PL195289B1

PL195289B1 - Analog kamptotecyny, związek pośredni, sposób wytwarzania związku pośredniego i zastosowania

Info

Publication number: PL195289B1
Application number: PL98338835A
Authority: PL
Inventors: Jean-Bernard Cazaux; Olivier Lavergne; Breton Christine Le; Eric Manginot; Dennis Bigg
Original assignee: Sod Conseils Rech Applic
Priority date: 1997-08-29
Filing date: 1998-08-07
Publication date: 2007-08-31
Also published as: CZ297896B6; PL338835A1; RU2233283C2; DE69819340T2; HRP20000110A2; NO20000995D0; NO324882B1; HK1031732A1; IL134437A0; ATE253069T1; DK1007527T3; JP2001514261A; AU8989698A; FR2768431A1; HUP0003429A3; EP1007527A1; CN1195758C; AR016856A1; CZ2000711A3; HK1058665A1

Abstract

1. Analog kamptotecyny o wzorze (II) przedstawionym ponizej i jego sole, takie jak np. sól o wzorze (III) przedstawionym ponizej PL PL PL PL

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest nowy analog kamptotecyny, związek pośredni w syntezie tego typu związków, sposób wytwarzania związku pośredniego i zastosowania terapeutyczne.

Kamptotecyna jest naturalnym związkiem, który wydzielono po raz pierwszy z liści i kory chińskiej rośliny nazywanej Camptotheca acuminata (patrz Wall i in. J. Amer. Chem. Soc. S8:3888 (1966)).

Kamptotecyna jest pentacyklicznym związkiem tworzonym przez indolizyno[1,2-b]chinolinowy fragment skondensowany z α-hydroksylaktonem sześcioma wiązaniami. Węgiel w położeniu 20 związany z grupą α-hydroksylową jest asymetryczny i nadaje właściwości rotacyjne cząsteczce. Naturalna postać kamptotecyny ma absolutną konfigurację „S” w odniesieniu do węgla 20 i odpowiada następującemu wzorowi:

Kamptotecyna wykazuje aktywność przeciwrozrostową w kilku liniach komórek rakowych, w tym w liniach komórek ludzkich nowotworów okrężnicy, płuci sutka (Suffness, M. i in.: The Alkaloids Chemistry and Pharmacology, wyd. Bross A., Vol. 25, str. 73 (Academic Press, 1985)). Proponuje się, że przeciwrozrostowa czynność kamptotecyny jest związana z jej hamującą aktywnością wobec topoizomerazy I DNA.

Wskazywano, że α-hydroksylakton był bezwzględnie konieczny dla czynności in vivo i in vitro kamptotecyny (Camptothecins: New Anticancer Agents, wyd. Putmesil, M. i in., str. 27 (CRC Press, 1995); Wall M. i in., Cancer Res. 55: 753 (1995); Hertzberg i in., J. Med. Chem. 32:715 (1982) i Crow iin., J. Med. Chem. 35: 4160 (1992)). Ostatnio zgłaszający dopracował nową klasę analogów kamptotecyny, w której naturalny α-hydroksylakton kamptotecyny zastąpiony jest β-hydroksylaktonem (por. zgłoszenie patentowe WO 97/00876).

Niniejszy wynalazek dotyczy nowego sposobu wytwarzania enancjomerycznie czystego syntetycznego związku pośredniego, jak też nowego enancjomerycznie czystego analogu kamptotecyny. Analog kamptotecyny według wynalazku określony jest wzorem (II) przedstawionym poniżej

PL 195 289 B1 lub stanowi jedną z soli związku o wzorze (II), taką jak np. sól o wzorze (III) przedstawionym poniżej

Kluczowym związkiem pośrednim w syntezie tego typu optycznie czystych związków, wchodzącym również w zakres wynalazku, jest produkt o wzorze ogólnym M przedstawionym poniżej

w którym R oznacza rodnik etylowy.

Związek o wzorze (II) można wytworzyć w następujący sposób: - związek o poniższym wzorze

PL 195 289 B1 sprzęga się ze związkiem o wzorze N2 przedstawionym poniżej:

w celu wytworzenia związku o wzorze O2

W wyniku cyklizacji związku O2 otrzymuje się związek o wzorze (II), który można, po wysoleniu, przeprowadzić w związek o wzorze (III).

Wytwarzanie związku O2, wychodząc ze związku o wzorze ogólnym M, w którym R oznacza rodnik etylowy i związku N2, prowadzi się w sposób znany specjaliście pod nazwą reakcji Mitsunobu (według Mitsunobu, O. i in. Synthesis, str. 1 (1981)). Grupa hydroksylowa związku N2 jest wypierana przez nukleofil, taki jak związek M lub jego deprotonowana pochodna, pod działaniem fosfiny, np. trifenylofosfiny i pochodnej azodikarboksylanowej, np. azodikarboksylanu dietylu lub diizopropylu w aprotonowym rozpuszczalniku, takim jak np. tetrahydrofuran lub N,N-dimetyloformamid. Cyklizację związku O2 w celu wytworzenia związku o wzorze (II) korzystnie prowadzi się w obecności katalizatora palladowego (np. dioctanu palladu) w warunkach zasadowych (zapewnianych np. przez zasadowy octan ewentualnie połączony ze środkiem przenoszenia fazowego, takim jak np. bromek tetrabutyloamoniowy), w aprotonowym rozpuszczalniku, takim jak acetonitryl lub N,N-dimetyloformamid, w temperaturze w zakresie 50°C-120°C (R. Grigg i in., Tetrahedron 46, strona 4003 (1990)).

Wynalazek proponuje także, jako nowy przemysłowy produkt, związek o wzorze ogólnym M,jak określono uprzednio. Ten produkt można stosować do wytwarzania leków.

Związek o wzorze M syntetyzuje się zgodnie z nowym sposobem, który jest częścią wynalazku i obejmuje następujące kolejne etapy:

- racemiczny ester t-butylowy o wzorze przedstawionym poniżej

PL 195 289 B1 (jego wytwarzanie przedstawia w szczególności zgłoszenie patentowe WO 97/00876) traktuje się kwasem trifluorooctowym przez 18 godzin w temperaturze otoczenia w celu wytworzenia odpowiedniego kwasu karboksylowego;

- następnie sól chinidynową kwasu otrzymanego uprzednio ogrzewa się w alkoholu izopropylowym w temperaturze wyższej niż 30°C, a korzystnie w temperaturze około 50°C, po czym pozostawia się środowisko reakcji do ochłodzenia do temperatury otoczenia, aby sól jednego z enancjomerów wspomnianego wyżej kwasu krystalizowała, podczas gdy sól drugiego enancjomeru, której anion ma wzór przedstawiony poniżej, pozostaje w roztworze

- roztwór w alkoholu izopropylowym soli enancjomeru, która nie krystalizowała, zatęża się, traktuje kwasem chlorowodorowym i miesza, wytwarzając związek o wzorze ogólnym A przedstawionym poniżej

- związek o wzorze ogólnym A kontaktuje się następnie z palladem na wilgotnym węglu, po czym dodaje się do mieszaniny mrówczan amonu lub kwas mrówkowy w celu wytworzenia debenzylowanego produktu o wzorze ogólnym B przedstawionym poniżej

PL 195 289 B1

- następnie związek o wzorze ogólnym B cyklizuje się działaniem dicykloheksylokarbodiimidu wcelu wytworzenia związku laktonowego o wzorze ogólnym C przedstawionym poniżej

- wreszcie, grupę -OCH3 związku laktonowego o wzorze ogólnym C przekształca się w karbonyl działaniem jodku sodu i chlorku trimetylosililu, z wytworzeniem związku o wzorze ogólnym M przedstawionym poniżej.

