FI101083B - Menetelmä solumassan ja/tai fermentointituotteiden aikaansaamiseksi st eriileissä olosuhteissa sekä laitteiston käyttö menetelmän toteuttamis eksi - Google Patents

Description

1 101083

Menetelmä solum&ssan ja/tai fermentointituotteiden aikaansaamiseksi steriileissä olosuhteissa sekä laitteiston käyttö menetelmän toteuttamiseksi 5 Keksintö koskee menetelmää solumassan ja/tai fer- mentointituotteiden aikaansaamiseksi steriileissä olosuhteissa, jossa fermentointiseosta kierrätetään ainakin ajoittain ja erotetaan viljeltyjen solujen aineenvaihduntatuotteita ja mahdollisesti solumassaa epäjatkuvasta tai 10 jatkuvasti, samoin kuin laitteiston käyttöä menetelmän toteuttamiseksi .

Nykyisin käytetään bioteknisessä teollisuudessa fermentorien käytön yhteydessä yleensä panosmenetelmää fermentointiliuosten valmistukseen, biomassan tuotantoon 15 ja aineenvaihduntatuotteiden aikaansaantiin. Tämä panosme-netelmä sisältää normaalisti ravintoalustan inokuloinnin halutulla viljelmällä, määrätyn ajan kestävän viljelyn tarkasti määrätyissä olosuhteissa ja mikro-organismin ja/tai halutun aineenvaihduntatuotteen talteenoton.

20 Näillä panosmenetelmillä on kuitenkin joukko hait tapuolia .

!,'·· Alustan sterilointi tehdään yleensä käyttöpitoisuu- dessa täytetyssä fermentointisäiliössä. Laitoksissa, jois- ; sa säiliöiden käyttötilavuus on yli 1 000 1, liittyy alus- .’.J 25 tojen lämpösterilointiin suuria kuumennus- ja jäähdytys- * « .·. : kustannuksia. Koska alusta on pitkään lämpötilassa yli • · · 80 °C, tapahtuu usein alustan laadun heikkenemistä.

• · ·

Steriloinnin vaatima aika on yleensä useita tunteja, mikä johtaa valmisteluajän ja työskentelyajan epäsuo- • · · *·1·1 3 0 tuisaan suhteeseen. Tämä suhde käy sitä epäsuotuisammaksi, *.1 1 mitä lyhyempi varsinainen fermentointiaika on, ja saavut- ·1·,· taa lyhytaikaisten fermentointien yhteydessä arvon 1:1.

« ·

Mikro-organismien ja elävien solujen kasvu tapahtuu • _ panosfermentoinnissa yleensä epäsuotuisissa olosuhteissa.

' "· 3 5 Solut tarvitsevat kasvun aluksi jonkin ajan alustaan so- 2 101083 peutumi seen (lag-vaihe). Panosfermentoinnissa on prosessin alussa pieneliömäärä (inokulaatin pieneliömäärä) pienimmillään ja substraattipitoisuus suurimmillaan, mikä johtaa monissa tapauksissa substraatti-inhibitioon.

5 Lag-vaiheessa kasvuaineenvaihdunnan ja ylläpitoai- neenvaihdunnan suhde on sangen epäsuotuisa; organismi kuluttaa substraattia, mutta ei kasva. Tämä merkitsee heikkoa substraatin hyödyntämistä solumassasaantoon ja/tai kataboliatuotteiden muodostumiseen ja/tai biokemiallisiin 10 muutostuotteisiin nähden.

Myös siirryttäessä seuraavaan eksponentiaaliseen kasvuvaiheeseen on ylläpitoaineenvaihdunnan osuus suuri.

Eksponentiaalisessa kasvuvaiheessa ollaan kasvun kannalta optimaalisella alueella; ylläpitoaineenvaihdunnan 15 osuus verrattuna kasvuaineenvaihdunnan osuuteen on pieni ja substraatin muuttuminen solumassaksi optimaalista. Panosten ollessa kyseessä aineenvaihduntatuotteiden kasvava pitoisuus lopettaa kuitenkin eksponentiaalisen kasvuvaiheen lyhyen ajan kuluttua, koska tapahtuu tuoteinhibitio, 20 ts. solujen alustaan erittämien aineenvaihduntatuotteiden pitoisuus kasvaa niin suureksi, että tapahtuu ensin kasvun 4 4 hidastuminen ja sen jälkeen kasvun pysähtyminen.

4 f

Jos tuoteinhibitiopitoisuus on tiettyjen solulajien kohdalla sangen alhainen tai tuotteen muodostumisnopeus 25 solua kohden on sangen suuri, tapahtuu kasvun ja metabo- • 4 .‘•t· liittituotannon estyminen sangen varhaisessa vaiheessa • · kasvatuksen aikana ja saannot jäävät siten heikoiksi. Ai- • 44 ka, jonka kuluessa muodostuu suurehkoja määriä metabolia-. . tuotteita, on lyhyen eksponentiaalisen kasvuvaiheen vuoksi lii 30 samoin sangen lyhyt. Tuotettaessa panoksittain solumassaa, • · · ’j ’ metaboliatuotteita tai muutostuotteita muodostuu suurin :\i osa massasta sangen lyhyen ajan kuluessa eksponentiaalisen ;***: kasvuvaiheen aikana. Fermentorin tuotantokyky (tilavuus- 4 4 4 . aikasaanto) on siten korkea sangen lyhyen jakson aikana.

I 14 • 4 I I • 4 1 4 4 3 101083

Kuten kuviosta 1 on nähtävissä, kuvatuissa olosuhteissa noin 50 % prosessissa talteensaadusta biomassasta muodostuu 1 tunnin aikana. Jos koko prosessin, ts. esivalmistelujen, tuotannon ja koneiden puhdistuksen, arvioidaan 5 kestävän 24 tuntia, toimii fermentori vain 1/24 käyttö-ajastaan optimaalisissa olosuhteissa.

Tunnetaan myös muutamia menetelmiä juoksevien substraattien fermentoimiseksi jatkuvatoimisesti. Niinpä DE-hakemusjulkaisussa 3 323 205 kuvataan menetelmää ja 10 laitteistoa juoksevan substraatin fermentoimiseksi jatkuvatoimisesti erottaen samanaikaisesti fermentointiproses-sissa muodostuneita aineenvaihduntatuotteita. Tälle toimintatavalle on tunnusmerkillistä, että fermentointiin käytettävää käymisseosta kierrätetään, jolloin tämän kier-15 ron aikana saadaan aikaan myös virtaus kalvon pinnan yli ohuena virtaavana kerroksena ja kierrätettävän fermentoin-tiseoksen paine nostetaan sellaiseksi, että muodostuneet aineenvaihduntatuotteet tulevat kalvon yli tapahtuvan virtauksen aikana samanaikaisesti selektiivisesti ja frak-20 tioivalla tavalla erotetuiksi fermentointiseoksesta kalvo-suodatuksella. Jatkuvan toiminnan ylläpitämiseksi kytke-tään fermentorin edelle substraattivarastokierto, josta • "·· voidaan ottaa jatkuvasti tuoretta substraattia steriloin- tiyksikön kautta ja johtaa se fermentointiseoskiertoon. 25 Aineenvaihduntatuotteita voidaan poistaa jatkuvasti pro- • * : sessista.

• · · • · Tällä tunnetulla jatkuvatoimisella menetelmällä on • ♦ · kuitenkin joukko puutteita, jotka perustuvat sekä raken- . . teellisiin että menetelmän toteutukseen liittyviin tunnus- • · · • · · ·.* 30 merkillisiin piirteisiin.

• · · * DE-hakemusjulkaisun 3 332 205 mukaisessa menetel- mässä käytetään kalvoa muodostuneiden aineenvaihduntatuot- 4 4 teiden erottamiseksi fermentointiseoksesta. Tällaisilla • · · .* . kalvoilla on kuitenkin taipumus tukkeutua, mikä heikentää 35 erotustehoa ja vaatii sangen suuria kalvopintoja. Lisäksi 4 · « · • « · 4 101083 täytyy käyttää määrttyjä menetelmiä ja korkeita paineita kalvon pitämiseksi läpäisevänä. Kalvo ei myöskään mahdollista lietteen jatkuvaa poistamista fermentointilaitteis-tosta eikä myöskään fermentorissa muodostuneen solumassan 5 jatkuvaa erottamista.

Lisäksi tällä tunnetulla menetelmällä on joukko haittapuolia, joita on kuvattu edellä panosmenetelmän yhteydessä. Nämä haittapuolet liittyvät erityisesti laitteiston ja alustojen sterilointiin ja lisäksi siihen, et-10 teivät viljelyolosuhteet ole sovitettavissa mikro-organis min kulloiseenkin kasvuvaiheeseen. Tästä on seurauksena heikentynyt solumassasaanto ja/tai kataboliatuotteiden muodostuminen substraatin hyödyntämisen ollessa samalla heikkoa, ja se johtaa lisäksi hyväksyttävää pitempiin vil-15 jelyaikoihin.

Tämän keksinnön päämääränä oli siksi saada aikaan kuvatunlainen menetelmä, jonka yhteydessä on sekä jatkuvatoimisessa että myös puolijatkuvassa ja panoskäytössä mahdollista tehdä viljelyolosuhteiden optimaalinen sovittami-20 nen viljeltävän mikro-organismin kasvuvaiheeseen ja solu- massatuotannon ja/tai kataboliatuotteiden muodostuksen • · « ’· '! optimaalinen säätö ja ravintoalusta tulee optimaalisesti I · i ’*· hyödynnetyksi kulloiseenkin tarkoitukseen.

Tämä päämäärä saavutetaan kuvatunlaisella menetel-25 mällä, joka sisältää seuraavat vaiheet: - fermentointilaitteistoon syötetään halutun solu- • · viljelmän käynnistämiseksi riittävä ravintoalustamäärä; - laitteisto steriloidaan ja säädetään haluttu ra- #.>.t vintoalustan pitoisuus, joka on pienempi kuin soluviljel- • · · 30 män spesifinen ravintoalustan pitoisuus; • · ·*, - ravintoalusta inokuloidaan ymppäysviljelmällä ja • · :/.j viljelmän annetaan kasvaa häiriöttä määrätty aika panos- :viljemänä ja fermentointilaitteiston ollessa osittain täy-

• I I

/ ; tettynä; 35 - ravintoalustan pitoisuus nostetaan soluviljelmän spesifiseen ravintoalustan pitoisuuteen samalla kun nos- s 101083 tetaan 1)ravintoalustan tilavuutta laitteiston edellyttämään työskentelytilavuuteen ja 2)solupitoisuutta; siirrytään jatkuvaan toimintatapaan, jolloin vaihdetaan ravintoalustaa ja erotetaan aineenvaihdunta-5 tuotteita sekä kierrätetään soluja täydellisesti tai osittain; - jatkuva toimintatapa keskeytetään halutulla hetkellä ja solumassa otetaan talteen steriileissä olosuhteissa; ja mahdollisesti 10 - kaikki tai jotkut edellä mainituista vaiheista toistetaan mainitussa järjestyksessä.

Edullisia menettelytapoja määritellään alavaatimuksissa .

Keksinnön mukainen menetelmä on käytettävissä kai-15 kille tavanomaisissa fermentoreissa viljeltävissä oleville mikro-organismeille. Käytetään tavanomaisia viljelylolo-suhteita ja ravintoalustoja; keksinnön mukaisen menetelmän etu perustuu menetelmän erityiseen toteutustapaan eikä erityisolosuhteiden tai -alustojen käyttöön. Jos keksinnön 20 mukaisessa menetelmässä tehdään sekoitus suurilla kierros-taajuuksilla tai erotus sentrifugilla, ovat edullisia organismit, jotka eivät ole herkkiä leikkausvoimille.

