JPH05503635A - 細胞マスおよび／または発酵産物を無菌条件下で生産する方法、およびこの方法を実施する装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 細胞マスおよび／または発酵産物を無菌条件下で生産する方法、およびこの方法 を実施する装置主玉夏五！ 本発明の分野は細胞マス（ｃｅｌｌ　ｍａｓｓ）および／または発酵産物（ｆｅ ｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ　ｐｒｏｄｕｃｔｓ）を生産する方法に関する・本発明は 、発酵混合物を少なくとも時々循環させ、培養細胞の代謝産物およびある場合に は細胞マスそれ自体を断続的にまたは連続的に分離する、細胞マスおよび／また は発酵産物を無菌条件下で生産する方法に関し、また本発明は方法を実施する装 置に関する。

現在、一般に生物工学工業において、発酵槽は発酵溶液を調製する回分式プロセ ス、バイオマスの製造および発酵産物の製造に用いられている。これらの回分式 手順は、慣例上、普通培地の所望とする培養による接種、正確に規定した条件下 での特定時間にわたる培養、および微生物の収穫および／または代謝の所望とす る産物の回収を包含している。

しかしながら、これらの回分式プロセスには多くの欠点がある。一般に、出発濃 度における培地は充填発酵槽において滅菌している。培地の加熱滅菌は、１．０ ００４２以上の作業容積の容器を有する設備における高い加熱および冷却経費が かかる。しばしば、培地は８０″Ｃで長時間にわたって保持されるために、培地 品質を失うことになる。

一般に、滅菌は調製時間（ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ　ｔｉｍｅ）および作業時間 （ｗｏｒｋｉｎｇ　ｔｉｍｅ）の相互間に不利益比を与える数時間を必要とする 。実際の発酵時間を短くするのにつれて、この比が一層不利益になり、短時間の 発酵では１：１に達する。

回分式発酵において、微生物および生（１ｉｖｉｎｇ）細胞の成長は、一般に不 利な条件下で生じる。成長の開始時において、細胞は培地に適応する時間（遅滞 期）が必要となる。プロセスの開始時における回分式発酵において、生菌数（ｖ ｉａｂｌｅ　ｃｅｌｌ　ｃｏｕｎｔ）（接種原生菌数）は、多くの場合、基質抑 制を導びく最大基質遅滞期において、成長（ｇｒｏｗｔｈ）代謝と維持（ｍａｉ ｎｔｅｎａｎｃｅ）代謝との相互関係は極めて望ましくなく、生物は基質を使い 尽くすが、しかし成長しない。この事は、細胞収量および／または異化代謝産物 組成および／または生化学形質転換産物に関係して基質利用性が乏しいことを意 味している。

また、維持代謝の分配は次の指数的成長期に移行する間なお高い。

維持代謝が成長代謝に比べて低く、かつ細胞による基質の最適転換がある指数的 成長期は最適成長範囲を示す。

しかしながら、回分式培養において、代謝産物の高められる濃度のために、指数 的成長期が終りに速やかに達する。なぜならば、この事は産物抑制（ｐｒｏｄｕ ｃｔ　１ｎｈｉｂｉｔｉｏｎ）、すなわち、細胞により生成した代謝産物の濃度 が最初の成長より低下し、ついに停止するように高くなるためである。

この産物抑制における濃度がある細胞タイプについて極めて低いか、または細胞 当りの産物形成の割合が掻めて高い場合には、成長の過程において極めて早い成 長および代謝産物生成が抑制され、乏しい収量を得るようになる。同様に、多量 の代謝産物を生成する期間は、指数的成長期が短いために、極めて短い。細胞マ スまたは代謝産物または形質転換産物の回分式生成においては、大部分の産物が 指数的成長期の終りに生成する。

それ故、発酵槽は高い生産性（高い時間収量）の極めて短い時期だけを有してい る。

図１に示しているように、上述する条件下で、プロセスにおいて得られた約５０ ％のバイオマスは１時間で生成している。

プロセス、すなわち、調製、生産および装置洗浄の全持続時間を２４時間に設定 する場合には、発酵槽は最適条件下で、作業時間の１／２４時間、作動するだけ である。

光皿至１１ とかくするうちに、液体基質の連続発酵について、二三のプロセスが知られるよ うになった。欧州特許出願公開第３３２３２０５号公報には、液体基質の連続発 酵と同時に、発酵において生成した代謝産物を分離する方法および装置について 記載されている。この方法は、発酵混合物を循環し、この循環中、薄い液体流れ を膜の表面上に流し、循環発酵混合物を加圧している。この加圧は生成した代謝 産物が選択的分別と同時に、膜を介して濾過することによって発酵混合物から分 離する程度に加圧している。連続作動を維持する場合には、新鮮な基質を連続的 に取出し、かつ滅菌モジュールを介して発酵サイクルに導びく基質供給サイクル を上流に設ける。代謝産物はプロセスから連続的に除去している。

しかしながら、従来の上記連続プロセスは、構造の特性並びにその作動に関連し た特性による多くの欠点を有している。

欧州特許出願公開第３３３２２０５号明細書に記載されている方法においては、 膜を用いて発酵混合物から生成した代謝産物を除している。しかしながら、この 膜は閉塞する傾向があり、分離効率を低下させ、かつ極めて大きい膜の表面積を 必要とす維持する必要がある。また、膜は発酵装置から沈降物を連続的に除去す ることができず、また発酵から生した細胞マスを連続的に分離することができな い。

さらに、従来のこの方法は回分式プロセスについて上述する多くの欠点を有して いる。特に、これらの欠点は装置および培地の滅菌、および微生物の普通の成長 期に対する培養条件の適応の不能に関するものである。この欠点は細胞マスの収 量および／または異化代謝産物の生成および同時に乏しい基質の利用性を低下さ せ、また許容できない長い培養時間を必要とする。

光里皇塁要 本発明の目的は、連続的、半連続的または回分式操作で、培養条件を培養する微 生物の成長期に最適に適応すること、細胞マスおよび／または異化代謝産物生成 を最適に調整すること、および普通培地を手近の目的に最適に利用することがで きる上述するタイプの方法を提供することである。

この本発明の目的は上述するように達成でき、本発明は次に示す段階を含んでい るニ ー　発酵装置に十分な量の普通培地を装填して所望の細胞培養を開始する段階； −装置を滅菌し、および普通培地の所望濃度を調整する段階； −普通培地を種培地（ｓｔａｒｔｅｒ　ｃｕｌｔｕｒｅ）で接種し、および培養 の平静成長を一定時間にわたり行う段階；−普通培地の濃度を、細胞培養の特定 の普通培地濃度に高め、同時に普通培地の容量を発酵装置の作業容量に高め、お よびさらに細胞濃度を高めるようにする段階；−普通培地の交換により連続手順 に移行し、代謝産物を分離し、および細胞を完全にまたは部分的に再循環する段 階−一　連続手順を所望時間において停止し、および細胞マスを無菌条件下で収 穫する段階；および必要に応して−若干のまたはすべての上述する段階を連続的 に繰り返する段階。

皿皿汝呈婁星註凱 図１はスタフィロコッカス　カルノシュス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓｃａ ｒｎｏｓｕｓ）　Ｓ　ｃ　１についての単位時間当りの細胞マスの収量を示すグ ラフ； 図２は５，０ＯＯｎの発酵槽における異なる液体容量の滅菌における時間および エネルギー要件を比較して示した表；図３はラクトハシルス　カーバトウス（Ｌ ａｃｔｏｂａｃｉｌ　１ｕｓｃｕｒｖａｔｕｓ）　Ｓ　３についての培地におけ る初期グルコース濃度に対する平均成長速度μを示すグラフ； 図４は線状および指数細胞成長（ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ　ｃｅｌｌ　ｇｒｏｉ ｖｔｈ）中の特定の成長速度μを示すグラフ； 図５は分離器を介して細胞を再循環する本発明における発酵槽の配管およびその 作業系統を示す線図；図６は分離器を介して細胞を再循環する本発明における発 酵槽を制御する配管およびその作業系統を示す線図；図７はペジオコノカス　ペ ントサシニスの培養における時間に対するプロセス　パラメータを示すグラフ； 図８はベジオコッ力ス　ペントサシニスの培養におけるプロセス　パラメータか ら選定したパラメータを示すグラフ；図９はラクトハシルス　カーバトウス菌株 ２についての図７に相当して示すグラフ；および 図１０は図８に相当して示すグラフである。

