CZ283799B6

CZ283799B6 - Spôsob výroby bunkovej hmoty a/alebo fermentačných produktov za sterilných podmienok a zariadenie na vykonávanie tohto spôsobu

Info

Publication number: CZ283799B6
Application number: CS921883A
Authority: CZ
Inventors: Michael Metz
Original assignee: Karl Müller & Co. Kg
Priority date: 1990-11-23
Filing date: 1991-11-21
Publication date: 1998-06-17
Also published as: BG96651A; BG61039B1; ATE138684T1; JPH05503635A; ES2090199T3; FI922172A7; AU672745B2; EP0487867B1; US5981260A; CA2074466A1; CA2074466C; DE4037325C2; FI101083B; WO1992009683A1; AU8946691A; EP0487867A1; NO922887L; FI922172A0; DE59107860D1; BR9106024A

Abstract

Spôsob výroby bunkovej hmoty a/alebo fermentačných produktov za sterilných podmienok, pri ktorom fermentačná zmes sa vedie aspoň občas cez recirkulačný okruh a produkty látkovej výmeny kultivovaných buniek a prípadne bunková hmota sa odděĺujú, pričom tento postup pozostáva z následovných krokov: - opatrí sa fermentačné zariadenie takým množstvom živného média, ktoré je dostatočné k začatiu tvorby žiadanej bunkovej kultúry; - sterilizuje sa zariadenie a nastaví sa žiadaná koncentrácia živného média; - naočkuje sa živné médium očkovacou kultúrou a kultúra sa nechá nerušene rásť počas stanovenej doby; - zvýši sa koncentrácia živného média na špecifickú koncentráciu pre bunkovú kultúru pri súčasnom zvyšování objemu živného média na objem zariadenia a pri súčasnom zvyšování koncentrácie buniek; - prechod na kontinuálny postup pri výmene živného média a oddeĺovaní produktov látkovej výmeny ako i pri úplnom aleboŕ

Description

Způsob výroby buněčné hmoty a/nebo fermentačních produktů za sterilních podmínek

Oblast techniky

Vynález se týká způsobu výroby buněčné hmoty a/nebo fermentačních produktů za sterilních podmínek, při kterém fermentační směs alespoň občas cirkuluje a produkty látkové výměny kultivovaných buněk a v daném případě buněčná hmota se diskontinuálně nebo kontinuálně oddělují, jakož i použití zařízení kjeho provádění.

Dosavadní stav techniky

V současnosti se v biochemickém průmyslu při použití fermentorů zpravidla používají vsázkové postupy pro přípravu fermentačních roztoků, výrobu biomasy a k přípravě produktů látkové výměny. Tento vsázkový způsob výroby normálně zahrnuje naočkování živného média požadovanou kulturou, kultivaci po určitou dobu za přesně definovaných podmínek a výtěžek mikroorganismu a/nebo získání žádaného produktu látkové výměny.

Tyto vsázkové způsoby maj í řadu nevýhod.

Tak se provádí sterilizace média zpravidla při počáteční koncentraci při naplněném fermentačním tanku. U zařízení s náplněmi většími než 1000 1 pracovního objemu je třeba při tepelné sterilizaci médií předpokládat vysoké náklady na topení a chlazení. Pro dlouhou dobu zdržení média při teplotách nad 80 °C dochází často u média ke ztrátě kvality.

Potřeba času na sterilizaci obecně činí několik hodin, což způsobuje nevýhodný poměr mezi dobou přípravy a dobou výroby. Poměr se stává o to nevýhodnějším, oč je kratší vlastní doba fermentace, a dosahuje při krátkodobých fermentacích poměru 1:1.

Růst mikroorganismů a živých buněk obecně probíhá při vsázkové fermentaci za nepříznivých podmínek. Na začátku růstu potřebují buňky určitý čas (lag-fáze) k přizpůsobení médiu. Ve vsázkové fermentaci stojí na začátku procesu nejnižší počet zárodků (počet zárodků při očkování) vůči nejvyšší koncentraci substrátu, což vede v mnoha případech k inhibici substrátu.

V lag-fázi je poměr mezi látkovou výměnou v růstu a látkovou výměnou při udržování velmi nepříznivý; organismus spotřebovává substrát, avšak neroste. To znamená špatné využití substrátu s ohledem na výtěžek buněčné hmoty a/nebo tvorbu katabolitů a/nebo biochemických transformačních produktů.

Též v přechodu do následující exponenciální fáze růstu je podíl látkové výměny na udržování ještě vysoký.

Exponenciální růstová fáze představuje optimální oblast pro růst, podíl látkové výměny při udržování je vůči podílu látkové výměny při růstu malý, obrat substrátů v buněčné hmotě je optimální. V batch-vsázkách však exponenciální fáze růstu končí zpravidla po krátké době se zvyšující se koncentrací produktů látkové výměny, protože dochází k brzdění tvorby produktů, tj. že koncentrace buňkami do média odevzdaných produktů látkové výměny bude tak vysoká, že dochází nejdříve ke zpomalení růstu a v dalším průběhu k zastavení růstu.

Je-li inhibiční koncentrace produktů u určitých druhů buněk velmi nízká, nebo je-li míra tvorby produktů na buňku velmi vysoká, dochází velmi časně v průběhu kultivace k brzdění růstu a produkce metabolitů, a tím ke špatným výtěžkům. Doba, ve které se tvoří větší množství metabolitů,

- 1 CZ 283799 B6 je z důvodu krátké exponenciální fáze růstu též velmi krátká. Při vsázkové výrobě buněčné hmoty nebo metabolitů nebo transformačních produktů se hlavní masa vytvoří ve velmi krátké době na konci exponenciální fáze růstu. Fermentor má tedy jen velmi krátkou fázi vysoké produktivity (tj. kdy dosahuje vysokého výtěžku v závislosti na prostoru a Čase).

Jak vyplývá z obr. 1, za uvedených podmínek se vytvoří asi 50% postupem získané biomasy v průběhu jedné hodiny. Předpokládá-li se celkové trvání procesu 24 hodin, tj. příprava - výroba - čištění zařízení, fermentor se využívá za optimálních podmínek jen 1/24 své provozní doby.

Mezitím se staly známými některé způsoby kontinuální fermentace kapalných substrátů. Tak popisuje DE-A 33 23 205 způsob přípravy a zařízení pro kontinuální fermentaci kapalného substrátu za současného oddělování produktů látkové výměny, vytvořených ve fermentačním procesu. Tento postup se vyznačuje tím, že fermentační směs se za účelem fermentace recirkuluje, přičemž během recirkulace se povrch membrány též proplachuje tenkou vrstvou proudu a při recirkulaci vedená fermentační směs se ostřikuje takovým tlakem, že během proplachování membrány se současně oddělují membránovou filtrací selektivní a frakčně vytvořené produkty látkové výměny z fermentační směsi. Pro udržení kontinuálního provozu je předřazen sběrný okruh substrátu, ze kterého se může kontinuálně odebírat čerstvý substrát přes sterilizační modul a zavádět do oběhu fermentační směsi. Produkty látkové výměny se mohou 20 z procesu kontinuálně odebírat.

Tento známý kontinuální postup má však ještě řadu nedostatků, které jsou způsobeny jak konstrukčními prvky, tak znaky postupu.

Tak v postupu podle DE-A 33 32 205 se používá membrána, aby se oddělily vytvořené produkty látkové výměny z fermentační směsi. Takovéto membrány mají sklon k ucpávání, což snižuje účinnost oddělování a vyžaduje velmi velký povrch membrány. Kromě toho je třeba použít určité techniky a vysoké tlaky, aby membrána zůstala propustná. Dále membrána též nedovolí kontinuální odkalení fermentačního zařízení a ani kontinuální oddělování ve fermentoru vytvořené buněčné hmoty.

Kromě toho má tento známý postup ještě řadu nevýhod, které jsou výše uvedeny pro vsázkový postup. Tyto nevýhody se týkají zejména sterilizace zařízení a médií a dále chybějící přizpůsobivosti podmínek kultivace, té které fáze růstu mikroorganismu. Toto má za následek snížený 35 výtěžek buněčné hmoty a/nebo tvorbu katabolitů za současného špatného zužitkování substrátu a vede kromě toho k nepřijatelně dlouhé době kultivace.

