製各種有機酸之水溶液，討論投用鼻腔內 時之溴覺與刺激性之原因。做爲有機酸例者如：醋酸及檸 檬酸以及酒石酸、草酸、蘋果酸、苯二甲酸、抗壞血酸、 己二酸以及二醇酸之使用。 調製 0 · 1ν/ν%、0 · 2ν/ν%、〇 · 3ν/ ν%以及0·6ν/ν%之醋酸之水溶液、檸檬酸、草酸 、蘋果酸、苯二甲酸、抗壞血酸、己二酸以及二醇酸之 〇 . 6 ν/ν%水溶液後，噴霧於鼻腔內，與上述進行相 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） -50- 1293563 A7 _B7_ 五、發明説明（48 ) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 同之溴覺與刺激性之評定（健康成人男性4名）。結果如 表6所示。由表6顯示醋酸爲0 · 3 v/v%以上爲強烈 酸臭，且，0 · 3 v / v %以上亦增加刺激性。 另外，所使用之有機酸水溶液中未感覺有臭味，又， 針對刺激性其檸檬酸亦與抗壞血酸、己二酸、二醇酸同時 藉由生理食鹽水之鼻腔投用後，呈相同之結果。 又，參考例1取得之h P T Η ( 1 — 3 4 )凍結乾燥 品之醋酸含量爲約9 · 5 %者，本試驗例所投用之此 hPTH(1-34)溶液與0·lv/v%醋酸水溶液 所含醋酸量幾乎相同。 由上述結果證明檸檬酸本身未出現臭味，因此， hPTH醫藥用成份中之臭味係做爲與hPTH (1 — 3 4 )之鹽，或附著物所含之醋酸，而做成醋酸水溶液呈 無臭味感覺濃度之原因者。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 再使用實施例1 (3)取得之醋酸含量2 · 9%之 h P T Η ( 1 - 3 4 )凍結乾燥品後，調成h P T Η爲5 mg/m£20 · 4ν/ν%檸檬酸水溶液後，同樣進行投 用鼻腔內之溴覺與刺激1生之評定（健康成人男性1 2名） 。結果如表6所示。由表6顯示藉由醋酸之減量後，臭味 與刺激性被抑制，用於醫藥組成物時可提供良好使用感之 醫藥用成份。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） -51 - 1293563

A B 五、發明説明（49) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 表6 . hPTH (1 - 34)水溶液以及各種有機酸水 溶液之刺激與真味 hPTH/有機酸 刺激 臭味 hPTH(l-34)《· 1 + + 有酸臭 1ιΡΤΗ(1-34Γ 2 + 有酸臭 生理食鹽水 + 4πΤ- m 醋酸 （0 · 6v/v%水溶液） + + + 有酸臭 醋酸 （0 · 3v/v%水溶液） + + + 有酸臭 醋酸 （0 . 2v/v%水溶液） + 僅些許酸臭 醋酸 （0 . lWv%水溶液） + 幾乎沒有 檸檬酸 （0· 6w/v%水溶液） + Λ 酒石酸 （0· 6w/v%水溶液 ) + + + + Μ j\\\ 草酸 （0. 6w/v%水溶液） + + + + 4rrt. 蘋果酸 （0 · 6w/v%水溶液 ) + + + + 對苯二甲酸（0 · 6w/v%水溶 液） + + + See j\ w 抗壞血酸 （0 · 6w/v%水溶液 ) + te 己二酸 （0 · 6w/v%水溶液） + 4rrr 無 乙醇酸 （0 · 6w/v%水溶液） + ίΚ y \\\ hPTH(l-34)^ 3 + 僅些許酸臭 + + + + :伴隨疼痛強烈刺激 + + + :強刺激 + + :弱刺激 +:極微弱之刺激 ※工· 10mg/mL hPTH(l — 34)醋酸 含量9·5%)之0.6w/v%檸檬酸水溶液 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) -52- 1293563 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明説明（50) ※2 . lOmg/mL hPTH (1 — 34)醋酸 含量9 . 5 % )之水溶液 ※3 · 5mg/mL hPTH (1 — 34)醋酸含 量9 · 5 % )之水溶液 〔試驗例5、官能性試驗（2 )〕 (1 )試驗液之調製 將3 0 〇mg之參考例1取得之醋酸含量9 . 