主里夏昆に笠ｌ所 本発明の目的は、連続的、半連続的または回分式操作で、培養条件を培養する微 生物の成長期に最適に適応すること、細胞マスおよび／または異化代謝産物生成 を最適に調整すること、および普通培地を手近の目的に最適に利用することがで きる上述するタイプの方法を提供することである。

本発明の目的は上述するように達成でき、次に示す段階を含んでいるニ ー　発酵装置に十分な量の普通培地を装填して所望の細胞培養を開始する段階； −装置を滅菌し、および普通培地の所望濃度を調整する段階； −普通培地を種培地で接種し、および培養の平静成長を一定時間にわたり行う段 階； −普通培地の濃度を、細胞培養の特定の普通培地濃度に高め、同時に普通培地の 容量を発酵装置の作業容量に高め、およびさらに細胞濃度を高めるようにする段 階；−普通培地の交換により連続手順に移行し、代謝産物を分離し、および細胞 を完全にまたは部分的に再循環する段階；−連続手順を所望時間において停止し 、および細胞マスを無菌条件下で収穫する段階；および必要に応じて−　若干の またはすべての上述する段階を連続的に繰り返す段階。

好適な手順は従属の請求の範囲に示している。

本発明の方法は普通の発酵槽において培養できる任意の微生物について用いるこ とができる。普通の培養条件および普通培地を使用でき：本発明の方法の利点は 異常な条件または培地の利用より、むしろ、特別の操作手順にある。高速攪拌ま たは遠心分離を本発明において用いる場合には、せん断に敏感でない生物が好ま しい。

本発明の方法は種々のタイプの細菌および菌を培養するのに用いることができる 。方法は好気性および嫌気性菌、およびダラム陽性およびグラム陰性菌に、特に 適当である。特に注目すべき細菌としては、特にコクシ（ｃｏｃｃｉ）　、特に ミクロコクシ、プラノコクシ、ディノコクシ、スタフロコクシ、ストマトコクシ 、ストレプトコクシ、ロイコノストク、ベデイオコクシ、アエロモナス、ゲメラ 、ペプトコクシ、ペプトストレブトコクシ、ルミノコクシ、キュプロコクシ、並 びにサルシナ属を示すことができる。さらに、ハシラス、スポロラクトハシラス 、クロストリジウム、デスルホトマクラム、スポロサルシナ、プラノコッカス、 ラクトパシラスおよびコルシア（Ｋｏｒｔｈｉａ）属を示すことができる。さら に、ビフィズス菌、ブレビバクテリア、およびジモモナス、アセトバクター、グ ルコノバクタ−、プソイドモナス、ビブリオおよびアエロモナス属における菌が 適当である。さらに、ニジエリシア、シゲラ、ニドワードシェラ、シトロバクタ −、サルモネラ、クレブシェラ、エンテロバクタ−、ハフニア、セラチア、プロ テウス、プロビデンシア、モルガネラ、エルシニア、エルウィニア、オペスムハ クテリウム（ＯｂｅｓｕｍｂａｃｔｅｒｉｕＩＭ）、クルイヘラ（Ｋｌｕｙｖｅ ｒａ）、セデセア（Ｃｅｄｅｃｅａ）　、タツメラ（Ｔａｔｕ＋＋＋ｅｌｌａ） 　、キセノルハブダス（Ｘｅｎｏｒｈａｂｄｕｓ）およびラハネラ（Ｒａｈａｎ ｅｌｌａ）属におけるゲノム陰性嫌気性菌を示すことができる。本発明の方法に 適当なゲノム陰性好気性桿状体（ａｅｒｏｂｉｃ　ｒｏｄｓ）およびコクシはプ ソイドモナス、アセトバクテリア、リゾビア、メチロコツ力、ハロバクテリア、 アセトバクテリア、レジオネルラおよびナイセリア科に属する。

本発明の方法はプロセスから分離でき、次いで異なる目的のために、および微生 物により生成した代謝産物を得るために用いることができる培養微生物を増殖お よび注産するのム二適当である。それ故、微生物および代謝産物の収量は簡単な 手段で、例えば最大増殖速度を利用する、または微生物による最適基質形質転換 を利用する作業段階を達成することにより最適化することができる。従って、本 発明の方法は細胞マスの生産に重要である維持代謝における基質利用の分担を小 さくする、または代謝産物の生産に重要である維持代謝およびわずかな細胞生産 の高い割合の作業段階を達成することができる。さらに、プロセスＣ９おいて、 培地を最大充填範囲（ｆｕｌｌｅｓｔ　ｅｘｔｅｎｔ）で用いることができると 同時に、代謝産物を除去することができ、これによって基質抑制を避けることが できる。

本発明の方法は装置の開始後、循環的に行う５つの段階に分けることができ、お よび次に示すプロセス工業要件に再分することができる。

１、　発酵装置および普通培地の成分の調製および滅菌；２、低い培地濃度を有 し、および部分充填する回分式プロセス　モードでの装置の第１作業サイクル； ３、　特定培地濃度を達成した後、最終発酵容積に達するまで、制御培地分配に 移行； ４、　普通培地交換による連続プロセス　モードおよび完全または部分細胞分離 に移行； ５、　連続発酵セグメントの終結、および無菌条件下での全バイオマスの収穫； および ６、必要に応し、滅菌普通培地の滅菌装置への再添加、および全滅菌時間および エネルギー要件を軽減する段階１〜５によるプロセスの繰返し。

段階１において、全装置を生産がまにおける培地の濃厚物の加熱滅菌により滅菌 する。滅菌後、濃厚物の温度が１００°Ｃ以下に降下するや否や、発酵温度に速 やかに冷却し、濾過−滅菌冷水の直接注入により稀釈し、しかる後に濾過により 滅菌できる培地を添加する。このプロセスは全容量の培地の加熱滅菌に要する熱 エネルギーを節約し、もし温および冷相を適当な関係で混合すれば、全発酵容量 を１００°Ｃに近い温度から発酵温度に冷却する冷却工フルギーが節約され；滅 菌水の直接注入により濃厚物を冷却するのに要する時間が比較的に短いから、攪 拌ジャケットがまにおける全発酵容量を冷却するのに必要とする時間もまた、節 約される。

図２は異なる滅菌容量を含む５，０ＯＯｆｆｉの発酵槽を滅菌する場合の時間お よびエネルギー要件の比較を示している。時間の約２５％、および水、ガスおよ び電気の約７５％が節約される。

段階２による低い培地濃度による回分式手順として装置を始動する場合、相当す る低い培地濃度において、基質も産物抑制も生じないから、細胞はその基質に最 適に適合し、かつ高い成　、長速度を有する。これに反して、普通の回分式手順 においては、培地濃度を高収量を与える高いレベルに設定し、最初から基質抑制 を導びき、および成長を悪くし、かつ細胞マス、異化代謝産物および形質転換産 物の収量を低下する。

図３は成長培地のグルコース濃度における、他の微生物を示す、ラクトバシルス 　カーバトウス菌株の平均成長速度μの影響を示している。培地のグルコース濃 度が高くなるのにつれて、平均成長速度μが低下する。すなわち、平均成長速度 μは低グルコース濃度で増加する。