Podstata vynálezu

Úkolem vynálezu je tedy nalézt postup v úvodu uvedeného typu, při kterém bude možné, jak v kontinuálním, tak v semikontinuálním a vsázkovém provozu, optimální přizpůsobení podmínek kultivace jednotlivým fázím růstu příslušného šlechtěného mikroorganismu, přičemž je možné optimální nastavení tvorby buněčné hmoty a/nebo tvorby katabolitů a živné médium se pro daný 45 účel optimálně zužitkuje.

Tento úkol je vyřešen způsobem výroby buněčné hmoty a/nebo fermentačních produktů za sterilních podmínek, při kterém se fermentační směs alespoň občas recirkuluje a produkty látkové výměny kultivovaných buněk a popřípadě buněčná hmota se oddělují, jehož podstata 50 podle vynálezu spočívá v tom, že zahrnuje následující stupně:

- opatření fermentačního zařízení množstvím živného média, postačujícím k započetí tvorby požadované buněčné kultury, . 7 CZ 283799 B6

- sterilizaci zařízení a nastavení požadované koncentrace živného média, která je nižší než specifická koncentrace živného média buněčné kultury,

- naočkování živného média očkovací kulturou a ponechání nerušeného růstu kultury po definovaný čas ve vsádkovém způsobu a za částečného naplnění fermentačního zařízení,

- zvýšení koncentrace živného média na koncentraci, specifickou pro buněčnou kulturu, za současného zvyšování objemu živného média na pracovní objem zařízení při současném zvyšování koncentrace buněk,

- přechod na kontinuální postup za výměny živného média a oddělování produktů látkové výměny a při úplném nebo částečném zpětném toku buněk,

- přerušení kontinuálního postupu v požadovaném čase a sklizení buněk za sterilních podmínek, a popřípadě

- opakování části nebo všech uvedených kroků v uvedeném pořadí.

Postup podle vynálezu je možno využít pro každý mikroorganismus, kultivovatelný v obvyklých fermentorech. Používají se obvyklé kultivační podmínky a živná média; výhoda postupu podle vynálezu je ve zvláštním provedení postupu, a nikoli v použití zvláštních podmínek nebo médií. Pokud se podle vynálezu míchá při vysokých frekvencích nebo odděluje centrifugou, preferují se mikroorganismy, které nejsou citlivé na střihové síly.

Postup podle vynálezu je možno použít pro kultivaci bakterií a hub různých druhů. Zvláště se hodí pro kultivaci bakterií aerobních nebo anaerobních, gram-pozitivních nebo gramnegativních. Zvláště je nutno uvést různé koky, zejména mikrokoky, planokoky, deinokoky, stafylokoky, stomatokoky, sterotpokoky, Leuconostoc, pediokoky, aerokoky, gemelly, peptokoky, peptostreptokoky, ruminokoky, kuprokoky, jakž i rodu Sarcina. Dále bakterie rodu Bacillus, Sporolactobacillus, Clostridium, Desulfotomaculum, Sporosarcina, Planococcus, Lactobacillus a Korthia. Vhodné jsou dále bifidobakterie, Brevibacteriae, bakterie rodu Zymomonas, Acetobacter, Glucunobacter, Pseudomonas, Vibrio a Aeromonas. Dále je nutno jmenovat gram-negativní anaerobní bakterie rodů Escherichia, Shigella, Edwardsiella, Citrobacter, Salmonella, Klebsiella, Enterobacter, Hafnia, Serratia, Próteus, Providencia, Morganella, Yersinia, Erwinia, Obesumbacterium, Kluyvera, Cedecea, Tatumella, Xenorhabdus a Rahnella. Gram-negativní aerobní tyčinky a koky, které jsou vhodné pro postup podle vynálezu, jsou z čeledí Pseudomonaceae, Azotobacteraceae, Rhizobiaceae, Methylococcaceae, Halobacteriaceae, Acetobacteraceae, Legionellaceae a Neisseriaceae.

Postup podle vynálezu se hodí jak k pomnožování a k získání zde vyšlechtěných mikroorganismů, které je možno oddělit při výrobě a následně použít jinde, tak i k získávání mikroorganismy vyrobených produktů látkové výměny. Umožňuje přitom jednoduchým způsobem optimalizovat výtěžek mikroorganismů nebo produktů látkové výměny, tj. nastavit takový pracovní bod, ve kterém se využije maximální míra rozmnožování mikroorganismu nebo optimální přeměna substrátu. Postup podle vynálezu tedy umožňuje nastavení pracovních bodů s nízkým podílem látkové výměny k udržování pro využití substrátu, což je důležité při výrobě buněčné hmoty, nebo s vysokým podílem látkové výměny k udržování a nízké produkci buněk, což má význam při získávání produktů látkové výměny, dále umožňuje postup dalekosáhlé využití příslušného živného média a současně kontinuální odvádění produktů látkové výměny, přičemž se neinhibuje substrát.

Vynález se dále týká použití zařízení pro výrobu buněčné hmoty a/nebo produktů fermentace se strerilizovatelným fermentačním kotlem, alespoň jedním tankem na příjem a tepelnou sterilizaci filtrací nesterilizovatelné složky média a/nebo alespoň jednou zásobní nádrží pro příjem filtrací

-3 CZ 283799 B6 sterilizovatelné složky média se sterilním filtrem pro kontinuální přípravu sterilní složky média, jakož i sterilizovatelným recirkulačním okruhem, spojeným s fermentačním kotlem se zařízením pro oddělení vyčerpaného živného média a produktů látkové výměny, kde sterilizovatelný recirkulační okruh obsahuje centrifugu a mezi fermentačním kotlem a centrifugou je umístěna zadržovací dráha, jejíž délka umožňuje zachytit živiny, ještě zbývající v živném médiu, k provedení způsobu podle vynálezu.

Přehled obrázků na výkresech

Vynález je blíže objasněn pomocí přiložených výkresů, na nichž představuje:

obr. 1 výtěžek buněčné hmoty za časovou jednotku pro Staphylococcus camosus Sc 1;

obr. 2 porovnání potřeby času a energie na sterilizaci různých objemů v 5000 1 fermentoru;

obr. 3 závislost střední rychlosti růstu μ na výchozí koncentraci glukózy v médiu pro

Lactobacillus curvatus kmen S 3;

obr. 4 průběh specifické rychlosti růstu μ při lineárním a exponenciálním růstu buněk;

obr. 5 fermentor podle vynálezu se zpětným tokem buněk přes separátor;

obr. 6 řízení fermentoru podle vynálezu se zpětným tokem buněk přes separátor;

obr. 7 při kultivaci Pediococcus pentosaceus stanovené parametry postupu v závislosti na čase;

obr. 8 ukazuje vybrané parametiy, získané při kultivaci Pediococcus pentosaceus v závislosti na čase;

obr. 9 odpovídá obr. 7 pro Lactobacillus curvatus kmen 2, tj. závislost vybraných parametrů na čase;

obr. 10 odpovídá obr. 8.

Příklady provedení vynálezu

Postup podle vynálezu je možno rozčlenit na pět kroků, které po startu zařízení cyklicky probíhají a mohou se dále rozčleňovat na následující technické úkoly.

1. Příprava a sterilizace fermentačního zařízení a složek živného média.

2. První pracovní cyklus zařízení ve vsázkovém postupu s nízkou koncentrací médií a při částečném naplnění.

3. Po dosažení specifické koncentrace média přechod na řízené dávkování média až po dosažení konečného objemu fermentace.

4. Přechod na kontinuální postup s výměnou živného média a s úplným zpětným tokem buněk nebo s částečným oddělováním buněk.

-4CZ 283799 B6

5. Přerušení úseku kontinuální fermentace a sběr celé biomasy za sterilních podmínek.

6. Případné nové nasazení sterilních živných médií do sterilního zařízení a zopakování postupu podle kroků 1 až 5 za současného šetření celkové sterilizační doby a energie.