W sposobie opisanym powyżej reakcja prowadząca od związku o wzorze ogólnym A do związku o wzorze ogólnym B korzystnie zachodzi w metanolu i korzystnie przez ogrzewanie środowiska reakcji do około 40°C po dodaniu mrówczanu amonu. Cyklizację związku o wzorze ogólnym B w celu wytworzenia związku C można prowadzić w THF, korzystnie w temperaturze około 50°C, chociaż reakcję korzystnie prowadzi się w temperaturze otoczenia z acetonitrylem jako rozpuszczalnikiem w reakcji prowadzącej od związku o wzorze ogólnym C do związku o wzorze ogólnym M.

W konkretnym przypadku, gdy R oznacza grupę etylową, związek o wzorze M syntetyzuje się zgodnie z procesem złożonym z następujących kolejnych etapów:

- racemiczny ester t-butylowy o wzorze przedstawionym poniżej

(jego wytwarzanie przedstawia w szczególności zgłoszenie patentowe WO 97/D0876) traktuje się kwasem trifluorooctowym przez 18 godzin w temperaturze otoczenia w celu wytworzenia odpowiedniego kwasu karboksylowego;

PL 195 289 B1

- sól chinidynową kwasu 3-(3-benzyloksymetylo-2-metoksy-4-pirydylo)-3-hydroksypentanowego ogrzewa się w alkoholu izopropylowym w temperaturze wyższej niż 30°C i korzystnie w temperaturze około 50°C, po czym pozostawia środowisko reakcji do ochłodzenia do temperatury otoczenia tak, żesól (+)enancjomeru kwasu 3-(3-benzyloksymetylo-2-metoksy-4-pirydylo)-3-hydroksypentanowego krystalizuje, podczas gdy sól izomeru (-), której anion ma wzór przedstawiony poniżej, pozostaje w roztworze

- roztwór w alkoholu izopropylowym soli enancjomeru (-) kwasu 3-(3-benzyloksymetylo-2-metoksy-4-pirydylo)-3-hydroksypentanowego zatęża się, traktuje kwasem chlorowodorowym i miesza, wytwarzając związek o wzorze A' przedstawionym poniżej

- związek A' kontaktuje się następnie z palladem na wilgotnym węglu, dodaje się do mieszaniny mrówczan amonu lub kwas mrówkowy w celu wytworzenia debenzylowanego produktu o wzorze B' przedstawionym poniżej

- następnie związek o wzorze B' cyklizuje się działaniem dicykloheksylokarbodiimidu w celu wytworzenia związku laktonowego o wzorze C' przedstawionym poniżej

PL 195 289 B1

- wreszcie, grupę -OCH3 związku laktonowego o wzorze C' przekształca się w karbonyl działaniem jodku sodu i chlorku trimetylosililu z wytworzeniem (+)-5-etylo-5-hydroksy-1,3,4,5,8,9-heksahydrooksepino-[3,4-c]pirydyno-3,9-dionu (lub (+)-EHHOPD) o wzorze przedstawionym poniżej.

(+)-EHHOPD

Związek o wzorze N2 można otrzymać zgodnie z następującym procesem: anilinę o wzorze P2 przedstawionym poniżej

orto-acyluje się w reakcji z chloroacetonitrylem w obecności trichlorku boru i innego kwasu Lewisa, takiego jak trichlorek glinu, tetrachlorek tytanu lub chlorek dietyloglinu w aprotonowym rozpuszczalniku lub mieszaninie aprotonowych rozpuszczalników, następnie hydrolizuje (por. Sugasawa T. i in. J. Am. Chem. Soc. 100 str. 4842 (1978)). Związek pośredni tak otrzymany traktuje się następnie chlorkiem etylomalonylu w aprotonowym rozpuszczalniku, takim jak acetonitryl w obecności zasady, takiej jak trietyloamina, następnie traktuje się zasadowym alkoholanem, np. metanolanem sodu w metanolu wcelu wytworzenia 7-chloro-4-chlorometylo-6-metylo-2-okso-1,2-dihydro-3-chinolinokarboksylanu etylu. Ten ostatni przekształca się w 2,7-dichloro-4-chlorometylo-6-metylo-3-chinolinokarboksylan etylu działając tlenochlorkiem fosforylu. Następnie prowadzi się podstawienie nukleofilowe przez działanie 4-metylopiperydyną. Grupę etylokarboksylanową redukuje się następnie wodorkiem diizobutyloglinu w aprotonowym rozpuszczalniku, takim jak dichlorometan z wytworzeniem związku o wzorze N2. Kolejność, w której prowadzi się dwa ostatnie etapy, można ewentualnie odwrócić.

Analogi związku pośredniego N2 opisano w literaturze, a w szczególności w zgłoszeniu PCT 95/05427.

Związek o wzorze (II) można przekształcić w postać farmaceutycznie dopuszczalnych soli zwykłymi sposobami. Dopuszczalne sole obejmują, przykładowo i w nie ograniczający sposób, sole addycyjne z kwasami nieorganicznymi, takie jak chlorowodorek, siarczan, fosforan, difosforan, bromowodorek i azotan lub z kwasami organicznymi, takie jak octan, maleinian, fumaran, winian, bursztynian, cytrynian, mleczan, metanosulfonian, p-toluenosulfonian, pamoesan, salicylan, szczawian i stearynian. Inne przykłady farmaceutycznie dopuszczalnych soli można znaleźć w „Pharmaceutical Salts”, J. Pharm. Sci. 66:1 (1977).

Związki według niniejszego wynalazku mają przydatne właściwości farmakologiczne. Tak więc związki według niniejszego wynalazku wykazują działanie hamujące topoizomerazę I i/lub II i aktywność przeciwnowotworową. Stan techniki sugeruje, że związki według wynalazku wykazują aktywność przeciwpasożytniczą i/lub przeciwwirusową. Tym samym związki według niniejszego wynalazku można stosować w różnych terapeutycznych zastosowaniach.

PL 195 289 B1

Ilustrację właściwości farmakologicznych związków według wynalazku podano dalej w części doświadczalnej.

Związki mogą hamować topoizomerazę, np. typu I i/lub II u pacjenta, np. ssaka, takiego jak człowiek, przy podawaniu pacjentowi terapeutycznie skutecznej ilości związku o wzorze (II) lub farmaceutycznie dopuszczalnej soli związku o wzorze (II), lub także dowolnej mieszaniny wskazanych powyżej związków.