5%凍 結乾燥品.（h P T Η ( 1 - 3 4 )溶於蒸餾水（3 0 ^ ) 後，進行調製1 〇 m g /J之水溶液。更針對此溶液（ p Η 4 · 7 )於裝置micro acilaizer (旭化成工業股份公司 )進行電氣透析，pH5 · 0 (醋酸含量7 · 3%)爲止 去除醋酸後，進行調製h P T Η ( 1 - 3 4 )水溶液。 同樣使pH呈6 . 0 (醋酸含量2 · 9%)爲止去除 醋酸後，調製h P T Η ( 1 - 3 4 )水溶液。又使P Η 7 · 6 (醋酸含量0 · 5%)爲止去除醋酸後’§周製 hPTH(l — 34)水溶液。 (2 )官能性試驗 於本試驗例（1 )所調製之各1 . 5 2試驗液中，分 別混合含270mg精製白糖、12mg檸檬酸、以及 0 · 3 m g氯化苄院銨之1 · 5 m2水溶液後做成經鼻處方 溶液。於置有此經鼻處方溶液之小瓶中裝置Voloa公司製之 噴霧噴嘴（5 0 // 1 )後，用於官能試驗（健康成人男性 5名）。針對臭味分成「A :幾乎無醋酸臭感」、「：B : 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -53 - 1293563 A7 ____B7_ _ 五、發明説明（51 ) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本f) 醋酸臭弱」、「C :醋酸臭強」進行評定。針對刺激性分 成「A ··無刺激感」、「B :稍有刺激感」、以及「C : 刺激強烈」進行評定。結果示於表7。 由表7顯示藉由醋酸之減量後，抑制臭味與刺激’ $ 長期用於經鼻投用醫藥組成物，提供良好使用感之醫藥組 成物者。 表7 . 各種醋酸含罱h PTH ίΐ -3 4)含有 官能試驗 被驗者 醋酸含量 醋酸含量 醋酸含量 醋酸含量 9 . 5% 7 . 3% 2 . 9% 0 · 臭味 刺激 臭味 刺激 臭味 刺激 臭味 剌 1 ① B B B B B B A 一 A _____ ② B B A B A B A B , ③ C B B A A A A A .—--一 ④ C B B A A A A A ^ ⑤ A B B A B A A 一 A L-— 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 臭味 A:醋酸臭幾乎沒感覺 B:醋酸臭極弱 C:醋酸臭極強 刺極 A :刺激幾乎沒有 B:多少刺激出現 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -54- 1293563 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明説明（52 ) C :刺激強烈 〔試驗例6、各種有機酸對h P T Η安定性之影響〕 醋酸之去除係藉由前述電氣透析等方法進行者，亦可 以其他有機酸取代醋酸者。 針對以其他有機酸取代醋酸時h Ρ Τ Η安定性進行評 定。 本試驗例中有機酸係公知做爲吸收促進劑者，於試驗 例4中被確定爲良好使用感之有機酸者以己二酸、檸檬酸 、及二醇酸使用之。又，有機酸之添加做爲取代醋酸量者 爲化學當量添加者。h Ρ Τ Η ( 1 — 3 4 )係含鹽基性胺 基酸9殘基與酸性胺基酸4殘基、分子全體下+ 5陽電荷 形成酸成份與鹽之量，亦即，化學當量之1莫耳h Ρ ΤΗ (1 — 34) ( M w 4 1 1 7 . 8 )時分別添加 5 / 2 莫耳己二酸（Mw 146.14) 、5/3莫耳檸檬酸 (M w 192 · 13)、或5莫耳二醇酸 (Mw 76.05) 〇 利用實施例1 ( 3 )取得之醋酸含量2 . 9 %之 h Ρ Τ Η ( 1 — 3 4 )凍結乾燥品後，調製5 m g /2之 h Ρ Τ Η ( 1 — 3 4 )水溶液。 