NO324882B1 - Optisk rene camptotecin analoger, optisk rent mellomprodukt, fremgangsmate for fremstilling av disse, anvendelse og farmasoytisk preparat - Google Patents

Description

OPTISK RENE ANALOGER AV CAMPTOTECIN, OPTISK RENT SYNTETISK MELLOMPRODUKT OG FREMGANGSMÅTE FOR FREMSTILLING AV DISSE

Camptotecin er en naturlig forbindelse som ble isolert for første gang fra bladene og barken av den kinesiske planten betegnet camptotheca acuminata (se Wall et al. J. Amer. Chem. Soc. 88:3888 (1966)). Camptotecin er en pentacyklisk forbindelse oppbygget av et indolizino[1,2-b]kinolinfragment kondensert med et a-hydroksylakton med seks bindinger. Karbonet i stilling 20 som bærer a-hyd-roksygruppen er asymmetrisk og gir molekylet en rotasjonsevne. Den naturlige formen av camptotecin har en absolutt "S" konfigurasjon med hensyn til karbon 20 og svarer til den følgende formel:

Camptotecin har en anti-proliferativ aktivitet i mange cancerøse cellelinjer, omfattende cellelinjene av humane tumorer i kolon, lunge og bryst (Suffness, M

et al: The Alkaloids Chemistry and Pharmacology, Bross A., red., bind 25, p. 73 (Academic Press, 1985)). Det er foreslått at den anti-proliferative aktiviteten av camptotecin er forbundet med dets hemmende aktivitet på DNA topoisomerase I.

Det har vært antydet at a-hydroksylakton var et absolutt krav for både in vivo og in vitro aktiviteten av camptotecin (Camptothecins: New Anticancer Agents, Putmesil, M et al, red., p. 27 (CRC Press, 1995); Wall M. et al, Cancer Res. 55:753 (1995); Hertzberg et al, J. Med. Chem. 32:715 (1982) og Crow et al,

J. Med. Chem. 35:4160 (1992)). Senere har søkeren perfeksjonert en ny klasse av analoger av camptothecin, hvor et B-hydroksylakton erstatter det naturlige oc-hydroksylaktonet av camptotecin (kfr. Patentsøknad WO 97/00876).

En gjenstand for foreliggende oppfinnelse er en ny fremstillingsmetode for et enantiomerisk rent syntetisk mellomprodukt, så vel som nye enantiomerisk rene analoger av camptotecin.

For det første er en gjenstand for foreliggende oppfinnelse derfor nye analoger av camptotecin som er forskjellige fra hvilke som helst kjente forbindelser, kjennetegnet ved at de har formelen (II) representert nedenfor

eller ved at det er saltene av forbindelsen med formel (II) så som for eksempel det med formel (III) representert nedenfor Et nøkkel-mellomprodukt i syntesen av denne typen av optisk rene forbindelser er et produkt med den generelle formel M representert nedenfor

hvor R representerer en lineær eller forgrenet alkylrest inneholdende fra 1 til 10 karbonatomer. Fortrinnsvis, representerer R en etylrest.

Forbindelsen med formel (II) kan fremstilles på følgende måte:

- forbindelsen med formel

kobles med én forbindelse med formel N2 representert nedenfor: for å fremstille forbindelsen med formel O2: - ringslutningen av forbindelse 02 gir forbindelsen med formel (II), som, etter saltdannelse, kan gi forbindelsen med formel (III).

Dannelsen av forbindelse O2 ved å starte fra forbindelsen med den generelle formel M hvori R representerer en etylrest og N2 blir utført med en behandling kjent for fagfolk på området under navnet Mitsunobu's reaksjon (se Mitsunobu, O. et al. Synthesis, p,1 (1981)). Hydroksylfunksjonen av forbindelse N er erstattet med en nukleofil, så som forbindelse M eller et deprotonert derivat av den sistnevnte, ved en behandling med et fosfin, for eksempel trifenylfosfin og et azodikarboksylatderivat, for eksempel dietyl eller diisopropyl-azodikarboksylat, i et aprotisk oppløsningsmiddel så som, for eksempel tetrahydrofuran eller N, N-dimetylformamid. Ringslutningen av forbindelse O2 for å fremstille forbindelsen med formel (II) blir fortrinnsvis utført i nærvær av en palladium- katalysator (for eksempel palladiumdiacetat) under basiske betingelser (tilveiebrakt for eksempel ved et alkalisk acetat eventuelt kombinert med et faseoverføringsmiddel, så som, for eksempel tetrabutylammoniumbromid), i et aprotisk oppløsningsmiddel så som acetonitril eller A/,A/-dimetylformamid, ved en temperatur mellom 50° C og 120° C (R. Grigg et al., Tetrahedron 46, side 4003 (1990)).

Oppfinnelsen tilveiebringer også en forbindelse med den generelle formel M som definert tidligere. Dette produktet kan anvendes for fremstilling av medikamenter.