: " Keksinnön mukaista menetelmää voidaan käyttää mitä erilaisimpien bakteeri- ja sienilajien viljelyyn. Se so-: 25 veltuu erityisesti sekä aerobisten että anaerobisten ja :*·.· sekä grampositiivisten että gramnegatiivisten bakteerien • * viljelyyn. Erityisesti mainittakoon ovat erilaiset kokit, erityisesti Micrococcus, Planococcus, Deinococcus, Stap-hylococcus, Stomatococcus, Streptococcus, Leuconostoc, • · · *.! 30 Pediococcus, Aerococcus, Gemella, Peptococcus, Peptostrep- • · · tococcus, Ruminococcus, Cuprococcus samoin kuin Sareina- • · ί/·ί suku. Lisäksi mainittakoon suvut Bacillus, Sporolactoba- cillus, Clostridium, Desulfotomaculum, Sporosarcina, Pla- / . nococcus, Lactobacillus ja Korthia. Soveltuvia ovat li- « < * 35 säksi bifidobakteerit ja brevibakteerit ja sukujen Zymo-monas, Acetobacter, Gluconobacter, Pseudomonas, Vibrio ja 6 101083

Aeromonas bakteerit. Lisäksi mainittakoon sukujen Escherichia, Shigella, Edwardsiella, Citrobacter, Salmonella, Klebsiella, Enterobacter, Hafnia, Serratia, Proteus, Pro-videncia, Morganella, Yersinia, Erwinia, Obesumbacterium, 5 Kluyvera, Cedecea, Tatumella, Xenorhabdus ja Rahnella gramnegatiiviset anaerobiset bakteerit. Keksinnön mukaiseen menetelmään soveltuvia gramnegatiivisia aerobisia sauvoja ja kokkeja ovat heimojen Pseudomonadaceae, Azoto-bacteraceae, Rhizobiaceae, Methylococcaceae, Halobacte-10 riaceae, Acetobacteraceae, Legionellaceae ja Neisseriaceae j äsenet.

Keksinnön mukainen menetelmä soveltuu erotettavissa ja sen jälkeen muualla hyödynnettävissä olevien viljeltyjen mikro-organismien lisäämiseen ja ottamiseen talteen 15 tai myös mikro-organismien aikaansaamien aineenvaihdunta-tuotteiden talteenottoon. Se mahdollistaa tällöin yksinkertaisella tavalla mikro-organismi- tai myös aineenvaih-duntatuotesaannon optimoinnin, ts. toiminnan säätämisen vaheeseen, jossa hyödynnetään mikro-organismin suurinta 20 mahdollista lisääntymisnopeutta tai myös optimaalista substraatin muuttamista. Keksinnön mukainen menetelmä mah- « « .

' dollistaa siis toiminnan säätämisen vaiheisiin, joissa : " ylläpitoaineenvaihdunnan osuus substraatin käytöstä on pieni, mikä on tärkeää solumassan muodostamisen yhteydes-25 sä, tai joissa ylläpitoaineenvaihdunnan osuus on suuri ja solutuotanto vähäistä, mikä on merkityksellistä aineen- • · vaihduntatuotteiden talteenotossa. Lisäksi tämä menetelmä • · · mahdollistaa kulloisenkin ravintoalustan mitä tehokkaimman hyödyntämisen ja samalla aineenvaihduntatuotteiden jät- • · · 30 kuvan poistamisen, jolloin vältetään substraatti-inhibi- *. tio.

• · Σ/·· Keksintöä valaistaan tarkemmin liittenä olevin ku- vioin, joissa .' . kuvio 1 esittää solumassasaantoa aikayksikköä koh- 35 den Staphylococcus carnosus Scl:n ollessa kyseessä; « 4 7 101083 kuviossa 2 verrataan 5 000 l:n fermentorin steriloinnin ajan- ja enegiankulutusta steriloitavan tilavuuden vaihdellessa; kuvio 3 esittää keskimääräisen kasvunopeuden μ 5 riipuvuutta glukoosin alkupitoisuudesta Lactobacillus cur-vatus S3;lie tarkoitetussa alustassa; kuvio 4 esittää ominaiskasvunopeutta μ kuvaavia käyriä solujen lineaarisen ja eksponentiaalisen kasvun ollessa kyseessä; 10 kuvio 5 esittää keksinnön mukaista fermentoria, jossa soluja kierrätetään erottimen kautta; kuvio 6 esittää keksinnön mukaisen erottimen kautta tapahtuvalla solujen kierrätyksellä varustetun fermentorin ohjausta; 15 kuvio 7 esittää Pediococcus pentosacaeusin viljelyn yhteydessä määritettyjen menetelmäparametrien riippuvuutta ajasta; kuvio 8 esittää valittuja parametreja Pediococcus pentosacaeusin viljelyn yhteydessä määritettyjen menetel- 20 mäparametrien joukosta; kuvio 9 vastaa kuviota 7 Lactobacillus curvatus -kannan 2 ollessa kyseessä; 4 · : " kuvio 10 vastaa kuviota 8.

Keksinnön mukainen menetelmä voidaan jakaa viideksi !/· 25 vaiheeksi, jotka etenevät laitteiston käynnistämisen jäl- keen syklisesti ja voidaan edelleen jakaa seuraaviksi me-netelmäteknisiksi toimenpiteiksi: 1. fermentointilaitteiston ja ravintoalustakompo-nenttien valmistelu ja sterilointi; • · · S·’' 30 2. laitteiston ensimmäinen toimintasykli, jossa • · · noudatetaan panosmenettelyä ja alustan pitoisuus on alhai- • · sempi ja laitteisto osittain täytetty; « · · :<t<: 3. määrätyn alustan pitoisuuden saavuttamisen jäl- : keen siirtyminen säädeltyyn alustan annosteluun, kunnes c · t 35 saavutetaan lopullinen fermentointitilavuus; 4 « 4 I · β 101083 4. siirtyminen jatkuvaan toimintatapaan, jossa vaihdetaan ravintoalustaa ja käytetään täydellistä solujen kierrätystä tai solujen osittaista erottamista; 5. jatkuvatoimisen fermentointivaiheen keskeyttämi-5 nen ja koko biomassan talteenotto steriileissä olosuhteissa; 6. mahdollisesti uuden steriilin ravintoalustan panostus steriiliin laitteistoon ja vaiheiden 1-5 mukaisen menettelyn toistaminen säästäen steriloinnin vaatimaa 10 kokonaisaikaa ja -energiaa.

Koko laitteiston sterilointi vaiheessa 1 tapahtuu steriloimalla ravintoalustakonsentraatti lämmöllä tuotan-toastiassa. Heti kun konsentraatti on jäähtynyt steriloinnin jälkeen lämpötilan 100 °C alapuolelle, jäähdytetään se 15 lyhyessä ajassa fermentointilämpötilaan ruiskuttamalla suoraan siihen suodattamalla steriloitua kylmää laimennus-vettä ja sen jälkeen suodattamalla steriloitavissa olevia alustoja. Siten säästetään koko alustatilavuuden lämpöste-riloinnin vaatimaa lämpöenergiaa; jäähdytysenergiaa, jota 20 tarvitaan koko fermentointitilavuuden jäähdyttämiseksi 100 °C:n lähellä olevasta lämpötilasta fermentoin-tilämpötilaan, jos kylmän ja kuuman faasin sekoitussuhteet ; on säädetty sopiviksi; ja aikaa, jota tarvitaan koko fer mentointitilavuuden jäähdyttämiseen sekoituksella varuste- ; 25 tussa astiassa kaksoisvaipan kautta, koska aika, joka tar- • » • *.tj vitaan konsentraatin jäähdyttämiseen ruiskuttamalla suo- • · raan steriiliä vettä, kunnes saavutetaan fermentointitila- • · · vuus, on suhteellisen lyhyt.

.. Kuviossa 2 verrataan ajan- ja energiankulutusta • « · 30 steriloitaessa 5 000 l:n fermentori sterilointitilavuuden • · · *·[ ’ vaihdellessa. Säästö on ajassa noin 25 % ja kaasun, veden ja sähköenergian määrässä noin 75 %.

Laitteiston käynnistäminen panoksittaisella menet- . telytavalla käyttämällä pienempää alustan pitoisuutta vai- • · · )tt* 35 heen 2 mukaisesti mahdollistaa solujen optimaalisen so- • · • « • t · 9 101083 peuttamisen substraattiinsa ja antaa tulokseksi korkeita solujen kasvunopeuksia, koska kyseisissä melko alhaisissa alustan pitoisuuksissa ei esiinny substraatti- eikä tuote-inhibitiota. Tavanomaisen panosmenettelytavan yhteydessä 5 valitaan alustan pitoisuus sen sijaan korkeaksi suurten saantojen aikaansaamiseksi, mikä johtaa prosessin alussa substraatti-inhibitioon ja heikentää kasvuominaisuuksia ja solumassa-, kataboliatuote- ja muutostuotesaantoa.

Kuvio 3 esittää riippuvuutta kasvualustan glukoosi-10 pitoisuuden ja muita mikro-organismeja edustavan kannan Lactobacillus curvatus keskimääräisen kasvunopeuden μ välillä. Mitä suurempi alustan glukoosipitoisuus on, sitä alhaisempi on keskimääräinen kasvunopeus, ts. keskimääräinen kasvunopeus kasvaa glukoosipitoisuuden aletes-15 sa.

Vaiheessa 3 annostellaan fermentoriin aloitus-substraatin kulutuksen mukaan tai ennalta määrätyn annos-telutoiminnon kautta alustaa, jonka pitoisuus on määrätty, mikä johtaa tilavuuden kasvuun. Kohoavaa solupitoisuutta 20 alennetaan jatkuvasti annostelemalla alustaa, niin ettei esiinny tuoteinhibitiota. Annosteltavana alustan pitoisuus säädetään siten, että saavutettaessa lopullinen fermen- I · • *·· tointitilavuus alustan kokonaispitoisuus on sellainen, jossa kasvunopeus on vielä niin suuri, ettei kasvuaineen-25 vaihdunnan prosentuaalinen osuus verrattuna ylläpitoai- • * ·*·.· neenvaihdunnan prosentuaaliseen osuuteen ole kyseisille • · .·;·. soluille sopivaa arvoa suurempi.

« · ·

Vaiheella 3 on panosmenettelytapaan nähden se etu, . . että annosteltava alustamäärä kasvaa solujen kasvun ede- • · · *.| 30 tessä ja ainepitoisuus alustassa pidetään suurin piirtein • · · \ ’ vakiona. Tämä saa aikaan solujen eksponentiaalisen kasvun • · koko vaiheen ajan. Tavanomaisen panosmenettelytavan yhtey-dessä substraatin määrä pienenee solujen kasvun aikana ja . ainepitoisuudet muuttuvat. Tämä vaikuttaa ihanteelisen • · · 35 solukasvun vastaisesti. Vaiheen 3 toinen etu on sangen • · • · · ίο 101083 hyvä substraatin hyödyntäminen tässä menettelyvaiheessa alustan tarvetta vastaavan annostelun ansiosta.