針對此 2 溶液（h Ρ Τ Η ( 1 — 3 4 ) 1 0 m g， 2.43//mol)，分別加入888//g己二酸 (2.43父5/2#111〇1) ，778//g 檸檬酸（ ΜΙΓ,----I — (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 丨· 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -55- 1293563 Α7 Β7 五、發明説明（53 ) 2· 43x 5/3//mo 1)或 924//g 二醇酸（ 2 · 4 3 X 5 // m ο 1 )。以蒸餾水調製各溶液爲胜肽濃 度爲lmg/me，進行凍結乾燥後，取得各含1 〇rng之 h P T Η ( 1 - 3 4 )凍結乾燥品。於6 〇 °C下將此等各 試料進行保存3週後，利用逆相Η P L C測定開始時純度 ，保存後純度，進行評定安定性。對照使用實施例1 ( 3 )所製作之醋酸含量2 · 9% hPTH (1— 34)凍 結乾燥品。結果如表8所示。 添加己二酸、檸檬酸、二醇酸時，其醋酸含量2·9 %之h P T Η ( 1 - 3 4 )凍結乾燥品保存後純度爲 92 · 7%’而己二酸鹽爲92 ·0%、檸檬酸鹽爲 93 _ 9%、二醇酸鹽爲90 . 3%。因此，做爲 h Ρ ΤΗ之鹽或附著物含有之醋酸與減量至化學當量以下 之h P 丁 Η醫藥用成份相同，於此加入己二酸、檸檬酸、 或二醇酸之醫藥用成份亦具有良好安定性，均顯示滿足使 用感與安定性之醫藥用成份者。 又，將做成與h Ρ Τ Η之鹽或附著物存在之醋酸取代 有機酸後減少醋酸含量後取得相同的醫藥用成份。更且， 藉由醋酸減量後取得具有良好安定性，且，用於醫藥組成 物時爲使用感良好之醫藥用成份，而，配合以改善吸收爲 目的之有機酸後，仍具有安定之配合變化之特性者。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) -訂 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -56- 1293563 五、發明説明（54 ) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 表8 . 各種有機酸對h P T Η安宙件的影響（6. _〇JC / 3週保存） 醋 酸 己二酸 檸檬酸 二醇酸 hPTH(l-34)酸含量 & 9 . 5% 2 . 9% 8 . 8% 7.7% 9 . 2% 開始時純度（％) 99 . 99 . 100 . 100 · 100 . 0% 保存後純度（％) 8% 8% 0% 0% 90 . 3% 73 . 92 . 92 . 0% 93 . 9% 2% 7% ※：酸含量=酸重量xlOO (%)/hPTH之胜 肽重量 〔試驗例7、經鼻吸收試驗〕 設計經鼻投用製劑時，針對重要因素之1的經鼻吸收 性進行討論。被確定試驗例4具良好使用感之有機酸檸檬 酸與抗壞血酸之經鼻吸收效果藉由血中藥物濃度一時間曲 線下面積（A U C )與生物有效率進行評定。 將實施例1(3)取得醋酸含量2·9%之hPTH (1 — 3 4 )凍結乾燥品溶於0 · 3 w / v %、0 · 6 w /v% 之抗壞血酸及 0 · 2w/v%、〇 · 3w/v%、 0 . 4w/v%、0 · 6w/v%之檸檬酸水溶液後，調 製5 m g /2之胜肽溶液。同樣的將實施例5 ( 4 )取得 之醋酸含量0 . 9 %之h P T Η ( 1 — 8 4 )凍結乾燥品 溶於0 . 6 w/ ν %之檸檬酸水溶液後，調製1 〇 m g / W之胜肽溶液，用於本試驗。又，做爲對照者使甩實施例 本紙ϋ度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐) 一 " " -57- (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