Forbindelsen med formel M blir syntetisert i henhold til en ny fremgangsmåte som utgjør del av foreliggende oppfinnelse og omfatter de følgende suksessive trinnene:

- den racemiske f-butylesteren representert nedenfor

(for dens fremstilling se spesielt patentsøknad WO 97/00876) blir behandlet med trifluoreddiksyre i 18 timer ved omgivelsestemperatur for å fremstille den tilsvarende karboksylsyren; - kinidinsaltet av 3-(3-benzyloksymetyl-2-metoksy-4-pyridyl)-3-hydroksy-pentan-syre blir oppvarmet i isopropylalkohol ved en temperatur høyere enn 30 °C og fortrinnsvis ved ca. 50 °C, før reaksjonsmediet hensettes for å avkjøles til omgivelsestemperatur, slik at saltet av (+) enantiomeren av 3-(3-benzyloksymetyl-2-metoksy-4-pyridyl)-3-hydroksy-pentansyre krystalliserer mens saltet av (-) isomeren, hvis anionet er representert nedenfor, forblir i løsning - løsningen i isopropylalkohol av saltet av (-) enantiomeren av 3-(3-benzyloksy-metyl-2-metoksy-4-pyridyl)-3-hydroksy-pentansyre blir konsentrert og behandlet med saltsyre og om rørt, idet forbindelsen med formel A' representert nedenfor fremstilles - forbindelsen A<1> blir deretter bragt i kontakt med palladium på fuktig karbon, deretter blir ammoniumformiat eller maursyre satt til blandingen for å fremstille det debenzylerte produkt B<1> representert nedenfor - deretter blir forbindelsen med formel B<1> ringsluttet ved virkningen av dicykloheksylkarbodiimid for å oppnå den laktoniske forbindelse med formel C representert nedenfor - til slutt blir -OCH3 gruppen av den laktoniske forbindelsen med formel C omdannet til karbonyl, ved virkningen av natriumjodid og trimetylsilylklorid, for å oppnå (+)-5-etyl-5-hydroksy-1,3,4,5,8,9-heksahydrooxepino[3,4-c]pyridin-3)9-dion (eller (+)-EHHOPD) representert nedenfor.

Forbindelsen med formel N2 kan oppnås i henhold til den følgende fremgangsmåten: anilinet med formel P2 representert nedenfor blir orto-acylert ved omsetning med kloracetonitril i nærvær av bortriklorid og en annen Lewis-syre, så som aluminiumtriklorid, titantetraklorid eller dietylaluminiumklorid i et aprotisk oppløsningsmiddel eller en blanding av aprotiske oppløsnings-midler, fulgt av hydrolyse ( cf. Sugasawa T. et al. J. Am. Chem. Soc. 100 p,4842

(1978)). Mellomproduktet oppnådd på denne måten blir deretter behandlet med etylmalonylklorid i et aprotisk oppløsningsmiddel, så som acetonitril, i nærvær av en base, så som trietylamin, deretter behandlet med et alkalisk alkoholat, for eksempel natriummetylat i metanol, for å fremstille etyl 7-klor-4-klormetyl-6-metyl-2-okso-1,2-dihydro-3-kinolinkarboksylat. Den sistnevnte blir omdannet til etyl 2,7-diklor-4-klormetyl-6-metyl-3-kinolinkarboksylat ved behandling med fosforyloksy-klorid. Deretter utføres nukleofil substitusjon ved behandling med 4-metylpiperidin. Etylkarboksylatfunksjonen blir deretter redusert med diisobutylaluminiumhydrid i et aprotisk oppløsningsmiddel, så som diklormetan, for å fremstille forbindelsen med formel tø. Rekkefølgen de to siste trinnene utføres i kan reverseres.

Analoger av mellomproduktforbindelsen av N2 type er beskrevet i litteraturen og spesielt i søknaden PCT 95/05427.

Forbindelsen med formel (II) kan omdannes til farmasøytisk godtagbare salter i henhold til vanlige metoder. Godtagbare salter omfatter, eksempelvis og på ikke-begrensende måte, addisjonssaltene med uorganiske syrer så som hydro-klorid, sulfat, fosfat, difosfat, hydrobromid og nitrat eller med organiske syrer så som acetat, maleat, fumarat, tartrat, succinat, citrat, laktat, metansulfonat, p-toluensulfonat, pamoat, salicylat, oksalat og stearat. For andre eksempler på farmasøytisk godtagbare salter vises det til "Pharmaceutical Salts", J. Pharm. Sei. 66:1 (1977).

Forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse har nyttige farmakologiske egenskaper. Således har forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse en hem-stand antyder at forbindelsene ifølge oppfinnelsen har en anti-parasitisk og/eller anti-viral aktivitet. På denne måten kan forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse anvendes i forskjellig terapeutiske anvendelser.

En illustrasjon av de farmakologiske egenskapene av forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse vil bli funnet nedenfor i den eksperimentelle delen. Forbindelsene kan hemme topoisomerase, for eksempel av type I og II, hos en pasient, for eksempel et pattedyr så som et menneske, ved administrering til denne pasienten av en terapeutisk effektiv mengde av en forbindelse med formel (II) eller av et farmasøytisk godtagbart salt av en forbindelse med formel (II) eller også av hvilken som helst blanding av sistnevnte forbindelser.

Forbindelsene ifølge oppfinnelsen har en anti-tumor aktivitet. De kan anvendes for behandling av tumorer, for eksempel tumorer som uttrykker en topoisomerase, hos en pasient ved administrering til nevnte pasient av en terapeutisk effektiv mengde av en forbindelse med formel (II) eller av et farmasøytisk godtagbart salt av en forbindelse med formel (II) eller også av hvilken som helst blanding av sistnevnte forbindelser. Eksempler på tumorer eller kreft omfatter kreft i spiserøret, maven, tarmene, rektum, munnhulen, svelget, strupehodet, lungene, tarmen, brystet, livmorhalsen, corpus endometrium, eggstokkene, prostata, testiklene, blæren, nyrene, leveren, bukspyttkjertelen, ben, bindevevet, huden, øyet, hjernen og sentralnervesystemet, så vel som kreft i skjoldbruskkjertelen, leukemi, 1-lodgkin's sykdom, lymfomer forskjellige fra de beslektet med Hodgkin, multiple myelomer og andre.