段階３において、培地を制限基質の利用に応答させ、または規定形式により発酵 槽に分配し、これにより容量を増加させる。

連続的に増加する細胞濃度は培地添加により稀釈して産物抑制を生しないように する。分配培地の濃度は、発酵槽の最終容量に達する場合に、全培地濃度が成長 代謝：維持代謝の分配割合の比を培養する特定細胞について有効な値を越えない ように調整する。

段階３は、添加培地の量を細胞成長中、高めるのに、および培地の材料濃度を実 質的に一定に保持するのに、回分式プロセスにおいて重要である。この事は、全 段階にわたって指数的細胞成長を生ずるようにする。普通の回分式プロセスにお いては、基質の量を細胞成長中、減少させ、材料濃度を変化させている。

この事は、理想的な細胞成長に反している。段階３の付加利点はこのプロセス　 セグメントにおいて基質が極めて良く利用されることである。なぜならば、基質 が必要条件に応答して分配されるためである。

本発明の方法において、段階４では最終発酵容量を達成する場合に培地交換を行 うことである。

培地は滅菌分離システム、好ましくは滅菌条件下で作動する遠心機によって除去 する。第１変数４ａに従って、すべての細胞をプロセスに戻す。システムから分 離した利用済み培地を同量の新鮮な培地と交換する。分配培地の濃度は基質抑制 を生ずる濃度以下に設定して、細胞マスの成長を制限した基質にする。

最大基質利用を確実にするために、回分式から連続手順への゛移行を次のように する。連続段階の始めにおいて、分配培地の量を制限基質の特別利用からまたは 成長曲線から計算すると共に、連続段階の開始からの培地容量交換の割合をでき るだけ高く維持する。この事は、連続段階の開始において培地を稀釈し、および 代謝産物の洗浄を高めて細胞成長をさらに促進する。

成長を連続させるように、培地の必要条件は、培地の付加量が連続操作について の最適範囲を達成するまで、高める。これが達成される場合、分配培地の量を一 定に維持し、システムを基質制限の安定状態にする。

操作の最適連続範囲を達成するまで、実質的に同じ値に維持する細胞の特定成長 速度μは、この範囲における操作の過程中、指数的に減少すると共に、生存数は 直線的に増大する。

図４は線状および指数的細胞成長中の特定成長速度μの過程を示している。この 場合、指数的に成長する生物について特定生存数を達成するのに要する時間と、 線状的に成長する同じ生物によって必要とされる時間との間には有意な差が存在 する。

普通培地の添加または普通培地の有効性が指数的よりは、むしろ線状的である場 合には、培養物は線状的に成長する。線状成長において、成長速度μは細胞数の 増加に伴って指数的に減少する。これにより、維持代謝は全代謝において極めて 大きい分配を存している。部分分離を開始するμの値は実験的に定める。

第２変数４ｂに従って、段階４における本発明のプロセスを、例えば生化学的形 質転換における微生物の部分分離によって行う。この場合、段階４において、細 胞マス濃度は、成長速度μが最大形質転換速度の点で達成する。この点において 、システムカラの細胞マス除去が始まる。この事はシステムにおいて一定の細胞 濃度を維持することになる。これにより、システムは最大形質転換速度による規 定作業段階に維持される。

連続発酵段階の終結による段階５は、成長速度μが下限に達する場合、変数４ａ を誘導する。一般に、この限界は後付加（ｌａｔｅｒ　ａｄｄｉｔｉｏｎ）に依 存する異なる特性を有する細胞の代謝生理機能による。

４ａによる培養物の収穫において、全バイオマスを分離する。

原則として、この段階は回分式手順を示すが、しかし細胞マス収量に関して有意 に異なっている。本発明の方法において、収量は普通の回分式プロセスにおける より有意に多い。

回分式手順（段階４ａ）からの収量は、産物（ｐｒｏｄｕｃｔ）を、例えば製薬 または食品工業における装填材料（ＣＨＡＲＧＥ）として合法的またはプロセス 技術観点から規定する必要があるプロセスにおいて重要である。本発明の方法は 細胞再循環する連続プロセスによる細胞収量に関する利点および明白な装填材料 規定を得る利点を有している。いずれの場合においても、収穫は無菌条件下で達 成する。

段階４ｂにおいて、他方において、全連続発酵プロセスにっいて記載する。その 段階５における終結は細胞マスの成長速度論（ｇｒｏｗｔｈ　ｋｉｎｅｔｉｃｓ ）によらないが、しかし、むしろ汚染、欠陥のある装置構成部分、または意図的 な終結のような外部環境による。

段階５において収穫した後、産物と接触する装置の部分を、濾過−滅菌水で洗浄 し、少し前に滅菌した培地を収納した分配タンクから装填し、これにより直ちに 次の操作を行う。この操作は指数期において１種の種培地で再び接種し、プロセ スを繰り返す。

本発明の方法において、生成発酵槽は初めにおいて、または汚染後においてだけ 滅菌し、順次操作において貯蔵タンクだけを滅菌する必要がある。培地を発酵槽 に加温装填できる場合には、水の直接注入により速やかに冷却することができる 。

さらに、本発明は本発明の方法を実施する装置に関するもので、本発明の装置は 滅菌しうる発酵がま、濾過により滅菌できない１種の培地成分を受け、かつ加熱 滅菌する少なくとも１個のタンク、および／または濾過により滅菌できる培地成 分を受ける滅菌フィルターを有し、かつ滅菌培地成分の連続生成についての滅菌 フィルターを有する少なくとも１個の貯蔵容器、発酵まかに連結し、かつ排出し た普通培地および代謝産物を分離するための取付部品を設けた滅菌しうる循環器 、および細胞マスおよび排出普通培地を分離および単離する遠心機を含むことを 特徴とする。

本発明の装置を実施する好ましい手順は従属の請求の範囲に規定している。

本発明の装置およびその操作については、添付する図５に基づいて、以下に説明 する。

発酵槽Ｆ１を濾過−滅菌空気ＬＦＩで空気にさらし、蒸気で滅菌できる循環器に より遠心機Ｚ１に連結する。ポンプＰ１はＺｌにおいて分離した濃厚物をＦｌに 戻す。発酵槽Ｆ１をタンクＢｌからおよび／または滅菌フィルターＳ１を介して 濾過−滅菌培地で交互に充填し、またはタンクＢｌから直接に濾過−滅菌培地で 充填する。培地貯蔵容器ＳおよびＡを同様にして培地で充填する。さらに、培地 貯蔵容器Ｓを濾過−滅菌培地で滅菌フィルターＭ１を介して充填する。完成装置 の測定、制御および調整するソフトウェアにより、特にプログラムし、図６に線 図で示している。

本発明の方法は以下に詳述する前に引用した６つの段階からなる。段階１〜６は 図５に示している。

段階１は発酵装置および培地成分の調製および滅菌を含んでおり、６つの補助段 階からなる。

１．１　水を貯蔵タンクＦ１において処理し、タンクＦ１およびＢ１に培地を充 填する。

１．２　濾過により滅菌できない培地濃厚物をＦｌにおいて加熱滅菌する。

１、３　滅菌冷却水をＦｌに滅菌フィルターＳ１を介して直接注入する。

１．４　濾過−滅菌培地を貯蔵タンクＢ１から発酵槽Ｆｌおよび培地貯蔵容器Ｓ およびＡに移す。

１．５Ｆ１における発酵容量を８１からの滅菌水で調整する。

１．６Ｂｌを濾過により滅菌できない培地成分を含む濃厚物で再充填し、および Ｂ１を加熱滅菌し、次いで水で直接に冷却する。

段階１．１において、培地成分を溶解するのに十分な水を発酵槽Ｆ１および貯蔵 タンクＢｌに主プロセス水供給弁Ｖ１７およびＶ１８を介して充填する。両容器 を培地でハンドホールＨ１およびＢ２を介して充填し、培地を攪拌機ＲＦＩおよ びＲＢＩにより攪拌することによって塊まらないようにする。この点において、 両容器は培地４厚物を含有する。