1293563 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 i '發明説明（55 ) 1 (3)取得之醋酸含量2 _ 9% hPTH (1-34 )凍結乾燥品與實施例5 ( 4 )取得之醋酸含量〇 · 9 % hPTH (1 - 84)凍結乾燥品溶於生理食鹽水之溶液 〇 又，於實施例1 (3)取得之醋酸含量2 · 9% h P 丁 Η ( 1 — 3 4 )凍結乾燥品之〇 · 3 w / v %、或 〇·6w/v%檸檬酸水溶液中進行調製公知做爲蛋白質 分解酵素阻礙劑之添加0 · 3w/v%甲磺醯酸camostat之 溶液，用於本試驗。 將 7 〜9 週齡 Sprague-Danley系雄鼠（G r j : C D， 曰本Charzliva )於金屬盒，溫度2 2± 5。<3，濕度3 0〜 7 0 %，明暗循環1 2小時進行飼養後，自由攝取固形飼 料與來自水。於試驗2 4小時前開始絕食供與試驗（1群 5隻）。 經鼻投用時，於戊巴比妥麻醉下，進行大腿動脈插管 後，以液量計將各試料溶液5 // 1或1 〇 // 1 (含氯化苄 烷銨、蔗糖）投入鼻腔內。由插管採血於添加凝固防止劑 與酵阻礙劑之採血管中，進行離心後取得血漿。利用抗 P T Η ( 1 — 3 4 )抗體（CHEMICON international Inc. 製）以R I A法進行測定血漿中h Ρ Τ Η ( 1 — 3 4 )及 11?丁1^(1一84)之濃度。 皮下用時，以1 4/ k g之溶量於注射器將試料溶液 投與實驗鼠背部皮下後，與經鼻投用相同方式求出血漿中 h Ρ Τ Η濃度。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

-58- 1293563 A7 _____B7_ 五、發明説明（56) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 又生物有效率係針對h P T Η ( 1 - 3 4 )投用3小 時後’且，hPTH (1 - 84)投用6小時爲止對皮下 注射A U C相互之比進行算取之。結果如表9所示。 對於皮下注射之生物有效率於hPTH (1 - 3 4) 單獨中爲1 · 4%，相對的，hPTH (1 - 34)之 0 · 3w/ v%〜〇 · 6w/v%抗壞血酸水溶液或 0·2w/v%〜〇·6w/v%檸檬酸水溶液時，分別 提昇爲5 %〜10%、12%〜19%者。 又，hPTH (1 — 84)中於 0 · 6w/v%檸檬 酸水溶液呈約3 0 %之生物有效率。 更且’加入蛋白質分解酵素之阻礙劑Camostat mesilate 溶液中於hPTH (1 — 34)顯示27%〜31%之生 物有效率。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 如此，藉由使用低濃度有機酸後，被確定呈現良好之 經鼻吸收效果。且，更藉由添加吸收促進劑，更呈現良好 之經鼻吸收效果。亦即，藉由降低做爲與h ‘ P T Η之鹽或 附著物存在之醋酸後具有取得良好安定性，且，用於醫藥 組成物時含有良好使用感之醫藥用成份的經鼻投用醫藥組 成物顯示可適於做爲經鼻藥使用者。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（21〇><297公釐） -59- 1293563 A7 B7 五、發明説明（57) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 鐲 * 褂 寸 00 1 生物有效率 (% S.C.) (100) 1.4 5.2 9.9 12.2 17.6 18.7 18.3 30.8 27.0 (100) csj AUC (pgx hr/mL) 1356.5± 503.4 93.7± 61.3 357.4± 308.3 687·3± 281·9 838·4± 407.9 1208.9± 618.6 1285.2± 572.4 1254.9± 526.1 2118.0± 860.4 1829.4± 1072.7 46833.3土 15667 _________ j 14166.7± 6833 投與經路 皮下 孅衊邀i|礒i| f| 1¾鍵鍵製製製製 經鼻 經鼻 皮下 經鼻 K Η Λ /^\ CO 1 r—1 Ε 〇) 投與量 25 β g/kg 1 125//g/kg 125//g/kg 125//g/kg 125 β g/kg 125//g/kg 125//g/kg 125//g/kg 125 "g/kg 1 1 125// g/kg 285 β g/kg 285 β g/kg 處方 ^ ITT 11 吾别 HM 氍饀 ^ _饀氍瀣趑 ^ ® Μ |M « « »: s颧域軾爨爨爨爨 g頭1彡彡豸彦彡彡 44J ^寸 〇 MH 4J I ······ ^JwOOOOOO S 2 C/2 C/3 Ο Ο S S οΰ d U U > > cn cn ο ο i έ i： 1： > > CO ν〇 Ο Ο 二輕 刮 趑 S爨 二沴 o (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 I鲁. 