NO303230B1 - FremgangsmÕte for dannelse av cellemasse og/eller fermenteringsprodukter under sterile betingelser samt anvendelser av denne - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse angår en fremgangsmåte for dannelse av cellemasse og/eller fermenteringsprodukter under sterile betingelser, hvorunder fermenteringsblandingen i det minste tidvis føres i kretsløp og stoffskifteprodukter fra de kultiverte celler og eventuelt cellemasse fraskilles, samt anvendelse av en anordning for produksjon av cellemasse og/eller fermenteringsprodukter ved utførelse av denne fremgangsmåte.

I den biotekniske industri anvendes for tiden som regel trinnvis utførelse for fremstilling av fermenteringsløsninger, for produksjon av biomasse og for dannelse av stoffskifteprodukter ved utnyttelse av fermenter. Denne trinnvise driftsmåte omfatter normalt innpodning av et næringsmedium med den ønskede kultur, kultivering over et bestemt tidsrom under nøyaktig fastlagte betingelser samt høsting av mikroorganismen og/eller utvinning av de ønskede stoffskifteprodukter.

Denne trinnvise fremgangsmåte har imidlertid en rekke ulemper.

Mediesteriliseringen finner nemlig som regel sted ved driftskonsentrasjon med fylt fermenteringstank. I anlegg som har beholdere større enn 1000 liter arbeidsvolum kreves det da høye oppvarmings- og kjøleomkostninger ved termisk sterilisering av medier. På grunn av den lange oppholdstid av mediet ved temperaturer over 80°C forekommer det hyppig kvalitetstap for vedkommende medium.

Tidsbehovet for steriliseringen ligger vanligvis på flere timer, hvilket innebærer et ugunstig forhold mellom forberedelsestid og arbeidstid. Dette forhold blir da i stigende grad mer ugunstig jo kortere den egentlige fermenteringstid er, og når ved korttids-fermentering et forhold på 1:1.

Veksten av mikroorganismer og levende celler forløper vanligvis under ugunstige betingelser ved den trinnvise fermentering. For å innlede veksten behøver cellene en viss tid (lag-Phase) for tilpasning til mediet. Ved sådan trinnvis fermentering står ved begynnelsen av prosessen det laveste kimantall (podekimtall) overfor den høyeste substratkonsentrasjon, hvilket i mange tilfeller fører til substrathemning.

I lag-Phase er forholdet mellom vekststoffskiftet og vedlikeholdstoffskiftet meget ugunstig, idet organismen fortærer substrat men likevel ikke vokser. Dette innebærer dårlig substrathusholdning med hensyn på cellemasseutbytte og/eller katabolitdannelse og/eller biokjemiske transformasjonsprodukter.

Også ved overgang til den etterfølgende eksponensielle vekstfase er vedlikeholds-stoffskifteandelen fremdeles høy.

Den eksponensielle vekstfase utgjør det optimale område for vekst, hvor vedlikeholds-stoffskiftets andel er liten i forhold til den andel som vekststoffskiftet utgjør, og omsetningen av substratet er da optimal i cellemassen. Ved porsjonsvis igangsetting avsluttes imidlertid den eksponensielle vekstfase som regel etter kort tid på grunn av den stigende konsentrasjon av stoffskifteprodukter, idet det da opptrer en produkthemning, hvilket vil si at konsentrasjonen av de stoffskifteprodukter som avgis fra cellene til mediet blir så høy at det først gir en langsommere vekst og deretter veksten helt opphører.

Hvis produkthemningskonsentrasjonen ved bestemte celletyper er meget lav eller produktdannelsestakten pr. celle er meget høy, så opptrer det meget tidlig i dyrknings-forløpet en vekst- eller metabolitproduksjonshemning og som således fører til dårlig utbytte. Den tid hvor den større mengde metaboliter dannes blir da på grunn av den korte eksponensielle vekstfase i alle tilfeller meget kort. Ved trinnvis produksjon av cellemasse eller metaboliter eller transformasjonsprodukter frembringes hovedmassen i løpet av meget kort tid ved slutten av den eksponensielle vekstfase. Fermenteren har således en meget kort fase med høy produktivitet (høyt rom/tid-utbytte).

Som det vil fremgå av figur 1, frembringes under de beskrevne forhold ca. 50% av den utvunnede biomasse under prosessen, i løpet av en time. Hvis den samlede prosesstid, hvilket vil si forberedelse - produksjon - maskinrengjøring, antas å være 24 timer, så har fermenteren bare optimale betingelser under 1/24 av sin virksomme tid.

I mellomtiden er imidlertid noen fremgangsmåter for kontinuerlig fermentering av flytende substrater blitt kjent. Således beskriver DE-A 33 23 205 en fremgangsmåte og en innretning for kontinuerlig fermentering av et flytende substrat under samtidig utskillelse av de dannede stoffskifteprodukter i fermenteringsprosessen. Denne driftstype er kjennetegnet ved at fermenteringsblandingen føres i kretsløp for å fremme fermenteringen, hvor innenfor dette kretsløp, også en membranoverflate overstrømmes med et tynt strømningssjikt og den fermenteringsblanding som fremføres i kretsløpet påføres et sådant trykk at under overstrømningen av membranet samtidig og ved hjelp av membranfiltrering, de dannede stoffskifteprodukter fraskilles fermenteringsblandingen selektivt og fraksjonert. For å opprettholde kontinuerlig drift er det forkoblet en substrat-matekrets, hvorfra det over en steriliseringsmodul kontinuerlig trekkes ut fersk substrat som kan ledes inn i fermenteringsblandingens kretsløp. Stoffskifteproduktene kan da kontinuerlig trekkes ut av prosessen.

Denne kjente kontinuerlige fremgangsmåte oppviser imidlertid likevel en rekke mangler, som skriver seg såvel fra konstruktive forhold som også fra særtrekk ved fremgangsmåtens utførelse.

Fremgangsmåten i henhold til DE-A 33 32 205 arbeider således med en membran for å skille ut de dannede stoffskifteprodukter fra fermenteringsblandingen. Sådanne membraner har imidlertid en tendens til å bli tilstoppet, hvilket nedsetter effektiviteten ved fraskillelsen og gjør det nødvendig å anvende meget store membranoverflater. I tillegg må det benyttes bestemte teknikker og høye trykk for å gjøre membranen gjennom-trengelig. Videre tillater membranen heller ikke kontinuerlig avslemning av fermenteringsanlegget og heller ikke kontinuerlig fraskillelse av den dannede cellemasse ved fermenteringen.

Utover dette oppviser denne kjente fremgangsmåte også en rekke av de ulemper som ovenfor er angitt for den trinnvise fremgangsmåte. Disse ulemper gjelder særlig steriliseringen av anlegget og mediene, og videre manglende muligheter for å tilpasse kulturbetingelsene til den foreliggende vekstfase for mikroorganismen. Dette fører til nedsatt cellemasseutbytte og/eller katabolitdannelse ved samtidig lavere substratutnyttelse, og medfører i tillegg altfor lange dyrkningstider.

Fra US-A 4 167 450 er det kjent en fermenteringsmetode hvor cellemassen opprettholdes i en vedlikeholdsstoffskifte-tilstand. Metoden sikter til produksjon av stoffskifteprodukter uten at cellemassen derved øker. Ifølge denne metode blir inokulum inngitt i en fermenter som allerede er fullstendig fylt med substrat. For å begrense kulturens vekstrate i reaktoren, senkes substratkonsentasjonen i løpet av prosessen

EP-A 0 065 895 beskriver en prosess for fremstilling av mikroorganismer, hvor mikroorganismen i en første fase dyrkes i et sterkt konsentrert næringsmedium, idet denne konsentrasjon holdes konstant. I en andre fase blir brukt næringsmedium utvekslet og næringsmediumkonsentrasjonen senket for å undertrykke dannelse av vekstrate-hemmende metaboliter.

FR-A 2 259 903 beskriver en konvensjonell kontinuerlig fermenteringsprosess hvor en del av mediet fjernes og samtidig erstattes med nytt medium, idet fermenteringsenheten er utstyrt med en resirkuleringskanal. FR-A 2 611 742 beskriver en prosess for fremstilling av mikroorganismer og/eller metaboliter i et næringsmedium, og hvor substratkonsentrasjonen holdes konstant så lenge prosessen varer. Reaktoren muliggjør utveksling av brukt næringsmedium og trinnvist kontinuerlig prosessforløp.