Sterilizace celého zařízení v kroku 1 se provádí tak, že se ve výrobním kotli sterilizuje teplem koncentrát média. Jakmile je koncentrát po sterilizaci ochlazen pod 100 °C, ochladí se během krátké doby na fermentační teplotu přímým vstřikováním sterilně filtrované studené zřeďovací vody a následně sterilně filtrovatelných médií. Ušetří se tím tepelná energie pro sterilizaci celého objemu média teplem; dále energie potřebná k ochlazení celého fermentačního objemu z teplot blízkých 100 °C na fermentační teplotu, jsou-li poměry míšení studené a horké fáze navzájem v souladu; a dále se ušetří čas, který je potřebný k ochlazení celého fermentačního objemu v míchaném kotli přes dvojitý plášť, neboť k ochlazení koncentrátu pomocí přímého vstřikování sterilní vody až do dosažení fermentačního objemu je nutná poměrně krátká doba.

Obr. 2 ukazuje porovnání potřeby času a energie pro sterilizaci 50001itrového fermentoru s rozdílnými sterilizačními objemy. Ušetří se alespoň 25 % času a asi 75 % množství plynu, vody a proudu (el. energie).

Spuštění zařízení vsázkovým způsobem s nízkou koncentrací média podle kroku 2. umožňuje optimální přizpůsobení buněk jejich substrátu a dává vysokou míru růstu buněk, neboť při nízkých koncentracích média se neprojevuje inhibice ani substrátu, ani produktu. Naproti tomu se při běžném vsázkovém způsobu volí vysoká koncentrace média pro dosažení vysokých výtěžků, což vede na začátku postupu k inhibici substrátu a zhoršuje průběh růstu a výtěžek buněčné hmoty, katabolitů a transformačních produktů.

Obr. 3 ukazuje závislost mezi koncentrací glukózy v kultivačním médiu na střední rychlosti μ růstu kmene Lactobacillus curvatus, zastupujícího i ostatní mikroorganismy. Čím vyšší je koncentrace glukózy v médiu, tím nižší je střední rychlost růstu μ, tj. při nízké koncentraci glukózy se zvýší střední rychlost růstu μ.

V kroku 3. se do fermentoru dávkuje médium o určené koncentraci v závislosti na spotřebě hlavního substrátu nebo na předem dané dávkovači funkci, což vede ke zvyšování objemu. Narůstající koncentrace buněk se přidáváním média stále zřeďuje, takže se neprojeví inhibice produktu. Koncentrace přidaného média se nastaví tak, že při dosažení konečného objemu fermentace je celková koncentrace, při které je míra růstu ještě tak vysoká, že procentuální podíl látkové výměny při růstu oproti procentuálnímu podílu látkové výměny na udržování nepřekročí hodnotu platnou pro příslušnou buňku.

Krok 3. vykazuje oproti vsázkovému způsobu tu výhodu, že stoupá dávkované množství média v průběhu růstu buněk a koncentrace látek v médiu se udržuje v podstatě konstantní. Toto způsobuje exponenciální růst buněk během celého kroku. V běžných vsázkových postupech ubývá množství substrátu s růstem buněk, přičemž koncentrace látek jsou proměnlivé. Toto působí proti ideálnímu růstu buněk. Další výhoda kroku 3. je velmi dobré využití substrátu v tomto úseku postupu, podmíněné dávkováním média podle potřeby.

V postupu podle vynálezu se v kroku 4. při dosažení konečného objemu fermentace zavádí výměna média. Oddělení média se provádí prostřednictvím sterilního oddělovacího systému, s výhodou prostřednictvím sterilně běžící centrifugy. Podle první varianty 4a se buňky úplně vracejí do procesu. Ze systému oddělený, spotřebovaný objem média se v systému nahradí ve formě čerstvého média. Koncentrace přidávaného média se volí tak, aby byla nižší než koncentrace, která vede k inhibici produktu, takže buňková hmota bude růst, limitovaná substrátem.

-5CZ 283799 B6

V dalším průběhu kultivace stoupá potřeba média se stoupající buňkovou hmotou až po dosažení dávky média, při které dosahuje koncentrace média optimální kontinuální pracovní oblast. Od tohoto okamžiku se udržuje množství dodávaného média konstantní; systém se nachází nyní ve stabilním stavu s limitovaným substrátem.

Specifická rychlost růstu μ buněk, která si do dosažení optimální kontinuální pracovní oblasti udržuje téměř stejnou hodnotu, klesá exponenciálně v provozu optimální kontinuální pracovní oblasti, zatímco počet zárodků lineárně roste.

Obr. 4 ukazuje průběh specifické rychlosti růstu μ při lineárním a exponenciálním růstu buněk. Jestliže se porovná čas, který potřebuje exponenciálně rostoucí organismus, aby dosáhl určitého počtu zárodků, s časem, který tento organismus potřebuje, roste-li lineárně, ukazuje se přitom značný časový rozdíl. K lineárnímu růstu jedné kultury dochází tehdy, jestliže přívod živného média, resp. jeho dostupnost, není exponenciální, ale lineární. Při lineárním růstu klesá exponenciálně míra růstu se stoupajícím počtem buněk. Tím se stává podíl látkové výměny na udržování celkové látkové výměny velmi vysokým. Experimentálně se zjistí, při kterém μ začíná částečné dělení.

Podle druhé varianty 4b postup podle vynálezu v kroku 4 probíhá za částečného oddělení mikroorganismů, například při biochemických transformacích. Zde v kroku 4. začíná koncentrace buněčné hmoty, při které je rychlost růstu μ v bodě maximální míry transformace. Dosáhne-li se tohoto bodu, začíná se s odběrem buněčné hmoty ze systému. Koncentrace buněk v systému se tím udržuje konstantní. Tím se drží systém na definovaném pracovním bodě s maximální mírou transformace.

Krok 5. s přerušením kontinuálního fermentačního kroku se ve variantě 4a zavádí tehdy, když míra růstu μ dosáhne spodní hraniční hodnoty. Hraniční hodnota se zjišťuje zpravidla z fyziologie látkové výměny buněk, která podle doby nasazení musí vykázat určité znaky.

Při sběru po kultivaci podle 4a se oddělí celá biomasa. Tento krok odpovídá v principu vsázkovému postupu, odlišuje se však od něj výrazně, což se týká výtěžku buněčné hmoty. Výtěžek je při postupu podle vynálezu viditelně vyšší než při obvyklém vsázkovém postupu.

Sběr podle vsázkového postupu (krok 4a) je důležitý při takových procesech, při kterých se produkt z právních nebo technologických hledisek musí definovat jako šarže, tak například ve farmaceutickém nebo potravinářském průmyslu. Postup podle vynálezu vykazuje výhody kontinuálního postupu se zpětným tokem, buněk z hlediska výtěžku buněk, jakož i výhody jednoznačně definované šarže. Sběr se uskutečňuje vždy za sterilních podmínek.

V bodě 4b se naproti tomu popisuje plně kontinuální fermentační postup, jehož přerušení v kroku 5. nastává nikoli díky kinetice růstu buněčné hmoty, ale pro vnější vlivy, jako je například infekce, defektní součásti zařízení, nebo úmyslným přerušením.

Při sběru v kroku 5. se část zařízení, týkající se produktu, proplachuje sterilně filtrovanou vodou a naplní se krátce předtím sterilizovaným médiem z dávkovačích tanků a hned potom je zařízení připraveno pro další vsázku. Tato vsázka se znovu naočkuje předkulturou, nacházející se v exponenciální fázi růstu, a proces se zopakuje.

V postupu podle vynálezu se produkční fermentor sterilizuje pouze při prvním nasazení nebo po infekci; v následných nasazeních se provede pouze sterilizace předřazeného zásobníku. Případně se může médium za horka převést do fermentoru a tam rychle ochladit přímo vstřikovanou vodou.

-6CZ 283799 B6

Zařízení, používané podle vynálezu, a jeho provoz, jsou popsány v souvislosti s obrázkem 5.

Fermentor F1 se provzdušňuje sterilní filtrací vzduchu LF1 a je spojen s centrifugou Z1 přes párou sterilizovatelný recirkulační okruh. Čerpadlo PÍ dopravuje zpět v centrifuze Z1 oddělený koncentrát do fermentoru Fl. Fermentor se zásobuje buď z tanku Bl, a/nebo ze sterilního filtru Sl sterilně filtrovaným nebo přímo z tanku Bl tepelně sterilizovaným médiem. Současně mohou být zásobník média S a A zásobovány sterilně filtrovaným médiem. Zásobníky média S a A mohou být navíc ještě zásobovány sterilně filtrovatelným médiem přes sterilní filtr Sl. Měření, řízení a regulace celého zařízení se provádí integrovaným řídicím systémem procesu, který je pomocí softwaru specificky programován a schematicky znázorněn na obr. 6.