De kan også anvendes for behandling av parasittiske infeksjoner ved hemning av hemoflagellatene (for eksempel i trypanose eller leishmaniasis infeksjoner) eller ved hemning av plasmodia (så som for eksempel i malaria), men også for behandlingen av virale infeksjoner og sykdommer.

Disse egenskaper gjør produktet med formel (II) egnet for farmasøytiske anvendelser. En gjenstand for foreliggende oppfinnelse er også, som medikamenter, produktet med formel(ll) som definert ovenfor, så vel som addisjonssaltene med farmasøytisk godtagbare mineralsyrer eller organiske syrer av produktet med formel (II), så som for eksempel saltet av formel (III) beskrevet tidligere eller også av hvilken som helst blanding av sistnevnte forbindelser. Tilsvarende angår oppfinnelsen de farmasøytiske preparatene inneholdende minst ett av medikamentene som definert ovenfor som aktiv bestanddel.

Følgelig angår oppfinnelsen farmasøytiske preparater inneholdende en forbindelse ifølge oppfinnelsen eller et addisjonssalt med en farmasøytisk godtagbar syre av dette, i kombinasjon med en farmasøytisk godtagbar bærer i henhold til den valgte administreringsmetode (for eksempel oral, intravenøs, intraperiton-eal, intramuskulær, transdermisk eller subkutan). Det farmasøytiske preparatet (for eksempel terapeutisk) kan foreligge i form av et faststoff, væske, liposom eller lipidisk micelle.

Det farmasøytiske preparatet kan foreligge i fast form, så som for eksempel pulvere, piller, granuler, tabletter, liposomer, gelatinkapsler eller suppositorier. Pillen, tabletten eller gelatinkapselen kan være dekket med en substans som kan beskytte preparatet mot virkningen av magesyre eller enzymer i maven av objektet i en tilstrekkelig tidsperiode til å tillate preparatet å passere i en ikke-nedbrutt form i tynntarmen av den sistnevnte. Forbindelsen kan også administreres lokalt, for eksempel ved samme lokalisering som tumoren. Forbindelsen kan også administreres i henhold til en forsinket frigjøringsprosess (for eksempel et forsinket frigjøringspreparat eller en infusjonspumpe). Den passende faststoffbæreren kan for eksempel være kalsiumfosfat, magnesiumstearat, magnesiumkarbonat, talk, sukkere, laktose, dekstrin, stivelse, gelatin, cellulose, metylcellulose, natrium-karboksymetylcellulose, polyvinylpyrrolidin og voks. De farmasøytiske preparatene inneholdende en forbindelse ifølge oppfinnelsen kan også foreligge i væskeform så som, for eksempel løsninger, emulsjoner, suspensjoner eller en formulering med forsinket frigivelse. Egnede væskebærere kan for eksempel være vann, organiske oppløsningsmidler så som glyserol eller glykoler så som polyetylenglykol, tilsvarende deres blandinger, i varierte andeler, i vann.

En gjenstand for foreliggende oppfinnelse er også anvendelse av produktet med formel (II) som definert ovenfor eller addisjonssalter derav med farmasøytisk godtagbare mineralsyrer eller organiske syrer av et produkt med formel (II), så som for eksempel saltet av formel (III) beskrevet tidligere eller også en blanding av sistnevnte forbindelser, for fremstilling av medikamenter som er ment å hemme topoisomerase, og mer spesielt topoisomeraser av type I eller type II, medikamenter ment for behandling av tumorer, medikamenter ment for behandling av parasittiske infeksjoner, så vel som medikamenter ment for behandling av virale infeksjoner eller -sykdommer.

Dosen av en forbindelse ifølge foreliggende oppfinnelse som forutses for behandling av sykdommene eller lidelsene nevnt ovenfor, varierer i henhold til administreringsmetoden, alderen og kroppsvekt av objektet som skal behandles så vel som tilstanden av den sistnevnte og den fastsettes av den behandlende lege eller veterinær. En slik mengde bestemt av den behandlende lege eller veterinær betegnes her «terapeutisk effektiv mengde».

Hvis ikke definert på annen måte har alle de tekniske og vitenskapelige betegnelsene som her er anvendt den samme betydning som vanligvis anvendes av spesialister innen det fagfeltet som oppfinnelsen tilhører.

De følgende eksempler er presentert for å illustrere de ovenfor omtalte fremgangsmåtene og utgjør ingen begrensning av omfanget av foreliggende oppfinnelse.

EKSPERIMENTELL DEL:

Eksempel 1 : (+)- 5- etyl- 5- hydroksy- 1, 3, 4, 5, 8, 9- heksahydrooksepino[ 3, 4-c] pyridin- 3, 9- dion [(+)- EHHOPD] 1 .a. Kinidinsalt av 3-(3-benzyloksymetyl-2-metoksy-4-pyridyl)-3-hydroksy-pentansyre: Tertiobutyl 3-(3-benzyloksymetyl-2-metoksy-4-pyridyl)-3-hydroksy-penta-noat (40 g; 100 mmol) blir behandlet med trifluoreddiksyre (150 ml) og reaksjonsmediet blir om rørt i 18 timer ved 20°C. Etter inndampning av trifluoreddiksyren, blir metylenklorid (200 ml) hellet i og en mettet løsning av natriumbikarbonat blir innført inntil pH = 7,5-8. Etter dekantering, blir den vandige fasen vasket med 100 ml metylenklorid. pH i den vandige fasen blir deretter regulert til 1 ved tilsetning av en oppløsning av 6N saltsyre. Produktet blir deretter ekstrahert fra den vandige fasen med metylenklorid (2 ganger 200 ml). Løsningen blir tørket over magnesiumsulfat og konsentrert. 3-(3-benzyloksymetyl-2-metoksy-4-pyridyl)-3-hydroksy-pentansyren (31,1 g; 90 mmol) således oppnådd, opptatt i isopropylalkohol (30 ml), blir behandlet med en oppløsning av kinidin (29,2 g; 90 mmol)

i isopropylalkohol (30 ml) ved 50°C under agitering inntil fullstendig oppløsning. Deretter hensettes reaksjonsmediet slik at temperatur reduseres til 40°C, agiter-ingen blir stanset og temperaturen tillates å falle til 20°C. Mediet tas til 0°C uten agitering, holdes deretter ved denne temperatur i 16 timer. Deretter får temperaturen stige til 20°C og agitering blir utført inntil krystallisering. Mediet blir fortynnet

med isopropylalkohol og deretter filtrert. Fellingen skylles med isopropylalkohol. Saltet av (+) enantiomeren utfelles (m=26,6 g) mens saltet av (-) enantiomeren forblir i løsning i isopropylalkoholen. Således blir filtratet gjenvunnet og blir konsentrert for å fremstille en olje (34 g) som blir anvendt uten ytterligere rensing i det følgende trinn.

Produktene analyseres ved HPLC på en 5u CHIRAL AGP kolonne (10 cm x 4mm) elueres med en 30/920/50 isopropylalkohol/vann/fosfat bufferblanding, pH = 6,5, ved en strømningshastighet på 1,2 ml/min, UV deteksjon ved 280 nm. De oppnådde retensjonstidene er 6,4 minutter for (-) enantiomeren og 2,8 minutter for (+) enantiomeren. (-) Enantiomer / (+) enantiomer forholdet er 83/17. 1.b. (-)-3-(3-benzyloksymetyl-2-metoksy-4-pyridyl)-3-hydroksy-pentansyre Løsningen i isopropylalkohol av kinidinsaltet av (-) enantiomeren av 3-(3-benzyl-oksymetyl-2-metoksy-4-pyridyl)-3-hydroksy-pentansyre (trinn 1 .a) blir konsentrert. Konsentratet blir tatt opp i 270 ml metylenklorid og 270 ml av en 1N løsning av saltsyre. Reaksjonsmediet blir omrørt i 16 timer ved 20°C. Etter dekantering blir den organiske fasen konsentrert, konsentratet blir tatt opp i metanol for å anvendes i det følgende trinn.

13,5 g produkt (utbytte of 87%) og et (-)enantiomer (+) enantiomer forhold på 85/15 blir oppnådd.

HPLC retensjonstidene (samme fremgangsmåte som i 1 .a.) er:

- (-) enantiomer: 6,4 minutter

- (+) enantiomer: 2,8 minutter

1 .c. (+)-5-etyl-5-hydroksy-1,3,4,5,8,9-heksahydrooksepino[3,4-c] pyridin-3,9-dion;

(-)-3-(3-benzyloksymetyl-2-metoksy-4-pyridyl)-3-hydroksy-pentansyre

(13,5 g; 39 mmol; trinn 1 .b) bringes i løsning i 87 ml metanol. Denne løsningen blir hellet under nitrogen på 10% palladium på fuktig karbon ved 50% (27,7 g; 13m mol). Reaksjonsmediet blir omrørt i 5 minutter, deretter blir det hellet i en oppløs-ning av ammoniumformiat (11,5 g; 183 mmol) i 135 ml metanol. Reaksjonsmediet blir omrørt i 30 minutter mens temperaturen tillates å stige, deretter blir det oppvarmet ved 40°C i 30 minutter. Mediet blir deretter filtrert på et sjikt av Clarcel fulgt av konsentrering. 40 ml toluen blir hellet inn og blir avdampet; denne operasjonen

blir gjentatt for å eliminere metanolen. Det derved oppnådde residuet blir tatt opp i 45 ml THF. Deretter blir en oppløsning av dicykloheksylkarbodiimid (7,180 g; 34,5 mmol) i 20 ml THF hellet i. Reaksjonsmediet blir oppvarmet til 50°C i 1 time. Blandingen bringes til 20°C hvoretter dicykloheksylurea blir filtrert. Filtratet blir konsentrert til tørrhet. Residuet bringes i løsning i 46 ml acetonitril, 6,0 g (40,5 mmol.) natriumjodid og deretter 5,13 ml (40,5 mmol) trimetylsilylklorid blir tilsatt. Reaksjonsmediet blir holdt under agitering ved omgivelsestemperatur i 5 timer. Deretter blir 28 ml acetonitril og 5,6 ml vann tilsatt. Fellingen oppnådd blir filtrert, deretter tatt opp i 1 ml vann og pH reguleres til 7,5 ved tilsetning av en oppløsning av ammoniumhydroksid. Det faste stoffet oppnådd blir filtrert og tørket, m = 4,2 g sluttprodukt blir oppnådd i et utbytte på 34 % og et (+) enantiomer / (-) enantiomer forhold på 88,4/11,6.