EP-A 0 051 151 angår en fermenteringsprosess og en dertil egnet reaktor, hvor skum ved hjelp av en sentrifuge-innretning i selve reaktoren separeres i en gassfase, en celle-fattig, flytende fase og en celle-rik, flytende fase.

Formålet for foreliggende oppfinnelse er derfor å fremskaffe en fremgangsmåte av innledningsvis angitt art og hvorved det såvel ved kontinuerlig som også halvkontinuerlig eller trinnvis drift er mulig å oppnå en optimal tilpasning av kulturbetingelsene til vekstfasen for en kultivert mikroorganisme, samt også optimal innstilling av cellemasse-produksjonen og/eller katabolitdannelsen, mens næringsmediet disponeres optimalt for vedkommende formål.

Dette oppnås i henhold til oppfinnelsen ved hjelp av en fremgangsmåte av innledningsvis angitte art, som omfatter følgende prosesstrinn: a) fermenteringsanlegget tilføres en tilstrekkelig mengde næringsmedium til å starte den ønskede cellekultur, b) anlegget steriliseres og den ønskede næringsmediumkonsentrasjon, som er lavere enn cellekulturens spesifikke næringsmediumkonsentrasjon, innstilles, c) næringsmediet innpodes med en podekultur og på en porsjonsvis måte og med delvis fylling av fermenteringsanlegget tillates denne kultur uforstyrret vekst i et

fastlagt tidsrom,

d) næringsmediets konsentrasjon økes opp til cellekulturens spesifikke næringsmediumkonsentrasjon ved samtidig økning av næringsmediets volum til arbeids-volumet for såvel anlegget som dets cellekonsentrasjon, e) det utføres en overgang til kontinuerlig drift under utveksling av næringsmediet og fraskillelse av stoffskifteprodukter, såvel som fullstendig eller delvis celle-resirkuler-ing, f) den kontinuerlige drift avbrytes ved et ønsket tidspunkt og cellemassen høstes under sterile betingelser, og g) valgfritt blir en del av eller alle nevnte prosesstrinn gjentatt i den angitte rekkefølge.

Foretrukne utførelsesformer av fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen er angitt i de vedføyde underkrav.

Fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen kan anvendes i enhver vanlig fermentering av kultiverbare mikroorganismer. Vanlige kultiveringsbetingelser og næringsmedier blir benyttet, og fordelen ved fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen ligger da i fremgangsmåtens spesielle utførelse og ikke i anvendelse av spesielle betingelser eller medier. I den utstrekning det i henhold til oppfinnelsen omrøres i høy takt eller fraskillelse finner sted ved hjelp av en sentrifuge, foretrekkes det organismer som ikke er skjærkraftfølsomme.

Oppfinnelsens fremgangsmåte kan anvendes for dyrkning av bakterier og sopper av forskjellig art. Særlig er den egnet for kultivering av bakterier, aerobe såvel som anaerobe, samt gram-positive såvel som gram-negative. Det kan særlig nevnes forskjellige coccer, særlig mikrococcer, planococcer, deinococcer, staphylococcer, stomatococcer, streptococcer, leuconostoccer, pediococcer, aerococcer, gemella, peptococcer, pepto-streptococcer, ruminococcer, cuprococcer, såvel som av arten sarcina. Videre er den egnet for bakterier av artene bacillus, sporolactobacillus, clostridium, desulfotomaculum, sporosarcina, planococcus, lactobacillus og korthia. Videre er egnet bifidobakterier, brevibakterier, bakterier av arten zymomonas, aceto-bakter, gluconobakter, pseudomonas, vibrio og aeromonas. Nevnes kan videre gram-negative anaerobe bakterier av artene escherichia, shigella, edwardsiella, citrobakter, salmonella, klebsiella, enterobakter, hafnia, serratia, proteus, providencia, morganella, yersinia, erwinia, obesumbacterium, kluyvera, cedecea, tatumella, zenorhabdus og rahnella. Gram-negative aerobe kortstaver og kokker, som er egnet for fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen, er slike som tilhører familiene pseudomonadaceae, azoto-bakteraceae, rhizobiaceae, methylococcaceae, halobacteriaceae, acetobacteraceae, legionellaceae og neisseriaceae.

Fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen egner seg både for formering og utvinning av de derved kultiverte mikroorganismer, som da kan utskilles fra prosessen og til slutt kan utnyttes videre, samt også for utvinning av de frembragte stoffskifteprodukter av mikroorganismene. Den gjør det da mulig på enkel måte å optimere utbyttet av mikroorganismer eller av stoffskifteprodukter, hvilket innebærer innstilling i et arbeidspunkt hvor den maksimale formeringstakt av mikroorganismen utnyttes, eller også hvor den optimale substratomforming finner sted. Fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen gjør det også mulig å innstille arbeidspunkter hvor bare en liten andel av vedlikeholdsstoffskiftet går til substratutnyttelse, hvilket er viktig ved dannelse av cellemasse, eller også med en høy andel av vedlikeholdsstoffskifte og liten celleproduksjon, hvilket er av betydning ved utvinning av stoffskifteprodukter. Videre muliggjør denne fremgangsmåte en vidtgående utnyttelse av det foreliggende næringsmedium og likeledes en kontinuerlig bortføring av stoffskifteproduktene, således at en substrathemning unngås.

Oppfinnelsen vil nå bli nærmere forklart ved hjelp av de vedføyde tegninger, på hvilke:

Fig. 1 angir cellemasseutbytte pr. tidsenhet for staphylococcus carnosus Sd,

fig. 2 gir en sammenligning mellom tids- og energibehovet ved sterilisering av en 5000

I fermenter ved forskjellige steriliseringsvolum,

fig. 3 angir den midlere vekstrates (u) avhengighet av utgangskonsentrasjonen for

glykose i mediet for lactobacillus curvatus S3,

fig. 4 angir forløpet av den spesifikke vekstrate u ved lineær og eksponensiell

cellevekst,

fig. 5 angir en fermenter i henhold til oppfinnelsen med celletilbakeføring over en

separator;

fig. 6 angir styringen av fermenteren i henhold til oppfinnelsen med celletilbakeføring

over en separator,

fig. 7 angir den utledede prosessparameter ved kultivering av pediococcus pentosaceus i avhengighet av tiden,

fig. 8 angir utvalgte parametere som viser den oppnådde prosessparameter ved

kultivering av pediococcus pentosacirus,

fig. 9 tilsvarer fig. 7 for lactobacillus curvatus stamme 2, og

fig. 10 tilsvarer i denne forbindelse fig. 8.

Fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen kan oppdeles i fem prosesstrinn, som etter starten av anlegget forløper syklisk samt kan fordeles på følgende prosesstekniske formål: 1. Forberedelse og sterilisering av fermenteringsanlegget og næringsmediums-komponentene, 2. anleggets første arbeidssyklus i en stykkvis prosess og med lav mediekonsentrasjon og delutfylling, 3. etter oppnåelse av en spesifikk mediekonsentrasjon, overgang til regulert mediumdosering inntil fermenteringens endevolum er oppnådd, 4. overgang til kontinuerlig driftsmodus med næringsmediumsutveksling og fullstendig celletilbakeføring, eller med delvis cellefraskillelse, 5. avbrudd av det kontinuerlige fermenteringsavsnitt og høsting av den samlede biomasse under sterile betingelser, 6. eventuell ny tilførsel av sterile næringsmedier i det sterile anlegg samt gjentagelse av prosesstrinnene 1-5 under innsparing av samlet steriliseringstid og energi.

Steriliseringen av anlegget som helhet i prosesstrinn 1 finner sted på sådan måte at et mediumkonsentrat varmesteriliseres i produksjonskjelen. Så snart dette konsentrat etter steriliseringen er nedkjølt til under 100°C, blir det ved direkte innsprøytning av sterilisert, kaldt uttynningsvann og deretter sterilfiltrerbare medier i løpet av kort tid nedkjølt til fermenteringstemperatur. Herved innspares den termiske energi for varmesterilisering av det samlede mediumvolum samt kjøle-energi for nedkjøling av det samlede fermenteringsvolum ved temperaturer på nesten 100°C til fermenteringstemperaturen, i den utstrekning blandingsforholdene mellom kald og varm fase er avstemt i forhold til hverandre, og dessuten den tid som nødvendigvis går med til kjøling av det samlede fermenteringsvolum over den omrørte kjele over dobbeltmantelen, da den tid er forholdsvis kort, som går med til konsentratkjøling ved direkte innsprøytning av sterilt vann inntil fermenteringsvolumet er oppnådd.