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -60- 1293563 A7 B7 五、發明説明（58) 〔製劑例1〕 以124·2g精製水（白局方）溶解40·5g之 精製白糖（日局方）後，調製1 5 〇^之27〜/7%精 製白水溶液。另外’將做爲醫藥用成份實施例2取得之醋 酸含量2 . 1 %凍結乾燥品（小瓶1 〇支，；[· 5 g之 hPTH (1 — 34))於約752精製水（日局方）中 進行溶解。逆相Η P L C測定之結果該溶液之h P T Η ( 1 — 34)濃度爲 20 · 4mg/m£。於 72 · 0m£ 此溶 液中加入2 5 · 94精製水後，調製濃度爲1 Smg/^ 。取得97mC此調整之1 Smg/J hPTH (1-34)溶液後，與之前調製之48.52 27w/v% 精製白糖水溶液進行混合後，取得約1 4 5 W之9 w/ v %精製白糖濃度，hPTH (1 — 34)濃度l〇mg/ W之 h P T Η ( 1 - 3 4 )水溶液。將該溶液各以3 J ί具入4 7支小瓶後’於F Ζ - 6凍結乾燥機（L a b 〇 c ο n k 〇公 司製）進行凍結乾燥後，取得1小瓶中含2 7 0 m g精製 白糖與30mg hPTH (1 — 34)之安定醫藥組成 物。 〔製劑例2〕 將40 . 5g精製白糖（日局方）溶於124 . 2g 精製水（日局方）後，調製1 5 Om£之2 7w/v%精製 白糖水溶液。另外，將做爲醫藥用成份之實施例2取得醋 酸含量2 · 1 %凍結乾燥品（5支小瓶，7 5 0 m g 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 4 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -61 - 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1293563 A7 B7五、發明説明（59) hPTH(i - 34))溶於I46me精製水（日局方） 後，取得hPTH (1 一 34)濃度5 · lmg/^之 hPTH (1 - 34)水溶液。更加入544精製水（日 局方）充份進行攪拌後’調整hPTH (1一34)濃度 3.8mg/me(2〇〇J)。混合取得之 hPTHCl 一 34)濃度3 · ^之溶液與先前調整 之2 7 w/ v %精製白水溶液1 〇 〇 J後，取得約3 0 〇 精製白糖濃度gw/v%、hPTH (1 — 34)濃度 2 · Smg/J之hPTH (1 - 34)水溶液。將該溶 液各以3 J塡入9 〇支小瓶中，於F z — 6凍結乾燥機（ Labconko公司製）進行凍結乾燥後，取得每小瓶含2 7 0 mg精製白糖與7 · 5mg之hPTH (1 — 34)安定 的醫藥組成物。 〔製劑例3〕 將22 · 甘露糖（日局方）溶於124 . 2g糖 製水（日局方）後，調製1 50J 1 5%甘露糖醇水溶 液。另外，於約7 5 2精製水（日局方）中溶解做爲醫藥 用成份之實施例2取得醋酸含量2 · 1 %之凍結乾燥品（ 10 支小瓶，1 · hPTH(l — 34))。逆相 HPLC測定之結果，該溶液之hPTH(1-34)濃 度爲20·4mg/a者。於72·02此溶液中加入 25 · 9J精製水後，調整濃度爲i5mg/r^。取97 ^£此調整之1 Smg/^ihPTH ( 1 - 3 4)水溶液 I紙張尺度適用中國國家標準（CNST^：( 210χ297公着） ' -62- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 1293563 A7 B7 五、發明説明（60 ) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) &混合先前調製之1 5%甘露糖醇水溶液4 8 . 