Keksinnön mukaisessa menetelmässä aloitetaan vaiheessa 4 saavutettaessa lopullinen fermentointitilavuus 5 alustan vaihto. Alustan erottaminen tapahtuu steriilissä erotusjärjestelmässä, edullisesti steriilillä sentrifugil-la. Ensimmäisen vaihtoehdon 4a mukaisesti solut kierrätetään kokonaan prosessiin. Järjestelmästä erotettu käytetty alustatilavuus lisätään järjestelmään tuoreen alustan muo-10 dossa. Lisättävän alustan pitoisuus valitaan siten, että se on pienempi kuin pitoisuus, joka johtaa tuoteinhibi-tioon, niin että substraatti rajoittaa solumassan kasvua.

Siirtyminen panoksittaisesta jatkuvaan menettelytapaan tapahtuu seuraavassa kuvattavalla tavalla substraatin 15 maksimaalisen hyödyntämisen aikaansaamiseksi. Jatkuvatoi misen vaiheen alussa lasketaan annosteltava alustamäärä aloitussubstraatin ominaiskulutuksesta tai kasvukäyrän kautta, samalla kun vaihdettava alustatilavuus pidetään jatkuvan vaiheen alusta asti sellaisena, että erotusnopeus 20 on mahdollisimman korkea. Tämä johtaa jatkuvatoimisen vaiheen alussa alustan laimenemiseen ja aineenvaihduntatuot-'· '· teiden lisääntyneeseen poistoon, mikä edistää solujen jat- : ' · kokasvua.

Kasvatuksen jatkuessa alustan tarve kasvaa solumas-: 25 san lisääntyessä, kunnes saavutetaan alustan annostelumää- rä, jossa annosteltu pitoisuus saavuttaa jatkuvan toimin- • · nan kannalta optimaalisen alueen. Tästä hetkestä eteenpäin pidetään annosteltava alustamäärä vakiona; järjestelmä on tällöin stabiilissa tilassa, jossa rajoittavana tekijänä • · · !.! 30 on substraatti.

• · · ♦ ♦ · *. Solujen ominaiskasvunopeus μ, joka jatkuvan toimin- • · ·.*·; nan kannalta optimaalisen alueen saavuttamiseen asti pysyy « t · : t<: lähes tasaisena, laskee jatkuvan toiminnan kannalta opti- : maalisella alueella toimittaessa eksponentiaalisesti, sa- 35 maila kun eliömäärä lisääntyy lineaarisesti.

• · U 101083

Kuvio 4 esittää ominaiskasvunopeuden μ kulkua solujen lineaarisen ja eksponentiaalisen kasvun ollessa kyseessä. Kun verrataan aikaa, jonka eksponentiaalisesti kasvava organismi tarvitsee määrätyn eliömäärän saavutta-5 miseen, aikaan, jonka sama organismi vaatii kasvaessaan lineaarisesti, on ero ajoissa tällöin huomattava. Viljelmässä tapahtuu lineaarinen kasvu, kun ravintoalustan syöttö tai ravintoalustan hyödynnettävyys ei ole eksponentiaalinen vaan lineaarinen. Lineaarisen kasvun ollessa kysees-10 sä kasvunopeus μ pienenee eksponentiaalisesti solumäärän kasvaessa. Siten ylläpitoaineenvaihdunnan osuus koko aineenvaihdunnasta tulee sangen korkeaksi. Se, minkä μ-arvon vallitessa aloitetaan osittainen erotus, määritetään kokeellisesti.

15 Toisen vaihtoehdon 4b mukaisesti toteutetaan kek sinnön mukainen menetelmä vaiheessa 4 käyttämällä mikro-organismien osittaista erotusta, esimerkiksi biokemiallisten muutosreaktioiden ollessa kyseessä. Tällöin vaiheessa 4 toimitaan solumassapitoisuudella, jossa kasvunopeus μ 20 vastaa maksimaalista muuttumisnopeutta. Jos saavutetaan tämä piste, aloitetaan solumassan poisto järjestelmästä. '· Solupitoisuus järjestelmässä pidetään siten vakiona. Jär- : ' jestelmä pidetään siten määrätyssä toimintapisteessä, jos sa muuttumisnopeus on maksimiarvossa.

25 Vaihe 5, jossa jatkuvatoiminen fermentointivaihe :1·.· keskeytetään, aloitetaan vaihtoehdon 4a mukaisesti, kun • · ;‘j1. kasvunopeus μ on saavuttanut alemman ääriarvon. Ääriarvon määrää yleensä solujen aineenvaihduntafysiologia; soluilla täytyy olla kulloisenkin myöhemmän käytön mukaan määrätyt • · 1 I.1 30 tunnusmerkilliset ominaisuudet.

• · · • · ·

Otettaessa talteen viljelmä vaihtoehdon 4a mukai- • · :.1·· sesti erotetaan koko biomassa. Tämä vaihe vastaa periaat- : teessä panosmenettelytapaa, mutta eroaa siitä kuitenkin «'· selvästi solumassasaannon suhteen. Saanto on keksinnön • 1 « • · • · « « · « 101083 mukaisen menetelmän yhteydessä selvästi suurempi kuin tavanomaisen panosmenettelyn yhteydessä.

Panosmenettelytavan (vaihe 4a) mukainen talteenotto on tärkeää sellaisissa prosesseissa, joissa tuote täytyy 5 oikeudellisten tai jalostusteknisten näkökohtien vuoksi määritellä panoksittaan, siis esimerkiksi lääke- tai elintarviketeollisuudessa. Keksinnön mukaisella menetelmällä on soluja kierrättävän jatkuvatoimisen menetelmän edut solusaannon suhteen ja samalla yksiselitteisen panoksit-10 täisen määrittelyn tarjoamat edut. Talteenotto tapahtuu aina steriileissä olosuhteissa.

Vaiheessa 4b sen sijaan on kyse täysin jatkuvatoimisesta fermentointimenetelmästä, jonka keskeyttäminen vaiheessa 5 ei tapahdu solumassan kasvukinetiikan vaan 15 ulkoisten vaikutusten, kuten esimerkiksi infektoitumisen, laitteiston viallisten osien tai tarkoituksellisen keskeyttämisen, vuoksi.

Vaiheessa 5 tehdyn talteenoton jälkeen huuhdotaan tuotteen kanssa kosketuksessa ollut laitteiston osa suo- 20 dattamalla steriloidulla vedellä ja täytetään annostelu- säiliöstä käsin vähän aikaa sitten steriloidulla alustal- *· la, jolloin se on heti uudelleen valmis seuraavaa panosta : *·· varten. Tämä panos inokuloidaan uudelleen eksponen- tiaalisessa kasvuvaiheessa olevalla esikasvatetulla vil- 25 jelmällä ja toistetaan prosessi.

:*·.· Keksinnön mukaisen menetelmän yhteydessä tuotanto- • · ;*j·. fermentori steriloidaan vain ensimmäisen panostuksen yh- teydessä tai infektoitumisen jälkeen; seuraavien panosten t.t«t yhteydessä tehdään kuitenkin vastaanottosäiliön steriloin- • · · M 30 ti. Alusta voidaan siirtää fermentoriin mahdollisesti kuu-• · · ·. ’ mana ja jäähdyttää se siellä nopeasti suoralla vesiruisku- • tuksella.

• *

Keksintö koskee lisäksi laitteiston käyttöä keksin-.' . nön mukaisen menetelmän toteuttamiseksi, jossa laitteis- 35 tossa on steriloitavissa oleva fermentointiastia, vähin-

< I

• · • I < 13 101083 tään yksi säiliö suodatussterilointiin soveltumattoman alustakomponentin ottamiseksi vastaan ja lämpösteriloimi-seksi ja/tai vähintään yksi varastosäiliö suodattamalla steriloitavissa olevan alustakomponentin vastaanottamisek-5 si, joka on varustettu sterilointisuodattimella steriilin alustakomponentin jatkuvaksi tuottamiseksi, sekä fermen-tointiastiaan liitetty steriloitavissa olevalla kierto, jossa on laitteet käytetyn ravintoalustan ja aineenvaihduntatuotteiden erottamiseksi, jolloin steriloitavissa 10 olevassa kierrossa on sentrifugi ja fermentointiastian ja sentrifugin väliin on sovitettu pidätysosa, jonka pituus on riittävä ravintoalustan vielä sisältämien ravintoaineiden käyttämiseksi.

Tämän laitteiston käytön edulliset suoritusmuodot 15 ovat alivaatimusten kohteena.

Keksinnön mukaista käyttöä ja laitteiston toimintaa kuvataan seuraavassa viitaten kuvioon 5.

Fermentoria F1 ilmastetaan ilmansuodatussteriloin- tiyksikön LF1 kautta ja se on kytketty vesihöyryllä steri- 20 loitavissa olevan kierron kautta sentrifugiin Zl. Pumppu P1 syöttää Zl:ssä erotetun konsentraatin takaisiin Fl:een.

'· Fermentoriin F1 syötetään valinnan mukaan säiliön B1 : *· ja/tai suodatussterilointiyksikön SI kautta suodattamalla steriloitua tai suoraan säiliön B1 kautta lämpösteriloitua

: 25 alustaa. Lisäksi voidaan syöttää alustavarastoihin S ja A

:*·.· suodattamalla steriloitua alustaa. Alustavarastoon S voi- • · daan lisäksi syöttää suodatussteriloitinyksikön Ml kautta suodattamalla steriloitua alustaa. Koko laitteistoon koh-distuva mittaus, ohjaus ja säätely tapahtuu integroidun • · · 30 prosessinohjaus järjestelmän kautta, joka toimii prosessi- • · · \ * spesifisen ohjelmiston ohjauksessa ja jota esittää kaavio- • · • *·: maisesti kuvio 6.

• ·

Keksinön mukainen menetelmä voidaan jakaa edellä , esitetyiksi kuudeksi vaiheeksi, joita kuvataan seuraavas- I3 5 sa. Vaiheita 1-6 valaistaan kuvion 5 avulla.

( I

4 I

14 101083

Vaihe 1 käsittää fermentointilaitteiston ja ravin-toalustakomponenttien valmistelun ja steriloinnin ja koostuu seuraavista kuudesta osavaiheesta: 1.1 prosessiveden laittaminen säiliöön F1 ja säi-5 liöiden F1 ja B1 täyttäminen alustalla; 1.2 suodatussterilointiin soveltumattoman alusta-konsentraatin lämpösterilointi Fl:ssä; 1.3 steriilin jäähdytysveden suora ruiskutus Fl:een suodatussterilointiyksiköstä SI; 10 1.4 suodattamalla steriloidun alustan siirtäminen säiliöstä B1 fermentoriin F1 ja alustavarastoihin S ja A; 1.5 fermentointitilavuuden säätäminen Flrssä S:stä tulevalla steriilillä vedellä; 1.6 Bl:n täyttäminen uudelleen suodatussteriloin-15 tiin soveltumattomia alustan aineosia sisältävällä kon- sentraatilla ja Bl:n lämpösteriloiti ja sitä seuraava epäsuora vesijäähdytys.

Vaiheessa 1.1 fermentoriin F1 ja säiliöön B1 syötetään prosessivesisyötön pääventtiilien V17 ja V18 kautta 20 alusta-aineosien liuotukseen tarvittava prosessivesimäärä.

. , Kumpikin säiliö täytetään käsitäyttöaukkojen Hl ja H2

« « I

'· ' kautta alustalla ja sekoitetaan alusta kokkareettomaksi • · • " sekoittimilla RF1 ja RBl. Kummassakin säiliössä on nyt ' alustakonsentraattia.