Figur 2 gir en sammenligning av tids- og energibehov for sterilisering av en 5000 I fermenter ved forskjellige steriliseringsvolum. Det oppnås da en innsparing på ca. 25% med hensyn på tid samt 75% innsparing av gass, vann og strøm.

Igangsettingen av anlegget innledningsvis med lav mediekonsentrasjon i henhold til trinn 2 gjør det mulig å oppnå en optimal tilpasning av cellene til sitt substrat og frembringe høye cellevekstrater, da det ved tilsvarende mediekonsentrasjoner hverken opptrer substrat- eller produkthemning. I motsetning til dette velges ved vanlige igangsetnings-prosesser mediekonsentrasjonen høy for derved å oppnå høyt utbytte, hvilket ved begynnelsen av prosessen fører til en substrathemning som gjør vekstforholdene og katabolit- og transformasjonsproduktutbyttet for cellemassen dårligere.

Figur 3 viser avhengigheten mellom glykosekonsentrasjonen i vekstmediet og den midlere vekstrate u for stammen lactobacillus curvatus som stedfortreder for de andre mikroorganismer. Jo høyere glykosekonsentrasjonen i mediet ligger, desto lavere vil den midlere vekstrate være, hvilket vil si at ved lavere glykosekonsentrasjoner forhøyes den midlere vekstrate.

I trinn 3 doseres i avhengighet av forbruk av et ledesubstrat eller over en forut fastlagt doseringsfunksjon, medium med en bestemt konsentrasjon inn i fermenteren, hvilket fører til en volumøkning. Den stigende cellekonsentrasjon fortynnes stadig ved dosering av mediet, således at ingen produkthemning opptrer. Konsentrasjonen av det tilførte medium er innstilt slik at når fermenteringens sluttvolum oppnås, foreligger det en samlet mediumkonsentrasjon hvor vekstraten fremdeles er så høy at prosentandelen av vekststoffskiftet i forhold til prosentandelen av vedlikeholdsstoffskiftet ikke overskrider en verdi som gjelder for vedkommende celle.

Prosesstrinn 3 oppviser i forhold til det innledende prosessforløp den fordel at mediedoseringsmengden stiger i løpet av celleveksten, mens stoffkonsentrasjonen i mediet hovedsakelig holdes konstant. Dette frembringer en eksponensiell cellevekst over hele prosesstrinnet. Ved de tidligere igangsettingsprosesser avtar prosessmengden under celleveksten, mens stoffkonsentrasjonen forandres. Dette motvirker den ideelle cellevekst. Den ytterligere fordel ved prosesstrinn 3 er den meget gode substratutnyttelse i dette prosesstrinn, forårsaket av den behovsorienterte mediumsdosering.

Ved oppfinnelsens fremgangsmåte innledes ved oppnåelse av fermenteringens endevolum i skritt 4 en medieutveksling. Fraskillelse av mediet finner sted ved hjelp av et sterilt fraskillelsessystem, fortrinnsvis ved hjelp av en steril løpende sentrifuge. Cellene blir i henhold til en første prosessvariant 4a fullstendig tilbakeført i prosessen. Det fraskilte, forbrukte medievolum blir da tilført systemet i form av ferskt medium. Konsentrasjonen av det inndoserte medium er valgt slik at den ligger under den konsentrasjon som fører til produkthemning, således at cellemassen bringes til å vokse substratbegrenset.

Overgangen fra igangsettingsmodus til kontinuerlig prosessmodus finner sted på den måte som vil bli beskrevet i det følgende, for derved å sikre maksimal substratutnyttelse. For innledning av det kontinuerlige prosesstrinn beregnes mediumsdoseringsmengden utfra det spesifikke forbruk av ledesubstrat eller ved hjelp av vekstkurven, mens mediets utvekslingsvolum fra begynnelsen av det kontinuerlige trinn holdes på den størst mulige fraskillingstakt. Dette fører ved begynnelsen av det kontinuerlige prosesstrinn til en uttynning av mediet samt til øket utvasking av stoffskifteproduktene, hvilket fremmer den videre vekst av cellen.

Ved det videre dyrkningsforløp øker mediebehovet med økende cellemasse inntil den mediedoseringsmengde oppnås, hvorved den doserte mediekonsentrasjon oppnår det optimale kontinuerlige arbeidsområde. Fra og med dette tidspunkt holdes mediedoseringsmengden konstant, idet systemet nå befinner seg i stabilt substratbegrenset tilstand. Cellenes spesifikke vekstrate u, som frem til det optimale kontinuerlige arbeidsområde opprettholdes på tilnærmet samme verdi, synker eksponensielt i drift innenfor det optimale kontinuerlige arbeidsområdet, mens kimtallet tiltar lineært.

Figur 4 viser forløpet for den spesifikke vekstrate u ved lineær og eksponensiell cellevekst. Sammenligner man den tid som en eksponensielt voksende organisme behøver for å nå et bestemt kimtall med den tid den samme organisme behøver når den vokser lineært, så fremkommer det en betraktelig tidsdifferanse. Lineær vekst finner sted i en kultur når næringsmiddeltilførselen eller næringsmediets tilgjengelighet ikke er eksponensiell, men lineær. Ved lineær vekst avtar vekstraten u-eksponensielt med stigende celletall. Derved blir andelen av vedlikeholdsstoffskiftet innenfor stoffskiftet som helhet meget høy. Eksperimentelt kan det utledes ved hvilken u-verdi delfraskillelsen skal begynne.

Ved en annen variant 4b utføres fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen innenfor prosesstrinn 4 under delvis fraskillelse av mikroorganismene, ved en type biokjemiske transformasjoner. Her innledes i prosesstrinn 4 med en cellemassekonsentrasjon hvor vekstraten u ligger i punktet for maksimal transformasjonstakt. Når dette punkt er oppnådd, påbegynnes et cellemasseuttak fra systemet. Cellekonsentrasjonen i systemet holdes derved konstant. På denne måte holder man systemet på et fastlagt arbeidspunkt med maksimal transformasjonstakt.

Prosesstrinn 5 med avbrudd av det kontinuerlige fermenteringstrinn innledes da i prosessvarianten 4a når vekstraten u har nådd en nedre grenseverdi. Denne grenseverdi kan som regel utledes fra cellenes stoffskiftefysiologi, idet cellene alt etter påfølgende innføring må oppvise bestemte særtrekk.

Ved høsting av dyrket masse i henhold til 4a fraskilles den samlede biomasse. Dette prosesstrinn tilsvarer i prinsippet en innledende arbeidsprosess, men skiller seg sterkt fra denne med hensyn til cellemasseutbytte. Utbyttet ligger ved oppfinnelsens fremgangsmåte betydelig høyere enn ved vanlige innledende arbeidsprosesser.

Innhøstningen i samsvar med en igangsettende arbeidsprosess (trinn 4a) er viktig ved sådanne prosesser hvor produktet utfra rettslige eller bearbeidingstekniske synspunkter må defineres som råvaremengde, slik som f.eks. i den farmasøytiske industri eller næringsmiddelindustrien. Fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen oppviser således fordelene ved en kontinuerlig fremgangsmåte med celletilbakeføring med henblikk på celle-gevinst, samt også fordelene ved en entydig råvaredefinisjon. Innhøstingen finner likeledes sted under sterile betingelser.

Med hensyn til prosesstrinn 4b er imidlertid en fullstendig kontinuerlig fermenteringsprosess beskrevet, hvis avbrudd i prosesstrinn 5 ikke finner sted ved cellemassens vekstkinetikk, men på grunn av ytre innflytelser, slik som f.eks. infeksjon, sviktende anleggskomponenter eller bevisst avbrudd.

Etter innhøstingen i skritt 5 spyles den produktberørte del av anlegget med sterilfiltrert vann, samt fylles med nettopp sterilisert medium fra doseringstanken og er da umiddelbart atter beredt for den neste igangsetting. Denne igangsettingsmasse podes atter med en forkultur som befinner seg i den eksponensielle vekstrate, og prosessen gjentas.