HPLC analyse blir utført på en Chiralcel OD kolonne 25 cm x 4,6 mm, eluerings-midlet anvendt er heptan 600 og etanol 400, strømningshastigheten er 1 ml/min 210 nm. Den oppnådde retensjonstiden er: - (-) enantiomer: 7,1 minutter - (+) enantiomer: 9 minutter. Produktet blir tatt opp i aceton (40 ml), deretter blir vann (150 ml) tilsatt. Reaksjonen etterlates for å utfelles og 3 g produkt blir oppnådd med et (+) enantiomer / (-) enantiomer forhold på 99,4/11,6.

NMR <1>H (250 MHz, DMSO D6): 0,8 (f, 3H, CH3-CH2); 1,65 (m, 2H, CH2-CH3); 3,00-3,35 ( q, 1H+1H, -CH2-C=0); 5,3 ( q, 2H, CH2-O); 5,7 (s, -OH); 6,35 (o*. aromatisk 1H); 7,3 (d, aromatisk 1H); 11,7 (s, N-H).

Eksempel 2: (+) 1-[ 9- klor- 5- etyl- 5- hydroksy- 10- metyl- 3, 15- diokso- 4, 5, 13, 15-tetrahydro- 1H, 3H- oksepino[ 3', 4' :6J] indolizino[ 1, 2- b] kinolifr metyl- heksahydropyridiniumklorid

2.a. 1 -(2-amino-4-klor-5-metylfenyl)-2-klor-etanon:

3-klor-4-metylanilin (44,4 ml; 0,366 mol) i 1,2-dikloretan (440 ml), under en argonatmosfære, blir avkjølt i et isbad. Følgende blir tilsatt dråpevis og i følgende rekkefølge i blandingen: bortriklorid (1M i heptan; 400 ml; 0,4 mol), kloracetonitril (28 ml; 0,44 mol) og dietylaluminiumklorid (1M i heptan; 400 ml; 0,4 mol). Under tilsetningen holdes temperaturen under 20j C. Den resulterende blanding blir deretter oppvarmet ved tilbakeløp i 3 timer, deretter avkjølt til 10j C. Hydrolyse av reaksjonsmediet blir deretter utført forsiktig ved anvendelse av 2N saltsyre (240

ml) og det blir oppvarmet ved tilbakeløp i 1 time. Vann (1 I) og etylacetat (1 I) blir tilsatt, blandingen oppnådd blir omrørt i 15 minutter før separering av fasene. Den vandige fasen blir igjen ekstrahert med etylacetat (200 ml) og de samlede organiske faser blir vasket med vann (500 ml). Etter tørking over magnesiumsulfat blir den organiske fasen konsentrert. Residuet blir tatt opp i petroleter (fraksjon som har et kokepunkt på 45 til 60°C; 150 ml) og den således oppnådde blandingen hensettes i 16 timer ved 4°C. Det resulterende utfelte stoff blir oppsamlet ved filtrering, vasket med petroleter og tørket under redusert trykk for å fremstille produktet i overskriften (°C 25 g; 31 % utbytte). Sm.p. 129-130°C.

NMR <1>H (DMSO): 2,20 (s, 3H); 4,98 (s, 2H); 6,90 (s, 1H); 7,15 (bred topp, 2H); 7,70 (s, 1H).

IR(KBr): 871, 1018, 1183, 1225, 1270, 1533, 1577, 1619,1662 cm"1. 2.b. Etyl 7-klor-4-klormetyl-6-metyl-2-okso-1,2-dihydro-3-kinolinkarboksylat: Produktet fra trinn 3.a (25 g; 0,11 mol) og trietylamin (30,6 ml; 0,22 mol) blir blandet sammen i acetonitril (520 ml). Etylmalonylklorid (28,1 ml; 0,22 mol) blir tilsatt ved omgivelsestemperatur og under en argonatmosfære. Blandingen oppnådd blir omrørt i 3 timer. Natriumetanolat (fremstilt ved oppløsning av 3 g, dvs. 0,13 mol, natrium i 140 ml absolutt etanol) blir deretter tilsatt dråpevis og den resulterende blanding blir omrørt ved omgivelsestemperatur i 16 timer. Fellingen blir oppsamlet ved filtrering, vasket suksessivt med etanol, vann, etanol og eter. Den blir deretter tørket under redusert trykk ved 70°C over fosforpentoksid for å fremstille produktet i overskriften (28,6 g; 83 % utbytte) i form av et hvitaktig pulver.

NMR <1>H (DMSO): 1,30 (t, 3H); 2,40 (s, 3H); 4,35 (q, 2H); 4,85 (s, 2H);

7,41 (s, 1H); 7,91 (s, 1H); 12,15 (bred topp, 1H).

IR (KBr): 879, 1108, 1250, 1288, 1483, 1664, 1721 cm"<1>.

2.c. Etyl 2,7-diklor-4-klormetyl-6-metyl-3-kinolinkarboksylat:

Produktet fra trinn 3.b (28,4 g; 90 mmol) blir oppvarmet i 4 timer ved til-bakeløp i fosforoksyklorid (400 ml). Blandingen oppnådd blir konsentrert under redusert trykk (20 mm Hg) ved 80°C. Residuet blir tatt opp i diisopropyleter (400 ml). Det resulterende, utfelte stoff blir oppsamlet ved filtrering, vasket med eter og petroleter, deretter tørket under redusert trykk for å fremstille produktet i overskriften (25,4 g; 85 % utbytte) i form av et hvitaktig pulver (Sm.p. 126-127°C). NMR <1>H (DMSO): 1,37 (t, 3H); 2,58 (s, 3H); 4,49 (q, 2H); 5,14 (s, 2H);

8,16 (s, 1H); 8,35 (s, 1H).