Ｆｌにおける培地濃厚物を段階１．２において加熱マントルＨＭＩで加熱滅菌し 、１００°Ｃ以丁に冷却する。

段階１．３において、滅菌プロセス水を、混合物の温度が約６０°Ｃに達するま で、攪拌しながら弁■２および滅菌フィルターＳｌを介して注入する。

次いで、滅菌培地を発酵槽Ｆ１に容器Ｂ１および滅菌フィルター３１における弁 Ｖｌｌを介して移す。同様に、段階１．４において濾過−滅菌培地を培地貯蔵タ ンクＳおよびＡに弁Ｖ１２およびＶ１３を介して移す。

次の段階１．５において、発酵槽Ｆ１を滅菌フィルターＳｌから弁■２を介して 送給する滅菌プロセス水で開始時の容量にする。この連結において、発酵槽を最 大作業容量の約１／４〜１／３に充填する。プロセスの開始時の培地濃度を調整 し、温度を一般にプロセス温度に近い３０〜５０°Ｃの範囲にする。

段階１．６において、プロセス水を弁Ｖ１７を介して受け入れた後、空にしおよ び洗浄した貯蔵タンクＢ１に、濾過により滅菌できない培地成分で、ハンドホー ルＨ２を介して充填し、濃厚物を加熱マントルＨ２で滅菌し、水で間接的に冷却 する。容器Ｂ１および培地貯蔵容器ＳおよびＡに貯蔵された培地成分を培地を分 配する順次段階において用いる。段階２は低い培地濃度を有し、かつ部分充填す る回分式手順による装置の第１作業サイクルを含んでおり、および４つの主段階 からなる。

２．１　プロセス制御システムＰＬＳの活性化。

２．２　発酵槽Ｆ１の接種。

２．３　細胞成長。

２．４　切替えについての上述する基準による段階３への切替え。

プロセス制御システムＰＬＳは全プロセスを監視しおよび制御する。このシステ ムＰＬＳはコンピューター　ユニン）ＲＥ、キーボードＴＡ、スクリーンＢｉお よびプリンターＤｕからなる。プロセス制御システムはデータ　インターフェー スＲ３２３２を介してセットポイント制御発酵槽ＦＩＳＰＳのコンピューター　 インターフェースに二方向的に（ｂｉｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌｌｙ）接続し、弁 制御器ＳＰＳ　ＶＳの制御を介して調節器Ｒ１弁ＶおよびポンプＰを目標値によ り直接にまたは間接的に制御する。

プロセスにおいて測定したすべての値をプロセス制御システムＰＬＳに増ｌｔＭ 器ＭＶ、コンピュータ　インターフェースＣＩおよびデータ　インターフェース Ｒ２３２を介して送る。プロセスを開始する前に、プロセス−特定ソフトウェア を入れる。このソフトウェアはすべての警報値、目標値、分析関数、値を制御す るためのデータ、およびドキュメンテーション（ｄｏｃｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ） を含んでいる。プロセスについての開始条件はＰＬＳによって送られ、例えばＦ ｌについての次に示すパラメータの取決めを含んでいる： プロセス温度 ｐＨ値 レトンクス　ボテンシャル 酸素の分圧 重量 制御下で閉じる弁Ｖ１．Ｖ２．Ｖ３．Ｖ５および■７；装置は接種するように用 意する。

発酵槽Ｆ１をあらかじめ調製した種培地で接種ノズルＡｓを介して接種し、プロ セスをプロセス制御システムＰＬＳにより開始する。すなわち、プロセス制御お よび監視関数を活性化する。

プロセスの初期（段階２．３）において、細胞成長は回分式プロセスに調和させ る。本発明の方法による利点は最適な細胞増殖を与え、および細胞を培地に良く 適合する低い培地濃度にすることである。

回分式成長期の終りで、基質制限を達成する前に、切替え基準においてプロセス 、培地分配における次の段階に切替える必要がある。切替えを確立する二三の例 に基づいて後述する。

グルコースを乳酸に実質的に定量的に転化するラクトハシルスのホモ発酵型菌株 は代謝産物の化学量論滴定による切替え基準を確立する１例として役に立つ。

発酵槽のｐＨはラクトハシルスの培養中、一定に維持し、すなわち、乳酸形成す るｐＨは規定された規定度のアルカリ溶液の滴定によって一定に維持する。発酵 槽Ｆ１のＰＩ（値を測定し、ｐＨ−制御器ｐＨＱＡｒｃＲで制御する。このｐＨ −制御器は測定プローブＭＳ、測定増幅器ＭＶおよび調整器Ｒからなる。

測定値および目標値をプロセス制御システムにおいて上述するように交換する。

培地貯蔵タンクＬ中のアルカリ溶液を発酵槽Ｆ１にｐＨ調整器Ｆｌ　ｐＨＱＡＩ ＣＲにより弁■４を介して分配する。培地貯蔵タンクＬにおけるアルカリ溶液の 利用度は容量（ｃａｐａｃｉ　ｔｉｖｅ）流体レベル　ブローへＬ　Ｉ　ＲＡで 測定し、データをプロセス制御システムＰＬＳにより処理する。

切替え限界はアルカ’Ｊ　’ｔ９液の全使用量で定める。切替え限界は予備試験 において確立する。この場合、細胞を成長培地において停止期に成長させ、アル カリの利用度を測定し、細胞が指数的成長期で、まだ基質制限の条件下にない場 合を示す残留基質の量（グルコース量）に相当するアルカリ溶液の使用量を計算 する。それ故、アルカリ／８液の計算量は実際に使用された量より少ない。

ミクロコンカス菌株（好気性菌株）は空気についての必要条件に基づく切替え基 準を確立する例として役に立つ。酸素分圧を段階２における成長中、一定値に維 持する。０□制御器ｏ２ＱＡ［ＣＲは測定プローブＭＳ、測定増幅器ＭＶおよび 制御器Ｒからなる。測定値および目標値を２．１に記載するようにプロセス制御 システムＰＬＳによって交換する。制御器Ｒの出力は、システムに供給する一定 量のガスを制御する制御値Ｖ１５およびＶ１６を活性化する。

回分式成長中、細胞は酸素の使用がだんだん多くなる。この酸素はバルク流量計 ＭＦＩおよびＭＦ２により測定する。

この事は、基質をできるだけ長く存在させて細胞を増殖させる。細胞が基質制限 の条件に入る時に、一定酸素分圧下における空気についての必要条件をＦｌ−０ □−ＱＡＩＣＲで制御し、一定速度攪拌（ＳＡＩＣＲにより制御した）を下げる 。この下げを切替え限界として用いる。

ロイコノストク（ｌｅｕｃｏｎｏｓ　ｔｏｃ）菌株は液相または気相のＣＯ□含 有量に基づく切替え点を確立する例として役に立つ。

回分式成長中、細胞は培地に溶解するＣＯ２を生成し、測定プローブＭＳおよび 増幅器ＭＶからなるＣＯ２測定機器Ｆ　１．−Ｃ○、−ＱＡＩＣにより測定する 。ＣＯ２濃度の変化を速やかに検出するために、発酵槽をバルク　フロー　ゲー ジ（ｂｕｌｋｆｌｏｉｍ　ｇａｕｇｅ）を介して窒素でパージし、一定速度で攪 拌してＣＯ□を除去する。細胞が基質制限の条件に入る時に、培地中のＣＯ２の 分圧が下がる。この下げを切替え限界として用いる。