Ved fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen blir produksjonsfermenteren bare sterilisert ved en første igangsetting eller etter en infeksjon, idet bare sterilisering av en forlagringsbeholder finner sted ved de følgende igangsettinger. Eventuelt kan mediet innføres i fermenteren i varm tilstand, og der nedkjøles raskt ved direkte innsprøyting av vann.

Fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen kan gjennomføres ved hjelp av en anordning med en steriliserbar fermenteringskjele, minst en tank for opptak og termisk sterilisering av en ikke-steril filtrerbar mediumkomponent og/eller minst en forrådsbeholder for opptak av en steril filtrerbar mediumkomponent og med et sterilfilter for kontinuerlig frembring-else av en mediumkomponent i steril tilstand, samt et steriliserbart kretsløp forbundet med fermenteringskjelen og utstyrt med innretninger for utskillelse av forbrukt næringsmedium og stoffskifteprodukter, idet det steriliserbare kretsløp oppviser en sentrifuge for utskilling og utvinning av cellemasse samt forbrukt næringsmedium.

En sådan anordning og dens drift vil bli nærmere beskrevet i det følgende under henvisning til figur 5.

Fermenteren F1 utluftes ved hjelp av sterilfiltrert luft LF1 og er tilkoblet sentrifugen Z1 over et dampsteriliserbart kretsløp. En pumpe P1 driver det utskilte konsentrat i Z1 tilbake i F1. Fermenteren F1 beskikkes valgfritt over tanken B1 og/eller over sterilfiltreringen S1 med sterilfiltrert eller direkte over tanken B1 med termisk sterilisert medium. Mediumforlagrene S kan i tillegg beskikkes over sterilfiltreringen M1 med sterilfiltrert medium. Målingen, styringen og vurderingen av det samlede anlegg finner sted over et integrert prosess-styringssystem, som prosess-spesifikt er programmert med programvare og er skjematisk vist i figur 6.

Fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen kan oppdeles i de tidligere angitt 6 prosesstrinn, som vil bli beskrevet i det følgende. Forklaringen av prosesstrinnene 1 til 6 finner sted under henvisning til figur 5.

Trinn 1 omfatter forberedelse og sterilisering av fermenteringsanlegget og nærings-mediumkomponentene, samt består av 6 deltrinn: 1.1 Forlagring av prosessvann i beholder F1 og fylling av beholder Fn og B1 med

medium.

1.2 Termisk sterilisering av ikke sterilfiltrerbart medium-konsentrat i F1.

1.3 Direkte innsprøytning av sterilt kjølevann i F1 fra sterilfiltreringen S1.

1.4 Overføring av sterilfiltrert medium fra beholderen B1 i fermenteren F1 samt

forlagrene S og A for mediet.

1.5 Innstilling av fermenteringsvolumet i F1 med sterilt vann fra S1.

1.6 Fornyet oppfylling av B1 med konsentrat av ikke sterilfiltrerbare mediebestanddeler

samt termisk sterilisering av B1 med påfølgende indirekte vannkjøling.

I trinn 1.1 innføres først i fermenteren F1 og beholderen B1 en nødvendig prosess-vannmengde for løsning av mediene over hovedventil og prosessvanntilløp ved V17, V18. De to beholdere fylles over håndåpningshull H1, H2 med medium, og mediet omrøres til klumpfri tilstand med omrører RF1 og RB1. I begge beholdere befinner det seg nå mediumkonsentrat.

Mediumkonsentratet i F1 steriliseres termisk i trinn 1.2 over varmemantelen HM1 og avkjøles til under 100°C.

Over ventil V2 blir da i trinn 1.3 sterilt prosessvann innsprøytet under omrøring fra sterilfiltreringen S1, inntil en blandetemperatur på ca. 60°C er oppnådd.

Over ventil V11 på beholderen B1 blir da sterilt medium overført over sterilfiltreringen S1 inn i fermenteren F1. Likeledes blir i trinn 1.4 sterilfiltrert medium innført over ventilene V12, V13 inn i mediumforlagrene S, A.

I det påfølgende trinn 1.5 blir begynnelses-fermenteringsvolumet F1 oppfylt med sterilt prosessvann fra sterilfiltreringen S1 over ventilen V2. Fermenterens fyllningsvolum beløper seg nå til ca. 1/3 - 1/4 av det maksimale arbeidsvolum. Mediumkonsentrasjonen er da innstilt for prosessens begynnelse, idet blandetemperaturen ligger mellom 30 og 35°C og dermed som regel nær prosesstemperaturen.

Den tomme og spylte beholder B1 blir i prosesstrinn 1.6 etter forinnføring av prosessvann over ventil V17, fylt over håndåpningshull H2 med ikke-sterilfiltrerbare mediebestanddeler, hvorpå disse steriliseres termisk som konsentrat over varmemantelen HM2 samt indirekte nedkjøles ved hjelp av vannkjøling. De foreliggende mediumbestanddeler som foreligger i beholder i beholder B1 og mediumforlagrene S, A tjener i de videre prosesstrinn til mediumdosering.

Prosesstrinn 2 omfatter anleggets første arbeidssyklus med innledende prosessforløp under lav mediekonsentrasjon og delvis fylling, og består hovedsakelig av fire deltrinn: 2.1 Aktivering av prosess-styringssystemet PLS

2.2 Inokulering av fermenteren F1

2.3 Cellevekst

2.4 Omkobling til trinn 3 i samsvar med forut fastlagte koblingskriterier.

Prosess-styringssystemet PLS overvåker og kontrollerer prosessen som helhet. Det består av en regneenhet RE, et tastatur TA, en billedskjerm Bi og en knappsats Du. Prosess-styringssystemet er over et datagrensesnitt av typen RS 232 toveis forbundet med regnemaskingrensesnittet Cl for innstillingsstyringen av fermenter F1 SPS og styrer over ventilstyringen SPS VS direkte eller indirekte over en forut angitt tilsiktet verdi til regulatoren R, ventilen V og pumpen P. Alle målte verdier i prosessen blir overført over måleverdiforsterkeren MV, datamaskingrensesnittet Cl og datagrensesnittet RS 232 til prosess-styringssystemet PLS. Før begynnelsen av prosessen lastes den prosess-spesifikke programvare inn. Denne inneholder alle alarmverdier, tilsiktede innstillings- verdier, vurderingsfunksjoner, data for ventilstyring og dokumentasjon. Start-betingelsen for prosessen angis på forhånd fra PLS og inneholder innstillingen av f.eks. følgende parametere for F1:

Prosesstemperatur

pH-verdi

Redoxpotensial

Oksygenpartialtrykk

Vekt

Omrørerens omdreiningstall.

De styrte ventiler V1, V2, V3, V5 og V7 er da lukket, og anlegget er beredt for inokulering. Over innstikningsstussen AS blir den fremstilte podekultur inokulert i fermenteren F1, og prosessen startes av prosess-styringssystemet, hvilket vil si at prosessleder- og overvåkningsfunksjonen aktiveres.

I prosessens begynnelsesfase (trinn 2.3) løper celleveksten i samsvar med en

innledende prosess. Fordelen ved fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen ligger da i den lave mediumkonsentrasjonen, som tillater en optimal tilvekst av cellene samt en god tilpasning av cellene til sitt medium. Ved slutten av den innledende vekstfase og før en substrat-begrensning nås, må det utfra et koblingskriterium kobles om til neste prosesstrinn, nemlig mediumdoseringen (trinn 2.4). Opprettelsen av koblingskriteriene vil i det følgende bli beskrevet ved hjelp av noen eksempler.

Som eksempel for dannelse av et koblingskriterium over støchiometrisk titrering av stoffskifteproduksjonen tjener en homofermentativ lactobasillstamme, som omsetter glykose nesten kvantitativt til melkesyre.