Postup podle vynálezu je možno rozčlenit na již uvedených šest kroků, které jsou popsány dále. Vysvětlení kroku 1 až 6 se uvádí v souvislosti s obr. 5.

Krok 1. zahrnuje přípravu a sterilizaci fermentačního zařízení a složek živného média a sestává ze šesti částečných kroků.

1.1. Umístění technologické vody do fermentoru Fl a naplnění nádrže Bl a Fl médiem.

1.2. Tepelná sterilizace nesterilně filtrovatelného koncentrátu média ve fermentoru Fl.

1.3. Přímé vstřikování sterilní chladicí vody do fermentoru Fl ze sterilního filtru Sl.

1.4. Převedení (transfer) sterilně filtrovaného média z nádrže Bl do fermentoru Fl do zásobníků média S a A.

1.5. Nastavení fermentačního objemu ve fermentoru Fl sterilní vodou ze sterilního filtru Sl.

1.6. Nové naplnění nádrže Bl koncentrátem z nesterilně filtrovatelných složek média a tepelná sterilizace nádrže Bl s následným nepřímým ochlazováním vodou.

V kroku 1.1. se zavádí do fermentoru Fl a nádrže Bl přes hlavní ventily V17, VI8 přítok technologické vody v množství, potřebném k rozpuštění média. Obě nádrže se naplní médiem skrz ruční otvory Η1, H2 a médium se rozmíchá míchadly RF 1 a RB1 do bezhrudkového stavu.

V obou nádržích se nyní nacházejí koncentráty média.

V kroku 1.2. se koncentrát média ve fermentoru Fl tepelně sterilizuje pomocí ohřívacího pláště HM1 a ochladí se na teplotu pod 100 °C.

V kroku 1.3. se pak přes ventil V2 za míchání vstřikuje sterilní technologická voda ze sterilního filtru Sl, dokud se nedosáhne teploty směsi asi 60 °C.

Potom se přes ventil Vil na nádrži Bl a přes sterilní filtr Sl převede sterilní médium do fermentoru Fl. Současně se v kroku 1.4. vede sterilně filtrované médium přes ventily V12, V13 do zásobníků média S, A.

V následujícím kroku 1.5. se počáteční objem fermentoru Fl doplní sterilní technologickou vodou ze sterilního filtru Sl přes ventil V2. Objem náplně fermentoru činí nyní asi 1/3 až 1/4 maximálního pracovního objemu. Koncentrace média se nastaví na počáteční hodnotu procesu, teplota směsi se nachází mezi 30 a 35 °C a tím zpravidla blízko procesní teploty.

Prázdná a vypláchnutá nádrž B1 se v kroku 1.6. po zavedení technologické vody přes ventil V17 a ruční otvor H2 naplní nesterilně filtrovatelnými složkami média, ty se ve formě koncentrátu pomocí ohřívacího pláště HM2 tepelně sterilizují a ochlazují se nepřímo vodou. V nádrži B1 a v zásobnících média S, A se nacházející složky média slouží v dalších krocích dávkování média.

Krok 2 obsahuje první pracovní cyklus zařízení ve vsázkovém postupu s nízkou koncentrací média a částečnou náplní a sestává ze čtyř hlavních kroků.

2.1. Aktivování řídicího systému procesu PLS.

2.2. Inokulace (naočkování) fermentoru F1.

2.3. Růst buněk.

2.4. Přepojení na krok 3 pomocí předem daných kritérií změny.

Řídicí systém procesu PLS sleduje a kontroluje celý proces. Sestává z počítačové jednotky RE, klávesnice TA, obrazovky Bi a tiskárny Du. Řídicí systém procesu PLS je přes propojení dat RS 232 dvousměmě spojený pomocí počítačového interface Cl s řízením nastavení hodnot fermentoru F1 SPS a řídí pomocí ovládače ventilů SPS VS přímo nebo nepřímo přes údaje požadovaných hodnot ovládače R, ventily V a čerpadla P. Všechny v procesu naměřené hodnoty se přenášejí přes zesilovače měření MV, počítačový interface Cl, propojení dat RS 232 na řídicí systém procesu PLS. Před započetím procesu se v kroku 2.1. zapojí specifický software. Obsahuje všechny kritické hodnoty, všechny požadované hodnoty, vyhodnocovací funkce, údaje pro ovládání ventilů a dokumentaci. Podmínky startu se udávají předem z PLS a obsahují nastavení například následujících parametrů pro fermentor Fl:

teplota procesu, hodnota pH, redox potenciál, parciální tlak kyslíku, hmotnost, počet otáček míchadla.

Ovládané ventily Vl, V2, V3, V5 a V7 jsou zavřené; zařízení je připraveno k inokulaci.

Připravená očkovací kultura se přes nástavnou trubici AS naočkuje do fermentoru Fl a proces se odstartuje na řídicím systému PLS, tj. aktivuje se řídicí a kontrolní funkce procesu.

V začáteční fázi postupu (krok 2.3.) probíhá růst buněk podle vsázkového postupu. Výhoda postupu podle vynálezu spočívá v nízké koncentraci média, která umožňuje optimální narůstání buněk a umožňuje dobré přizpůsobení buněk svému médiu.

Na konci fáze růstu vsázkovým způsobem, před dosažením limitování substrátem, se musí přepnout pomocí kritéria změny na následující krok postupu, kterým je dávkování média (krok

2.4. ). Zjišťování kritérií změn se uvádí dále na několika příkladech.

Jako příklad pro tvorbu kritéria změny pro produkci látkové výměny pomocí stechiometrické titrace slouží homofermentativní kmen Lactobacillus, který téměř kvantitativně přeměňuje glukózu na kyselinu mléčnou.

Při kultivaci laktobakterií pracuje fermentor Fl při statické hodnotě pH, tj. klesající hodnota pH, podmíněná vznikající kyselinou mléčnou, se udržuje konstantní titrací louhem o definované normalitě. Hodnota pH ve fermentoru Fl se měří a upravuje prostřednictvím regulačního zařízení QAICR, sestávajícího z měřicí sondy MS, zesilovače měření MW a ovládače R. Naměřené a požadované hodnoty se řídicím systémem procesu PLS zpracují výše uvedeným způsobem. Louh se nachází v zásobníku média L a dávkuje se přes regulátor pH QAICR a ventil V4 ve

-8CZ 283799 B6 fermentoru Fl. Spotřeba louhu v zásobníku média L se měří pomocí kapacitní měřicí sondy objemu LTRA a hodnoty se zpracují v řídicím systému procesu PLS.

Prahová hodnota změny se definuje jako celkové množství spotřeby louhu. Zjištění prahové hodnoty změny se provádí v předběžných pokusech, při kterých se buňky kultivují v kultivačním médiu až do stacionární fáze, zjistí se spotřeba louhu a pak se vypočte to množství spotřeby louhu, které odpovídá zbytkovému množství substrátu (množství glukózy), při kterém buňky ještě nejsou limitovány substrátem a nacházejí se v exponenciální fázi růstu. Vypočtené množství spotřeby louhuje tedy nižší než skutečné.

Jako příklad pro vytvoření kritéria změny na základě potřeby vzduchu slouží kmen mikrokoků (aerobní kmen). Parciální tlak kyslíku se během růstu v kroku 2 upraví na konstantní hodnotu. Zařízení, regulující O₂, CSQAICR, sestává z měřicí sondy MS, zesilovače měření MV a ovládače R. Naměřené hodnoty a požadované hodnoty se podle popisu v části 2.1. vymění řídicím systémem procesu PLS. Výstup ovládače R se nachází na regulačních ventilech V15, V16, které řídí množství plynu, zaváděného do procesu.

Během vsázkového postupu spotřebují buňky více vzduchu, naměřeno průtokovým měřičem hmoty MF1 a MF2.

Toto platí, pokud je ještě substrát a buňky se rozmnožují. Jestliže se dostanou buňky do stavu limitování substrátem, klesá potřeba vzduchu při udržování konstantního parciálního tlaku kyslíku, ovládaného pomocí Fl-CL-QAICR, a při konstantním počtu otáček (regulovaného přes SAICR). Tento pokles se použije jako prahová hodnota změny.