25 Fl:ssä oleva alustakonsentraatti steriloidaan vai- :\j heessa 1.2 kuumennusvaipan HM1 avulla ja jäähdytetään läm- :1·1: pötilaan alle 100 °C.

Vaiheessa 1.3 ruiskutetaan sitten sekoittaen vent-tiilin V2 kautta suodatussterilointiyksiköstä SI steriiliä • · · #·.Ι# 30 prosessivettä, kunnes saavutetaan seoksen lämpötila noin 60 °C.

• · ·.1·· Sitten siirretään venttiilin Vll ja suodatussteri- • « < !t<i! lointiyksikön SI kautta säiliöstä B1 steriiliä alustaa .·, : fermentoriin Fl. Lisäksi vaiheessa 1.4 syötetään suodat- • · · • · ti t · • « • · · 15 tamalla steriloitua alustaa venttiilien V12 ja V13 kautta alustavarastoihin S ja A.

Seuraavassa vaiheessa 1.5 fermentori F1 täytetään aloitustilavuuteen steriilillä prosessivedellä suodatus-5 sterilointiyksiköstä SI venttiilin V2 kautta. Fermentorin täyttötilavuus on nyt noin 1/3 - 1/4 suurimmasta mahdollisesta toimintatilavuudesta. Alustan pitoisuus säädetään sopivaksi prosessin käynnistämistä varten, ja seoksen lämpötila on 30 - 35 °C ja siten yleensä lähellä prosessiläm-10 pötilaa.

Kyn tyhjään ja huuhdottuun säiliöön B1 on lisätty prosessivesi venttiilin VI7 kautta, se täytetään käsitäyt-töaukon H2 kautta suodatussterilointiin soveltumattomilla alustan aineosilla, lämpösteriloidaan ne konsentraattina 15 kuumennusvaipan HM2 avulla ja jäähdytetään epäsuoralla vesijäähdytyksellä. Säiliössä B1 ja alustavarastoissa S ja A olevia alusta-aineosia käytetään myöhemmissä vaiheissa alustan annosteluun. Vaihe 2 käsittää laitteiston ensimmäisen panosmenettelytavalla toteutettavan toimintasyk-20 Iin, jossa alustan pitoisuus on alhaisempi ja fermentori . , osittain täytetty, ja se koostuu seuraavista neljästä pää- '· ' vaiheesta: « · " 2.1 prosessinohjausjärjestelmän PLS aktivointi; 2.2 fermentorin F1 inokulointi;

I I

25 2.3 solujen kasvatus; i^*.: 2.4 siirtyminen vaiheeseen 3 ennalta määrättyjen :*·*; kriteerien mukaisesti.

Prosessinohjausjärjestelmä PLS valvoo ja säätää .·.·. koko prosessia. Se koostuu laskinyksiköstä RE, näppäimis- • · « • · 30 töstä TA, monitorista Bi ja kirjoittimesta Du. Prosessin- • · · ohjausjärjestelmä on kytketty kaksisuuntaisesti RS232-lii- • · ·.**: tännän kautta fermentorin asetusarvo-ohjauksen F1SPS tie- « · · tokoneliitäntään CI ja ohjaa suoraan venttiilien ohjauksen .·. : SPS VS tai epäsuorasti säätimen R asetusarvojen kautta • · · 35 venttiilejä V ja pumppuja P. Kaikki prosessista mitatut • · • · · 16 101083 arvot siirretään mittaustulosvahvistimen MV, tietokonelii-tännän CI ja RS232-liitännän kautta prosessinohjausjärjestelmään PLS. Ennen prosessin käynnistämistä ladataan vaiheessa 2.1 koneeseen prosessispesifinen ohjelmisto. Se 5 sisältää kaikki hälytysarvot, asetusarvot, analysointitoi-minnot, venttiilienohjaustiedot ja dokumentoinnin. PLS säätää ennalta prosessin aloitusolosuhteet, ja niihin sisältyvät esimerkiksi seuraavat Fl:ä koskevat parametrit: prosessilämpötila, pH-arvo, redoksipotentiaali, hapen osa-10 paine, massa ja sekoittimen pyörimisnopeus. Ohjauksen alaisina olevat venttiilit VI, V2, V3, V5 ja V7 ovat kiinni; laitteisto on valmis inokulointia varten.

Fermentori F1 inokuloidaan ennalta valmistetulla ymppäysviljelmällä ymppäysmuhvin AS kautta ja käynniste-15 tään prosessi prosessinohjausjärjestelmällä PLS, ts. aktivoidaan prosessinohjaus- ja valvontatoiminto.

Prosessin alkuvaiheessa (vaihe 2.3) etenee solujen kasvatus panosmenetelmällä. Keksinnön mukaisen menetelmän etuna on alhainen alustan pitoisuus, joka mahdollistaa 20 solujen optimaalisen kasvun ja saa aikaan solujen hyvän . , sopeutumisen alustaansa.

* « i ]; : Panoskasvatusvaiheen lopussa, ennen substraatti- • · • " inhibitiovaiheen saavuttamista, täytyy kytkentäkriteerin I t i i i 1 ' vuoksi siirtyä seuraavaan prosessivaiheeseen, alustan an-

« I

25 nosteluun (vaihe 2.4). Kytkentäkriteerien määrittämistä • · ! *.ί kuvataan seuraavassa muutamin esimerkein.

• · :T: Esimerkkinä kytkentäkriteerien muodostamisesta ai- neenvaihduntatuotteiden stoikiometrisen titrauksen kautta .·.·. toimii homofermentatiivinen Lactobacillus-kanta, joka • · · • · 30 muuttaa glukoosin lähes kvantitatiivisesti maitohapoksi.

• · ·

Kasvatettaessa Lactobacillus-bakteereja käytetään • · *. *: fermentoria F1 vakio-PH: ssa, ts. muodostuvan maitohapon • · · vuoksi aleneva pH pidetään vakiona lisäämällä normaalisuu- : deltaan määrättyä emäsliuosta. Fermentorissa F1 vallitse- • · ,··, 35 vaa pH-arvoa mitataan ja säädellään pH-säätölaitteistolla • · • i · I? 101083 pH QAICR, joka koostuu mittausondista MS, mittausvahvisti-mesta MV ja säätimestä R. Mittausarvo- ja asetusarvotieto-ja vaihdetaan prosessinohjausjärjestelmän PLS kanssa, kuten edellä kuvattiin. Emäs on alustavarastossa L, ja sitä 5 annostellaan pH-säätimen F1 pH QAICR avulla venttiilin V4 kautta fermentoriin Fl. Emäksen kulutusta alustavarastossa K mitataan kapasitiivisella nestepinnanmittaussondilla LIRA ja arvot käsitellään prosessinohjausjärjestelmässä PLS.

10 Kytkentäkynnys määritetään emäksen kokonaiskulutuk sena. Kytkentäkynnys määritetään esikokeilla, joissa kasvatetaan soluja ravintoalustassa stationaarivaiheeseen asti, määritetään emäksenkulutus ja lasketaan sitten emäksen käyttömäärä, joka vastaa jäännössubtraattimäärää (glu-15 koosimäärää), jossa solut eivät vielä ole substraatti-inhiboituja ja ovat eksponentiaalisessa kasvuvaiheessa. Laskennallinen emäksenkulutus on siten pienempi kuin todellinen.

Esimerkkinä kytkentäkriteerin muodostamisesta il-20 mantarpeen perusteella toimii eräs Micrococcus-kanta (ae-, t robinen kanta). Hapen osapaine säädetään vaiheessa 2 ta-

• · I

pahtuvan kasvatuksen ajaksi vakioarvoon. 02-säätelylait-

• I

ί " teisto 02 QAICR koostuu mittaussondista MS, mittausvahvis- : timesta MV ja säätimestä R. Mittausarvo- ja asetusarvotie- !,*! 25 toja vaihdetaan prosessinohjaus järjestelmän PLS kanssa, kuten edellä kuvattiin kohdassa 2.1. Säätimen R lähtö on • · j'j'j säätöventtiilien V15 ja V16 edellä, jotka ohjaavat proses- « siin syötettävää kaasumäärää.

Panoskasvatuksen aikana solut kuluttavat lisäänty- • · · 30 vässä määrin ilmaa mitattuna massaläpivirtausmittareilla \ ’ MF1 ja MF2.

• · ·,*·· Tämä pitää paikkansa niin kauan, kun läsnä on subs-

• ( I

iif<! traattia ja solut lisääntyvät. Kun solut tulevat vaihee- .·. ; seen, jossa substraatti on rajoittavana tekijänä, alenee 35 ilmantarve pidettäessä Fl-02-QAICR:llä säädeltävä hapen • « χβ 101083 osapaine ja pyörimisnopeus (säädellään SAICR:llä) vakiona. Tätä laskua käytetään kytkentäkynnyksenä.

Esimerkkinä kytkentäkriteerin muodostamisesta neste- tai kaasufaasin C02-pitoisuuden perusteella toimii eräs 5 Leuconostoc-kanta.

Panoskasvatuksen aikana solut tuottavat C02:a, joka liukenee alustaan ja mitataan C02-mittauslaitteistolla Fl-C02-QAIC, joka koostuu mittaussondista MS ja vahvistimesta MS. Jotta pystyttäisiin nopeammin havaitsemaan C02-pitoi- 10 suuden muutokset, syötetään fermentoriin F1 typpeä massa-läpivirtausmittarin MF2 kautta ja sekoitetaan sisältöä vakionopeudella C02:n poistamiseksi. Kun solut tulevat vaiheeseen, jossa substraatti on rajoittavana tekijänä, syntyy vähemmän C02:a ja C02:n osapaine alustassa laskee. Tätä 15 laskua käytetään kytkentäkynnyksenä.

Vaiheessa 3 tapahtuu siirtyminen säädeltyyn ja ohjattuun alustan annosteluun, kunnes saavutetaan fermen-tointitilavuus; se koostuu seuraavista kahdesta päävaiheesta : 20 3.1 alustan annostelu; , , 3.2 siirtyminen vaiheeseen 4 ennalta määrättyjen

· I

kytkentäkriteerien mukaan.

• · • " Heti kun asianomainen kytkentäkriteeri toteutuu, ' alkaa säädelty alustan annostelu. Tämän tekemiseksi pH- • i 25 arvon kautta tapahtuvan ohjauksen yhteydessä määritetään ϊ,1·ί emäksenkulutus kuluneiden 2-10 min:n aikana alustavaras- ton L pinnankorkeusmittauksen LIRA kautta, ja prosessinohjaus järjestelmä muuttaa sen indikaattorisubstraatin (esi-merkiksi glukoosin) annostelunopeudeksi. Tämä voidaan teh- • · 30 dä seuraavalla kaavalla: * · · • · • · · • ·· • 9 • t · « · » I · I • · · * · < • « * I · « t 19 101083 SDBed.Gluc = (k1*k3«0,5*Z*a‘180 g/mol)/k2*t: jossa Z = emäksenkulutus (1) 5 a = emäsliuoksen normaalisuus (mol) tx = emäksenkulutuksen mittausaika (min) k3 = korjauskerroin kasvatus-pH:ssa dissosioitumatonta happoa varten k2 = kyseisen viljelmän substraatinhyödyntämiskerroin 10 k3 = esiannostelukerroin SDBed.oiuc = glukoosin annostelunopeus (g/min).