Ved dyrkning av lactobasillene kjøres fermenteren F1 pH-statisk, hvilket vil si at den avtagende pH-verdi, som betinges av den frembragte melkesyre, holdes konstant ved titrering med lut av en definert normalitet. Verdien av pH i fermenteren F1 blir målt og regulert ved hjelp av en pH-regulatorinnretning pH QAICR, som består av en målesonde MS, måleforsterker MV og regulator R. Målverdier og tilsiktede verdier utveksles ved hjelp av prosess-styringssystemet PLS, slik som beskrevet ovenfor. Luten befinner seg i mediumforlageret L og doseres over pH-regulatoren F1 pH QAICR og ventilen V4 inn i fermenteren F1. Lutforbruket i mediumforlageret L måles over en kapasitiv fyllnings-nivåsonde LIRA og de utledede verdier bearbeides i prosess-styringssystemet PLS. Koblingsterskelen defineres som total lutforbruksmengde. Opprettelse av koblingsterskelen finner sted ved hjelp av forforsøk, hvor cellene i dyrkningsmediet kultiveres opp til stasjonær fase, lutforbruket fastlegges og derpå en lutforbruksmengde beregnes som tilsvarer en restsubstratmengde (glykosemengde) hvor cellene ennå ikke er substratbegrenset og fremdeles befinner seg i den eksponensielle vekstfase. Den beregnede lutforbruksmengde er således lavere enn den faktiske.

Som eksempel for dannelse av et koblingskriterium på basis av luftbehovet tjener en mikrococcestamme (aerob stamme). Oksygenpartialtrykket reguleres under veksten i trinn 2 til en konstant verdi. 02-reguleringsinnretningen 02QAICR består av en målesonde MS, måleforsterker MV og regulator R. Måleverdiene og de tilsiktede verdier utveksles i henhold til beskrivelsen under 2.1 ved hjelp av prosess-styringssystemet PLS. Utgangen fra regulatoren R påtrykkes reguleringsventilene V15 og V16, som styrer den innmatede gassmengde i prosessen.

Under den innledende vekst forbruker cellene i tiltagende grad mer luft, som måles med målere MF1 og MF2 for massegjennomløpsmengde. Dette gjelder så lenge det foreligger substrat og cellene formerer seg. Hvis cellene befinner seg i en substratbegrensning, vil luftbehovet synke mens oksygenpartialtrykket holdes konstant regulert over F1-02-QAICR og konstant omdreiningstall (regulert over SAICR). Denne senkning utnyttes som koblingsterskel.

Som eksempel på dannelse av koblingskriterium på grunnlag av C02-innholdet i den flytende fase eller gassfasen tjener en leuconostoc-stamme. Under den innledende vekstperiode produserer cellene C02som løser seg opp i mediet og kan avføles over en C02-måleinnretning F1-C02-QAIC, som består av en målesonde MS og forsterker MB. For å raskere kunne oppfange forandringer i C02-konsentrasjonen, tilføres fermenteren F1 nitrogen over massegjennomløpsmåleren MF2og omrøres med konstant omdreiningstall for å drive ut C02. Hvis cellene utsettes for en substratbegrensning, vil det produseres mindre C02og C02-partialtrykket i mediet vil avta. Denne avtagning utnyttes som koblingsterskel.

I trinn 3 finner overgangen til regulert eller styrt mediumdosering sted inntil fermenteringsvolumet er nådd. Trinnet består da hovedsakelig av to deltrinn:

3.1 Mediumdosering

3.2 Omkobling til trinn 4 i samsvar med forut gitt koblingskriterier.

Så snart innkoblingskriteriet for denne er oppfylt, begynner den regulerte mediumdosering. For dette formål utledes ved styringen over pH-verdien lutforbruket under de siste 2 til 10 minutter over nivåmålingen LIRA i mediumforlageret L og omregnes av prosess-styringssystemet til en doseringsmengde av lede-substrat (f.eks. glykose). Dette kan finne sted ved hjelp av følgende formel.

hvor:

Z = Lutforbruket i I

a = Normallut (mol)

t1= Måletid for lutforbruk (min)

k1= Korreksjonsfaktor for den ikke-dissosierte syre ved dyrknings-pH-verdien k2= Substratutnyttelsesfaktoren for vedkommende kultur k3= Fordoseringsfaktor

SDBed G|yk<=>Glykosedoseringsmengde (i g/min).

Ledesubstratet står i et fastlagt forhold utledet ved forforsøk til de øvrige substrat-bestanddeler. Prosess-styringssystemet beregner doseringsmengden for det øvrige substratkonsentrat samt vannmengden for fortynning til brukskonsentrasjon.

Mediumkonsentrasjonsdoseringen finner sted hver periode på 2 til 5 minutter. De sterilfiltrerbare mediumbestanddeler doseres inn fra mediumtanken S over ventilen V5, mens de termisk steriliserbare mediebestanddeler doseres fra beholderen B1 over ventil V1 samt fortynningsvannet over sterilfiltreringen S1 gjennom ventilen V2. De doserte mediumvolumer fra mediumtanken S og beholderen V1 avføles ved hjelp av kapasitive målesonder for fyllningsnivået. Doseringen av fortynningsvannet over sterilfiltreringen S1 styres over vektregulatoren WICA, idet fermenteren F1 på forhånd inngis en stigende tilsiktet vektverdi fra prosess-styringssystemet PLS.

Med stigende cellemasse i systemet stiger forbruket av ledesubstrat og således også av samlet medium. Da mediumkonsentrasjonen holdes konstant, øker stadig den doserte medium-mengde pr. doseringssyklus inntil den maksimale fermentfyllning er oppnådd. Konsentrasjonen av det doserte medium er valgt slik at det ved oppnåelse av maksimal fermenterfyllning også oppnås samlet mediummengde for maksimalt celleutbytte under de gitte driftsbetingelser. Denne verdi er det maksimale eller spesifikke celleutbytte. Ved organismer hvor intet eksakt bestembart ledesubstrat foreligger ved deres dyrkning, styres mediumdoseringen over en omhyllningskurve som tilsvarer den spesifikke eksponensialkurve for vekst av vedkommende organisme. Under forforsøkene bestemmes det spesifikke substratbehov for 1 * 10<12>celler, den spesifikke vekstrate u, det kimtall som i trinn 2 oppnås ved tidspunktet for koblingskriteriet, samt mediumkonsentrasjonen ved det maksimalt oppnåelige kimtall. ;Så snart det koblingskriterium som er beskrevet under trinn 2.4 er oppnådd, begynner den styrte mediumdosering. Den mediemengde som er nødvendig for å oppnå et kimtall på1x10<12>kimer, defineres som mediummengde 1 og er spesifikk for vedkommende stamme. Mediumkonsentrasjonen for det medium som skal doseres holdes konstant og innstilles slik at det ved oppnåelse av maksimal fermenterfyllning, også oppnås samlet mediummengde for maksimalt celleutbytte under de gitte driftsbetingelser. Under dyrkningens forløp ligger de doserte substratvolumer pr. doseringssyklus. ;Substratdoseringen SD kan beregnes etter formlene: ;;X0= Samlet kimtall i systemet ved doseringens begynnelse ;Xt= Samlet kimtall i systemet ved tidspunkt t ;u0= Spesifikk vekstrate ved doseringens begynnelse ;t = Tiden mellom måling x0og xt;sS = Spesifikt substratbehov for 1 * io<12>kimer (i g eller ml)

<SD>Ber = Beregnet substratdosering

Beregningen av doseringsverdiene og selve doseringen finner sted hver periode på 5 til 15 minutter. Hvis doseringsvolumene ved begynnelsen av doseringen er for små, blir de øket for neste doseringssyklus samt etter overskridelse dosert i en minimal doseringsmengde.

Hvis cellenes oksygenbehov målt over massefluksmåleme MF1 og MF2 over en viss tid ikke lenger stiger ved konstant omdreiningstall for omrøringsverket RF1, eller til og med avtar, hvilket da forårsakes av en substratbegrensning, så forhøyes doseringsmengden slik at substratbegrensningen oppheves. Hvis begrensningen etter en gangs økning av u fremdeles ikke er opphevet, blir u forhøyet enda en gang etter en prosess-spesifikk ventetid.

Tilpasningen av styrefunksjonen til prosessen kan ikke bare finne sted over 02-partial-trykket, men også ved hjelp av C02-partialtrykket som bestemmes av CCymålingen C02QAICR. Måleprinsippet er beskrevet under trinn 2.4.3. Hvis ved konstant omdreiningstall av omrøringsverket RF1 og konstant innblåst nitrogenmengde i fermenteren F1, målt ved hjelp av massefluksmåleren MF2, C02-partialtrykket ikke stiger men til og med avtar, hvilket forårsakes av en substratbegrensning, så forhøyer programvaren i prosess-styringssystemet PLS doseringsmengden med et bidrag som fører til en økning av næringsmedium-doseringen og opphever substratbegrensningen. Hvis denne begrensning etter en engangsforhøyelse av u fremdeles ikke er opphevet, finner en ytterligere forhøyning sted ved hjelp av programvaren i prosess-styringssystemet PLS etter en prosess-spesifikk ventetid.