IR (KBr): 874, 1006, 1163, 1243, 1278, 1577, 1723 cm"<1>.

2.d. 2,7-diklor-4-klormetyl-6-metyl-3-klnolylmetanol:

Produktet fra trinn 3.c (25,2 g; 76,5 mmol) blir blandet under en argonatmosfære med dikloretan (630 ml). Diisobutylaluminiumhydrid (1M i diklormetan; 307 ml; 307 mmol) blir tilsatt dråpevis mens reaksjonsblandingen blir omrørt og temperaturen blir holdt under 20°C. Reaksjonsblandingen blir deretter omrørt ved omgivelsestemperatur i 3 timer, deretter hellet i en vandig løsning av kaliumtartrat (konsentrert til 20 % etter vekt; 1,51). Den derved oppnådde emulsjonen blir om-rørt kraftig i 1 time, filtrert på celit og de to fasene blir deretter separert. Den vandige fasen blir ekstrahert med etylacetat (200 ml) og de samlede organiske faser blir vasket med en vandig løsning av natriumklorid (konsentrert til 20 % etter vekt; 500 ml). Den oppnådde organiske fasen blir tørket over magnesiumsulfat, filtrert og konsentrert under redusert trykk. Residuet blir tatt opp i dietyleter (50 ml) og det resulterende, utfelte stoffet blir oppsamlet ved filtrering. Ved tørking under redusert trykk oppnås produktet i overskriften (18,3 g; 93 % utbytte) i form av et hvitaktig pulver (Sm.p. 169-170°C).

NMR <1>H (DMSO): 2,57 (t, 3H); 4,84 (s, 2H); 5,36 (s, 2H); 8,06 (s, 1H);

8,27 (s, 1H).

IR (KBr): 870, 1022, 1102,1304,1482, 1567 cm"<1>.

2.e. 2,7-diklor-6-metyl-4-(4-metylpiperidinometyl)-3-kinolylmetanol:

En løsning av produktet fra trinn 3.d (16,2 g; 55,7 mmol) i THF (70 ml) blir behandlet med en oppløsning av 4-metylpiperidin (23 ml; 195 mmol). Blandingen oppnådd blir omrørt ved omgivelsestemperatur i 2 timer. Vann (200 ml) og dikloretan (200 ml) blir tilsatt. Den organiske fasen blir vasket med en vandig løsning av natriumklorid (konsentrert til 20 % etter vekt; 100 ml), tørket over magnesiumsulfat og konsentrert under redusert trykk. Ved krystallisering av residuet fra dietyleter oppnås produktet i overskriften (18,3 g; 93 % utbytte) i form av et hvitt krystallinsk faststoff (Sm.p. 170-171,5°C).

NMR <1>H (CDCI3): 0,88 (d, 3H); 1,17 (m, 2H); 1,42 (m, 1H); 1,60 (m, 2H);

2,19 (t, 2H); 2,56 (s, 3H); 2,82 (d, 2H); 4,02 (s, 2H); 4,93 (s, 2H); 6,36 (bred topp, 1H); 7,95 (s, 1H); 8,02 (s, 1H).

IR (KBr): 971, 1013, 1105, 1293, 1479, 1559cm"<1>. 2.f. (+)-8-[2,7-diklor-6-metyl-4-(4-metylpiperidinometyl)-3-kinolylmetyl]-5-etyl-5-hydroksy-1,3,4,5,8,9-heksahydrooksepino[3,4-c]pydidin-3,9-dion: En suspensjon av (+)-EHHOPD (oppnådd i trinn 1 .a; 1,56 g; 7,0 mmol) i vannfri dioksan (70 ml) blir behandlet suksessivt, under en argonatmosfære, med produktet fra trinn 3.e (2,47 g; 7,0 mmol), trifenylfosfin (2,02 g; 7,7 mmol) og diisopropyl-azodikarboksylat (1,07 ml; 10,5 mmol). Blandingen blir omrørt ved omgivelsestemperatur i 16 timer. De flyktige substansene blir deretter avdampet under redusert trykk. Residuet blir renset ved kromatografi på en silikakolonne (elueringsmiddel: etylacetat). Det faste stoffet oppnådd blir tatt opp i dietyleter, filtrert og tørket for å fremstille produktet i overskriften (1,96 g; 50 % utbytte) i form av et hvitaktig faststoff (Sm.p. 182°C). NMR <1>H (DMSO): 0,89 (m, 8H); 1,23 (m, 1H); 1,41 (t, 2H); 1,64 (m, 2H); 2,09 (q, 2H); 2,59 (m, 5H); 3,15 (dd, 2H); 4,06 (dd, 2H); 5,31 (dd, 2H); 5,35 (dd, 2H); 5,75 (s, 1H); 6,29 (d, 1H); 7,17 (d, 1H); 8,06 (s, 1H); 8,46 (s, 1H). IR (KBr): 878, 1053, 1275, 1474,1572, 1648, 1747 cm"<1>. 2.g. (+)-9-klor-5-etyl-5-hydroksy-10-metyl-12-(4-metylpiperidinometyl)-4,5,13,15-tetrahydro-1 H,3H-oksepino[3',4':6,7]indolizino[1,2-c]kinolin-3,15-dion: En blanding av produktet fra trinn 3.f (3,80 g; 6,80 mmol), tetrabutylammoniumbromid (2,42 g; 7,5 mmol), kaliumacetat (1,00 g; 10,2 mmol), trifenylfosfin (890 mg; 3,4 mmol) og palladium (II) acetat (220 mg; 0,68 mmol) blir omrørt under en argonatmosfære i vannfritt acetonitril (85 mg) ved tilbakeløp i 24 timer. Etter avkjøling til omgivelsestemperatur blir det resulterende, utfelte stoffet oppsamlet ved filtrering og vasket suksessivt med acetonitril, vann, aceton og dietyleter for,

etter tørking under redusert trykk, å fremstille produktet i overskriften (2,5 g; 70 % utbytte) i form av et hvitaktig pulver.