Związki według wynalazku wykazują aktywność przeciwnowotworową. Można je stosować do leczenia nowotworów, np. nowotworów wyrażających topoizomerazy u pacjenta, przy podawaniu pacjentowi terapeutycznie skutecznej ilości związku o wzorze (II) lub farmaceutycznie dopuszczalnej soli związku o wzorze (II), lub także dowolnej mieszaniny powyższych związków. Przykłady nowotworów lub raków obejmują raki przełyku, żołądka, jelit, odbytu, jamy ustnej, gardła, krtani, płuc, okrężnicy, sutka, szyjki macicy, trzonu i śluzówki macicy, jajników, prostaty, jąder, pęcherza, nerek, wątroby, trzustki, kości, tkanek łącznych, skóry, oczu, mózgu i ośrodkowego układu nerwowego, jak też raka tarczycy, białaczki, choroby Hodgkina, chłoniaków innych niż ziarnicze, szpiczaków mnogich i innych.

Można je także stosować do leczenia pasożytniczych infekcji przez hamowanie wiciowców we krwi (np. w infekcjach świdrowcami lub leiszmaniozach) lub przez hamowanie zarodźców (takich jak np. w malarii), lecz także do leczenia chorób i infekcji wirusowych.

Te właściwości czynią związek o wzorze (II) odpowiednim do stosowania farmaceutycznego. Zakresem niniejszego wynalazku objęty jest także jako lek związek o wzorze (II) określonym powyżej, jak też sole addycyjne z farmaceutycznie dopuszczalnymi kwasami mineralnymi lub organicznymi związku o wzorze (II), takie jak np. sól o wzorze (III) opisana uprzednio lub także dowolna mieszanina wskazanych powyżej związków. Ponadto, w zakres wynalazku wchodzą kompozycje farmaceutyczne zawierające co najmniej jeden z leków, jak określono powyżej, jako składnik czynny.

Tak więc, zakresem wynalazku objęte są kompozycje farmaceutyczne zawierające związek według wynalazku lub jego sól addycyjną z farmaceutycznie dopuszczalnym kwasem, w połączeniu z farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem w zależności od wybranego sposobu podawania (np. doustnie, dożylnie, dootrzewnowo, domięśniowo, przezskórnie lub podskórnie). Kompozycja farmaceutyczna (np. lecznicza) może mieć postać ciała stałego, cieczy, liposomowych lub lipidowych miceli.

Kompozycja farmaceutyczna może mieć postać stałą, taką jak np. proszki, pigułki, granulki, tabletki, liposomy, kapsułki żelatynowe lub czopki. Pigułkę, tabletkę lub żelatynową kapsułkę można powlec substancją, która będzie chronić kompozycję przed działaniem kwasów żołądkowych lub enzymów w żołądku pacjenta przez czas dostateczny do umożliwienia kompozycji przejścia w formie niestrawionej do jelita cienkiego pacjenta. Związek można także podawać w określone miejsce, na przykład w miejsce lokalizacji nowotworu. Związek można także podawać w postaci preparatu o przedłużonym uwalnianiu (np. kompozycja o przedłużonym uwalnianiu lub pompa infuzyjna). Odpowiednimi stałymi nośnikami mogą być np. fosforan wapnia, stearynian magnezu, węglan magnezu, talk, cukry, laktoza, dekstryna, skrobia, żelatyna, celuloza, metyloceluloza, karboksymetyloceluloza sodowa, poliwinylopirolidyna i wosk. Kompozycje farmaceutyczne zawierające związek według wynalazku można także sporządzać w postaci ciekłej, takiej jak np. roztwory, emulsje, zawiesiny lub kompozycja o przedłużonym uwalnianiu. Odpowiednimi ciekłymi nośnikami mogą być np. woda, organiczne rozpuszczalniki, takie jak gliceryna lub glikole, takie jak poli(glikol etylenowy), podobnie ich mieszaniny, w różnych stosunkach w wodzie.

Zakresem wynalazku objęte jest także zastosowanie związku o wzorze (II) określonym powyżej, lub soli addycyjnych z farmaceutycznie dopuszczalnymi kwasami mineralnymi lub organicznymi związku o wzorze (II), takiej jak np. sól o wzorze (III) opisana uprzednio lub także mieszaniny wyżej wskazanych związków, do wytwarzania leków do hamowania topoizomeraz, a dokładniej topoizomeraz typu I lub typu II, leków przeznaczonych do leczenia nowotworów, leków przeznaczonych do leczenia pasożytniczych infekcji, jak też leków przeznaczonych do leczenia infekcji i chorób wirusowych.

Dawka związku według niniejszego wynalazku przewidywana do leczenia chorób lub zaburzeń wspomnianych powyżej, zmienia się w zależności od sposobu podawania, wieku i ciężaru ciała leczonego pacjenta, jak też od jego stanu i będzie ostatecznie ustalana przez właściwego lekarza lub weterynarza. Taka ilość określona przez właściwego lekarza lub weterynarza jest tutaj nazywana „skuteczną terapeutycznie ilością”. Wszystkie stosowane tutaj terminy techniczne i naukowe, o ile nie zdefiniuje się ich w inny sposób, mają takie same znaczenia jak zwykle rozumiane przez specjalistę w dziedzinie, do której należy wynalazek. Podobnie, wszystkie publikacje, zgłoszenia patentowe, wszystkie patenty i wszystkie inne odnośniki wspomniane tutaj są dołączone przez odniesienie. Na10

PL 195 289 B1 stępujące przykłady przedstawiono dla zilustrowania powyższych procedur i nie powinny być w żadnym razie uważane za ograniczenie zakresu wynalazku.

Przykład 1 (+)-5-etylo-5-hydroksy-1,3,4,5,8,9-heksahydro-oksepino[3,4-c]pirydyno-3,9-dion [(+)-EHHOPD]

1a. Sól chinidynowa kwasu 3-(3-benzyloksymetylo-2-metoksy-4-pirydylo)-3-hydroksypentanowego

3-(3-benzyloksymetylo-2-metoksy-4-pirydylo)-3-hydroksypentanian t-butylu (40 g; 100 mmol) traktuje się kwasem trifluorooctowym (150 ml) i środowisko reakcji miesza się przez 18 godzin w temperaturze 20°C. Po odparowaniu kwasu trifluorooctowego dolewa się chlorek metylenu (200 ml) i wprowadza nasycony roztwór wodorowęglanu sodu, aż pH wyniesie 7,5-8. Po dekantacji fazę wodną przemywa się 100 ml chlorku metylenu. Odczyn pH fazy wodnej ustawia się następnie na 1, dodając 6N roztwór kwasu chlorowodorowego. Produkt ekstrahuje się następnie z fazy wodnej chlorkiem metylenu (2 razy 200 ml). Roztwór osusza się nad siarczanem magnezu i zatęża. Tak otrzymany kwas 3-(3-benzyloksymetylo-2-metoksy-4-pirydylo)-3-hydroksypentanowy (31,1 g; 90 mmol) rozpuszcza się w alkoholu izopropylowym (30 ml), traktuje się roztworem chinidyny (29,2 g; 90 mmol) w alkoholu izopropylowym (30 ml) w temperaturze 50°C z mieszaniem do całkowitego rozpuszczenia. Następnie środowisko reakcji pozostawia się, aby temperatura spadła do 40°C, mieszanie wstrzymuje się i pozwala temperaturze spaść do 20°C. Środowisko ochładza się do0°C bez mieszania, następnie utrzymuje się tę temperaturę przez 16 godzin, po czym temperaturę podwyższa się do 20°C i miesza się do wykrystalizowania. Środowisko reakcji rozcieńcza się alkoholem izopropylowym, następnie przesącza. Osad przepłukuje się alkoholem izopropylowym. Sól enancjomeru (+) wytrąca się (m = 26,6 g), podczas gdy sól enancjomeru (-) pozostaje w roztworze w alkoholu izopropylowym. W ten sposób odzyskuje się przesącz, który zatęża się w celu wytworzenia oleju (34 g), który stosuje się bez dalszego oczyszczania w następnym etapie.