5W之後 ’取得約1 4 52之5%甘露糖醇濃度，1 〇mg/m£ hpTH (i — 34)濃度之 hPTH (1 — 34)水溶 液。將該溶液各以3 m£塡入4 7支小瓶中，於F z — 6凍 結乾燥機（Laboconko公司製）進行凍結乾燥後，取每小瓶 含l5〇mg甘露糖醇與30mg之hPTH (1 — 34 )安定的醫藥組成物。 〔製劑例4〕 秤取8 0 5mg (粉末重量）之做爲醫藥用成份之實 施例2取得之醋酸含量2 · 1%之hPTH (1 - 34) 凍結乾燥後，溶於3 6 0 精製水（日局方）中’調成2 mg/j逆相HPLC上hPTH (1 — 34)濃度之水 溶液。另外，秤取lg之甘露糖醇（日局方）’溶於50 4精製水（日局方）中，調製甘露糖醇水溶液。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 此5 0W全量甘露糖醇水溶液與先前調製之h p TH (1 一 3 4 )水溶液（2 m g /2 ) 5 0 4進行充份混合 後，各以1 W分注於小瓶中。於F Z - 6凍結乾燥機（ Laboconko公司製）進行凍結乾燥後，取得每小瓶含1 m g 之h PTH ( 1 - 3 4)與1 Omg甘露糖醇安定的醫藥 組成物。 〔製劑例5〕 量取8 0 5mg (粉末重量）做爲醫藥用成份實施例 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -63- 1293563 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 •_B7_ __五、發明説明（61 ) 2取得之醋酸含量2 · 1%之hPTH (1 — 34)凍結 乾燥品’溶於3 6 0τη£精製水（曰局方），調製逆相 HPLC上hPTH (1 — 3 4)濃度爲2111容/^之水 溶液。量取5 g甘露糖醇（日局方），溶於5 0“精製水 (曰局方）後，調製甘露糖醇水溶液。 將此5 0J全量甘露糖醇水溶液與先前調製之5 04 h P T Η ( 1 — 3 4 )水溶液（2 m g /J )充份進行混 合後，各以1 2分注於小瓶。於F Z - 6凍結乾燥機（ Laboconko公司製）進行凍結乾燥後，取得1小瓶含1 m g 之hPTH ( 1 - 3 4)及5 Omg甘露糖醇安定的醫藥 組成物。 〔製劑例6〕 量取1 1 mg做爲醫藥用成份之實施例2取得之醋酸 含量2 · 1 % h P T Η ( 1 - 3 4 )凍結乾燥品（粉末 重量），加入注射用水（日局方）做成5 0 0 ’取得逆 相 HPLC 上，20//g/J 之 hPTH (1 — 34)水 溶液（溶液A)。將5 g精製白糖（日局方）與1〇〇 mg氯化苄乙銨溶於注射用水（日局方）’調成1〇 (溶液B )。分別以3 0 2混合溶液A與溶液B ’以1 2 分注於小瓶，於F Z - 6凍結乾燥機（Laboconko公司製） 進行凍結乾燥後，取得1小瓶含1 m g之h P T Η ( 1 — 34) 、25mg之精製白糖及〇 · 5mg之氯化爷乙銨 安定的醫藥組成物。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS )六4規& ( 210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) -64- 1293563 A7 ___ B7_ 五、發明説明（62 ) 〔製劑例7〕 量取約5 Omg (粉末重量）做爲醫藥用成份實施例 5 (2)取得之醋酸含量2 · 5%之hPTH (1 — 84 )凍結乾燥品，加入注射用（日局方）後，調製逆相 HPLC 上 2mg/J之 hPTH (1 — 84)水溶液。 另外，於2 g精製白糖（日局方）中加入注射用水（ 日局方）做成1 0 02之精製白糖水溶液。混合2 〇m£ hPTH (1 - 84)水溶液（2mg/m£)與 20J 調 製過之精製白糖水溶液（2w/v%)後，將取得溶液各 以1 J塡入3 5支小瓶後，於F Z - 6凍結乾燥機（ Laboconko公司製）進行凍結乾燥後，取得1小瓶含1 m g 之hPTH(1—34)與l〇mg精製白糖之安定的醫 藥組成物。 