Jako příklad pro tvorbu kritéria změny na základě obsahu CO₂ v kapalné nebo plynné fázi slouží kmen Leuconostoc.

Po dobu vsázkového způsobu kultivace produkují buňky CO₂, který se v médiu rozpustí a zjistí se měřicím zařízením pro CO₂, FI-CO₂-QAIC, který sestává z měřicí sondy MS a zesilovače MV. Aby se mohly rychleji zjistit změny v koncentraci CO₂, fermentor Fl se přes průtokový měřič hmoty MF2 profukuje dusíkem a mísí se při konstantním počtu otáček, aby se CO₂ vytlačil. Když se buňky dostanou do stavu limitování substrátem, vytváří se méně CO₂, parciální tlak CO₂v médiu klesne. Tento pokles se použije jako prahová hodnota změny.

V kroku 3 se uskuteční přechod na pravidelné a řízené dávkování média až do dosažení fermentačního objemu. Sestává ze dvou hlavních kroků:

3.1. Dávkování média.

3.2. Přepojení na krok 4 pomocí předem daných kritérií změn.

Jakmile se dosáhne kritérium změny, začne řízené dávkování média. Proto se při řízení pomocí pH-hodnoty zjišťuje spotřeba louhu za uplynulých 2-10 minut měřením hladiny LIRA v zásobníku média L a řídicím systémem procesu se přepočítá dávkovači množství, vztažené na hlavní substrát (např. glukózu). Toto se může provést pomocí následujícího vzorce:

k| x k_; x 0.5 x Z x a x 180 g/ml

Sdg|_uk' k₂ xt, v kterém znamená:

Z = spotřeba louhu v litrech,

-9CZ 283799 B6 a = normalita louhu (mol), ti = doba měření spotřeby louhu (min), ki = korekční faktor pro nedisociovanou kyselinu při kultivační hodnotě pH, k₂ = faktor využitelnosti substrátu spec, kultury, k₃ - faktor předdávkování,

Sdgiuk = dávkovači množství glukózy (g/min).

Hlavní substrát se nachází v určitém definovaném poměru k ostatním složkám substrátu, který se zjistil v předběžných pokusech. Řídicí systém procesu vypočítá množství dávek pro ostatní substrátové koncentráty a množství vody na zředění na koncentraci vsázky.

Dávkování koncentrátu média se uskutečňuje každých 2 až 5 minut. Sterilně filtrované složky média se dodávají ze zásobníku média S přes ventil V5, tepelně sterilizovatelné složky média se dodávají z nádrže Bl přes ventil VI a zřeďovací voda přes sterilní filtr S1 přes ventil V2. Dávkované objemy média ze zásobníku média Sa z nádrže Bl se měří kapacitními měřicími sondami stavu náplně LIRA. Dávkování zřeďovací vody přes sterilní filtr S1 se řídí regulátorem hmotnosti WICA tak, že řídicím systémem procesu PLS se stanovuje požadovaná stoupající hmotnost fermentoru F1.

Se stoupající buněčnou hmotou v systému stoupá spotřeba hlavního substrátu a tím i celého média. Jestliže se koncentrace média udržuje konstantní, stále se zvyšuje dávkované množství média v dávkovaném cyklu, až do dosažení maximální náplně fermentoru. Koncentrace dávkovaného média se zvolí tak, že při dosažení max. náplně fermentoru se dosahuje celkové množství média, potřebné pro maximální výtěžek buněk za daných provozních podmínek. Touto hodnotou je maximální anebo specifický výtěžek buněk.

U organismů, při jejichž kultivaci není přesně stanovitelný hlavní substrát, se dávkování média řídí obalovou křivkou, která představuje pro daný organismus specifickou exponenciální funkci růstu. V předběžných pokusech se určí specifická potřeba substrátu pro 1 x 10¹² buněk, specifická rychlost růstu μ, počet zárodků, který se v kroku 2 dosahuje v době změny kritéria a koncentrace média, při které se dosáhne maximálního počtu zárodků.

Jakmile se dosáhne kritéria změny, popsané v kroku 2.4., zahájí se řízené dávkování média. Množství média, které je potřebné k dosažení počtu zárodků 1.10¹², se definuje jako množství média 1 a je pro každý kmen specifické. Koncentrace dávkovaného média se udržuje konstantní a je tak nastavená, že při dosažení maximální náplně fermentoru se dosáhne celkového množství média, potřebného pro maximální výtěžek buněk za daných provozních podmínek. V průběhu kultivace stoupá objem substrátu, dávkovaný v dávkovacím cyklu.

Dávka substrátu SD se vypočítá podle vzorců:

X_t = e^g ‘*^,nx ₀(3.1.2.a)

SD = sSxX, (3.1.2. b)

SD_Bct =sSxe^ut+lnx ₀(3.1.2.c) ve který ch znamená:

Xo = celkový počet zárodků v systému na začátku dávkování, x_t = celkový počet zárodků v systému v čase t, uo = specifická rychlost růstu na začátku dávkování, t = časový interval mezi měřením xo a x_t, sS = specifická potřeba substrátu pro 1.10¹² zárodků v gramech anebo milimetrech, SD_Ber = vypočtená dávka substrátu.

- 10CZ 283799 B6

Výpočet hodnoty dávky a dávkování se provádí každých 5 až 15 minut. Jestliže jsou dávkovači objemy na začátku dávkování příliš malé, přidají se k následujícímu dávkovacímu cyklu a po překročení dávky se přidávají ve velmi malých množstvích.

Jestliže při konstantním počtu otáček míchadla RF1 už určitou dobu nestoupá spotřeba kyslíku a buněk, měřená průtokovým měřičem množství MF1 a MF2, anebo klesá, což je zapříčiněno limitováním substrátem, zvýší se množství dávky, což odstraní toto limitování substrátem. Jestliže se limitování po jednorázovém zvýšení μ ještě neodstranilo, po určité, pro postup specifické, době čekání se μ ještě zvýší.

Přizpůsobení řídicí funkce procesu se může uskutečnit nejenom pomocí parciálního tlaku O₂, ale také pomocí parciálního tlaku CO₂, stanoveného měřením CO₂, měřičem CO₂QAICR. Princip měření se popisuje v kroku 2.4.3. Jestliže při konstantním počtu otáček míchadla RF1 a při konstantním množství dusíku, vháněného do fermentoru Fl, měřeného průtokovým měřičem množství MF2, parciální tlak CO₂ už nenarůstá nebo klesá, což je zapříčiněno limitováním substrátem, potom zvýší software řídicího systému procesu PLS množství dávky o objem, který vede ke zrychlení dávkování živného média a odstraní tím limitování substrátem. Jestliže se toto omezení ještě neodstraní po jednorázovém zvýšení μ, zvýší se pomocí software řídicího systému procesu PLS hodnota μ ještě jednou, a to po určité, pro postup specifické, době čekání.

Kritérium změny z kroku 3 na krok 4 se určí pomocí hmotnosti fermentoru Fl, měřeného váhami Fl WICA. Prahová hodnota hmotnosti se volí specificky pro každý postup.

Krok 4 obsahuje přechod pro kontinuální postup, zahrnující výměnu živného média a úplný zpětný tok buněk, anebo částečné oddělování buněk, a sestává ze 4 hlavních kroků.

4.1. Spuštění centrifugy a začátek separace se zpětným tokem buněk.

4.2. Postup zahrnující úplný tok buněk.

4.3. Postup s částečným oddělením buněk.

4.3.1. Řízení procesu s úplným zpětným tokem buněk až do počátku částečného oddělování.

4.3.2. Změna na částečné oddělení buněk.

4.3.3. Částečné oddělení buněk, jakož i

4.4. Přerušení a změna na krok 5.

Před dosažením prahové hodnoty změny podle kroku 3.2. se zapne separátor Z1 a po dosažení prahové hodnoty změny se otevře ventil V7 pomocí řídicího systému procesu PLS. Ventilem V8 se již před separováním nastaví maximální rychlost průtoku separátorem, která je specifická pro daný postup. Nastavená rychlost průtoku se změří indukčním průtokoměrem IDM1 a zaregistruje se v řídicím systému procesu PLS. Pro zpětné vedení oddělené buňkové hmoty se zapne čerpadlo PÍ současně s ventilem V7. Ventily V9 a V6 jsou otevřené od začátku procesu.