Produkty analizuje się metodą HPLC na 5 μ kolumnie CHIRAL AGP (10 cm x 4mm) eluowanej mieszaniną 30/920/50 alkohol izopropylowy/woda/bufor fosforanowy, pH =6,5, z natężeniem przepływu 1,2 ml/min, detekcją UV przy 280 nm. Uzyskane czasy retencji to 6,4 minuty dla enancjomeru (-) i2,8 minuty dla enancjomeru (+). Stosunek enancjomer (-) / enancjomer (+) wynosi 83/17.

1b. Kwas (-)-3 -(3-benzyloksymetylo-2-metoksy-4-pirydylo)-3-hydroksypentanowy

Zatęża się roztwór w alkoholu izopropylowym soli chinidynowej enancjomeru (-) kwasu 3-(3-benzyloksymetylo-2-metoksy-4-pirydylo)-3-hydroksypentanowego (etap 1a). Koncentrat rozpuszcza się w 270 ml chlorku metylenu i 270 ml 1N roztworu kwasu chlorowodorowego. Środowisko reakcji miesza się przez 16 godzin w temperaturze 20°C. Po dekantacji fazę organiczną zatęża się, koncentrat rozpuszcza się w metanolu w celu użycia w następnym etapie. Otrzymuje się 13,5 g produktu (wydajność 87%), przy stosunku enancjomer (-) / enancjomer (+) wynoszącym 85/15. Czasy retencji HPLC (ten sam protokół jak w 1a) wynoszą: enancjomer (-): 6,4 minuty, enancjomer (+): 2,8 minuty.

1c. (+)-5-etylo-5-hydroksy-1,3,4,5,8,9-heksahydrooksepino-[3,4-c]pirydyno-3,9-dion

Kwas (-)-3-(3-benzyloksymetylo-2-metoksy-4-pirydylo)-3-hydroksypentanowy (13,5 g; 39 mmol; etap 1b) umieszcza się w roztworze w 87 ml metanolu. Ten 50% roztwór wylewa się pod azotem do 10% palladu na wilgotnym węglu (27,7 g; 13 mmol). Środowisko reakcji miesza się przez 5 minut, następnie wylewa się do roztworu mrówczanu amonu (11,5 g; 183 mmol) w 135 ml metanolu. Środowisko reakcji miesza się przez 30 minut pozwalając na podniesienie się temperatury, następnie ogrzewa się w temperaturze 40°C przez 30 minut. Następnie przesącza się przez złoże Clarcel, anastępnie zatęża. Dolewa się 40 ml toluenu, który odparowuje się; tę operację powtarza się w celu wyeliminowania metanolu. Tak otrzymaną pozostałość rozpuszcza się w 45 ml THF. Następnie dolewa się roztwór dicykloheksylokarbodiimidu (7,180 g; 34,5 mmol) w 20 ml THF. Środowisko reakcji ogrzewa się do 50°C przez 1 godzinę. Mieszaninę doprowadza się do 20°C, następnie dicykloheksylomocznik odsącza się. Przesącz zatęża się do suchej masy. Pozostałość umieszcza się w roztworze w46 ml acetonitrylu, dodaje się 6,0 g (40,5 mmol) jodku sodu, następnie 5,13 ml (40,5 mmol) chlorku trimetylosililu. Środowisko reakcji miesza się w temperaturze otoczenia przez 5 godzin. Następnie dodaje się 28 ml acetonitrylu i 5,6 ml wody. Otrzymany osad odsącza się, po czym rozpuszcza w 1ml wody i pH ustawia się na 7,5 dodając roztwór wodorotlenku amonu. Otrzymane ciało stałe odsącza się i osusza. Otrzymuje się m = 4,2 g końcowego produktu z wydajnością 34%, przy stosunku enancjomer (+)/enancjomer wynoszącym 88,4/11,6. Analizę HPLC prowadzi się na kolumnie Chiralcel OD 25 cm x4,6 mm, użytymi eluentami są heptan 600 i etanol 400, natężenie przepływu wynosi 1 ml/min, 210 nm. Otrzymane czasy retencji wynoszą: enancjomer (-): 7,1 minuty, enancjomer (+): 9 minut. Produkt rozpuszcza się w acetonie (40 ml), następnie dodaje się wodę (150 ml). Mieszaninę pozostawia

PL 195 289 B1 się do wytrącenia osadu i otrzymuje się 3 g produktu, przy stosunku enancjomer (+) / enancjomer (-) wynoszącym 99,4/0,6.

NMR ¹H (250 MHz, DMSO D6): 0,8 (t, 3H, CH3-CH2); 1,65 (m, 2H, CH2-CH3); 3,00-3,35 (q, 1H+

IH, -CH2-C=O); 5,3 (q, 2H, CH2-O); 5,7 (s, -OH); 6,35 (d, aromatyczne 1H); 7,3 (d, aromatyczne 1H);

II, 7 (s, N-H).

Pr zy kł a d 2 (+)-5-etylo-9,10-difluoro-5-hydroksy-4,5,13,15-tetrahydro-1H,3H-oksepino(3',4':6,7]indolizyno-[1,2-b]chinolino-3,15-dion

2a. N-(3,4-difluorofenylo)acetamid

Mieszaninę 3,4-difluoroaniliny (50 ml; 0,5 mol) i trietyloaminy (70 ml; 0,5 mol) w dichlorometanie (1,5 l) ochładza się stosując łaźnię lodową. Dodaje się kroplami bezwodnik octowy (71,5 ml; 0,75 mol) i mieszaninę reakcyjną mieszą się przez 1 godzinę w temperaturze otoczenia. Otrzymaną mieszaninę przemywa się następnie kolejno wodą, 10% roztworem wodorowęglanu sodu i nasyconą solanką. Frakcję organiczną osusza się nad siarczanem sodu i zatęża pod zmniejszonym ciśnieniem. Pozostałość zawiesza się w pentanie, przesącza i osusza pod zmniejszonym ciśnieniem w celu wytworzenia tytułowego produktu (78 g; wydajność 91%) w postaci białawego ciała stałego (temperatura topnienia 126-127°C.

NMR ¹H (DMSO): 2,15 (s, 3H); 7,10-7,65 (m, 2H); 7,65-8,10 (m, 1H); 10,30 (szeroki pik, 1H).