Omkoblingskriteriet fra trinn 3 til trinn 4 bestemmes av vekten av fermenteren F1, målt ved hjelp av en vekt F1 WICA. Vektterskelen velges prosess-spesifikt.

Trinn 4 omfatter overgangen til kontinuerlig driftsmodus med næringsmiddelutveksling og fullstendig celletilbakeføring eller delvis cellefraskillelse, og består av fire hovedtrinn: 4.1 Igangsetting av sentrifugen og begynnelse av separeringen med celletilbake-føring,

4.2 Driftsprosess med fullstendig celletilbakeføring,

4.2.1 Substratdosering under celletilbakeføring,

alternativt

4.3 Prosessføring med delvis cellefraskillelse,

4.3.1 Prosessføring med fullstendig celletilbakeføring frem til delvis fraskillelse

begynner,

4.3.2 Omkobling til delvis cellefraskillelse

4.3.3 Delvis fraskillelse

samt

4.4 Avbrudd og omkobling til trinn 5.

Før koblingsterskelen oppnås i henhold til trinn 3.2 blir separatoren Z1 koblet inn, og etter at koblingsterskelen er oppnådd åpnes ventilen V7 via prosess-styringssystemet PLS. Over ventilen V8 innstilles allerede før separeringen den maksimale prosess- spesifikke gjennomløpstakt for separatoren. Den innstilte gjennomløpstakt registreres av den induktive fluksmengdemåler IDM 1 og fastlegges over prosess-styringssystemet PLS. For tilbakeføring av den fraskilte cellemasse innkobles pumpen P1 parallellt med ventilen V7. Ventilene V9 og V6 er åpne fra begynnelsen av prosessen.

Konsistensen av den fraskilte cellemasse må være flytende for at tilbakeføringen av cellemassen i henhold til trinn 4.2 over pumpe P1 skal være mulig, og tilbakeblanding av cellemassen i fermenteren finner da sted på kort tid. Ved sedimentandeler < 60% oppfyller konsistensen som regel disse fordringer. Fortykningsgraden bør ikke falle under 40% sediment, da i dette tilfellet det tilbakeførte mediumvolum nedsetter den effektive skilleytelse for separatoren Z1 til 15%.

Fortykningsgraden styres over tømmingstiden for separatoren Z1. Tømmingen finner sted hvert 3. til 4. minutt, da oppholdstiden av cellene i separatoren ikke kan overstige dette tidsrom. I avhengighet av den anvendte celleart gir dette lavest mulig skade på cellene.

Substratdoseringen finner sted under celletilbakeføringen samt videreføres eller eventuelt avbrytes ved tidspunktet for fullført tilbakeføring, alt etter den valgte parameter. Celle-tilbakeføring uten substratdosering er nødvendig ved slike organismer som først i fullstendig glykosefritt medium oppviser gode sedimenteringsegenskaper (se eksempel 1). Ved dyrkning av organismer hvor substratdoseringen finner sted under celletilbake-føringen, kan dette f.eks. finne sted på følgende måte.

Ved dosering via opptak av et ledesubstrat finner substrat-tilførselen sted behovsorientert. Doseringen av fortynningsvannet finner sted over sterilfiltreringen S1 og ventilen V2, styrt av vektreguleringen WICA av fermenteren F1, som holder fermentervekten konstant uavhengig av den faktiske skilleytelse for sentrifugen Z1. Den tilsiktede vektverdi er angitt på forhånd og tilsvarer det prosess-spesifikke arbeidsvolum i fermenteren F1. De mediumkonsentratmengder som doseres fra mediumtanken S1 og ventilen V5 og beholderen B1 gjennom ventilen V1 fastlegges og doseres utfra forbruket av ledesubstrat. Forløpet av den samlede innførte substratmengde i prosessen og de tidsaveheng-ige substratdoseringsmengder utgjør en eksponensialfunksjon opptil øvre grensepunkt, hvorfra doseringen ikke lenger er behovsorientert, men finner sted lineært. Det øvre grensepunkt fremkommer utfra den maksimalt mulige mediumkonsentrasjon i tilløpet, og som ikke bør overskride en verdi som er utledet ved forforsøk.

Denne maksimale tilløpsmengde orienterer seg etter den faktiske effektive skilleytelse Tefffor sentrifugen. Den behovsorienterte substratdosering er alltid lavere eller lik den beregnede maksimale substratdosering utfra Teff.

Sammenlignet med en tidligere vanlig igangsettingsprosess er det oppnådde kimtall ved denne styring i henhold til oppfinnelsen i det minste høyere med en faktor på 10.

Doseringen kan også finne sted utfra forut beregnede verdier (omhyllningskurve) analogt med den tidligere beskrevne dosering via opptak av et ledesubstrat.

Fremgangsmåten med delvis cellefraskillelse (trinn 4.3) tilsvarer til å begynne med den beskrevne prosess under 4.2 med fullstendig celletilbakeføring. Prosessen utføres under fullstendig celletilbakeføring frem til arbeidspunktet for begynnelsen av den delvise cellefraskillelse. Innkoblingskriteriet for begynnelsen av den delvise cellefraskillelse er fastlagt av prosessen, men er alltid sammenkoblet med den spesifikke vekstrate u, da substratutnyttelse og produksjon av stoffskifteprodukter direkte avhenger av den spesifikke vekstrate. Vekstraten u er særegen for vedkommende organisme og fastlegges ved forforsøk.

Utfra den inntrukne substratmengde i systemet som helhet beregnes over det spesifikke substratbehov pr. celletall det samlede kimtall i systemet. Ved fastlagt systemvolum definert ved maksimal mediumkonsentrasjon samt ved fastlagt separasjonsytelse tilsvarer dette en definert vekstrate, som bestemmer koblingspunktet. Det oppnådde kimtall i systemet ved tidspunktet for delfraskillelse holdes da konstant ved et uttak av en fastlagt cellemassestrøm fra systemet.

For uttak av cellemasse fra systemet lukkes ventilen V9 ved den arbeidende pumpe P1, mens ventilen V10 åpnes. Over gjennomløpsmengdemåleren IDM2 avføles avløps-mengden av konsentrat, og etter den beregnede mengde er oppnådd, lukkes ventilen V10 og V9 åpnes. Tidsintervallet for en uttakssyklus ligger ved omtrent 3-10 minutter.

Hvis substratdoseringen finner sted via et ledesubstrat, blir den faktiske doseringsmengde ved tidspunktet for delfraskillelsens begynnelse konstant videredosert. Hvis doseringen befinner seg ved den øvre grense, opprettholdes denne. Ved dosering utfra forut beregnede verdier (omhyllningskurve) blir også den foreliggende doseringsmengde ved tidspunktet for delfraskillelsens begynnelse videredosert uforandret. Hvis dadoseringen befinner seg ved den øvre grense, bibeholdes denne dosering.

Denne dosering muliggjør en ettervekst av den fraskilte cellemasse, og ved å holde tilløps- og avløpsforholdene konstant innstiller systemet seg på en stabil likevekt. Cellene vokser da med konstant vekstrate u.

Avbruddskriteriet for det kontinuerlige trinn dannes ved fremgangsmåten med fullstendig celletilbakeføring utfra den samlede substrattilførsel. Med en prosessavhengig samlet substratmengde frembringes det prosessavhengige samlede kim-tall i systemet med en fastlagt vekstrate u. Utfra en bestemt vekstrate fastlegges substratutnyttelsen som ikke lenger tilstrekkelig.

Avbruddskriteriet for det kontinuerlige trinn fastlegges ved fremgangsmåten med delvis cellefraskillelse utfra systemfeil, slik som infeksjoner, forurensning eller maskinfeil, eller fastlegges utfra driftsmessige eller lignende vurderinger.

Trinn 5 består i avbrudd av det kontinuerlige fermenteringsavsnitt samt av innhøsting av den samlede biomasse under sterile betingelser.