Indikaattorisubstraatin määrä on esikokeilla määritetyssä määrätyssä suhteessa muiden substraattiaineosien määrään. Prosessinohjausjärjestelmä laskee muiden subs-15 traattikonsentraattien annostelumäärät ja käyttöpitoisuu- teen laimentamisen vaatiman vesimäärän.

Koko alustakonsentraattiannostelu tapahtuu 2-5 minuutissa. Suodattamalla steriloitavissa olevat alustan aineosat annostellaan alustasäiliöstä S venttiilin V5 20 kautta, lämpösterioitavissa olevat alustan aineosat säili östä B1 venttiilin VI kautta ja laimennusvesi suodatusste- rilointiyksikön SI ja venttiilin V2 kautta. Alustasäiliös- • tä S ja säiliöstä B1 syötetyt alustatilavuudet mitataan kapasitiivisilla pinnankorkeusmittaussondeilla LIRA. Lai- 25 mennusveden annostelua suodatussterilointiyksikön SI kaut- j*.#| ta ohjataan massasäätimellä WICA antamalla prosessinoh- • · jaus järjestelmästä PLS kasvava asetusarvo fermentorille • · ·

Fl.

Solumassan lisääntyessä järjestelmässä kasvaa in- *.* 30 dikaattorisubstraatin ja siten koko alustan kulutus. Koska • · · * alustan pitoisuus pidetään vakiona, kasvaa annostelusykliä J^·.: kohden syötettävä alustamäärä koko ajan, kunnes saavute- taan fermentorin korkein mahdollinen täyttöaste. Annostel- 4 4* / . tavan alustan pitoisuus valitaan siten, että saavutettaes- • · « 35 sa fermentorin korkein mahdollinen täyttöaste saavutetaan • · · 20 101083 myös kyseisissä toimintaolosuhteissa korkeinta mahdollista solusaantoa vastaava kokonaisalustamäärä. Tämä arvo on maksimi- eli ominaissolusaanto.

Sellaisten organismien ollessa kyseessä, joiden 5 kasvatuksen yhteydessä ei ole olemassa tarkasti määriteltävissä olevaa indikaattorisubstraattia, tapahtuu alustan annostelu verhokäyrän ohjaamana, joka vastaa kyseiselle organismille ominaista kasvua kuvaavaa eksponenttifunktiota. Esikokeilla määritetään 1·1012 solun ominaissubstraa-10 tinkulutus, ominaiskasvunopeus μ, eliölukumäärä, joka saavutetaan vaiheessa 2 kytkentäkriteeripisteen saavuttamiseen mennessä, ja suurinta saavutettavissa olevaa eliölukumärää vastaava alustan pitoisuus.

Heti kun on saavutettu vaiheessa 2.4 kuvattu kyt-15 kentäkriteeri, alkaa ohjattu alustan annostelu. Määritetään alustamäärä 1, joka tarvitaan eliölukumäärän 1·1012 saavuttamiseen ja on kyseiselle kannalle ominainen. Annosteltavan alustan pitoisuus pidetään vakiona ja säädetään siten, että saavutettaessa fermentorin korkein mahdollinen 20 täyttöaste saavutetaan myös kyseisissä toimintaolosuhteissa korkeinta mahdollista solusaantoa vastaava kokonaisalustamäärä. Annostelusykliä kohden syötettävät substraat-titilavuudet kasvavat viljelyn edetessä.

Substraatin annostelu SD lasketaan seuraavista kaa- : 25 voista: xt = βμί+1ηχο (3.1.2.a) • · SD = sS^xt (3.1.2.b) • · · SDBer = sS>eMWnxo (3.1.2.C) • · • · · • · · *.' 30 xo = kokona!seiiölukumäärä järjestelmässä annostelun alus- • · · • · · sa : xt = kokonaiseliölukumäärä järjestelmässä ajanhetkellä t μο = ominaiskasvunopeus annostelun alussa • · . t = xo- ja xt-mittausten välinen aika 35 sS = 1-1012 eliön ominaissubstraatinkulutus (g tai ml) *···' SDBer = laskennallinen substraatinkulutus.

21 101083

Annosteluarvojen laskeminen ja annostelu tapahtuvat 5-15 minuutissa. Jos annostelutilavuudet ovat annostelun alussa liian pieniä, niitä lisätään seuraavaan annoste-lusykliin, ja ylityksen ollessa kyseessä annostellaan hy-5 vin pieniä määriä.

Ellei solujen hapenkulutus mitattuna massaläpivir-tausmittareilla MF1 ja MF2 sekoitusnopeuden ollessa vakio kasva enää määrätyn ajan kuluessa tai alenee, minkä aiheuttaa substraatin olo rajoittavana tekijänä, suurenne-10 taan annosteltavaa määrää, mikä kumoaa substraatin aiheuttaman rajoituksen. Ellei rajoitus vielä kumoudu, kun μ-ar-voa on kerran nostettu, nostetaan μ-arvoa uudelleen prosessille ominaisen odotusajan kuluttua.

Ohjaustoimintojen sovitus prosessiin voi tapahtua 15 02:n osapaineen lisäksi myös C02:n osapaineen kautta, joka määritetään C02-mittauksella C02QAICR. Mittausperiaatetta kuvataan kohdassa 2.4.3. Ellei massaläpivirtausmittarilla MF2 mitattu C02:n osapaine sekoittimen RF1 pyörimisnopeuden ja fermentoriin F1 syötettävän typpimäärän ollessa vakio 20 enää nouse tai laskee, minkä aiheuttaa substraatin olo rajoittavana tekijänä, suurentaa prosessinohjausjärjestel- t ( '· ' män PLS ohjelmisto annosteltua määrällä, joka johtaa ra- : " vintoalustan annostelunopeuden kasvuun ja kumoaa substraa- tin aiheuttaman rajoituksen. Ellei rajoitus vielä kumoudu, 25 kun μ-arvoa on kerran nostettu, nostaa prosessinohjausjär-jestelmän PLS ohjelmisto μ-arvoa uudelleen prosessille • · j1j'j ominaisen odotusajan kuluttua.

Kytkentäkriteeri vaiheesta 3 vaiheeseen 4 määrite- .·,·. tään fermentorin F1 massan kautta, joka mitataan vaa'alla • · · 30 FI WICA. Massakynnys valitaan prosessin mukaan.

• · · *. Vaihe 4 käsittää siirtymisen jatkuvatoimiseen me- • · :,1·· nettelytapaan, jossa vaihdetaan ravintoalustaa ja kierrä- tetään soluja täydellisesti tai erotetaan niitä osittain, s] ; ja se koostuu seuraavista neljästä päävaiheesta: • · · · • « • » · 22 101083 4.1 sentrifugin käynnistäminen ja erotuksen ja solujen kierrätyksen aloittaminen; 4.2 menettelytapa, jossa kierrätetään kaikkia soluja; 5 4.2.1 substraatin annostelu solujen kierrätyksen aikana tai vaihtoehtoisesti 4.3 menettelytapa, jossa erotetaan osa soluista 4.3.1. prosessin toiminta kierrättäen kaikkia soluja osittaisen erotuksen alkamiseen asti; 10 4.3.2 siirtyminen osittaiseen solujen erottamiseen; 4.3.3 osittainen erotus; 4.4 keskeytys ja siirtyminen vaiheeseen 5.

Ennen vaiheen 3.2 mukaisen kytkentäkynnyksen saavuttamista kytketään päälle erotin Zl ja kytkentäkynnyksen 15 saavuttamisen jälkeen avataan venttiili V7 prosessinohjaus järjestelmän PLS kautta. Venttiilillä V8 säädetään jo ennen erottamista prosessille ominainen maksimivirtausno-peus erottimen kautta. Säädetty läpivirtausnopeus rekisteröidään induktiivisilla läpivirtausmittarilla IDM 1, ja 20 sen ottaa vastaan prosessinohjausjärjestelmä PLS. Erotetun solumassan kierrättämiseksi kytketään venttiilin V7 rin-

I I

'· nalle pumppu Pl. Venttiilit V9 ja V6 ovat auki prosessin : alusta lähtien.

Erotetun solumassan konsistenssin tulee olla juok-25 seva, jotta vaiheen 4,2 mukainen solumassan kierrätys pum-pulla Pl on mahdollista ja solumassan takaisinsekoittumi- • » :’·*· nen tapahtuu nopeasti fermentorissa Fl. Konsistenssi vas- taa yleensä näitä vaatimuksia sedimentin osuuden ollessa alle 60 %. Sakeusaste ei saa laskea pienemmäksi kuin 40 % « · · 30 sedimenttiä, koska tällöin kierrätettävä alustatilavuus • · · ' • · · *. alentaa erottimen Zl tehollisen erotuskyvyn 15 %:ksi.

• *.*·; Sakeusastetta säädellään erottimen Zl tyhjennys- « · · ajalla. Tyhjennys tapahtuu suunnilleen 3-4 minuutissa, ,·] : koska solujen viipymisaika erottimessa ei saa olla tätä 9 9 9 9*9 9 9 9 9 9 23 1 0 1 0 8 3 pitempi. Tällöin tuloksena on käytetyn solulajin mukaan solujen vähäisin vahingoittuminen.

Substraatin annostelu jatkuu solujenkierrätyksen aikana valittujen parametrien mukaan tai sitä säädetään 5 mahdollisesti solujen kierrätyksen ajaksi. Solujen kierrätys ilman substraatin annostelua on välttämätöntä sellaisten organismien kohdalla, joilla on hyvät laskeutumisomi-naisuudet vasta täysin glukoosittomassa alustassa (katso esimerkki 1). Sellaisten organismien ollessa kyseessä, 10 joiden kasvatuksen yhteydessä annostellaan substraattia solujen kierrätyksen aikana, voi tämä tapahtua esimerkiksi seuraavasti.

Tehtäessä annostelu indikaattorisubstraattitietojen perusteella tapahtuu substraatin lisäys tarpeen mukaan. 15 Laimennusveden annostelu tapahtuu suodatussterilointiyksi- kön SI ja venttiilin V2 kautta fermentorin Fl massansää-telyn WICA ohjauksessa, joka pitää fermentorin massan vakiona riippumatta sentrifugin Z1 todellisesta erotustehos-ta. Massan asetusarvo on ennalta annettu ja vastaa proses-20 sille ominaista fermentorin Fl toimintatilavuutta. Alusta-säiliöstä S venttiilin V5 kautta ja säiliöstä B1 venttii- • · · *· 1! Iin VI kautta annosteltavat alustakonsentraattimäärät mää- : ’·· ritetään ja annostellaan indikaattorisubstraatin kulutuk- sen mukaan. Prosessin edetessä syötettävä kokonaissubs-25 traattimäärä ja eri aikoina annosteltavat substraattimää-rät noudattavat eksponenttikäyrää ylärajaan asti, jonka • · .1!1. jälkeen annostelu ei enää tapahdu tarpeen mukaan vaan li- neaarisesti. Yläraja saadaan korkeimmasta mahdollisesta alustan pitoisuudesta syötössä, joka ei saa ylittää esiko- • · · !.! 30 keillä määritettyä arvoa.

• · · *. Korkein syöttömäärä määräytyy sentrifugin todelli- • · ·,1·· sen tehollisen erotuskyvyn Teff mukaan. Tarpeen mukaan määräytyvä substraatin annostelu on aina pienempi tai sama ·1 · kuin Teff-arvosta laskettu substraatin maksimiannostelu.

« · · t 4 • · 24 101083

Verrattuna tavanomaiseen panosmenetelmään on tällaisella ohjauksella keksinnön mukaisen menetelmän yhteydessä saavutettava eliölukumäärä vähintään kymmenkertainen.