2b. 2-chloro-6,7-difluoro-3-chinolino-3-karbaldehyd

Stosuje się ogólną procedurę opisaną przez Meth-Cohna i in., J. Chem. Soc. Perkin Trans. I, 1981, 1520 i 2509.

Produkt z etapu 2a (32 g; 220 mmol) dodaje się do odczynnika Vilsmeyera, otrzymanego przez dodanie kroplami w atmosferze argonu tlenochlorku fosforu (103 ml; 1,1 mol) w bezwodnym DMF (34 ml; 440 mmol), ochładza na łaźni lodowej i miesza przez 30 minut, następnie pozostawia się do podniesienia temperatury do temperatury otoczenia. Tak otrzymaną mieszaninę miesza się w temperaturze 70°C przez 16 godzin. Po osiągnięciu temperatury otoczenia dodaje się mieszaninę kroplami do mieszaniny woda-lód (400 ml) i miesza przez 2 godziny. Otrzymany osad przesącza się i przemywa wodą, następnie osusza w celu wytworzenia tytułowego produktu (9 g; wydajność 18%) w postaci żółtego ciała stałego (temperatura topnienia 226,5-229°C).

NMR ¹H (DMSO): 8,17 (dd, 1H); 8,39 (dd, 1H); 8,97 (d, 1H); 10,34 (d, 1H).

IR (KBr): 888, 1061, 1262, 1507, 1691 cm^-1.

2c. 2-chloro-6,7-difluoro-3-chinolilometanol

Zawiesinę produktu z etapu 2b (9 g; 39 mmol) w metanolu (400 ml) traktuje się borowodorkiem sodu (2 g; 53 mmol) w temperaturze otoczenia przez pół godziny. Nadmiar borowodorku rozkłada się kwasem octowym (2 ml). Lotne substancje eliminuje się pod zmniejszonym ciśnieniem. Pozostałość rozpuszcza się w octanie etylu (500 ml), otrzymaną mieszaninę przemywa się następnie kolejno rozcieńczonym roztworem wodorowęglanu sodu, wodą i nasyconą solanką, następnie osusza nad siarczanem magnezu i zatęża pod zmniejszonym ciśnieniem. Pozostałość rekrystalizuje się z 1,2-dichloroetanu w celu wytworzenia tytułowego produktu (8 g; wydajność 80%) w postaci beżowego ciała stałego (temperatura topnienia 166,5-167°C).

NMR ¹H (DMSO): 4,67 (d, 2H); 5,80 (t, 1H); 8,01 (dd, 1H); 8,22 (dd, 1H); 8,48 (s, 1H).

IR (KBr): 871, 1038, 1253, 1513 cm^-1.

2d. (+)-8-(2-chloro-6,7-difluoro-3-chinolinometanolo)-5-etylo-5-hydroksy-1,3,4,5,8,9-heksahydrooksepino[3,4-c]pirydyno-3,9-dion

Do roztworu w bezwodnym DMF (30 ml) (+)-EHHOPD (1,58 g; 7,08 mmol; etap 1c), produktu z etapu 2c (1,62 g; 7,06 mmol) i tributylofosfiny (1,91 ml; 7,87 mmol) wkrapla się w temperaturze otoczenia i w atmosferze argonu azodikarboksylan dietylu (1,24 ml; 7,87 mmol). Tak otrzymaną mieszaninę miesza się następnie przez 16 godzin. Środowisko reakcji odparowuje się do suchej masy pod zmniejszonym ciśnieniem. Pozostałość oczyszcza się metodą chromatografii na kolumnie z krzemionką (eluent: octan etylu). Otrzymane ciało stałe rozpuszcza się w eterze dietylowym, przesącza i osusza w celu wytworzenia tytułowego produktu (1,56 g; wydajność 51%) w postaci białawego ciała stałego (temperatura topnienia 196°C).

NMR ¹H (DMSO): 0,84 (t, 3H); 1,74 (m, 2H); 3,02 (d, 1H); 3,34 (d, 1H); 5,29 (s, 2H); 5,31 (dd, 2H); 5,75 (s, 1H); 6,51 (d, IH); 7,80 (d, 1H); 8,03 (dd, 1H); 8,07 (s, 1H); 8,17 (dd, 1H).

IR (KBr): 875, 1057, 1360, 1507, 1574, 1647, 1749 cm^-1.

PL 195 289 B1

2e. (+)-5-etylo-9,10-difluoro-5-hydroksy-4,5,13,15-tetrahy-dro-1H,3H-oksepino[3',4':6,7]indolizyno[1,2-b]chinolino-3,15-dion

Mieszaninę produktu z etapu 2d (1,53 g; 3,52 mmol; etap 2d), bromku tetrabutyloamoniowego (1,25 g; 3,87 mmol), octanu potasu (520 mg; 5,28 mmol), trifenylofosfiny (180 mg; 0,70 mmol) i octanu palladu (II) (79 mg; 0,35 mmol) miesza się w atmosferze argonu w bezwodnym acetonitrylu ogrzewanym w temperaturze wrzenia przez 22 godziny. Po osiągnięciu przez środowisko reakcji temperatury otoczenia, zatęża się mieszaninę reakcyjną pod zmniejszonym ciśnieniem, następnie poddaje chromatografii na kolumnie z krzemionką (eluent: mieszanina 98/2 CH2Cl2/MeOH). Otrzymuje się tytułowy produkt (960 mg; wydajność 68%; czystość określona metodą HPLC: 97,1%). Ten produkt rozpuszcza się w bezwodnym CH2Cl2 (100 ml) i miesza się przez 24 godziny, następnie przesącza i osusza pod zmniejszonym ciśnieniem w celu wytworzenia oczyszczonego produktu tytułowego (850 mg; wydajność 61%; czystość określona metodą HPLC: 99,6%) w postaci białego ciała stałego.

NMR ¹H (DMSO): 0,87 (t, 3H); 1,85 (m, 2H); 3,08 (d, 1H); 3,44 (d, 1H); 5,26 (s, 2H); 5,39 (d, 2H); 5,52 (d, 2H); 5,99 (szeroki pik, 1H); 7,39 (s, 1H); 8,15 (dd, 1H); 8,23 (dd, 1H); 8,68 (s, 1H).

IR (KBr): 871, 1261, 1512, 1579, 1654, 1746 cm^-1.