Ved organismer hvis sedimenteringsegenskaper først er tilstrekkelige i glykosefrie medier, blir sentrifugen høstet uten substratdosering ved maksimal skilleytelse. Innhøstingen med substratdosering forløper for mengder med substratdosering via ledesubstrat eller omhyllningskurve på en og samme måte og tillater en cellehøst under opprettholdelse av stoffskifte-aktiviteten. Innhøstingen innledes ved åpning av ventilenV1 og lukking av ventilen V9. Forut for innhøstingen finner en tidsbestemt vektreduksjon av fermenteren F1AMF1 sted, styrt over vektregulatoren WICA F1, og som er bestemt av den maksimalt tillatelige innhøstingstid og som må være mindre enn sentrifugens maksimale skilleytelse, målt ved hjelp av IDM1.

Trinn 6 består i ny tilførsel av sterile næringsmedier til det sterile anlegg samt gjentagelse av prosessene i henhold til trinnene 1 til 5 under innsparing av samlet steriliseringstid og energi (drift av typen Split Batch).

Umiddelbart etter innhøstingen blir alle ventiler lukket. Fermenteren F1 spyles over ventil V19 og ClP-kulen med sterilfiltrert vann fra sterilfiltreringen S1, for eventuelt å fjerne foreliggende forurensninger (tilsmussing). Det forurensede vann føres over ventilene V7 og V8 inn i sentrifugen Z1 og tjener her til forspyling. Etter spyleprosessen lukkes ventilene V19, V7 og V8.

Sentrifugen Z1 rengjøres nå over ventilene V20, V21 CIP (cleaning in place). Dette er nødvendig for å fjerne de foreliggende cellemasserester i sentrifugen, da disse frem til begynnelsen av den følgende separasjonssyklus kunne gå over i lysis. Etter rengjøring-en lukkes ventilene V20, V21 og sentrifugen dampsteriliseres over hovedventilene V7, V8, V10 og V22. Steriliseringstidspunktet legges i det innledende prosesstrinn som er beskrevet under trinn 2. I dette trinn anvendes ikke separatoren.

Næringsmediene for de følgende prosessykler bringes i beredskap i beholderen B1. I denne beholder B1 fremstilles først de sterilfiltrerbare mediebestanddeler og disse overføres analogt med trinn 1.4 over ventilen V11 fra beholderen B1 over sterilfiltreringen S1 og ventilen V2 manuelt inn i fermenteren F1. Likeledes avgis sterilfiltrert medium over de manuelt betjente ventiler V12, V13 til mediumforlagrene S, A.

Derpå fylles beholder B1 etter forinnføring av prosessvann over ventil V17 med ikke-sterilfiltrerbare mediebestanddeler. Disse føres som konsentrat over varmemantelen HM2 for termisk sterilisering og nedkjøles ved hjelp av indirekte vannkjøling over HM2. Under steriliseringen av beholderen B1 avgis over sterilfiltreringen S1 og ventil V2 en mengde sterilt prosessvann på det sterilfiltrerte mediumkonsentrat i F1, således at etter dosering av det varme, termisk steriliserte medium-konsentrat fra beholder B1 over ventil V1 vil det i fermenteren F1 foreligge begynnelsesvolumet for fermentering.

Prosessen forløper i det følgende som beskrevet i trinnene 2 til 6.

Eksempel 1

Gjennomføring av en fermentering typisk for fremgangsmåten på organismus lactobacillus curvatus stamme 2 DSM nr.4264.

Gjennomføringen av fremgangsmåten kan oppdeles i fem trinn, som etter igangsetting av anlegget forløper syklisk.

Trinn 1: Forbehandling og sterilisering av fermenteringsanlegget og næringsmedium-komponentene.

Før en gjennomførelse av fremgangsmåten påbegynnes utprøves anlegget som helhet på tetthet, hvorpå startforutsetningene opprettes for tilførsel av mediene ved innstilling av de tilsvarende ventiler. Derpå blir fermenteringsanlegget gjort driftsklart. Næringsmediene blir veiet inn og tankene og beholderne påfylt. Anlegget steriliseres.

Fig. 9 og 10 viser forløpet av anleggs- og prosessparameterne.

Trinn 2: Start av fermenteringen ved poding av fermenteren med podekultur, igangsetting av prosess-styringssystemet og første arbeidssyklus for anlegget i innledende prosessmodus med lav mediumkonsentrasjon og delvis oppfylling.

Under forløpet blir alle driftsparametere holdt konstant. Ved slutten av trinn 2 nås koblingspunktet for omkobling til trinn 3. Dette koblingspunkt utgjøres av en fastlagt glykosekonsentrasjon i mediet. Frem til den fastlagte glykose-konsentrasjon på ca. 1 g/l glykose oppnås, som er fastlagt som koblingsterskel, forbrukes det fra begynnelsen av fermenteringen en definert mengde natronlut. Når dette forbruk er oppnådd, finner omkobling sted.

Trinn 3: Overgang til regulert mediumdosering inntil fermenteringens sluttvolum er

nådd.

Doseringen av mediet reguleres via ledesubstansen natronlut. I utførelseseksempelet gjennomføres doseringen i samsvar med en trappefunksjon, hvilket medfører rask vekst ved den foreliggende mikroorganisme (se figur 10). Ved andre mikroorganismer er en stadig dosering nødvendig for optimal vekst. Over prosess-styringssystemet kan en hvilken som helst doseringsfunksjon frembringes.

Trinn 4: Overgang til kontinuerlig prosessføring med næringsmediumutviksling og

fullstendig celletilbakeføring, eller med delvis cellefraskillelse.

Ved foreliggende organisme blir ved begynnelsen av trinn 4 fermentervolumet innskrenket under fullstendig celletilbakeføring og derpå dosert tilførsel av mediet. Ved videre forløp av fremgangsmåten finner en ytterligere celletilbakeføring med delvis cellefraskillelse sted. Derpå doseres atter medium. Den beskrevne avslutning av trinn 4 er karakteristisk for den anvendte organisme. Andre organismer behandles med forskjellige skille- og doseringsintervaller eller med vedvarende fraskillelse og dosering (se figur 9).

Trinn 5: Avslutning av det kontinuerlige fermenteringsavsnitt og innhøsting av den

samlede biomasse under sterile betingelser.

Etter det fullstendige forbruk av næringsmedier, som vil gi seg til kjenne ved slutten av natronlutforbruket, innledes innhøstingen. Innhøstingen utføres med maksimal skilleytelse for sentrifugen uten celletilbakeføring. Ved den her anvendte organisme er separatorytelsen liten sammenlignet med det som er tilfellet ved andre organismer. Den lave skilleytelse har sin årsak i den sakkaridinnhyllning som omgir organismen og som gjør en sedimentering vanskelig. Andre organismer uten sakkaridinnhyllning gjør det mulig å oppnå 2 til 3 ganger høyere skilleytelse fra separatoren. Den behandlede organisme i dette eksempel stiller på grunn av dannelsen av den ovenfor angitte sakkaridinnhyllning og de derved betingede dårlige sedimenteringsforhold høye fordringer til prosessens forløp, da bare forholdsvis små medieutvekslingsrater kan benyttes.

Trinn 6: Nyinnføring av sterile næringsmedier i det sterile anlegg samt gjentagelse av prosessen i henhold til trinnene 1 - 5 under innsparing av samlet steriliseringstid og energi.

Ved slutten av trinn 4 ble det i medietankene etterlatt en nødvendig mediummengde for den lavkonsentrerte innføring. Direkte etter trinn 5 blir sterilt mediumkonsentrat og sterilt vann pumpet inn i fermenteren F1, og umiddelbart deretter utføres en inokulasjon av det innførte medium med en ny podekultur. Under trinn 2 av fremgangsmåten blir så doseringsmediene for løpende tilførsel bragt i beredskap i forlagringstankene B1 for mediumet, samt i S-forlageret og A-forlageret.

Prosessen ble gjentatt med følgende stammer (se etterfølgende tabell):

Eksempel 3

Gjennomføring av en fermentering av organismus pediococcus pentosaceus.

Gjennomføringen av oppfinnelsens fremgangsmåte kan oppdeles i fem ledd, som etter starten av anlegget forløper syklisk.

Trinn 1: Forbehandling og sterilisering av fermenteringsanlegget og næringsmedium-komponentene.