NMR <1>H (DMSO): 0,86 (m, 6H); 1,12 (q, 2H); 1,36 (m, 1H); 1,56 (d, 2H);

1,84 (q, 2H); 2,12 (t, 2H); 2,56 (s, 3H); 2,83 (dd, 2H); 3,26 (dd, 2H); 4,03 (dd, 2H); 5,28 (dd, 2H); 5,45 (dd, 2H); 6,04 (s, 1H); 7,34 (s, 1H); 8,14 (s, 1H); 8,38 (s, 1H). IR (KBr): 870, 1058, 1208, 1280,1477, 1593, 1655, 1749 cm"<1.>

2.h. (+) 1 -[(5R)-9-klor-5-etyl-5-hydroksy-10-metyl-3,15-diokso-4,5,13,15-tetrahydro-1 H,3H-oksepino[3',4':6,7]indolizino[1,2-c]kinolin-12-ylmetyl]-4-metyl-heksahydropyridiniumklorid: En blanding av produktet fra trinn 3.g (2,3 g; 7,7 mmol) og absolutt etanol (300 ml) underkastes ultralyd i 2 minutter. Den oppnådde melkeaktige suspen-sjonen blir omrørt og behandlet med saltsyre (1N løsning; 13,2 ml; 13,2 mmol) for å fremstille en lyst gult løsning som, ved henstand, danner et gel-lignende presipi-tat. Fellingen blir oppsamlet ved filtrering på en Buchner og vasket suksessivt med etanol og eter, deretter tørket under redusert trykk for å fremstille produktet i overskriften (2,1 g; 85 % utbytte).

NMR <1>H (DMSO): 0,87 (m, 6H); 1,59 (m, 5H); 1,84 (q, 2H); 2,64 (s, 3H); 3,28 (dd, 2H); 3,45 (s, 2H); 4,93 (s, 2H); 5,47 (dd, 2H); 5,61 (s, 2H); 6,04 (bred topp, 1H); 7,41 (s, 1H); 8,28 (s, 1H); 8,63 (s, 1H); 10,30 (bred topp, 1H).

IR (KBr): 1043, 1212, 1479, 1585, 1655, 1751 cm"<1>.

FARMAKOLOGISK UNDERSØKELSE AV PRODUKTENE IFØLGE FORELIGGENDE OPPFINNELSE

Test av celleproliferasjon.

Fem tumorcellelinjer blir anvendt i denne undersøkelsen: SW620 (human kolon adenokarsinom), OVCAR-5 (human eggstokk adenokarsinom), PC-3 og DU 145 (cellelinje av human prostata) og NCI-H69 (human lunge adenokarsinom). Disse linjene blir oppnådd fra NCI/Frederick Cancer Research and Development Center (Frederick, MD). De blir dyrket i fullstendig medium inneholdende RMPI-1640 medium anriket med 10 % av føtalt kalveserum og 2 mM L-Glutamin. De blir inkubert ved 37°C i en fuktet atmosfære med 5 % av C02. De adherente cellene løsnes ved en behandling med en løsning med 0,25 % trypsin og 0,2% EDTA

(Worthington Biochemical Corp., Freehold, NJ) i 5 minutter ved 37°C. Telling av cellene blir utført ved anvendelse av en Coulter Z1 counter (Coulter Corp., Hialeah, FL). Levedyktigheten evalueres ved farging av cellene med propidium-jodid, deretter telles de med et EPICS Elite flow cytometer (Coulter).

Forbindelsen ifølge Eksempel 2 som skal testes blir oppløst ved 5 mM i en oppløsning av N,N-dimetylacetamin (DMA, Aldrich). Påfølgende fortynninger blir utført med dyrkningsmedium. De testede endelige molare konsentrasjonene er: 1,10-6, 2,10-7, 4,10-8, 8,10-9, 1,6,10-9, 3,2,10-1<0>, 6,4,10-<11>, 1,28,10-<11>, 2,56,10-<12> og 5,12,10"<13>. Hver konsentrasjon blir testet på åtte brønner. Undersøkelse av innvirkningen på av DMA blir utført på alle cellelinjene. Resultatet av disse undersøkelsene er at ved maksimal konsentrasjon anvendt (0,02 %) har DMA ingen effekt. Doksorubicin i konsentrasjoner på 1,10-<7> M og 2,10"<7> M blir anvendt som en positiv kontroll.

Cellene sås ved 5,10<3> celler pr. brønn på en mikroplate med 96 brønner (Costar Corporation, Cambridge, MA). Cellene blir inkubert i 24 timer ved 37°C for å tillate en gjentagelse av celleforøkelsen. Forbindelsen ifølge Eksempler 2 og 3 som skal testes blir deretter tilsatt ved konsentrasjonene angitt ovenfor og cellene blir inkubert ved 37°C i en fuktet atmosfære med 5 % CO2, i 3 dager for de adherente cellene (SW620, OVCAR-5, PC-3 og DU 145) og i 5 dager for cellene i suspensjon (NCI-H69).