段階３において、発酵の最終容量に達成するまで、調整または制御培地分配ユニ ットに移行する。この段階３は次の２つの主段階からなる： ３．１　培地の分配。

３．２　上述する切替え基準に基づく段階４への切替え。

培地の調整分配は、切替え基準を満たすや否や開始する。この終りに、上記２〜 １０分間の間に、ｐＨ制御に用いるアルカリ溶液の量を培地貯蔵容器りにおける 液体レベル　メーターＬＩＲＡで調べ、プロセス制御システムにより分配すべき 制御基質（例えばグルコース）の量に換算する。この換算は次の式に従って行う 。

ｋｌ　ｘｋｉ　Ｘｏ、５　Ｘ　ＺＸａ　Ｘ　１８０　ｇ／　モルＺ＝使用したア ルカリ溶液（１） ａ＝アルカリ溶液の規定度（モル） Ｌｌ　−アルカリ溶液が使用されるのに要する時間（分）ｋ、＝培養ｐＨ測定に おける非解離酸についての補正ファクター（ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ　ｆａｃｔｏ ｒ）ｋ、＝特定培養についての基質利用度ファクター（ｓｕｂｓ　ｔｒａ　ｔｅ ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ　ｆａｃｔｏｒ）ｋ、＝前付加についてのファクター ＳＤ□ｄ、ＧＬｃ　＝分配すべきグルコースの量（ｇ／分）制限基質と他の基質 成分との間には、予備試験において確定される規定された関係がある。プロセス 制御システムは他の基質濃厚物の量および作業濃度に稀釈するのに必要な水の量 を算定する。

培地濃厚物を２〜５分間の間隔で分配する。濾過により滅菌できる培地成分は弁 ■５を介して培地タンクＳから分配し、加熱滅菌できる培地成分は弁■１を介し てタンクＢ１から分配し、水稀釈剤を濾過滅菌装置Ｓ１および弁Ｖ２を介して分 配する。

培地タンクＳおよびタンクＢ１から分配した培地の容量を液体レベル　ゲージＬ ＩＲＡで調べる。重量制御器ＷＩＣＡは濾過滅菌装置Ｓ１を介して分配する稀釈 水を制御すると共に、高められる目標重量をプロセス制御システムＰＬＳにより 発酵槽Ｆ１についてプログラムに組み込む。

制限基質および全培地の利用度は細胞マスの増加につれて高くなる。培地濃度を 一定に維持するから、いかなる分配サイクルにおいても、分配された培地の量は 、発酵槽の最大容量を達するまで、常に増加する。この値は最大のまたは特定の 細胞収量である。ｌＸ１０１２個の細胞当りの特定基質必要条件、特定成長速度 μ、段階２における切替え限界の時間で達成した生存数、および達成しうる最大 生存数における培地濃度は予備試験において調べる。

段階２．４に記載する切替え基準に達するや否や、制御培地分配が始まる。■× 工ＯＩ２個の細胞の生存数を達成するのに必要な培地の量を培地量１として規定 し、特別に強調する。

分配すべき培地の濃度は一定に維持し、最大発酵容量を達成する時に、全量の培 地は与えられた条件下で最大細胞収量を与える。培養中、各分配サイクルについ ての基質容量は増加する。

分配した基質の量は次式に従って算定する。

μ×ｔ±１．ｎＸ。

Ｘ、　＝ｅ　（３，１，２，ａ） Ｓ　Ｄ　＝　ｓ　Ｓ　ｘ　Ｘ、　（３，１，２，ｂ　）μｔ±１ｎＸ。

ＳＤｓ＊ｒ　＝ｓ　ＳＸｅ　（３，１，２，ｃ）式中、 Ｘ０＝分配の始めにおけるシステム中の全生存数Ｘ、一時間しにおけるシステム 中の全生存数μ０＝分配の始めにおける特定成長速度ｔ＝ＸｏとＸｔとの間の時 間間隔 ５ｓ＝ＩＸ１０′２個の生細胞についての特定基質必要条件（ｇまたはＩｒ１２ ） ＳＤ８．、−一分配すべき基質の計算量分配すべき基質の量の計算は５〜１５分 ごとに行う。あまりに少ない容量を分配する場合には、次の分配サイクル間に調 製し、より多く容量が最小量の分配について補償するようにする。

一定速度の攪拌下でバルク流量計ＭＦＩおよびＭＦ２により分配した細胞の酸素 必要条件を基質制限のために特定時間に一定にまたはこの時間にする場合には、 分配量を増加させ、これにより基質制限をなくすようにする。それでも、制限が なくならない場合には、１時間後μが増加し、プロセスにより特定された時間間 隔後μが再び増加する。

プロセスの制御関数はＣＯ２メーターにより測定したＣＯ２分圧に適合すること ができ、および酸素分圧に適合することができる。測定の原理は段階２．４．３ に記載している。基質制限のため、攪拌機ＲＦＩで攪拌する一定速度下でバルク 流量計ＭＦ。

により測定したＣＯ２の分圧、および発酵槽Ｆ１に吹きつける一定量の窒素が増 減しない場合には、プロセス制御システムＰＬＳのソフトフェアは普通培地を分 配する速度を高めるのに十分な分配量に高め、基質制限をなくすようにする。そ れでも、制限がなくならない場合には、１時間後μが増加し、プロセス制御シス テムＰＬＳのソフトウェアは再びμを高める。

スケールＦＩ　ＷＩＣＡにより測定した発酵槽Ｆ１の重量は段階３と段階４との 間の切替え基準を定める。重量制限はプロセス規格書に従って定める。

段階４は普通培地交換による連続手順への移行、および細胞または部分細胞分離 の完全再循環を含んでおり、次に示す４つの主な段階を含んでいる。

４．１　遠心分離機の始動および細胞の再循環による分離の開始、 ４．２　完全再循環手順、 ４．２．１　細胞再循環中、基質の二者択一的分離、４．３　部分細胞分離によ る手順、 ４、３．１　部分分離の開始まで、細胞を完全に再循環するプロセス操作、 ４、３．２　部分細胞分離への切替え、４、３．３　部分分離、および ４．４　終了および段階５への切替え。

段階３．２による切替え制限を達成する前に、分離機Ｚ１を始動し；切替え制限 を達成した後に、弁Ｖ７をプロセス制御システムＰＬＳにより開放する。分離を 始める前に、分離機を弁■８により最大流量に設定する。流量設定は誘導バルク 流量計ＩＤＭＩにより定め、プロセス制御システムＰＬＳにより記録する。分離 細胞マスを再循環する場合には、ポンプＰ１を弁■７と同時に切替える。弁■９ および■６はプロセスの開始において開放する。

分離細胞マスの稠度は流体にする必要があるので、分離細胞マスは段階４．２に よりポンプＰＩを介して再循環することができ、発酵槽に速やかに再混合するこ とができる。一般に、稠度は沈降物含有量が６０％以下である場合が適当である 。低い増粘度において、再循環培地の容量が分離機Ｚ１の有効分離効率を１５％ に下げるから、沈降物含有量は４０％以下に下げないようにする必要がある。

増粘度は分離機Ｚ１の使用時間により制御する。細胞は分離機に長く保持しない ようにするために、３〜４分間の間隔で空にする。細胞のタイプによるが、これ らの条件は細胞損傷を最小にするようにする。

基質の分配は細胞再循環中、選定パラメータにより連続させ；必要に応じて、細 胞再循環を行う間、中断する。

培地を分配することなく細胞を再循環することは、沈降物がグルコースを完全に 含まない培地に適当である生物について必要である。次に、培養中、培地分配に より再循環できる生物の例を説明する。