〔製劑例8〕 將該製劑例1〜7取得之醫藥組成物做成用時溶解型 製劑後，調製使用時添附溶解·液如下。 量取0 · 35g氯化苄烷銨（白局方），21 · Og 檸檬酸（日局方）後，溶於3 5 0 02之精製水。將此溶 液以各3 分注於聚丙烯製瓶中，作成添附溶解液。 〔製劑例9〕 將該製劑例1〜7取得之醫藥組成物做成用時溶解型 製劑後，調製使用時添附溶解液如下。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） L-L丨.------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -65- 1293563 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7______五、發明説明（63 ) 量取0 · 70g氯化苄乙銨（日局方）’ I4 _ 檸檬酸（日局方）後，溶於3 5 0 〇m£之精製水°將此溶 液各以3 W分注於聚丙烯製瓶中，作成添附溶解 '液° 〔製劑例1 0〕 將該製劑例1〜7取得之醫藥組成物做成用時溶解型 製劑後，調製使用時添附溶解如下。 量取0 · 35g氯化苄乙銨（日局方）’ 21 · Og 檸檬酸（日局方）後，溶於3 5 0 0J之精製水。將此溶 液各以3 W分注於聚丙烯製瓶中，作成添附溶解液。 〔製劑例1 1〕 將該製劑例1〜7取得之醫藥組成物做成用時溶解型 製劑後，調製使用時添附溶解如下。 量取0.7 0 g氯化十六烷吡啶鐵（日局方）’ 14 _〇g己二酸（曰局方），溶於3500W ·精製水 。將此溶液各以3 W分注於聚丙烯製瓶中，作成添附溶解 液。 〔製劑例1 2〕 將做爲醫藥用成份本發明4 ( 1 )取得醋酸含量 2 · 5 %之凍結乾燥品（6小瓶、h P T Η ( 1 — 3 4 ) 90〇mg)溶於18J之注射用水（日局方）（50 m g /2 )。另外，將1 2檸檬酸（日局方）溶於注射用 本紙張尺度適用中國國家標準（CNs ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

-66 - 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製

1293563 A7 ________ B7_五、發明説明（64 ) 水（臼局方），做成lOOn^Cl.Sw/v%檸檬酸水 溶液）。使用此調製劑液爲如下。 1 · PH3、hPTH (1 — 34) Smg/d、檸檬酸 0·6w/v%溶液之調製 混合1 . 2w/v%檸檬酸水溶液與1 . 5 〇mg/m£2 1步驟（1 一 34)水溶液後，加入 9 5/il之IN NaOH，調整pH爲3。再於此溶液 中加入注射用水做成1 2 2之溶液。將取得溶液以 〇 · 2 2 // m過濾進行過濾，取得標的醫藥組成物。 2 · pH3 · 5、hPTH (1 — 34) 5mg/me、 檸檬酸0 . 6 w/ v %溶液之調製 混合62 1 · 2w/v%檸檬酸水溶液與1 · 2m£ 50mg/J之hPTH(1-34)水溶液後，加入 210//1之IN Na〇H後，調整pH3 · 5。再於 此溶液加入注射用水後做成1 2 rnC溶液。取得溶液於 0 . 2 2過濾器進行過濾後，取得標的醫藥組成物。 3 · pH4、hPTH (1 — 34) 5mg/me、檸檬酸 0 · 6 w. / v %溶液之調製 混合1 · 2w/v%檸檬酸水溶液與1 . 22 50mg/nX之hPTH (1 - 34)水溶液相互混合 後，加入350//1之IN Na〇H後，調整pH (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -67- 1293563 Α7 Β7 五、發明説明（65 ) 4 · 〇。再於此溶液加入注射用水後做成1 2 2溶液。取 得溶液於〇·22ηπι過濾器進行過濾後，取得標的醫藥組 成物。 4·ρΗ4·5'1ιΡΤΗ(1 — 34)5mg/J、 檸檬酸Ο·4w/v%溶液之調製 將4mC 1 . 