Konzistence oddělené buňkové hmoty musí být kapalná, aby se umožnil zpětný tok buňkové hmoty podle kroku 4.2. pomocí čerpadla PÍ a v krátké době se uskutečnilo znovu promísení buňkové hmoty ve fermentoru. Při podílu sedimentu pod 60 % odpovídá zpravidla tato konzistence těmto požadavkům. Stupeň zahuštění nesmí klesnout pod 40 % sedimentu, neboť jinak zpětný objem média sníží efektivní oddělovací výkon separátoru Z1 až na 15 %.

Stupeň zahuštění se řídí dobou vyprazdňování separátoru Zl. Vyprazdňování se uskutečňuje asi každé 3 až 4 minuty, neboť doba zdržení buněk v separátoru nesmí překročit tento časový interval. Vede to k nejmenšímu poškození buněk v závislosti na použitém druhu buněk.

- 11 CZ 283799 B6

Dávkování substrátu probíhá dále po dobu zpětného toku buněk v závislosti na zvolených parametrech, anebo se případně zataví po dobu zpětného toku buněk. Zpětný tok buněk bez dávkování substrátu je nutný u takových organismů, které mají až ve zcela bezglukózovém médiu dobré sedimentační vlastnosti (viz příklad 1). Postup, při němž se dávkování substrátu provádí v době zpětného toku buněk, probíhá například následovně.

Při dávkování prostřednictvím hlavního substrátu se substrát přidává podle potřeby. Dávkování zřeďovací vody se provádí pomocí sterilního filtru SI a ventilu V2, řízené váhami WICA fermentoru Fl, které udržují konstantní hmotnost fermentoru nezávisle na aktuálním oddělovacím výkonu centrifugy Zl. Je dána očekávaná hmotnost a specificky odpovídá pracovnímu objemu fermentoru Fl. Ze zásobníku média S přes ventil V5 a z nádrže B1 před ventil VI dávkovaná množství koncentrátu média se zjišťují a dávkují v závislosti na spotřebě hlavního substrátu. Do procesu zaváděné celkové množství substrátu a množství dávkovaných substrátů v závislosti na čase představuje exponenciální funkci až po vrchní hraniční bod, od kterého již není dávkování řízeno potřebou, aleje lineární. Vrchní hraniční bod se zjistí z maximálně možné koncentrace v přítoku, která nesmí překročit hodnotu, získanou v předběžných pokusech.

Toto maximální množství průtoku se řídí podle aktuálního efektivního výkonu oddělování T_eff centrifugy. Dávkování substrátu podle potřeby je vždy menší nebo rovné maximální hodnotě dávky, vypočítané z hodnoty T_eff.

V porovnání se známým vsázkovým postupem je počet zárodků, zjištěný postupem podle vynálezu, alespoň o 1 řád vyšší.

Dávkování se může uskutečnit na základě předem vypočítaných hodnot (obalová křivka) analogicky k vpředu popsanému dávkování, vztaženému na hlavní substrát.

Postup s částečným oddělením buněk (krok 4.3.) odpovídá na začátku pod 4.2. popsanému postupu s úplným zpětným tokem buněk. Při úplném zpětném toku buněk se proces dostane na pracovní bod, znamenající začátek částečného oddělování buněk.

Kritérium změny pro začátek částečného oddělování buněk je pro postup specifické, je však vždy spojeno se specifickou rychlostí růstu μ, protože využití substrátu a tvorba produktů látkové výměny jsou přímo závislé na specifické rychlosti růstu. Hodnota μ je specifická pro organismus a stanovuje se v předběžných pokusech.

Z množství substrátu, dodaného do celkového systému, se vypočítá celkový počet zárodků v systému, a to pomocí specifické potřeby substrátu na počet buněk. Tato hodnota odpovídá, při definovaném objemu systému, definované maximální koncentraci média a při definovaném výkonu oddělování definované rychlosti růstu μ, která představuje bod změny.

Počet zárodků v systému, dosažený v době částečného oddělování, se udržuje konstantní odebráním definovaného proudu buněčné hmoty ze systému.

Při odebrání buněčné hmoty ze systému se při pracujícím čerpadle Pl zavře ventil V9 a ventil V10 se otevře. Pomocí průtokoměru IDM2 se změří množství odtoku koncentrátu a po dosažení vypočítaného množství se ventil V10 zavře a V9 otevře. Časový interval cyklu odběru činí asi 3 až 10 minut.

Jestliže se dávkuje substrát v závislosti na hlavním substrátu, pak se dále konstantně dávkuje dávka, které bylo dosaženo na začátku oddělování.

- 12CZ 283799 B6

Při dávkování pomocí předem vypočtených hodnot (obalová křivka) se též konstantně déle dávkuje množství, nutné na začátku částečného oddělování. Když se dávkování nachází na homí hranici, tato se udržuje i nadále.

Takovéto dávkování umožňuje dorůstání oddělené buněčné hmoty. Při konstantním udržování přítokových a odtokových poměrů se vytvoří v systému stabilní rovnováha. Buňky rostou s konstantní rychlostí růstu μ.

Kritérium přerušení v kontinuální části (kroku) se v postupu s úplným zpětným tokem buněk vytvoří na základě celkového nasazení substrátu.

Na celkovém množství substrátu závisí celkový počet zárodků v systému s definovanou rychlostí růstu μ. Od určité rychlosti růstu se využití substrátu považuje už za nedostatečné.

Kritérium přerušení pro kontinuální úsek (krok) se při postupu s částečným oddělováním buněk vytvoří následkem chyb systému, jako je infekce, usazeniny nebo závady strojů, anebo vyplývá z hospodářských nebo jiných úvah.

Krok 5. sestává z přerušení kontinuální fermentační části a sběru a ze sběru celkové biomasy za sterilních podmínek.

U organismů, jejichž sedimentační vlastnosti jsou až v bezglukózovém médiu dostačující pro sběr, se sběr uskutečňuje při maximálním oddělovacím výkonu centrifugy.

Sběr s dávkováním substrátu probíhá identicky pro vsázky s dávkováním substrátu v závislosti na hlavním substrátu nebo obalové křivce a umožňuje sběr buněk při zachování aktivity látkové výměny. Sběr se zahájí otevřením ventilu Vl a uzavřením ventilu V9. Pro sběr se udává úbytek hmotnosti fermentoru F1 AMFl v čase, řízený regulátorem hmotnosti W1CA Fl, který vychází z maximálního přípustného trvání sběru a musí být menší, než maximální oddělovací výkon centrifugy, měřený pomocí IDM1.

Krok 6. sestává z nového nasazení sterilních živných médií do sterilního zařízení a z opakování postupu podle kroků 1. až 5., přičemž se ušetří celková doba sterilizace a energie (Split-Batchprovoz).

Hned po sběru se uzavřou všechny ventily. Fermentor Fl se ventilem V19 a ClP-koulí (CIP = cleaning in plače, čištění na místě) opláchne sterilně filtrovanou vodou ze sterilního filtru Sl, aby se odstranily případně se vyskytující nánosy usazenin (nečistoty). Znečištěná voda se vypustí ventily V7 a V8 do centrifugy a slouží k proplachování. Po oplachovacím kroku se ventily V19, V7, V8 uzavřou.

Centrifuga Z1 se nyní čistí ventily V20, V21 a systémem CIP. Je nutné, aby byly odstraněny v centrifuze se nacházející zbytky buněčné hmoty, pokud by před začátkem následujícího separačního cyklu přešly do lysis (protilátka, která působí rozkladně na buňky mikroorganismů). Po čištění se ventily V20, V21 uzavřou a centrifuga se sterilizuje párou, vháněnou přes hlavní ventily V7, VlOa V22.

Začátek sterilizace se nachází v kroku 2., popsaném ve vsázkovém postupu. V tomto kroku se separátor nepoužívá.

Živná média pro cyklus postupu se připravují v nádrži Bl. Nejprve se v nádrži Bl připraví sterilně filtrované složky média a tyto se analogicky v kroku 1.4. převedou přes ručně ovládané ventily Vil z nádrže B1 přes sterilní filtr SI a ventil V2 do fermentoru Fl. Současně se dává sterilně filtrované médium přes ručně ovládané ventily V12, VI3 do zásobníků média S, A.