5 Annostelu voi tapahtua myös ennalta laskettujen arvojen (verhokäyrän) perusteella vastaavalla tavalla kuin edellä kuvattu indikaattorisubstraattitietojen perusteella tapahtuva annostelu.

Menettelytapa, jossa käytetään osittaista solujen 10 erotusta (vaihe 4.3) vastaa aluksi kohdassa 4.2 kuvattua menetelmää, jossa tehdään solujen täydellinen kierrätys. Prosessi toteutetaan soluja täydellisesti kierrättäen siihen vaiheeseen asti, jossa aloitetaan solujen osittainen erotus.

15 Kytkentäkriteeri solujen osittaisen erotuksen aloi tukselle on prosessille ominainen, mutta liittyy aina omi-naiskasvunopeuteen μ, koska substraatin hyödyntäminen ja aineenvaihduntatuotteiden tuotanto riippuvat suoraan omi-naiskasvunopeudesta. μ on kullekin organismille ominainen 20 ja määritetään esikokein.

Koko järjestelmään syötetystä substraattimäärästä ja ominaissubstraatinkulutuksesta solulukumäärää kohden

I I

« I

: lasketaan järjestelmän kokonaiseliömäärä. Tämä vastaa jär jestelmän määrätyllä tilavuudella määrättyä alustan maksi-25 mipitoisuutta ja määrätyllä erotusteholla määrättyä kasvu- :\j nopeutta μ, joka vastaa kytkentäpistettä.

:*·*; Osittaiseen erotukseen mennessä saavutettu eliölu- kumäärä järjestelmässä pidetään vakiona poistamalla mää-rätty solumassavirta järjestelmästä.

• · · 30 Solumassan poistamiseksi järjestelmästä suljetaan » · t venttiili V9 ja avataan venttiili V10 pumpun P1 käydessä.

• · ·.*·· Määritetään läpivirtausmittarilla IDM2 poistettava konsen-

• I I

traattimäärä ja suljetaan venttili V10 ja avataan venttii-; li V9 lasketun määrän saavuttamisen jälkeen. Poistosyklin 35 kesto on noin 3-10 min.

• · • · II· 25 101083

Jos substraatin annostelu tapahtuu indikaattori-substraatin mukaan, jatketaan vakioannostelua noudattamalla osittaisen erotuksen alkamishetkellä käytettävää annos-telumäärää. Jos annostelu on ylärajalla, se pidetään tässä 5 arvossa.

Tehtäessä annostelu ennalta laskettujen arvojen (verhokäyrän) perusteella jatketaan samoin vakioannostelua noudattamalla osittaisen erotuksen alkamishetkellä käytettävää annostelumäärää. Jos annostelu on ylärajalla, se 10 pidetään tässä arvossa.

Tällainen annostelu mahdollistaa erotetun solumas-san jälkikasvatuksen. Pidettäessä syöttö- ja poistosuhteet vakioina järjestelmässä muodostuu stabiili tasapaino. Solut kasvavat vakiokasvunopeudella μ.

15 Menetelmässä, jossa käytetäänn solujen täydellistä kierrätystä, muodostaa substraatin kokonaiskulutus jatkuvatoimisen vaiheen keskeytyskriteerin. Kokonaissubstraat-timäärän ollessa prosessista riippuvainen muodostuu prosessista riippuva kokonaiseliömäärä järjestelmässä määrä-20 tyllä kasvunopeudella μ. Substraatin hyödyntämistä ei pidetä enää riittävänä määrätystä kasvunopeudesta lähtien.

« I

Menetelmässä, jossa käytetään solujen osittaista ! kierrätystä, muodostavat järjestelmäviat, kuten infektiot, pilaantuminen tai konehäiriöt, tai taloudelliset tai muut 25 näkökohdat jatkuvatoimisen vaiheen keskeytyskriteerin.

:*·.· Vaihe 5 koostuu jatkuvatoimisen fermentointivaiheen • · .*·*· keskeytyksestä ja koko biomassan talteenotosta steriileis- sä olosuhteissa.

Sellaisten organismien ollessa kyseessä, joiden • i · 30 sedimentoitumisominaisuudet ovat talteenoton kannalta • · « • · · *. riittävät vasta glukoosittomassa väliaineessa, tehdään • · s.*·· talteenotto ilman substraatin annostelua sentrifugin mak- simierotusteholla.

• t r

Talteenotto substraattia annostellen tehdään samal-35 la tavalla erille, joiden yhteydessä substraattia annos-

• I

• · « 26 1 0 1 0 8 3 teilaan indikaattorisubstraatin tai verhokäyrän perusteella, ja se mahdollistaa solujen talteenoton siten, että säilytetään aineenvaihdunta-aktiivisuus. Talteenotto aloitetaan avaamalla venttiili VI ja sulkemalla venttiili V9.

5 Talteenottoa varten määrätään ennalta massansäätimellä WICA F1 ohjattava fermentorin massan aleneminen ajan funktiona FlAMFl, joka saadaan talteenoton pisimmästä hyväksyttävästä kestosta ja jonka tulee olla pienempi kuin IDMl:llä mitattu sentrifugin maksimierotusteho.

10 Vaihe 6 koostuu uusien steriilien ravintoalustojen syöttämisestä steriiliin laitteistoon ja prosessien toistamisesta vaiheiden 1-5 mukaisesti säästäen steriloinnin vaatimaa kokonaisaikaa ja energiaa (peräkkäispanosmenette-ly).

15 Heti talteenoton jälkeen suljetaan kaikki venttii lit. Fermentori Fi huuhdotaan venttiilin V19 ja CIP-kuulan kautta suodatussterilointiyksiköstä SI tulevalla suodattamalla steriloidulla vedellä mahdollisesti läsnä olevien epäpuhtauksien poistamiseksi. Likaantunut vesi johdetaan 20 venttiilien V7 ja V8 kautta sentrifugiin Z1 käytettäväksi sen esihuuhteluun.

Huuhteluvaiheen jälkeen venttiilit V19, V7 ja V8 « « : suljetaan.

Sitten puhdistetaan sentrifugi Z1 venttiilien V20, 25 ja V21 CIP kautta (cleaning in place). Tämä on väittämäin*.: töntä sentrifugissa olevien solumassajäännösten poistami- :*·*: seksi, sillä ne siirtyisivät hajoamis vaiheeseen seuraavan erotussyklin alkamiseen mennessä. Puhdistuksen jälkeen suljetaan venttiilit V20 ja V21 ja sentrifugi steriloidaan • « « 1.'.' 30 vesihöyryllä pääventtiilien V7, V8, V10 ja V22 kautta.

• · ♦

Sterilointi ajoitetaan vaiheen 2 yhteydessä kuvattuun pa- • · ·.**: nosmenettelyvaiheeseen. Tässä vaiheessa erotinta ei käyte- tä.

: Valmistetaan ravintoalusta seuraavaa prosessisykliä 35 varten säiliössä Bl. Ensin valmistetaan säiliössä B1 suo- • · • · • · · 27 101083 dattamalla steriloitavissa olevat alustan aineosat ja siirretään ne samalla tavalla kuin vaiheessa 1.4 venttiilien Vll kautta säiliöstä B1 suodatussterilointiyksikön SI ja venttiilin V2 kautta käsin fermentoriin Fl. Lisäksi 5 syötetään suodattamalla steriloitua alustaa käsikäyttöisten venttiilien V12 ja V13 kautta alustavarastoihin S ja A.

Sen jälkeen säiliö B1 täytetään prosessiveden lisäämisen jälkeen venttiilin V17 kautta suodatussteriloin-10 tiin soveltumattomilla alustan aineosilla, lämpösteriloi-daan ne kuumennusvaipan HM2 avulla ja jäähdytetään epäsuorasti vedellä HM2:n avulla. Säiliön B1 steriloinnin aikana lisätään suodatussterilointiyksikön SI ja venttiilin V2 kautta sellainen määrä steriiliä prosessivettä Fl:ssä ole-15 vaan alustakonsentraattiin, että säiliöstä B1 venttiilin VI kautta tulevan kuuman lämpösteriloidun alustakonsen-traatin annostelun jälkeen fermentorissa Fl on fermentoin-nin aloituksen vaatima seosmäärä.

Prosessi etenee jatkossa kohdissa 2-6 kuvatulla 20 tavalla.

Esimerkki 1 «

Lactobacillus curvatus -organismin, kanta 2 DSM

4264, fermentointi tyypillisellä menetelmällä

Menetelmän toteutus voidaan jakaa viideksi vaiheek-25 si, jotka etenevät laitteiston käynnistyksen jälkeen syk- :*·.· lisesti.

• · .*j‘; Vaihe 1: fermentointilaitteiston ja ravintoalusta- komponenttien valmistelu ja sterilointi:

Ennen menetelmän toteuttamisen aloittamista tarkis- i i t 30 tetaan koko laitteiston tiiviys ja luodaan sen jälkeen • · · *. alkuedellytykset alustojen panostamiselle asettamalla • · ;,*·· asianomaiset venttiilit oikeaan asentoon. Ravintoalustat : : punnitaan ja laitetaan säiliöihin. Steriloidaan laitteis- .* . to.

• · · • · • · 28 1 0 1 0 8 3

Kuviot 9 ja 10 esittävät laitteisto- ja proses-siparametrien muuttumista ajan funktiona.

Vaihe 2: fermentoinnin aloitus inokuloimalla fer-mentori ymppäysviljelmällä, prosessinohjausjärjestelmän ja 5 laitteiston ensimmäisen toimintasyklin käynnistäminen noudattaen panostoimintamenettelyä käyttämällä alhaisempaa alustan pitoisuutta ja fermentorin ollessa osittain täytetty :

Kaikki toimintaparametrit pidetään vakioina tämän 10 vaiheen aikana. Vaiheen 2 lopussa saavutetaan kytkentäpiste, jossa siirrytään vaiheeseen 3. Kytkentäpiste on alustan määrätty glukoosipitoisuus. Kytkentäkynnykseksi asetetun glukoosipitoisuuden, noin 1 g/1, saavuttamiseen asti kuluu fermentoinnin alusta alkaen määrätty määrä natrium-15 hydroksidia. Jos saavutetaan tämä kulutusmäärä, siirrytään seuraavaan vaiheeseen.

Vaihe 3: siirtyminen lopullisen fermentointitila-vuuden saavuttamiseen asti jatkettavaan alustan säädeltyyn annosteluun: 20 Alustaa annostellaan indikaattoriaineena toimivan . natriumhydroksidin säätelemänä. Tässä esimerkissä annoste-

• I

lu tehdään noudattamalla portaittaista käyrää, mikä in- • '1 dusoi kyseisen mikro-organismin kohdalla sangen nopean kasvun (katso kuvio 10).

·. 25 Joidenkin muiden mikro-organismien ollessa kyseessä • » i#*.j on jatkuva annostelu välttämätöntä optimaalisen kasvun :*·*: kannalta. Prosessinohjaus järjestelmällä voidaan toteuttaa haluttuja annostelutapoja.