Przykład 3

Chlorek (+)1-[9-chloro-5-etylo-5-hydroksy-10-metylo-3,15-diokso-4,5,13,15-tetrahydro-1H,3H-oksepino-[3',4':6,7]indolizyno[1,2-b]chinolin-12-ylometylo]-4-metyloheksahydropirydyniowy

3a.1l-(2-amino-4-chloro-5-metylofenylo)-2-chloroetanon

3-chloro-4-metyloanilinę (44,4 ml; 0,366 mol) w 1,2-dichloroetanie (440 ml), w atmosferze argonu, ochładza się w łaźni lodowej. Następnie wkrapla się kolejno następujące substancje: dodaje się kroplami i w tym porządku: trichlorek boru (1M w heptanie; 400 ml; 0,4 mol), chloroacetonitryl (28 ml; 0,44 mol) i chlorek dietyloglinu (1M w heptanie; 400 ml; 0,4 mol). W czasie dodawania temperaturę utrzymuje się poniżej 20°C. Powstałą mieszaninę ogrzewa się w temperaturze wrzenia przez 3 godziny, po czym ochładza do 10°C. Następnie prowadzi się hydrolizę środowiska reakcji ostrożnie stosując 2N kwas chlorowodorowy (240 ml) i ogrzewa się w temperaturze wrzenia przez 1 godzinę. Dodaje się wodę (1 l) i octan etylu (1l), otrzymaną mieszaninę miesza się przez 15 minut przed rozdzieleniem faz. Fazę wodną ponownie ekstrahuje się octanem etylu (200 ml) i połączone fazy organiczne przemywa się wodą (500 ml). Po osuszeniu nad siarczanem magnezu fazę organiczną zatęża się. Pozostałość rozpuszcza się w eterze naftowym (frakcji mającej temperaturę wrzenia 45 do 60°C; 150 ml) itak otrzymaną mieszaninę pozostawia się na 16 godzin w temperaturze 4°C. Powstały osad odsącza się, przemywa eterem naftowym i osusza pod zmniejszonym ciśnieniem w celu wytworzenia tytułowego produktu (25 g; wydajność 31%). Temperatura topnienia 129-130°C.

NMR ¹H (DMSO): 2,20 (s, 3H); 4,98 (s, 2H); 6,90 (s, 1H); 7,15 (szeroki pik, 2H); 7,70 (s, 1H).

IR (KBr): 871, 1018, 1183, 1225, 1270, 1533, 1577, 1619, 1662 cm^-1.

3b. 7-chloro-4-chlorometylo-6-metylo-2-okso-1,2-dihydro-3-chinolinokarboksylan etylu

Produkt z etapu 3.a (25 g; 0,1! mol) i trietyloaminę (30,6 ml; 0,22 mol) miesza się ze sobą w acetonitrylu (520 ml). Dodaje się chlorek etylomalonylu (28,1 ml; 0,22 mol) w temperaturze otoczenia i w atmosferze argonu. Otrzymaną mieszaninę miesza się przez 3 godziny. Następnie dodaje się kroplami etanolan sodu (wytworzony przez rozpuszczenie 3 g, to jest 0,13 mol sodu w 140 ml absolutnego etanolu) i powstałą mieszaninę miesza się w temperaturze otoczenia przez 16 godzin. Osad odsącza się, przemywa kolejno etanolem, wodą, etanolem i eterem. Następnie osusza się pod zmniejszonym ciśnieniem w temperaturze 70°C nad pięciotlenkiem fosforu w celu wytworzenia tytułowego produktu (28,6 g; wydajność 83%) w postaci białawego proszku.

NMR ¹H (DMSO): 1,30 (t, 3H); 2,40 (s, 3H); 4,35 (q, 2H); 4,85 (s, 2H); 7,41 (s, 1H); 7,91 (s, 1H); 12,15 (szeroki pik, 1H).

IR (KBr): 879, 1108, 1250, 1288, 1483, 1664, 1721 cm^-1.

3c. 2,7-dichloro-4-chlorometylo-6-metylo-3-chinolinokarboksylan etylu

Produkt z etapu 3b (28,4 g; 90 mmol) ogrzewa się przez 4 godziny w temperaturze wrzenia w tlenochlorku fosforu (400 ml). Otrzymaną mieszaninę zatęża się pod zmniejszonym ciśnieniem (20 mm Hg) w temperaturze 80°C. Pozostałość rozpuszcza się w eterze diizopropylowym (400 ml). Powstały osad odsącza się, przemywa eterem i eterem naftowym, następnie osusza pod zmniejszonym ciśnieniem w celu wytworzenia tytułowego produktu (25,4 g; wydajność 85%) w postaci białawego proszku (temperatura topnienia 126-127°C).

NMR ¹H (DMSO): 1,37 (t, 3H); 2,58 (s, 3H); 4,49 (q, 2H); 5,14 (s, 2H); 8,16 (s, 1H); 8,35 (s, 1H).

IR (KBr): 874, 1006, 1163, 1243, 1278, 1577, 1723 cm^-1.

PL 195 289 B1

3d. 2,7-dichloro-4-chlorometylo-6-metylo-3-chinolilometanol

Produkt z etapu 3c (25,2 g; 76,5 mmol) miesza się w atmosferze argonu z dichloroetanem (630 ml). Dodaje się kroplami wodorek diizobutyloglinu (1M w dichlorometanie; 307 ml; 307 mmol) mieszając mieszaninę reakcyjną i utrzymując temperaturę poniżej 20°C. Mieszaninę reakcyjną miesza się następnie w temperaturze otoczenia przez 3 godziny, następnie wylewa do roztworu wodnego winianu potasu (zatężony do 20% wagowych; 1,5 l). Tak otrzymaną emulsję miesza się energicznie przez 1 godzinę, przesącza przez Celite i dwie fazy rozdziela się. Fazę wodną ekstrahuje się octanem etylu (200 ml) i połączone fazy organiczne przemywa się roztworem wodnym chlorku sodu (zatężony do 20% wagowych; 500 ml). Otrzymaną fazę organiczną osusza się nad siarczanem magnezu, przesącza i zatęża pod zmniejszonym ciśnieniem. Pozostałość rozpuszcza się w eterze dietylowym (50 ml) i powstały osad odsącza się. Po osuszeniu pod zmniejszonym ciśnieniem otrzymuje się tytułowy produkt (18,3 g; wydajność 93%) w postaci białawego proszku (temperatura topnienia 169-170°C).

NMR ¹H (DMSO): 2,57 (t, 3H); 4,84 (s, 2H); 5,36 (s, 2H); 8,06 (s, 1H); 8,27 (s, 1H).

IR (KBr): 870, 1022, 1102, 1304, 1482, 1567 cm^-1.

3e. 2,7-dichloro-6-metylo-4-(4-metylopiperydynometylo)-3-chinolilometanol

Roztwór produktu z etapu 3d (16,2 g; 55,7 mmol) w THF (70 ml) traktuje się roztworem 4-metylopiperydyny (23 ml; 195 mmol). Otrzymaną mieszaninę miesza się w temperaturze otoczenia przez 2 godziny. Dodaje się wodę (200 ml) i dichloroetan (200 ml). Fazę organiczną przemywa się roztworem wodnym chlorku sodu (zatężony do 20% wagowych; 100 ml), osusza nad siarczanem magnezu i zatęża pod zmniejszonym ciśnieniem. Przez krystalizację pozostałości z eteru dietylowego otrzymuje się tytułowy produkt (18,3 g; wydajność 93%) w postaci białego krystalicznego ciała stałego (temperatura topnienia 170-171,5°C).

NMR ¹H (CDCl3): 0,88 (d, 3H); 1,17 (m, 2H); 1,42 (m, 1H); 1,60 (m, 2H); 2,19 (t, 2H); 2,56 (s, 3H); 2,82 (d, 2H) ; 4,02 (s, 2H); 4,93 (s, 2H); 6,36 (szeroki pik, 1H); 7,95 (s, 1H); 8,02 (s, 1H).