Následně se nádrž B1 po předložení technologické vody přes ventil V17 naplní nesterilně filtrovatelnými složkami média, tyto se ve formě kocentrátu tepelně sterilizují ohřívacím pláštěm HM2 a nepřímo chladí vodou přes plášť HM2. Po dobu sterilizace nádrže B1 se přivádí do fermentoru Fl přes sterilní filtr SI a ventil V2 určité množství sterilní technologické vody na sterilně filtrovaný koncentrát média, takže po dávce horkého tepelně sterilizovaného koncentrátu média z nádrže B1 ventilem VI se získá objem fermentace.

Následně probíhá proces, jak se uvádí v krocích 2. až 6.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Příklad typického postupu fermentace organismu Lactobacillus curvatus kmen 2 DSM č. 4264.

Postup je možno rozčlenit do pěti kroků, které po spuštění zařízení probíhají cyklicky.

Krok 1: Příprava a sterilizace fermentačního zařízení a složek živného média.

Před započetím postupu se zkouší celé zařízení na těsnost a následně se vytvoří předpoklady startu pro nasazení médií nastavením odpovídajících ventilů. Potom se připraví zařízení fermentoru. Živná média se naváží a naplní do tanků a nádrží. Zařízení se sterilizuje.

Obr. 9 a 10 ukazují průběh parametrů zařízení a procesu.

Krok 2: Odstartování fermentace naočkováním fermentoru očkovací kulturou, start řídicího systému procesu a prvního pracovního cyklu zařízení vsázkovým postupem při nízké koncentraci média a při částečném naplnění.

Po dobu průběhu se udržují všechny parametry provozu konstantní. Na konci kroku 2. se dosahuje bodu změny na krok 3. Bod změny je definován koncentrací glukózy v médiu. Do dosažení koncentrace glukózy, určené jako prahová hodnota změny, asi 1 g/1 glukózy, se spotřebuje od začátku fermentace určité definované množství louhu sodného. Když se dosáhne této spotřeby, dojde ke změně.

Krok 3: Přechod na regulované dávkování média až do dosažení konečného objemu fermentace.

Médium se přidává regulovaně prostřednictvím hlavního substrátu - louhu sodného. V příkladu se dávkování provádí stupňovitě, což při daném mikroorganismu indukuje velmi rychlý růst (viz obr. 10).

U jiných mikroorganismů je pro optimální růst nutné plynulé dávkování. Prostřednictvím řídicího systému procesu se mohou uskutečnit libovolné funkce dávkování.

Krok 4: Přechod na kontinuální způsob provozu s výměnou živného média a s úplným zpětným tokem buněk anebo s částečným oddělením buněk.

- 14CZ 283799 B6

U daného organismu se na začátku kroku 4 sníží objem fermentoru při úplném zpětném toku buněk a následně se přidá médium. V dalším průběhu postupu se uskutečňuje další zpětný tok buněk s částečným oddělováním. Následně se zase dávkuje médium.

Popsaný průběh kroku 4. je charakteristický pro použitý organismus. U jiných organismů se používají buď změněné oddělovací a dávkovači intervaly, nebo plynulé oddělování a dávkování (pozn. obr. 9).

Krok 5: Přerušení části kontinuální fermentace a sběr celé biomasy za sterilních podmínek.

Po úplné spotřebě živných médií, zjistitelné na konci spotřeby louhu sodného, se zahájí sběr. Sběr se provádí při maximálním oddělovacím výkonu centrifugy bez zpětného toku buněk. Výkon separátoru je závislý na použitém organismu a v porovnání s jinými organismy je malý. Malý oddělovací výkon se vysvětluje sacharidovým obalem, obklopujícím organismus, který ztěžuje sedimentaci. Jiné organismy bez sacharidového obalu umožňují dvoj- až trojnásobný oddělovací výkon separátoru. V příkladu použitý organismus klade velké nároky na průběh procesu, protože výše uvedený sacharidový obal způsobuje špatné sedimentační podmínky, jestliže se může používat jen relativně malá rychlost při výměně média.

Krok 3: Nové nasazení sterilních živných médií do sterilního zařízení a opakování postupu dle kroků 1 až 5 při současném šetření celkové doby sterilizace a energie.

Na konci kroku 4. se v nádržích ponechá takové množství média, které je potřebné pro nízce koncentrovanou novou vsázku. Ihned po kroku 5. se do fermentoru Fl přečerpá sterilní koncentrát média a sterilní voda a hned potom se provede inokulace vsázky novou očkovací kulturou. Následně během kroku 2. postupu se připraví médium do nádrže Bl, zásobníků Sa A pro používanou vsázku.

Postup se v dalších příkladech opakuje s následujícími kmeny:

Příklad 2: Lactobacillus curvatus kmen 3 DSM 4265

Příklad 3: Pediococcus pentosaceus DSM6165

Příklad 4: Pediococcus acidilactici DSM6164

Příklad 5: Staphylococcus camosus Sel DSM 6162

Příklad 6: Micrococcus varians M 28 DSM6163

Příklad 7: Micrococcus varians M 101 DSM4263

- 15 CZ 283799 B6

Parametry kultivace - startovací kmeny

Kmen DSM č.	LAB¹) 4262	LAC^{1 2}) 4265	PEB^{3 4}) 6165	pec⁴⁾ 6164	SAB⁵) (ScA 1) 6162	MIB⁶) (M 28) 6163	MIC⁷) (M 101) 4263
teplota kultivace	30 °C	30 °C	30 °C	30 °C	35 °C	35 °C	35 °C
pH kultivace	5,9	5,9	5,9	5,9	6,5	6,5	6,5
provzdušnění % O2 wm	-	-	-	-	20 % O₂	20 % O₂ 0,14 wm	20 % O₂ 0,14 wm
zaplynování	n₂	n₂	n₂	n₂	čistý O₂	čistý O₂	čistý O₂
počet otáček míchadla	120 1/min	120 1/min	120 1/min	120 1/min	80 až 250 1/min	80 až 250 1/min	80 až 250 1/min
očkovací pomčr	1 : 562	1 : 562	1 : 1125	1 : 563	1 : 1000	1 : 80	1 : 80
očkovací kultura	kultura v log-fázi přeočkovat			kult.v log-fázi přeočkovat	kultura v log-fázi přeočkovat
doba kultivace	24 až 26 h	24 až 26 h	24 až 26 h	24 až 26 h	14až 17 h	18až20h	18 až 20 h
spotřeba louhu	333 gNaOH /1000g glukózy	333 gNaOH /1000g glukózy	333 gNaOH /1000g glukózy	333 gNaOH /1000 g glukózy	266 g NaOH /1000g glukózy	24 g NaOH /1000g glukózy	24 gNaOH /1000g glukózy
doba sbčru	konec gluk. konec gluk. konec gluk. konec gluk. konec gluk. konec gluk. konec gluk.
výkon separátoru	1400 1/h	1400 až 1600 1/h	2000 až 2400 1/h	2000 až 2400 1/h	3200 1/h	3400 1/h	3400 1/h
prac. objem fermentoru	45001	45001	4500 1	45001	40001	40001	40001
práh, hodnota změny z kroku 2 (Batch-ferm.)	1 g/1 konc.glukózy v médiu	1 g/i konc.glukózy v médiu	1 g/1 konc.glukózy v médiu	1 g/i konc.glukózy v médiu	3 g/1 nárůst parciálního konc.glukózy tlaku Q, v médiu nárůst spotřeby vzduchu

na krok 3 (fed-Batch-ferm)

1) Lactobacillus curvatus kmen 2

2) Lactobacillus curvatus kmen 3

3) Pediococcus pentosaceus

4) Pediococcus acidilactici

5) Staphylococcus camosus kmen 1

6) Micrococcus varians kmen M28

7) Micrococcus varians kmen M101

- 16CZ 283799 B6

Příklad 3

Průběh fermentace organismu Pediococcus pentosaceus.

Způsob výroby podle vynálezu se může rozčlenit do 5 kroků, které po nastartování zařízení probíhají cyklicky.