Vaihe 4: siirtyminen jatkuvatoimiseen menettelyta- • · 30 paan, jossa vaihdetaan ravintoalustaa ja kierrätetään so- • · · luja kokonaan tai osittain: • · *.*·: Kyseisen organismin kohdalla vaiheen 4 alussa pie- « « t nennetään fermentointitilavuutta kierrättäen kaikkia solu-.·. ja ja lisätään sitten alustaa. Menettelyn edetessä jatke- 35 taan solujen kierrätystä erottaen osa soluista. Sen jäi- « · < 29 101083 keen annostellaan taas lisää alustaa. Vaiheen 4 kuvattu kulku on tyypillinen käytettävällä organismille. Muille organismeille käytetään erilaisia erotus- ja annosteluvä-lejä tai jatkuvaa erotusta ja annostelua (katso kuvio 9).

5 Vaihe 5: jatkuvatoimisen fermentointivaiheen kes keytys ja koko solumassan talteenotto steriileissä olosuhteissa:

Kun ravintoalustat on kulutettu kokonaan, mikä on nähtävissä natriumhydroksin kulutuksen loppumisesta, aloi-10 tetaan talteenotto. Talteenotto tehdään sentrifugin suurimmalla mahdollisella erotusteholla ilman solujen kierrätystä. Käytetyn organismin vuoksi on erotusteho heikko muihin organismeihin verrattuna. Heikko erotusteho johtuu organismia ympäröivästä sakkaridivaipasta, joka vaikeuttaa 15 laskeutusta. Muut organismit, joilla ei ole sakkaridivaip-paa, mahdollistavat erottimen 2- - 3-kertaisen erotus-tehon. Tässä esimerkissä kuvattu organismi asettaa edellä mainitun sakkaridivaipan muodostuksen ja sen aiheuttamien heikkojen sedimentoitumisominaisuuksien vuoksi suuria vaa-20 timuksia menettelylle, koska voidaan käyttää vain suhteel-. lisen alhaisia alustanvaihtonopeuksia.

t

Vaihe 6: uusien steriilien ravintoalustojen panos- • “ taminen steriiliin laitteistoon ja prosessin toistaminen ' vaiheiden 1-5 mukaisesti säästäen kokonaisterilointiai- 25 kaa ja energiaa: • · ·,’·· Vaiheen 4 lopussa alustasäiliöihin syötetään uuden : pitoisuudeltaan alhaisen panoksen vaatimat alustamäärät.

Fermentoriin F1 pumpataan suoraan vaiheen 5 jälkeen ste-riiliä alustakonsentraattia ja steriiliä vettä ja tehdään • · 30 heti sen jälkeen panoksen inokulointi uudella ymppäysvil- #· # jelmällä. Sen jälkeen, menettelyvaiheen 2 aikana, valmis- • · · *· ” tetaan alustavarastosäiliöissä Bl, S ja A jatkuvan toimin-

«M

·...' nan aikana annosteltavat alustat.

;\j Menetelmä toistetaan käyttämällä seuraavia kantoja: • « .···. 35 Esimerkki 2: Lactobacillus curvatus, kanta 3 DSM 4265 • · 4 · · 101083 30

Esimerkki 3: Pediococcus pentosaceus DSM 6165

Esimerkki 4: Pediococcus acidilactici DSM 6164

Esimerkki 5: Staphylococcus carnosus Sei DSM 6162

Esimerkki 6: Micrococcus varians M 28 DSM 6163 5 Esimerkki 7: Micrococcus varians M 101 DSM 4263.

Kasvatusparametrit on koottu seuraavaan taulukkoon: « · * I ' < t

• · i « I

• · · • · IM · · • · · • · * · · * I · • 9 • · · • 1 · • · · f • · • · · • · · 9 9 • 1 t

• I I I

I · ·

• < I

· · • < • « • « · 31 101083 e «SO) e e -h -h a > CM CO QO to W 'rl CM > O G CO X O O 0 o x a) o o o 3 sf tn 0 o ω o m κ o Λ Λ ft o x o m^s-Hcd ·—. οο X cm o o 3 3 p.

Cji—icn « •'ΌΙι—I ·· ·Η sf G iH r-1 O

M in X O O X O a) I CM Z i-H ÖO O X

2 0 sf co cm 3ooo > w ^ m I oo CM 00--1 o

1“I

G

g -H G G <D

E> CM X X X G

cm > o G ex: öo en en x o -H -H O O 0 /-Nz-^cno sf en 0 o o o o o 3 130000 in &·? ·—ie \ O I—I CM ÖO CC O X X P.

ID N h « - Ό I X 00 3 0 0 3 3 0.

M in X O O X O ·· X I M β I—IrHO

S S x co cm 3000 *-i O CM Z —1 00 O i—I

v-· Cm m G oo

CM M r-C

G G

cm co a G <u

CM O G ·Η to X X X G

O -h -un) öo en en x /—s i—i cm O co 0 O G<ur^ O O 0 m x o m S'? e — o ή ΐ h öo o o o 3 m <; —i « toi^m o o -h w o X X o.

J, < O in i3 O XO X G I 1300330.

ti CO C/3 X CO CM 3000 ·—1 3> X G X X O

[1 w cm m ·· X I sf cm z -—i öo U x * cm -—i o oo * ω ¢3 °

0 M H

« G

JM a G 0)

S -H -H G

J* x ÖO CO CO -H

2 ^s sf o o o θ .·? st i3 O Oi Geo O 00 —.0003 B o .-h «I -h vo en m o x x o.

SF ω o m cMO0m co o o 3 3 p.

£ Ph X CO Z CM *·— ·· I CO G rH t-H O

w t-H i -—I CO Z —i 60 O H

S MJ-

·* CM

S G

« G G S

x X -H -H G

° m t>0 CO M -H

,·,!*: cm vo o o 0 - G ^s m C_> G—' CM ÖO -s. 0 0 0 3 • S co x O en -H ® o X X O.

.1¾ X i-H «I CMO0 -M I co O O 3 3 G.

;·,,·§ w o m z cm ^ · coe x x o

«RCMXCO .—I fH i-H Sf CO Z -—I ÖO O X

' CM

,, , ω ^ t M-> 3 « I ’ s w

, 2 co C

‘ 3 ωχ G G ω

? 3 ω ·Η -H G

! ,! 1 χχ öo m en ·η • · /~v in υ ή cm o o 0 ··· cm XO Ov G CM G ÖO — 0 0 0 3 O CM 1 I X X > 1 ® Ο X X O.

<; o m cm o 0 m I co o o 3 3 o.

X >3- CO Z CM ·· ÖO st COG 1-lrHO

i-H 1—1 --Η o CM COZ—löOOX

X

G

-H G G ω : : : 3 -h -h g

·· GX 00 co to X

• · · X O O 0 o x 00 —. 0003 . X CM « O X X O.

/-s sf O G CM 3 CO O O 3 3 P.

, . ,-h xo en xxxi co e x x o

··· M cm - I CM O 0 in O COZ^MÖOOX

*. *: < o m z CM ->» G sf

(11 X Sf CO I-Hf—li—I X CM

•" > 1

* CM G I I

: X o G G -H G O

. .. o p. e·? ω -u -u ω j-> . μ I G I 0 g G co 3 ... ω en r-H en en co x x -h 1 :g X o

:: 03 -H 33 34J0 O en 0 3 Geo G

... 3 3 3 3 3 3 3· H X >,X3 Φ3 G

G e G :o G en 3X0 3<u:G<ueocn4-> ωχ

3 ι > p. > β ΜομΜΧχο.·τ-)>μΧ3 χ X

G S en 0 en 0 GX:o BOX O. X en en :e x xx G CO G :Λ G X βω>ν3Ο30Χβω03 βω

X QXXXX xcnp..nXcn>H>XXWX HX

32 101083

»H

m _ g . “ l'' O VO g g «Π υ ^ ^ o ^ ° eo

ro ^ G C

<u m

ai CO

C M

•h a et u O. 3

t—l ClH

CO 3

O 00 O 2 S - S

g N ^ 5 ja ° S § » 5% - 4 o* 3

3 I

i—I ·Η

OO O

rH 4J

_ Ci CVJ O rH e) C.

irP S o O W -H

ia Z3 O .C O 00 CO CO CO

9 < -· evj 303 s ry —i oi m o 3 00 w ^ ro <3 .M co

O I

O 3 I

-θ’ '—I ·Η

iH 00 O

!N rH ^ *J

X! 00 C -H

_ i ^ o at ex

^ 2 O -H v -H

% , ~ O CO CO CO CO

ω ° 3 0 3 S o sf rH O 3 ^ <3 co

<N

O I

O 3 I

i—i *H

1—I ÖO o

. , CN i—I \ -U

... J3 M Ö Ή ’. ' JT' I ^ o at ex PO 'O --.o >—. 4-1 ·Η

: ·. w 1-1 O U-1 CO CO CO

• 1 W O 3 0 3 • PM VO o -o- r-H O 3

<J r^i CO

; es , o . o

. . : VO I CO

• · · i—I *H 3 • · '“v VO ,—| I-HCC03 >-1 ··· csivo o ^.aioto n o .

::: οο 4-> o ·η «ooo • ·*5 ^ in ra Ai o aio) 4-104.-1

*->·<* O rM ^-1 3 G 4-> 4-14-1 CSS

O s* t—I »H *H CC at <r <3 oo ex ota) Ajatat ^ ^ Ή 4-14-1

.*,* ^ CO O CO C C

··« co e co 3 ·Η 3 at at *· leo 3 0 at +j ra M & ··· Ή 3 -u-uouo ;;; .-i e ra 3 « at af at G co co • atoco > > co .H M G 0 . /-S -ίο O H 4-1 O ·Η m Μ o ·η at at at ·. <-· VO o O ·— (Ο,ώο 3 3 4-1 T3 O ·Η ·Η

• ·.: pq <Ν<3·^-ιο 00334-1 O O C Ή UM

. J /-n «? -·* i—ii—i ή euoeoated 3 μ 'vfrHr-i^j· 1-143000. co ra ex at 3 t> t> , 3 3 3 0

< £ CO I r-l r-l CO CO CJ CO CO

‘ 4-1 I psl CO r-s r-l i—I 3 3 O 3 3 ‘ a) β 0 Cl ο·η·η·ηοοοοο C Ή e N «I vl C 4J ooooooo ..v_x Oo ·η·η to Bo) ote a) at o o >h o o M X, M 4J .14 a! G > ro CX ·.-( χχυορ^υο • ••o ota) oa) :at 4-> at lo ooooxtoo

; · B 4-1 4-14J 4-1 CO M-l r-N β CO 4-1 4-1 4-1 ·Η -H CX M M

... ,14 3 ra CG cateo-Hotoc oo-COato^i 3 co Oa o)*h <d <d o -u o) -u cd <d aj a> o) ±j ·η ·η

H t! M e0V>Mjiaaw:aB ,J ,-J pn (X, W S S

3 S «O C -H 3 4J ·η at Ή a) >s h oj ® w u a)oa>*»cd0.o^wa) /-s /—s /—s /-s. /—% /-n /—n g_i m Qw e—icNco^LOvor·** 33 101083

Esimerkki 3

Pediococcus pentosaceus -organismin fermentointi

Menetelmän toteutus voidaan jakaa viideksi vaiheeksi, jotka etenevät laitteiston käynnistyksen jälkeen syk-5 lisesti.

Vaihe 1: Fermentointilaitteiston ja ravintoalusta-« komponenttien valmistelu ja sterilointi:

Ennen menetelmän toteuttamisen aloittamista tarkistetaan koko laitteiston tiiviys ja luodaan sen jälkeen 10 alkuedellytykset alustojen panostamiselle asettamalla asianomaiset venttiilit oikeaan asentoon. Sen jälkeen valmistellaan fermentointilaitteisto. Ravintoalustat punnitaan Pediococcus pentosaceus -reseptin mukaisesti ja laitetaan reseptissä ilmoitettuihin säiliöihin. Laitteisto 15 steriloidaan.