De adherente cellene blir testet ved SRB metoden (beskrevet av L.V. Rubenstein, R.H. Shoemaker, K.D. Pauli, R.M. Simon, S. Tosini, P. Skehan, D.A Scudiero, A. Monks og M.R. Boyd "Comparison of in vitro anticancer-drug-screen-ing data generated with tetrazolium assay versus a protein assay against a diverse panel of human tumor cell lines", J. Nat. Cancer Inst, 82:1113-1118,1990). Etter inkubering i 3 dager elimineres supernatanten og 200 ul RPMI-1640 fritt for føtalt kalveserum blir tilsatt. Cellene fikseres ved tilsetning av 50 ul 50% trikloreddiksyre (endelig konsentrasjon av trikloreddiksyre 10 %) og inkubert ved 4°C i 1 time.

Brønnene blir vasket 5 ganger med vann, deretter merket med 50 pl av en løsning med 0,4 % sulforodamin B (SRB, Sigma) i eddiksyre ved 1 % ved omgivelsestemperatur i 10 minutter. Fargen solubiliseres med 100 pl av TRIS buffer ved 10 mM, pH 10, i ca. 5 minutter under agitering, mikroplatene avleses ved anvendelse av spektrofotometri ved 570 nm.

Cellene i suspensjon blir testet ved XTT metoden (beskrevet av D.A. Scudiero, R.H. Shoemaker, K.D. Pauli, A. Monks, S. Tierney, T.H. Nofziger, M.J. Currens, D. Seniff og M.R. Boyd: "Evaluation of a soluble tetrazolium/formazan assay for cell growth and drug sensitivity in culture using human and other tumor-cell lines", Cancer Research 48:4827-4833,1988). Etter inkubering i nærvær av forbindelsen ifølge Eksempler 2 og 3 som skal testes, blir XTT [natriumsalt av 2,3-bis(2-metoksy-4-nitro-5-sulfofenyl)-2H-tetrazolium-5-karboksanilid, (Sigma)] og fenazinmetosulfat (PMS, Sigma) i løsning i saltvanns fosfatbuffer satt til kulturene og cellene blir inkubert i 4 timer ved 37°C i en atmosfære med 5 % CO2. De endelige konsentrasjonene av XTT og PMS er henholdsvis 50 og 0,38 ug/brønn. Frem-stillingen av formazan blir stanset ved tilsetning av 10 pl av natriumdodecylsulfat ved 10 % (Sigma) og absorbansen avleses ved anvendelse av spektrofotometri ved 450 nm med et referansefilter ved 600-650 nm.

Resultater:

De molare konsentrasjonene av forbindelsene ifølge Eksempel 2 som hemmer celleproliferasjonen med 50% er sammenfattet i den følgende tabellen:

Claims (9)

1. Produkt, karakterisert ved at det har formelen (II) representert nedenfor eller ved at det er saltene av forbindelsen med formel (II)

2. Produkt i følge krav 1 karakterisert ved at saltet av forbindelsen med formel (II) er forbindelsen med formel (III)

3. Produkt med den generelle formel M representert nedenfor hvor R representerer en etylrest.

4. Fremgangsmåte for fremstilling av et produkt med den generelle formel M representert nedenfor, hvor R representerer en etylgruppe, karakterisert ved at den omfatter følgende suksessiv trinn: - den racemiske f-butylesteren representert nedenfor blir behandlet med trifluoreddiksyre i 18 timer ved omgivelsestemperatur for å fremstille den tilsvarende karboksylsyren; - deretter blir kinidinsaltet av den tidligere oppnådde syren oppvarmet i isopropylalkohol ved en temperatur høyere enn 30°C, før reaksjonsmediet hensettes for å avkjøles til omgivelsestemperatur, slik at saltet av én av enantiomerene av ovennevnte syre krystalliserer, mens saltet av den andre enantiomeren, hvis anion er representert nedenfor, forblir i løsning - løsningen i isopropylalkohol av saltet av enantiomeren som ikke er krystallisert, konsentreres og behandles med saltsyre og omrøres, idet forbindelsen med den generelle formel A representert nedenfor fremstilles - forbindelsen med den generelle formel A blir deretter bragt i kontakt med palladium på fuktig karbon, deretter blir ammoniumformiat eller maursyre satt til blandingen for å fremstille det debenzylerte produktet med den generelle formel B representert nedenfor - deretter blir forbindelsen med den generelle formel B ringsluttet ved virkningen av dicykloheksylkarbodiimid for å oppnå den laktoniske forbindelsen med den generelle formel C representert nedenfor -til slutt omdannes -OCH3 gruppen av den laktoniske forbindelsen med den generelle formel C til karbonyl, ved virkningen av natriumjodid og tri m ety Isi ly I klo rid, for å oppnå en forbindelse med den generelle formel M representert nedenfor.

5. Produkt ifølge kravene 1 til 2, eller enhver blanding av disse produktene anvendt som et medikament.

6. Farmasøytiske preparat, karakterisert ved at det som aktiv bestanddel inneholder minst én av forbindelsene ifølge krav 5.

7. Anvendelse av forbindelse ifølge krav 1 eller 2, for fremstilling av et medikament med antitumor-aktivitet.

8. Anvendelse av forbindelse ifølge krav 1 eller 2 for fremstilling av antivirale medikamenter.

9. Anvendelse av forbindelse ifølge krav 1 eller 2 for fremstilling av antiparasittiske medikamenter.