制限基質の利用度に応答して分配した基質は、必要に応じて添加する。稀釈水を 滅菌フィルターＳ１または弁Ｖ２を介して分配し、発酵槽Ｆｌの重量調整器ＷＩ ＣＡにより制御する。この重量調整器は普通条件下で作動する遠心機Ｚｌの分離 効率とは関係なく、発酵槽の重量を一定に維持する。前も、って設定する目標重 量はプロセスにより特定された発酵槽Ｆ１における作業重量に相当する。弁Ｖ５ を介して培地タンクＳからおよび弁■１を介して容器Ｂ１から分配された濃厚培 地の量は制限ｔｉｔの利用度に応答して定めおよび分離する。全基質添加量およ びプロセスに分配した基質の時間依存量は上限まで指数関数的に示し、これらの 分配点は指数関数的より、むしろ線状である。

上限は予備試験において確定した値を越えないようにする入力の最大可能な培地 濃度から算定する。

この最大入力量は普通条件下で実施する遠心機の有効分離効率Ｔ　ｅ　ｆ　ｆに 依存する。必要条件に応答して分配された基質の量は、常にＴｅｆｆから計算し た最大量より少ないか、または最大量に等しくする。

本発明における制御システムにより、達成された生存数は普通の回分式プロセス からの生存数より少なくとも１０ファクター多い。

また、分配は上述する制限基質の利用度に調和している分配に類似するあらかし め計算した値（シェル曲線（ｓｈｅｌｌ　ｃｕｒｖｅ）　）により定める。

部分細胞分離による手順（段階４．３）の第１部分は段階４．２に記載する完全 細胞再循環によるプロセスを示す。部分細胞分離を開始する場合、プロセスは完 全細胞再循環の作業段階をもたらす。

部分細胞分離を開始する切替え基準はプロセスについて特定されるけれども１． 基質利用度および代謝産物の生産は特定成長速度に直接に依存するから、上記切 替え基準は特定成長速度μに結合する。生物に特定するμは予備試験において定 める。

完全システムにおける全生存数はシステムに加えた基質の量、および細胞数当り の特定基質必要条件から算定する。一定のシステム容量の場合、この事は一定最 大培地濃度に相当し、および一定の分離容量の場合、切替え点を示す一定の成長 速度μに相当する。

部分分離時におけるシステムにおいて達成された生存数はシステムからの細胞マ ス流れを取出すことによって一定に維持する。

細胞マスをシステムから取出す場合、ポンプＰ１を作動しながら、弁■９を閉じ 、弁ＶＩＯを開放する。取出された濃厚物の量をバルク流量計ＩＤＭ２により記 録し、弁ＶＩＯを閉じ、および計算量を達成した時に、弁■９を開放する。取出 しサイクルは３〜４分間続ける。

基質を制限基質に応答して分配する場合には、分配は部分分離の開始における普 通条件下で続ける。分配を上限において行うようにする場合には、分配は同しレ ベルで続ける。

同様に、あらかじめ計算した値（シェル曲線）に応答して分配した基質は部分分 離の開始において普通条件下で継続する。

分配を上限で行うようにする場合には、分配は同しレー・ルで続ける。

この分配レベルは新らたな再成長によって分離細胞マスを補充する。安定な平衡 は、流入と流出との間に一定の関係を維持することにより、システムにおいて達 成する。細胞は一定成長速度μで成長する。

部分細胞分離によるプロセスの連続段階における終了基準は全基質量による。全 基質量の存在において、プロセスにおいて特定されるように、プロセスにより特 定された全生存細胞量は規定成長速度μを有するシステムにおいて生ずる。基質 利用度は、成長速度が特定値以下である場合に、もはや適切でない。

部分細胞分離によるプロセスの連続段階における終了基準は汚染、よごれ、また は機械的欠陥のようなシステム欠陥に基づく　。

段階５は連続発酵セグメントの終了および滅菌条件下における全バイオマスの収 穫を含んでいる。

沈降特性がグルコースを含まない培地においてのみ満足に収穫できる生物は、基 質分配巳ないで、遠心機の最大分離効率で収穫できる。

基質を制限基質におよびシェル曲線に応答して分配するハツチは、代謝活性を保 有する細胞マスを得ると同様に収穫する。

収穫は弁Ｖ１を開き、弁■９を閉しることによって開始する。

上述する収穫は、最大に許容されうる収穫時間から得られる重量制御器ＷＩＣＡ 、Ｆ１により制御された発酵槽Ｆ１ΔＭＦＩの時間−依存重量損失を生じ；この 重量損失はＩＤＭＩにより測定した遠心機の最大分離効率より少な（する必要が ある。

段階６は滅菌培地の滅菌装置への再添加、および全滅菌時間およびエネルギーの 節約による段階１〜５によるプロセスの繰返しからなる（スプリット　バッチ（ ｓｐｌｉｔ　ｂａｔｃｈ）操作）。

収穫後、ただちにすべての弁を閉じる。発酵槽Ｆ１は弁Ｖ１９およびＣＥＰ球を 介して滅菌フィルター３１からの濾過滅菌水で洗浄して存在するよごれ沈積物（ 汚物）を除去する。汚水は、再洗浄するの用いるために、弁■７およびＶ８を介 して遠心機Ｚ１に管で送る。

弁Ｖ１９．Ｖ７およびＶ８を洗浄段階後、閉しる。

遠心機Ｚ１はＶ２ＯおよびＶ２１　ＣＥＰを介してきれいにする（ここで洗浄す る）。この事は、細胞マスの残留物を次の分解段階の開始前の一定時間において 溶解する（Ｉｙｓｉｓ）ことから、かかる細胞マスの残留物を除去する必要があ る。洗浄後、弁Ｖ２０およびＶ２１を閉し、遠心機を主弁Ｖ７．Ｖ８．Ｖ１０お よびＶ２２を介して蒸気滅菌する。滅菌を行う時間は段階２に記載した回分式プ ロセス段階において与える。分離機はこの段階において使用しない。

次のプロセス　サイクルについての普通培地は容器Ｂ１において調製する。先づ 、濾過により滅菌できる培地成分を調製し、段階１．４に類似するように弁Ｖｌ ｌ、滅菌フィルター８１および弁■２を介して容器Ｂ１から発酵槽Ｆ１に移送す る。同時に、濾過により滅菌できる培地を培地貯蔵タンクＳおよびＡに手動弁Ｖ １２およびＶＩ３を介して移送する。

次いで、弁Ｖ１７を介してプロセス水を与えた後、容器Ｂ１を濾過により滅菌で きない培地成分で満たし、濃厚溶液を加熱マントルＨＭ２で滅菌し、およびＨＭ ２を介して水で間接的に冷却する。容器Ｂ１の滅菌中、Ｆｌにおいて濃縮された 濾過滅菌培地を滅菌フィルター３１および弁■２を介して十分な滅菌プロセス水 で稀釈し、このために加温後、加熱−滅菌培地濃厚物を弁Ｖ１を介して容器Ｂｌ から発酵槽Ｆ１に分配し、Ｆｌを発酵の出発容量に充填する。

以下に記載するプロセスは段階２〜６に記載するように進行する。

裏施阻土 本発明における代表的な発酵をラクトバシルス　カーハトウス菌株２　ＤＳＭ　 Ｎｏ、４２６４を用いて行った。プロセスを、装置の始動後、循環的に実施する ５つの段階に再分することができる。

段階１：　発酵装置および普通培地の調整および滅菌。

プロセスの開始前に、装置配置の流体密を試験し、適当な値に設定することによ って、培地を添加する予備条件を満たすようにした。次いで、発酵槽装置を作動 するために用意した。普通培地を秤量し、タンクおよび容器に充填した。装置を 滅菌した。

図９および１０は装置の過程およびプロセス　パラメータを示している。

段階２：　発酵槽の種培地により接種することによる発酵の開始、すなわち、低 い培地温度および部分充填による回分式手順のようなプロセス制御システムおよ び装置の第１作業サイクルの始動。