Před započetím postupu se přezkouší celé zařízení na těsnost a následně se vytvoří startovací podmínky pro dávkování médií nastavením odpovídajících ventilů. Potom se připraví fermentor. Živná média se naváží podle receptury pro Pediococcus pentosaceus a naplní se do tam uvedených tanků a zásobníků. Zařízení se sterilizuje.

Krok 2: Start fermentace naočkováním fermentoru očkovací kulturou, start řídicího systému procesu a první pracovní cyklus zařízení ve vsázkovém postupu s nízkou koncentrací média s částečným naplněním.

Obr. 7 a obr. 8, oblast 1, Batch-fáze ukazuje průběh parametrů zařízení. Všechny provozní parametry se udržují konstantní. Na konci kroku 2. se dosáhne bodu změny na krok 3. V daném příkladě je bodem změny definovaná koncentrace glukózy v médiu. Až když se dosáhne koncentrace glukózy, stanovená jako prahová hodnota změny, tj. asi 1 g/1 glukózy, od začátku fermentace se spotřebuje definované množství louhu sodného. Když se dosáhne této spotřeby, provede se změna (viz obr. 8).

V daném příkladě je přidávání a regulování pomocí vedoucí látky - louhu sodného. V příkladě se dávkuje plynule, což u daného mikroorganismu vyvolává velmi rychlý růst. Plynulé dávkování je vidět na obr. 7 na zvětšování objemu fermentoru, množství glukózy a množství proteinů. U jiných mikroorganismů je pro optimální růst nutné stupňovité dávkování. Pomocí řídicího systému procesuje možné nastavit libovolné dávkovači funkce.

Krok 4: Přechod na kontinuální postup s výměnou živného média a úplným zpětným tokem buněk nebo s částečným oddělováním buněk.

Na začátku kroku 4. se sníží objem fermentoru při úplném zpětném toku buněk a následně se přidává médium. V dalším průběhu postupu se opět zavádí zpětný tok buněk s částečným oddělováním buněk. Následně se opět přidává médium. Popsaný průběh kroku 4. je charakteristický pro použitý organismus. U jiných organismů se pracuje se změněnými oddělovacími a dávkovacími intervaly nebo při plynulém oddělování a dávkování.

Po úplné spotřebě živných médií, což je u daného organismu zjevné na konci spotřeby louhu sodného, se zahájí sběr. Sběr se provádí s maximálním oddělovacím výkonem centrifugy bez zpětného toku buněk.

Krok 6: Nové nasazení sterilních živných médií do sterilního zařízení a opakování postupu podle kroků 1. až 5. Při současném šetření celkové doby sterilizace a energie.

- 17CZ 283799 B6

Na konci kroku 4. se v nádržích média ponechá takové množství, které je nutné pro nízce koncentrovanou vsázku. Ihned po kroku 5. se do fermentoru FI přečerpá sterilní koncentrát média a sterilní voda a ihned se potom provede inokulace vsázky novou očkovací kulturou. Následně během kroku 2. postupu se připraví médium do nádrže Bl, zásobníků Sa A pro používanou násadu.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Způsob výroby buněčné hmoty a/nebo fermentačních produktů za sterilních podmínek, při kterém se fermentační směs alespoň občas recirkuluje a produkty látkové výměny kultivovaných buněk a popřípadě buněčná hmota se oddělují, vyznačující se tím, že zahrnuje následující stupně:

-opatření fermentačního zařízení množstvím živného média, postačujícím kzapočetí tvorby požadované buněčné kultury,

- sterilizaci zařízení a nastavení požadované koncentrace živného média, která je nižší než specifická koncentrace živného média buněčné kultury,

- naočkování živného média očkovací kulturou a ponechání nerušeného růstu kultury po definovaný čas ve vsádkovém způsobu a za částečného naplnění fermentačního zařízení,

- zvýšení koncentrace živného média na koncentraci specifickou pro buněčnou kulturu za současného zvyšování objemu živného média na pracovní objem zařízení při současném zvyšování koncentrace buněk,

- přechod na kontinuální postup za výměny živného média a oddělování produktů látkové výměny a při úplném nebo částečném zpětném toku buněk,

- přerušení kontinuálního postupu v požadovaném čase a sklizení buněk za sterilních podmínek, a popřípadě

- opakování části nebo všech uvedených kroků v uvedeném pořadí.
2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že se ve fázi výměny média zvyšuje přidávané množství média s exponenciálním růstem kultury a při dosažení maximálního oddělení buněk se udržuje konstantní.
3. Způsob podle nároku 1 nebo 2, vyznačující se tím, že se přidávání živného média řídí hlavním parametrem, jehož hodnota se stanovuje trvale.
4. Způsob podle nároku 3, vyznačující se tím, že se jako hlavní parametr použije hodnota pH, koncentrace CO₂ nebo O₂.
5. Způsob podle nároku 4, vyznačující se tím, že se ve fermentačním zařízení stanoví hodnota pH a přídavkem báze o definované koncentraci se udržuje konstantní.

-18CZ 283799 B6
6. Způsob podle nároku 5, vyznačující se tím, žesekpoužitému množství zásady přidává ekvivalentní množství živného média, které se ve fázi růstu buňkové kultury mění s poměrným faktorem dávkování, který je úměrný rychlosti růstu.
7. Způsob podle nároku 3, vyznačující se tím, že se upotřebené živné médium nahradí na základě obalové křivky, specifické pro buněčnou kulturu, která zohledňuje danou buněčnou hmotu, rychlost růstu a podmínky kultivace.
8. Způsob podle některého z nároků laž7, vyznačující se tím, že se provádí kontinuálně.
9. Způsob podle nároku 8, vyznačující se tím, že se buněčná kultura nastaví na požadovanou rychlost růstu změnou podílu sběru, popřípadě zpětného toku buněk.
10. Způsob podle některého z nároků laž9, vyznačující se tím, že se produkt látkové výměny a buněčná hmota oddělí odstředěním.
11. Způsob podle některého z nároků 1 až 10, vyznačující se tím, že se do fermentačního zařízení na začátku přidá koncentrát živného média.
12. Způsob podle nároku 11, vyznačující se tím, že se nastavení počáteční koncentrace živného média provede nastříknutím studené sterilní vody.
13. Způsob podle některého z nároků lažl2, vyznačující se tím, že se živné médium přidává ve formě koncentrátu.
14. Způsob podle některého z nároků 1 až 13, vyznačující se tím, že se ve stadiu sběru buněčná hmota částečně vede zpět.
15. Způsob podle některého z nároků 1 až 14, vyznačující se tím, že se při kultivaci aerobních buněk buněčné kultury zavádí vzduch, obohacený čistým kyslíkem.
16. Použití způsobu podle nároků 1 až 15 pro získání bakterií mléčného kvašení a/nebo kyseliny mléčné.
17. Použití zařízení pro výrobu buněčné hmoty a/nebo produktů fermentace se sterilizovatelným fermentačním kotlem, alespoň jedním tankem na příjem a tepelnou sterilizaci filtrací nesterilizovatelné složky média a/nebo alespoň jednou zásobní nádrží pro příjem filtrací sterilizovatelné složky média se sterilním filtrem pro kontinuální přípravu sterilní složky média, jakož i sterilizovatelným recirkulačním okruhem, spojeným s fermentačním kotlem se zařízením pro oddělení vyčerpaného živného média a produktů látkové výměny, kde sterilizovatelný recirkulační okruh obsahuje centrifugu a mezi fermentačním kotlem a centrifugou je umístěna zadržovací dráha, jejíž délka umožňuje zachytit živiny ještě zbývající v živném médiu, k provedení způsobu podle nároku 1.
18. Použití podle nároku 17, vyznačující se tím, že centrifuga je centrifuga sterilizovatelná párou, samoodkalitelná s nastavitelným rozsahem odkalování.
19. Použití podle nároku 17 nebo 18, vyznačující se tím, že ve fermentačním kotli je umístěna měřicí sonda pro zjišťování velikosti řídicí veličiny procesu.
20. Použití podle nároku 19, vyznačující se tím, že měřicí sonda je měřicí sonda glukózy, pH, O₂, nebo CO₂.

- 19CZ 283799 B6
21. Použití podle některého z nároků 17až20, vyznačující se tím, tlivé tanky a zásobní nádrže mají zařízení pro stanovení množství náplně a spotřeby.