IR (KBr): 971, 1013, 1105, 1293, 1479, 1559 cm^-1.

3f. (+)-8-[2,7-dichloro-6-metylo-4-(4-metylopiperydynometylo)-3-chinolilometylo-3-5-etylo-5-hydroksy-1,3,4,5,8,9-heksahydrooksepino[3,4-c]pirydyno-3,9-dion

Zawiesinę (+)-EHHOPD (otrzymaną w etapie 1c; 1,56 g; 7,0 mmol) w bezwodnym dioksanie (70 ml) traktuje się kolejno, w atmosferze argonu, produktem z etapu 3e (2,47 g; 7,0 mmol), trifenylofosfiną (2,02 g; 7,7 mmol) i azodikarboksylanem diizopropylu (1,07 ml; 10,5 mmol). Mieszaninę miesza się w temperaturze otoczenia przez 16 godzin. Lotne substancje odparowuje się następnie pod zmniejszonym ciśnieniem. Pozostałość oczyszcza się metodą chromatografii na kolumnie z krzemionką (eluent: octan etylu). Otrzymane ciało stałe rozpuszcza się w eterze dietylowym, przesącza i osusza w celu wytworzenia tytułowego produktu (1,96 g; wydajność 50%) w postaci białawego ciała stałego (temperatura topnienia 182°C).

NMR ¹H (DMSO): 0,89 (m, 8H); 1,23 (m, 1H); 1,41 (t, 2H); 1,64 (m, 2H); 2,09 (q, 2H); 2,59 (m, 5H); 3,15 (dd, 2H); 4,06 (dd, 2H); 5,31 (dd, 2H); 5,35 (dd, 2H); 5,75 (s, 1H); 6,29 (d, 1H); 7,17 (d, 1H); 8,06 (s, 1H); 8,46 (s, 1H).

IR (KBr): 878, 1053, 1275, 1474, 1572, 1648, 1747 cm^-1.

3g. (+)-9-chloro-5-etylo-5-hydroksy-10-metylo-12-(4-metylopiperydynometylo)-4,5,13,15-tetrahydro-1H,3H-oksepino-[3',4':6,7]indolizyno[1,2-c]chinolino-3,15-dion

Mieszaninę produktu z etapu 3.f (3,80 g; 6,80 mmol), bromku tetrabutyloamoniowego (2,42 g; 7,5 mmol), octanu potasu (1,00 g; 10,2 mmol), trifenylofosfiny (890 mg; 3,4 mmol) i octan palladu (II) (220 mg; 0,68 mmol) miesza się w atmosferze argonu w bezwodnym acetonitrylu (85 mg) w temperaturze wrzenia przez 24 godziny. Po ochłodzeniu do temperatury otoczenia powstały osad odsącza się i przemywa kolejno acetonitrylem, wodą, acetonem i eterem dietylowym w celu wytworzenia, po osuszeniu pod zmniejszonym ciśnieniem, tytułowego produktu (2,5 g; wydajność 70%) w postaci białawego proszku.

NMR ¹H (DMSO): 0,86 (m, 6H); 1,12 (q, 2H); 1,36 (m, 1H); 1,56 (d, 2H); 1,84 (q, 2H); 2,12 (t, 2H); 2,56 (s, 3H); 2,83 (dd, 2H); 3,26 (dd, 2H); 4,03 (dd, 2H); 5,28 (dd, 2H); 5,45 (dd, 2H); 6,04 (s, 1H); 7,34 (s, 1H); 8,14 (s, 1H); 8,38 (s, 1H).

IR (KBr): 870, 1058, 1208, 1280, 1477, 1593, 1655, 1749 cm^-1.

3h. Chlorek (+) 1-[(5R)-9-chloro-5-etylo-5-hydroksy-10-metylo-3,15-diokso-4,5,13,15-tetrahydro-1H,3H-oksepino-[3',4':6,7]indolizyno[1,2-c]chinolin-12-ylometylo]-4-metyloheksahydropirydyniowy

Mieszaninę produktu z etapu 3g (2,3 g; 7,7 mmol) i absolutnego etanolu (300 ml) poddaje się działaniu ultradźwięków przez 2 minuty. Otrzymaną mleczną zawiesinę miesza się i traktuje kwasem

PL 195 289 B1 chlorowodorowym (roztwór 1N; 13,2 ml; 13,2 mmol) w celu wytworzenia jasnożółtego roztworu, który na koniec tworzy osad typu żelu. Osad odsącza się na lejku Buchnera i przemywa kolejno etanolem i eterem, następnie osusza pod zmniejszonym ciśnieniem w celu wytworzenia tytułowego produktu (2,1 g; wydajność 85%).

NMR ¹H (DMSO): 0,87 (m, 6H); 1,59 (m, 5H); 1,84 (q, 2H); 2,64 (s, 3H); 3,28 (dd, 2H); 3,45 (s, 2H); 4,93 (s, 2H); 5,47 (dd, 2H); 5,61 (s, 2H); 6,04 (szeroki pik, 1H); 7,41 (s, 1H); 8,28 (s, 1H); 8,63 (s, 1H); 10,30 (szeroki pik, 1H).

IR (KBr): 1043, 1212, 1479, 1585, 1655, 1751 cm^-1.

Badania farmakologiczne związków według wynalazku

Test proliferacji komórek

W tym badaniu stosuje się pięć nowotworowych linii komórek: SW620 (gruczolakorak ludzkiej okrężnicy), OVCAR-5 (gruczolakorak ludzkich jajników), PC-3 i DU 145 (linia komórek ludzkiej prostaty) i NCL-H69 (gruczolakorak ludzkich płuc). Te linie otrzymuje się z NCL/Frederick Cancer Research and Development Center (Frederick, MD). Hoduje się je w pełnej pożywce zawierającej pożywkę RMPL-164G wzbogaconą 10% płodową surowicą cielęcą i 2 mM L-glutaminy. Inkubuje się je w temperaturze 37°C w wilgotnej atmosferze z 5% CO2. Przylegające komórki oddziela się traktując roztworem 0,25% trypsyny i 0,2% EDTA (Worthington Biochemical Corp., Freehold, NJ) przez 5 minut w temperaturze 37°C. Zliczanie komórek prowadzi się stosując licznik Coulter Z1 (Coulter Corp., Hialeah, FL). Żywotność ocenia się zabarwiając komórki jodkiem propidiowym, następnie zlicza cytometrem przepływowym EPICS Elite (Coulter).

Przygotowuje się roztwór 5 mM badanych związków z przykładów 2 i 3 w N,N-dimetyloacetaminie (DMA, Aldrich). Dalsze rozcieńczenia wykonuje się w pożywce hodowlanej. Testuje się następujące końcowe stężenia molowe: 1 x 10^-6, 2 x 10^-7, 4 x 10^-8, 8 x 10^-9, 1,6 x 10^-9, 3,2 x 10^-10, 6,4 x10^-11, 11,28 x 10^-11, 2,56 x 10^-12 i 5,12 x 10^-3. Każde stężenie testuje się w ośmiu studzienkach. Sprawdza się wpływ DMA na wszystkie linie komórkowe. Ustalono, że przy stężeniu maximum 0,02% DMA nie ma wpływu. Doksorubicynę przy stężeniach 1 x10^-7 M i 2 x 10^-7 M stosuje się jako pozytywną kontrolę.