檸檬酸水溶液、0 · 24m£ 之 5〇mg/nie hPTH(l - 34)水溶液以及 52 精製水相互混合後，加入3 3 5 // 1之1 N N a〇Η後 ’調整Ρ Η爲4 · 5。再於此溶液加入注射用水後做成 1 2 J溶液。取得溶液於0 · 2 2 nm過濾器進行過濾後， 取得標的醫藥組成物。 〔產業上可利用性〕 本發明藉由降低醋酸量後，具有良好安定性，且，用 於醫藥組成物時，可取得良好使用感之醫藥用成份。 本發明醫藥用成份係爲製劑化時通常使用之載體、賦 形劑等成份，可適當配合各種其他機能性成份，被使用於 各種投用形態之醫藥組成物，且，可適用於各種劑型。 本發明係提供一種長期使用之經鼻投用醫藥組成物者 〔圖面之簡單說明〕 圖1係代表將醋酸含量9 · 5 %之h Ρ T Η ( 1〜 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 4 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -68- 1293563 A7 B7 五、發明説明（66) 3 4 )於4 Ot下保存6個月後之逆相HPL C層析法之 結果者。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 圖2係代表將含量2 · 9%醋酸之hPTH (1〜 3 4 )於4 0°C下進行保存6個月後之逆相HP L C層析 法之結果。 圖3係代表各種醋酸含量之hPTH(1〜34)於 8 0 t下保存5小時後之分解（副產）物B、C、D之生 成量。 圖4係代表各種醋酸含量之hPTH(1〜34)於 8 0 °C下保存1 5小時後之h P T Η ( 1〜3 4 )的純度 〇 圖5係將含量12 · 3%醋酸之hPT Η (1〜84 )於8 0 °C下保存1 5小時後之逆相Η P L C層析法之結 果。 圖6係代表各種醋酸含量的hPTH ( 1〜8 4 )於 8 0 °C下保存1 5小時後之分解（副產）物之生成量。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 圖7係代表各種醋酸含量之hPTH(1〜84)於 80 °C下保存1 5小時後hPTH ( 1〜84)之純度。 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公羡） -69-

Claims (1)

11 11 A8 B8 C8 D8 ^93563 六、申請專利範圍 .:L:、 第901 1 6031號專利申請案 中文申請專利範圍修正本 民國93年8月11日修正 1 . 一種使用於經鼻投與之醫藥組成物，其特徵係由 人體副甲狀腺激素胜肽或其衍生物，與對於人體副甲狀腺 激素胜肽或其衍生物而言爲未達化學當量之醋酸所成者。 2 .如申請專利範圍第1項之醫藥組成物，其中該成 份爲人體副甲狀腺激素胜肽或其衍生物與醋酸之鹽所成之 醫藥用成份者，該醋酸對於人體副甲狀腺激素胜肽或其衍 生物而言爲未達化學當量者。 3 .如申請專利範圍第1項或第2項之醫藥組成物， 其中該人體副甲狀腺激素胜肽或其衍生物爲，胺基酸號碼 1〜8 4所成之胜肽時由該胜肽與對該胜肽而言爲3重量 %以下之醋酸所成者，且，胺基酸號碼1〜3 4所成之胜‘ 肽時由該胜肽與對該胜肽而言爲6重量％以下之醋酸所成 者。 4 .如申請專利範圍第1項或第2項之醫藥組成物， 其中人體副甲狀腺激素胜肽或其衍生物爲，胺基酸號碼1 〜3 4所成之胜肽時由該胜肽與對該胜肽而言爲4重量％ 以下之醋酸所成者。 5 ·如申請專利範圍第1項或第2項之醫藥組成物， 其中該成份爲凍結乾燥組成物者。 6 ·如申請專利範圍第1項或第2項之醫藥組成物， 其可使用於骨質疏鬆症。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2l〇X297公釐） ------------ (許先閣讀嘴面之注意事項再填寫本頁) 訂 羥濟部智慧財產局員工消費合作社印製 ABCD 1293563 々、申請專利範圍 7 .如申請專利範圍第1項或第2項之醫藥組成物， 其可含於由冷凍乾燥部與添加溶解部所構成的使用於治 療骨質疏鬆症的用時溶解型製劑之冷凍乾燥部。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）