すべての作業パラメータを発酵の過程の間、一定に維持した。

段階３への切替え限界は段階２の終りにおいて達成させた。切替え限界は培地の 規定されたグルコース濃度である。約１ｇ／ｌ　に設定したこの切替え限界を達 成するまで、規定量の水酸化ナトリウム溶液を用いた。この量の水酸化ナトリウ ム溶液を用いた場合に、切替えが生した。

段階３：　発酵の最終量を達成するまで、制御培地分配に移行。

培地を制御物質、水酸化ナトリウム溶液の制御下で分配した。

この例において、分配を考慮中の微生物の極めて速い成長を誘導する段階作用（ ｓｔｅｐｗｉｓｅ　ｆｕｎｃｔｉｏｎ）により行った（図１０）。

他の微生物の場合、一定の分配が最適成長に要求された。任意に要求された分配 作用はプロセス制御システムにより用いることができる。

段階４：　普通培地の交換および完全細胞再循環または部分細胞分離による連続 手順への移行。

完全細胞再循環条件下で、段階４の開始において考慮される生物の場合、発酵槽 の容器を少なくし、しかる後に培地を発酵槽に分配した。プロセスの継続におい て、さらに細胞再循環と共に部分細胞分離を生じさせた。次いで、培地を再び分 配した。

一般に、記載した段階４の過程は考慮される生物についてである。異なる分離お よび分配開隔または一定分配および分離を他の生物について用いた（図９）。

段階５：　滅菌条件下における全バイオマスの連続発酵セグメントおよび収穫の 終了。

普通培地を完全に排出した後、収穫を開始した。この収穫は水酸化ナトリウム溶 液の消費の終了により定めた。収穫は細胞再循環しないで、遠心機の最大分離効 率で行った。考慮される生物による分離効率は他の生物の分離効率と比較して悪 い。悪い分離効率は沈降を妨げる生物のサツカリド粗膜による。サツカリド粗膜 が欠乏する生物は、分離器が２〜３倍高い分離効率を達成するようにした。上述 するサツカリド粗膜による生物の乏しい沈降挙動のために、比較的に低い培地交 換速度だけを達成できることから、本例において扱う生物はプロセスの進行に多 く必要になった。

段階６：　滅菌培地の滅菌装置への添加および全滅菌時間およびエネルギーの節 約による段階１〜５に従うプロセスの繰返し。

段階４の終りに、培地タンクには低濃度で再添加する培地を十分に含有させた。

直接、次の段階５において、滅菌培地濃厚物および滅菌水を他の種培地で直接に 接種する発酵槽Ｆ１に圧送する。次いで、プロセスの段階２において、進行中に 分配する培地を培地貯蔵タンクＢ１、Ｓ−貯蔵タンクおよび八−貯蔵タンクにお いて調製した。

プロセスを次に示す菌株で繰り返した。

実施例２：　ラクトハシルス　カーハトウス菌株３ＤＳＭ　４２６５ 実施例３：　ベジオコッカス　ベントサシュスＤＳＭ　６１６５ 実施例４：　ベジオコッ力ス　アシジラクティシ（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ　ａ ｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉ）ＤＳＭ　６１６４ 実ｍ例５．　スタフィロコッカス　カルノシュスＳｃｌＤＳＭ　６１６２ 実施例６：　ミクロコツカス　パリアンスＭ２Ｂ（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ　ｖ ａｒｉａｎｓ）ＤＳＭ　６１６３ 実施例７：　ミクロコツカス　パリアンスＭＩＯＩＤＳＭ　４２６３ 培養パラメータを次の表に示す。

種培地菌株の培養パラメータ 菌　株　ＩＡＢｌｌＬＡＣ”　ＰＥＢ”　ＰＥＣ”　５ＩＩＢ”　ＮＩＢ”　ｌ ｌＩｃη（ＳｃＪｌ　１）　（Ｍ　２８）　（Ｍ　１０１）［ＩＳＭＮｒ、　４ ２６４　４２６５　６１６５　６１６４　６１６２　６１６３　４２ａ３培養温 度（’Ｃ）　美　丈　美　美　あ　あ　肥培養ｐＨ５，９５，９５，９５，９６ ，５６，５６，５通気９ＡＤ２陶　−−−加換２　加筋、加換２０、１４ＶＶＩ Ｉ　０．１４ＷＩｌ ガス供給　Ｎ２　Ｎ２　Ｎ２　Ｎｘ　純ｙ幻２　締束にｚ　ｍｚＢ１牢Ｗ（Ｎ／ 分）　１２０　１２０　１２０　１２０　帥〜２５０　ｍ〜ｏ　８０〜２５０接 種比　１・五　１：沢　１：１１２５　１．：費　１；１（８）１：（イ）　■ −□□□全培養時全培養時間Ｃ−２６２４〜２６２４〜２６２４〜美　１４〜１ ７１８〜冗　１８〜加アルカリ消費量　３３３ｇ　３３３ｇ　３３３ｇ　３３３ ｇ　２６６ｇ　ヌｇ　鴎ｇ（グルコースｌ０００ｇ当り）　ＮａＯＨＮａ０ｔ（ ＮａＯＨＮａＯＨＮａＯＨＮａＯＨＮａＯＨ［駅！＝Ｉ’、ｌｌクルコースケル ブースクルコースケルコースケルコースクルコースケルブース排出　排出　排出 　排出　排出　排出　排出分離効率＜／１３）　１柳　１ａ〜　（イ）（３）〜 　加（１）〜　笠　Ｍ（１）　選発酵槽の作業容１ｔ（Ａ’＞　４５００　４５ （４）　６美　柘■　ａ　４０００　ａ段階２（バッチｍから　１１１１３０． 分圧の増加または段階３への切替え限界　空気についての必要（培地中のグルコ ース４１１）　条件の増加（ｇ／ｌ’） １）　ラクトパシルス　カーバトウス菌株２５）　スタフィロコッカス　カルノ シュス菌株１２）　ラクトバシルス　カーバトウス菌株３６）　ミクロコツカス 　パリアンス菌株Ｍ２８３）　ベジオコノカス　ベントサシュス　Ｄ　ミクロコ ツカス　パリアンス菌株Ｍ１０１０　ベジオコノカス　アンシラクチイン実五〇 九１ 生物ベジオコンカス　ベントサシュスによる発酵の実施。

本発明の方法の実施を、装置始動後、循環的に進行する５つの段階に再分するこ とができる。

段階１：　発酵槽装置および普通培地の成分の調整および滅菌。

プロセスの開始前に、装置の流体密を調べ、培地添加についての予備条件を適当 な弁を閉しることにより満たした。次いで、発酵装置を始動するために用意した 。′ｇ通培地を秤量し、タンクおよび容器を充填した。装置を滅菌した。

段階２：　発酵槽を種培地により接種することによる発酵の開始、低培地濃度お よび部分充填による回分式手順としてのプロセス制御システムおよび装置の第１ 作業サイクルの開始。

図７および８、パネル１、ハンチ相は装置パラメータの過程を示している。すべ ての操作パラメータを一定に維持した。段階２の終りに、段階５への切替え限界 を達成させた。この実施例において、規定量の水酸化ナトリウムは、約１　ｇ／ ｆｆｉに設定したこの切替え点が達成されるまで、消費された。この量の水酸化 ナトリウム溶液が消費された時に、切替えが生じた（図８参照）。

段階３：　発酵相の最終容量が達成するまで、制御培地分配に移行。

この実施例において、培地を制御物質、水酸化ナトリウム溶液の制御下で分配し た。この実施例において、培地を極めて速い成長を誘導するように連続的に分配 した。図７において、連続分配を、発酵槽容量、およびグルコースおよび蛋白質 の量の増加によって示している。他の生物の場合、段階的分配スケジュールが最 適成長の達成に要求された。要求された任意の分配関数はプロセス制御システム によって利用される。