Komórki posiewa się przy 5 x 10³ komórek na studzienkę na mikropłytce z 96 studzienkami (Costar Corporation, Cambridge, MA). Komórki inkubuje się przez 24 godziny w temperaturze 37°C wcelu umożliwienia namnażania się komórek. Testowane związki z przykładów 2 i 3 dodaje się następnie w stężeniach wskazanych powyżej i komórki inkubuje się w temperaturze 37°C w wilgotnej atmosferze z 5% CO2, przez 3 dni dla zrośniętych komórek (SW620, OVCAR-5, PC-3 i DU 145) i przez 5 dni dla komórek w zawiesinie (NCI-H69).

Przylegające komórki testuje się metodą SRB (opisaną przez L. V. Rubensteina, R. H. Shoemakera, K. D. Paulla, R. M. Simona, S. Tosiniego, P. Skehana, D. A Scudiero, A. Monksa, i M. R. Boyda „Comparison of in vitro anticancer-drug-screening data generated with tetrazolium assay versus a protein assay against a diverse panel of human tumor cell lines”, J. Nat. Cancer Inst., 82: 1113-1118, 1990). Po inkubacji przez 3 dni supernatant usuwa się i dodaje się 200 μΐ RPM1-1640 wolnego od płodowej surowicy cielęcej.

Komórki utrwala się dodając 50 μl 50% kwasu trichlorooctowego (końcowe stężenie kwasu trichlorooctowego 10%) i inkubuje w temperaturze 4°C przez 1 godzinę. Studzienki przemywa się 5 razy wodą, następnie zabarwia 50 μl 0,4% roztworu sulforodaminy B (SRB, Sigma) w 1% kwasie octowym w temperaturze otoczenia przez 10 minut. Barwnik solubilizuje się 100 μl buforu TR1S przy 10 mM, pH 10, przez około 5 minut z mieszaniem, mikropłytki odczytuje się stosując spektrofotometrię przy 570 nm.

Komórki w zawiesinie testuje się metodą XTT (opisaną przez D.A. Scudiero, R. H. Shoemakera, K. D. Paulla, A. Monksa, S. Tierneya, T. H. Nofzigera, M. J. Currensa, D. Seniffa i M. R. Boyda: „Evaluation of a soluble tetrazolium/formazan assay for cellgrowth and drug sensitivity in culture using human and other tumor celllines”, Cancer Research 48:4827-4833, 1988). Po inkubacji w obecności testowanego związku z przykładów 2 i 3 do hodowli dodaje się XTT [sól sodowa 2,3-bis(2-metoksy-4-nitro-5-sulfofenylo)-2H-tetrazolio-5-karboksyanilidu, (Sigma)] i metosiarczan fenazyny (PMS, Sigma) w roztworze w solankowym buforze fosforanowym i komórki inkubuje się przez 4 godziny w temperaturze 37°C w atmosferze z 5% CO2. Końcowe stężenia XTT i PMS wynoszą odpowiednio 50 i 0,38 μg/studzienkę. Wytwarzanie formazanu zatrzymuje się dodając 10 μl dodecylosiarczanu sodu o stężeniu 10% (Sigma) i odczytuje absorbancję stosując spektrofotometrię przy 450 nm z filtrem odniesienia przy 600-650 nm.

PL 195 289 B1

Wyniki

Stężenia molowe związków z przykładów 2 i 3 hamujące proliferację komórek o 50% zestawiono w następującej tabeli.

Linia komórkowa	Przykład 2	Przykład 3
5W620	5x 10^-9	3x 10^-8
OVCAR-5	8x 10^-9	4x 10^-8
PC-3	1 x 10^-8	3 x 10^-8
DU 145	1 x 10^-9	7x 10^-9
NCI-H69	3x 10^-10	1 x 10^-9

Zastrzeżenia patentowe

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Analog kamptotecyny o wzorze (II) przedstawionym poniżej i jego sole, takie jak np. sól o wzorze (III) przedstawionym poniżej

PL 195 289 B1
2. Związek pośredni o wzorze ogólnym M przedstawionym poniżej w którym R oznacza rodnik etylowy.
3. Sposób wytwarzania związku pośredniego o wzorze ogólnym M przedstawionym poniżej, w którym R oznacza rodnik etylowy, znamienny tym, że obejmuje następujące kolejne etapy: - racemiczny ester t-butylowy o wzorze przedstawionym poniżej traktuje się kwasem trifluorooctowym przez 18 godzin w temperaturze otoczenia z wytworzeniem odpowiedniego kwasu karboksylowego;

- następnie sól chinidynową otrzymanego uprzednio kwasu ogrzewa się w alkoholu izopropylowym w temperaturze wyższej niż 30°C, a korzystnie w temperaturze około 50°C, po czym pozostawia się środowisko reakcji do ochłodzenia do temperatury otoczenia tak, że sól jednego enancjomeru wspomnianego powyżej kwasu krystalizuje, podczas gdy sól drugiego enancjomeru, której anion ma wzór przedstawiony poniżej, pozostaje w roztworze

PL 195 289 B1

- roztwór w alkoholu izopropylowym soli enancjomeru, która nie wykrystalizowała, zatęża się, traktuje kwasem chlorowodorowym i miesza, wytwarzając związek o wzorze ogólnym A przedstawionym poniżej

- związek o wzorze ogólnym A kontaktuje się następnie z palladem na wilgotnym węglu, po czym dodaje się do mieszaniny mrówczan amonu lub kwas mrówkowy z wytworzeniem debenzylowanego produktu o wzorze ogólnym B przedstawionym poniżej

- następnie związek o wzorze ogólnym B cyklizuje się działaniem dicykloheksylokarbodiimidu z wytworzeniem laktonu o wzorze ogólnym C przedstawionym poniżej

- wreszcie, grupę -OCH3 laktonu o wzorze ogólnym C przekształca się w karbonyl w wyniku działania jodkiem sodu i chlorkiem trimetylosililu, z wytworzeniem związku o wzorze ogólnym M przedstawionym poniżej

PL 195 289 B1
4. Związek określony wzorem (II) przedstawionym poniżej lub sól addycyjna związku o wzorze (II) z farmaceutycznie dopuszczalnymi mineralnymi lub organicznymi kwasami, taka jak np. sól o wzorze (III) przedstawionym poniżej lub dowolna mieszanina określonych powyżej związków jako lek.
5. Kompozycja farmaceutyczna zawierająca substancję aktywną i farmaceutycznie dopuszczalny nośnik, znamienna tym, że jako substancję aktywną zawiera co najmniej jeden ze związków określonych w zastrz. 4.
6. Zastosowanie związku określonego w zastrz. 1do wytwarzania leków przeciwnowotworowych.
7. Zastosowanie związku określonego w zastrz. 1do wytwarzania leków przeciwwirusowych.
8. Zastosowanie związku określonego w zastrz. 1do wytwarzania leków przeciwpasożytniczych.