Vaihe 2: Fermentoinnin aloitus inokuloimalla fer-mentori ymppäysviljelmällä, prosessinohjausjärjestelmän ja laitteiston ensimmäisen toimintasyklin käynnistäminen noudattaen panostoimintamenettelyä käyttämällä alhaisempaa 20 alustan pitoisuutta ja fermentorin ollessa osittain täy- , tetty: ; Laitteistoparametrien kulku esitetään kuvioissa 7 ja 8, alue 1, panosvaihe. Kaikki toimintaparametrit pidetään vakioina. Vaiheen 2 lopussa saavutetaan kytkentäpiste 25 vaiheeseen 3 siirtymiselle. Tässä esimerkissä kytkentäpis- ί/.j te on alustan määrätty glukoosipitoisuus. Kytkentäkynnyk- seksi asetetun glukoosipitoisuuden, noin 1 g/1, saavutte-miseen asti kuluu fermentoinnin alusta alkaen määrätty .·.·, määrä natriumhydroksidia. Jos saavutetaan tämä kulutusmää- • · <4 30 rä, siirrytään seuraavaan vaiheeseen (katso kuvio 8).

• · «

Vaihe 3: Siirtyminen lopullisen fermentointitila- • · vuuden saavuttamiseen asti jatkettavaan alustan säädeltyyn annosteluun:

Alustaa annostellaan indikaattoriaineena toimivan 35 natriumhydroksidin säätelemänä. Tässä esimerkissä annoste- 34 101083 lu tehdään jatkuvasti, mikä indusoi kyseisen mikro-organismin kohdalla sangen nopean kasvun. Jatkuva annostelu on nähtävissä kuviossa 7 fermentointitilavuuden, glukoosimää-rän ja proteiinimäärän kasvusta. Joidenkin muiden mikro-5 organismien kohdalla on portaittainen annostelu välttämätöntä optimaalisen kasvun kannalta. Prosessinohjaus järjestelmällä voidaan toteuttaa haluttuja annostelutapoja.

Vaihe 4: Siirtyminen jatkuvatoimiseen menettelytapaan, jossa vaihdetaan ravintoalustaa ja kierrätetään so-10 luja kokonaan tai osittain:

Vaiheen 4 alussa pienennetään fermentointitilavuut-ta kierrättäen kaikkia soluja ja lisätään sitten alustaa. Menettelyn edetessä jatketaan solujen kierrätystä erottaen osa soluista. Sen jälkeen annostellaan taas lisää alustaa.

15 Vaiheen 4 kuvattu kulku on tyypillinen käytettävälle organismille. Muille organismeille käytetään erilaisia erotus- ja annosteluvälejä tai jatkuvaa erotusta ja annostelua.

Vaihe 5: Jatkuvatoimisen fermentointivaiheen kes-20 keytys ja koko solumassan talteenotto steriileissä olosuh-. , teissä:

• I

’· '· Kun ravintoalustat on kulutettu kokonaan, mikä on : " nähtävissä natriumhydroksin kulutuksen loppumisesta, aloi- tetaan talteenotto. Talteenotto tehdään sentrifugin suu-

• I

25 rimmalla mahdollisella erotusteholla ilman solujen kier-rätystä.

• ·

Vaihe 6: Uusien steriilien ravintoalustojen panos-taminen steriiliin laitteistoon ja prosessin toistaminen vaiheiden 1-5 mukaisesti säästäen kokonaisterilointiai- • · · 30 kaa ja energiaa: • · ♦

Vaiheen 4 lopussa alustasäiliöihin syötetään uuden • · ·.1·· pitoisuudeltaan alhaisen panoksen vaatimat alustamäärät.

:>if! Fermentoriin F1 pumpataan suoraan vaiheen 5 jälkeen ste- ,·. : riiliä alustakonsentraattia ja steriiliä vettä ja tehdään 35 heti sen jälkeen panoksen inokulointi uudella ymppäysvil- 35 101083 jelmällä. Sen jälkeen, menettelyvaiheen 2 aikana, valmistetaan alustavarastosäiliöissä Bl, S ja A jatkuvan toiminnan aikana annosteltavat alustat.

• ·

• t I

• · • · · • · · • · • · · • · · • · · • « • · <- • · t • « • · · • · · • · « 1 « • · · • · · • ·

Claims (21)

1. 36 1 0 1 0 8 3
2. 1. Menetelmä solumassan ja/tai fermentointituot-teiden aikaansaamiseksi steriileissä olosuhteissa kierrät-5 tämällä fermentointiseosta ainakin ajoittain ja erottamalla viljeltyjen solujen aineenvaihduntatuotteita ja mahdollisesti solumassaa, tunnettu siitä, että se sisältää seuraavat vaiheet: - fermentointilaitteistoon syötetään halutun solu-10 viljelmän käynnistämiseksi riittävä ravintoalustamäärä; - laitteisto steriloidaan ja säädetään haluttu ravintoalustan pitoisuus, joka on pienempi kuin soluviljelmän spesifinen ravintoalustan pitoisuus; - ravintoalusta inokuloidaan ymppäysviljelmällä ja 15 viljelmän annetaan kasvaa häiriöttä määrätty aika panos- viljemänä ja fermentointilaitteiston ollessa osittain täytettynä; - ravintoalustan pitoisuus nostetaan soluviljelmän spesifiseen ravintoalustan pitoisuuteen samalla kun nos- 20 tetaan 1)ravintoalustan tilavuutta laitteiston edellyttä-; mään työskentelytilavuuteen ja 2) solupitoisuutta; ;·. - siirrytään jatkuvaan toimintatapaan, jolloin vaihdetaan ravintoalustaa ja erotetaan aineenvaihdunta-, , tuotteita sekä kierrätetään soluja täydellisesti tai osit- '· 25 tain; • t • · · *· *! - jatkuva toimintatapa keskeytetään halutulla het- • · · V · kellä ja solumassa otetaan talteen steriileissä olosuh teissa; ja mahdollisesti : - kaikki tai jotkut edellä mainituista vaiheista :*J‘j 30 toistetaan mainitussa järjestyksessä. .* , 2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, • · · * tunnettu siitä, että alustanvaihtovaiheessa annos- " teltavaa alustamäärää suurennetaan viljelmän eksponenti- : aalisen kasvun myötä ja se pidetään vakiona saavutettaessa 35 solujen maksimierotus. 37 101083
3. 3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että ravintoalustan annostelua ohjataan indikaattoriparametrilla, jonka arvoa määritetään jatkuvasti.
4. 4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että indikaattoriparametrina käytetään pH-arvoa tai C02- tai 02-pitoisuutta.
5. 5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että määritetään fermentointilait- 10 teistossa vallitseva pH-arvo ja pidetään se vakiona lisäämällä pitoisuudeltaan määrättyä emästä.
6. 6. Patenttivaatimuksen 5 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että lisätään kulunutta emäsmäärää vastaava ravintoalustamäärä, jota muutetaan soluviljelmän 15 kasvuvaiheessa käyttämällä kasvunopeuteen verrannollista annostelukerrointa k.
7. 7. Patenttivaatimuksen 3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kulunut ravintoalusta korvataan noudattamalla soluviljelmälle ominaista verhokäyrää, 20 joka ottaa huomioon läsnä olevat solumassat, kasvunopeudet .·. : ja viljelyolosuhteet. :·. 8. Jonkin patenttivaatimuksista 1-7 mukainen me- • I · ' . netelmä, tunnettu siitä, että se toteutetaan jat- . , kuvatoimisesti. • 25 9. Patenttivaatimuksen 8 mukainen menetelmä, • · 9 • f · *·” tunnettu siitä, että soluviljelmän kasvunopeus • · · ·.* * säädetään halutuksi vaihtelemalla talteenotettavaa osuutta tai solujen kierrätystä. • · :#:t: lO. Jonkin patenttivaatimuksista 1-9 mukainen 30 menetelmä, tunnettu siitä, että aineenvaihdunta- .* . tuotteet ja solumassa erotetaan sentrifugoimalla. • · · * * 11. Jonkin patenttivaatimuksista 1-10 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että fermentointilait-teistoon syötetään aluksi ravintoalustakonsentraattia. i 38 1 0 1 0 8 3
8. 12. Patenttivaatimuksen 11 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että ravintoalustan alkupitoisuus säädetään ruiskuttamalla kylmää steriiliä vettä.
9. 13. Jonkin patenttivaatimuksista 1-12 mukainen 5 menetelmä, tunnettu siitä, että ravintoalusta annostellaan konsentraattina.
10. 14. Jonkin patenttivaatimuksista 1-13 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että solumassaa osittain kierrätetään talteenottovaiheessa.
11. 15. Jonkin patenttivaatimuksista 1-14 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kasvatettaessa aerobisia soluja soluviljelmään johdetaan puhtaalla hapel-la rikastettua ilmaa.
12. 16. Jonkin patenttivaatimuksista 1-15 mukaisen 15 menetelmän käyttö maitohappobakteerien ja/tai maitohapon talteenottoon.
13. 17. Laitteiston käyttö solumassan ja/tai fermen-tointituotteiden tuottamiseksi patenttivaatimuksen 1 mukaisen menetelmän toteuttamiseksi, jossa laitteistossa on 20 steriloitavissa oleva fermentointiastia, vähintään yksi .·. : säiliö suodatussterilointiin soveltumattoman alustakom- ' ponentin ottamiseksi vastaan ja lämpösteriloimiseksi • » · * , ja/tai vähintään yksi varastosäiliö suodattamalla steri- * ' loitavissa olevan alustakomponentin vastaanottamiseksi, '· 25 joka on varustettu sterilointisuodattimella steriilin alustakomponentin jatkuvaksi tuottamiseksi, sekä fermen- * · · V ·1 tointiastiaan liitetty steriloitavissa olevalla kierto, jossa on laitteet käytetyn ravintoalustan ja aineenvaih-:Y. duntatuotteiden erottamiseksi, jolloin steriloitavissa • C 30 olevassa kierrossa on sentrifugi ja fermentointiastian ja .· # sentrifugin väliin on sovitettu pidätysosa, jonka pituus • « · *· on riittävä ravintoalustan vielä sisältämien ravintoainei den käyttämiseksi. 101083 3 9
14. 18. Patenttivaatimuksen 17 mukainen käyttö, tunnettu siitä, että sentrifugi on vesihöyryllä steriloitavissa oleva, itsestään lietettä poistava setri-fugi, jonka poistamia lietemääriä voidaan säätää.
15. 19. Patenttivaatimuksen 17 tai 18 mukainen käyttö, tunnettu siitä, että fermentointiastiaan on sijoitettu mittaussondi jonkin prosessinohjaussuureen määrittämiseksi .
16. 20. Patenttivaatimuksen 19 mukainen käyttö, 10 tunnettu siitä, että mittaussondi on glukoosi-, pH-, 02- tai C02-mittaussondi.
17. 21. Jonkin patenttivaatimuksista 17 - 20 mukainen käyttö, tunnettu siitä, että yksittäisissä säiliöissä ja varastosäiliöissä on välineet täyttö- ja kulu- 15 tusmäärien mittaamiseksi. « 4 • « • · · • · · • · • ·· • · · • · · • · • · · • · C • · • · · • · · • · · 1 · • · · • · · • · 40 101083