段階４：　培地交換および完全または部分細胞循環による連続手順への移行。

段階４の始めにおいて、発酵槽容量は完全細胞再循環に伴って減少し；引続いて 培地を分配した。プロセスの連続において、さらに部分細胞分離と共に細胞を再 循環した。再び、培地を分配した。段階４の記載した過程は使用した生物の特性 を示している。異なる分離および分配間隔、または連続分離および分配は他の生 物について用いることができる。

段階５：　滅菌条件下における連続発酵セグメントの終了および全バイオマスの 収穫。

普通培地を完全に排出した場合に収穫を始めた。この場合、この生物により、水 酸化ナトリウム溶液の消費が終ることによって決めた。収穫は、細胞を再循環し ないで遠心機の最大分離効率で行った。

段階６：　滅菌普通培地の滅菌装置への再添加、および全滅菌時間およびエネル ギーの節約による段階１〜５のプロセスの繰返し。

段階４の終りにおいて、培地タンクには十分な培地を低濃度で再添加するために 含有させた。次の段階５において、滅菌培地濃厚物および滅菌水を発酵槽Ｆ１に 圧送し、ただちに他の種培地で接種した。その後、プロセスの段階２において、 進行するために分配すべき培地を培地貯蔵タンクＢ１、Ｓ−貯蔵タンクおよびＡ −貯蔵タンクにおいて調製した。

○　ｎ αコ　＼　Ｕつ　ｕ）　でｒ　が）　へ　−一ｌｆ’Ｉ　Ｃ）ｌ　ＩＭ　（Ｍ　 ＋　／’ｌ　ｆ””＋要　約　書 本発明は、発酵混合物を、時々、再循環し、培養細胞の代謝産物、必要に応じて 細胞マスを分離する、細胞マスおよび／または発酵産物を無菌条件下で生産する 方法であって、発酵装置に十分な量の普通培地を装填して所望の細胞培養を開始 し；装置を滅菌し、および普通培地の所望濃度を調整し；普通培地を種培地で接 種し、および培養の平静成長を一定時間にわたり行い；普通培地の濃度を、細胞 培養の特定の普通培地濃度に高め、同時に普通培地の容量を発酵装置の作業容量 に高め、およびさらに細胞濃度を高めるようにし：普通培地の交換により連続手 順に移行し、代謝産物を分離し、および細胞を完全にまたは部分的に再循環し； および連続手順を所望時間において停止し、および細胞マスを無菌条件下で収穫 する各段階からなる。

国際調査報告 、ユ、Ｍ、、□ｅｅｍ−ｓ−ｍ−ＰＣＴ／ＥＰ　９１１０２４８９

Claims (24)

【特許請求の範囲】
1. １．発酵混合物を、時々、再循環し、培養細胞の代謝産物、必要に応じて細胞マ スを分離する、細胞マスおよび／または発酵産物を無菌条件下で生産する方法に おいて、ａ）発酵装置に十分な量の普通培地を装填して所望の細胞培養を開始し ； ｂ）装置を滅菌し、および普通培地の所望濃度を調整し；ｃ）普通培地を種培地 で接種し、および培養の平静成長を一定時間にわたり行い； ｄ）普通培地の濃度を、細胞培養の特定の普通培地濃度に高め、同時に普通培地 の容量を発酵装置の作業容量に高め、およびさらに細胞濃度を高めるようにし； ｅ）普通培地の交換によむ連続手順に移行し、代謝産物を分離し、および細胞を 完全にまたは部分的に再循環し；ｆ）連続手順を所望時間において停止し、およ び細胞マスを無菌条件下で収穫する各段階を含むことに特徴とする細胞マスおよ び／または発酵産物を無菌条件下で生産する方法。
2. ２．１または２以上の段階を順次に繰り返す請求の範囲１記載の方法。
3. ３．培地交換期において、培地分配量を培養物の指数成長に比例して増加し、最 大細胞分離を達成するまで一定に維持する請求の範囲１記載の方法。
4. ４．普通培地を制御パラメータの制御下で分配し、前記制御パラメータの値を連 続的に調べる請求の範囲１記載の方法。
5. ５．普通培地はｐＨおよびＣＯｚ濃度またはＯ２濃度を有し、前記ｐＨ値および 前記ＣＯ２濃度または前記Ｏ２濃度を関係させる請求の範囲４記載の方法。
6. ６．前記ｐＨ値を発酵装置において測定し、塩基の添加によって一定に維持する 請求の範囲５記載の方法。
7. ７．ｐＨ値の保持定数に消費された塩基の量に相当する量の普通培地を添加し、 普通培地の量を細胞培養物の成長期中、細胞培養物の成長速度に比例する分配フ ァクターＫに従って変化させる請求の範囲６記載の方法。
8. ８．普通培地を排出し、および細胞培養物に対して特定し、かつ存在する細胞マ ス、成長速度および細胞培養物の培養条件を考慮するシェル曲線に従って交換す る請求の範囲７記載の方法。
9. ９．細胞培養物を所望の成長速度に調整する請求の範囲８記載の方法。
10. １０．培養物の平静成長を少なくとも一部、回分式で実施する請求の範囲１記載 の方法。
11. １１．培養物の前記平静成長をスプリットーバッチモードで行う請求の範囲１記 載の方法。
12. １２．滅菌条件下での細胞マスの収穫は、遠心分離による代謝産物および細胞マ スの分離を含む請求の範囲１記載の方法。
13. １３．発酵装置に充填する普通培地を濃厚物とする請求の範囲１記載の方法。
14. １４．普通培地濃厚物を発酵装置に装填した後、冷却滅菌水を注入する付加段階 をさらに含む請求の範囲１３記載の方法。
15. １５．滅菌条件下での細胞マスの収穫中、細胞マスの少なくとも１部分を再循環 する請求の範囲１記載の方法。
16. １６．前記細胞培養物が好気性細胞を含み、および方法はさらに普通培地を純粋 酸素に富んだ空気で通気する段階を含む請求の範囲１記載の方法。
17. １７．請求の範囲１の方法により生産した産物。
18. １８．滅菌しうる発酵がま、濾過により滅菌できない１種の培地成分を受け、か つ加熱滅菌する少なくとも１個のタンク、または濾過により滅菌できる培地成分 を受ける滅菌フィルターを有し、かつ滅菌培地成分の連続生成についての滅菌フ ィルターを有する少なくとも１個の貯蔵容器、発酵がまに連結した滅菌しうる循 環器、および排出普通培地および代謝産物を分離する装置を含み、さらに前記滅 菌しうる循環器は細胞マスおよび排出培地の分離および生産についての遠心機を 含むことから構成したことを特徴とする請求の範囲１の方法を実施する装置。
19. １９．遠心機が調整しうる注出容量（ｅｍｐｔｙｉｎｇ　ｃａｐａｃｉｔｙ）を 有する蒸気滅菌しうる自己−注出（ｓｅｌｆ−ｅｍｐｔｙｉｎｇ）遼心機である 請求の範囲１８記載の装置。
20. ２０．前記発酵がまにはプロセス制御特性を記録する測定プローブを設けた請求 の範囲１９記載の装置。
21. ２１．前記測定プローブがグルコース−測定プローブ、ｐＨ−測定プローブ、お よびＯ２−測定プローブまたはＣＯｚ−測定プローブである請求の範囲２０記載 の装置。
22. ２２．すべての各タンクおよび貯蔵容器はこぼれたおよび消費した量を記録する ようにした請求の範囲２１記載の装置。
23. ２３．流れ中断連結を発酵槽と遠心機との間に設けた請求の範囲２２記載の装置 。
24. ２４．前記流れ中断連結を十分に長くして、普通培地になお存在する栄養分を使 い果たすようにした請求の範囲２３記載の装置。