Før en prosess påbegynnes blir anlegget som helhet prøvet med hensyn på tetthet, hvorpå startforutsetningene for tilførsel av mediene opprettes ved innstilling av de tilsvarende ventiler. Deretter blir fermenteringsanlegget satt i beredskapstilstand. Næringsmediene innveies med hensyn på mottak av pediococcus pentosaceus og de angitte tanker og beholdere påfylles. Anlegget blir så sterilisert.

Trinn 2: Fermeneteringen startes ved poding av fermenteren med podekultur,

igangsetting av prosess-styringssystemet og den første arbeidssyklus i anlegget i innledende driftsmodus med lav mediumkonsentrasjon og delvis oppfylling.

Figurene 7 og 8, område 1, dvs. Batch-fasen, viser forløpet av anleggsparameterne. Alle driftsparametere holdes konstant. Ved slutten av trinn 2 nås omkoblingspunktet til trinn 3. I foreliggende eksempel utgjøres koblingspunktet av en fastlagt glykosekonsentrasjon i mediet. Frem til oppnåelse av den fastlagte glykosekonsentrasjon på ca. 1 g/l glykose som koblingsterskel blir det fra begynnelsen av fermenteringen forbrukt en fastlagt mengde natronlut. Hvis dette forbruk er oppnådd, finner omkobling sted (se fig. 8).

Trinn 3: Overgang til regulert mediumdosering inntil fermenteringens sluttvolum

oppnås.

I foreliggende utførelseseksempel blir mediet regulert dosert via ledesubstansen natronlut. I eksempelet finner doseringen sted uavbrutt, hvilket induserer meget rask vekst ved foreliggende mikroorganisme. Den stadige dosering fremgår i figur 7 ved stigningen av fermenteringsvolumet, glykosemengden og proteinmengden. Ved andre mikroorganismer er en trappeformet dosering nødvendig for optimal vekst. Ved hjelp av prosess-styringssystemet kan en hvilken som helst hensiktsmessig doseringsfunksjon gjennomføres.

Trinn 4: Overgang til kontinuerlig prosessmodus med næringsmediumutveksling og

fullstendig celletilbakeføring, eller med delvis cellefraskillelse.

Ved begynnelsen av trinn 4 innskrenkes fermenteringsvolumet under fullstendig celletilbakeføring, hvorpå mediet induseres. I fremgangsmåtens videre forløp finner en ytterligere celletilbakeføring med delvis cellefraskillelse sted. Etter dette doseres atter mediet. Det beskrevne forløp av trinn 4 er karakteristisk for den anvendt organisme. Andre organismer kjøres med endrede skille- og doseringsintervaller eller med uavbrutt fraskillelse og dosering.

Trinn 5: Avslutning av det kontinuerlige fermenteringsavsnitt samt innhøsting av den

samlede biomasse under sterile betingelser.

Etter fullstendig forbruk av næringsmediene, hvilket ved foreliggende organisme vil gi seg til kjenne ved slutten av natronlutforbruket, innledes innhøstingen. Denne innhøsting utføres med maksimal skilleytelse av sentrifugen og uten celle-tilbakeføring.

Trinn 6: Ny innføring av sterile næringsmedier i det steriliserte anlegg samt gjentagelse av prosessen i henhold til 1 - 5 under innsparing av den samlede steriliseringstid og energi.

Ved slutten av trinn 4 etterlates i medietankene en nødvendig mediummengde for den lavkonsentrerte nye tilsats. Direkte etter trinn 5 pumpes sterilt mediumkonsentrat og sterilt vann inn i fermenteren F1, og umiddelbart deretter utføres en inokulasjon av den innførte sats ved hjelp av en ny podekultur. Under trinn 2 av fremgangsmåten blir så doseringsmediene for den løpende sats gjort klar i forlagertankene B1 for mediet samt S-forlageret og A-forlageret.

Claims (13)

1. Fremgangsmåte for dannelse av cellemasse og/eller fermenteringsprodukter under sterile betingelser, og hvor fermenteringsblandingen i det minste til visse tider, føres i kretsløp og stoffskifteprodukter fra de kultiverte celler og eventuelt cellemassen fraskilles,karakterisert vedat fremgangsmåten omfatter prosesstrinn hvor: a) fermenteringsanlegget tilføres en tilstrekkelig mengde næringsmedium til å starte den ønskede cellekultur, b) anlegget steriliseres og den ønskede næringsmediumkonsentrasjon, som er lavere enn cellekulturens spesifikke næringsmediumkonsentrasjon, innstilles, c) næringsmediet innpodes med en podekultur og på en porsjonsvis måte og med delvis fylling av fermenteringsanlegget tillates denne kultur uforstyrret vekst i et fastlagt tidsrom, d) næringsmediets konsentrasjon økes opp til cellekulturens spesifikke næringsmediumkonsentrasjon ved samtidig økning av næringsmediets volum til arbeids-volumet for såvel anlegget som dets cellekonsentrasjon, e) det utføres en overgang til kontinuerlig drift under utveksling av næringsmediet og fraskillelse av stoffskifteprodukter, såvel som fullstendig eller delvis celle-resirkuler-ing, f) den kontinuerlige drift avbrytes ved et ønsket tidspunkt og cellemassen høstes under sterile betingelser, og g) valgfritt blir en del av eller alle nevnte prosesstrinn gjentatt i den angitte rekkefølge.

2. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert vedat i mediumutvekslingsfasen økes den tildelte mengde av mediet med den eksponensielle vekst av kulturen og holdes konstant når den maksimale cellefraskillelse oppnås.

3. Fremgangsmåte som angitt i krav 1 eller 2, karakterisert vedat tildelingen av næringsmediet reguleres ved hjelp av en styreparameter, hvis verdi fortløpende bestemmes.

4. Fremgangsmåte som angitt i krav 3, karakterisert vedat pH-verdien, C02-konsentrasjonen eller 02-konsentrasjonen anvendes som nevnte styreparameter.

5. Fremgangsmåte som angitt i krav 4, karakterisert vedat pH-verdien i fermenteringsanlegget bestemmes og holdes konstant ved tilsats av en base av fastlagt konsentrasjon.

6. Fremgangsmåte som angitt i krav 5, karakterisert vedat det tilsettes en mengde næringsmedium som tilsvarer den forbrukte basemengde og som i cellekulturens vekstfase forandres med en doseringsfaktor k som er proporsjonal med vekstraten.

7. Fremgangsmåte som angitt i krav 3, karakterisert vedat det forbrukte næringsmedium erstattes i samsvar med en spesifikk omhylningskurve for cellekulturen, som tar hensyn til de foreliggende cellemasser, vekstraten og dyrkningsbetingelsene.

8. Anvendelse av fremgangsmåte angitt i et av kravene 1 - 7 for gjenvinning av melkesyrebakterier eller melkesyre.

9. Anvendelse av anordning for produksjon av cellemasse og/eller fermenteringsprodukter ved utførelse av fremgangsmåten angitt i krav 1, idet anordningen omfatter en steriliserbar fermenteringskjele, minst en tank for opptak og termisk sterilisering av en mediumkomponent som ikke er steriliserbar ved filtrering og/eller minst en forrådsbeholder for opptak av en mediumkomponent som er steriliserbar ved filtrering og med et sterilfilter for kontinuerlig fremstilling av en steril mediumkomponent, samt et steriliserbart kretsløp forbundet med fermenteringskjelen og med utstyr for å fraskille forbrukt næringsmedium og stoffskifteprodukter, og hvor det steriliserbare kretsløp oppviser en sentrifuge og en oppholdsseksjon er anordnet mellom fermenteringskjelen og sentrifugen, idet oppholdsseksjonen har en tilstrekkelig lengde til å forbruke næringsstoffer som fortsatt inneholdes i næringsmediet.

10. Anvendelse som angitt i krav 9, og hvor sentrifugen er en dampsteriliserbar, selvavslammende sentrifuge med innstillbare avslamningsmengder.

11. Anvendelse som angitt i krav 9 eller 10, og hvor det i fermenteringskjelen er anordnet en målesonde for påvisning av en prosesstyringsstørrelse.

12. Anvendelse som angitt i krav 11, og målesonden er en sonde for måling av glykose, pH, 02eller C02.

13. Anvendelse som angitt i et av kravene 9 - 12, og hvor de enkelte tanker og forrådsbeholdere har utstyr for påvisning av fyllings- og forbruksmengder.