NO301596B1

NO301596B1 - Fremgangsmåte for fremstilling av lyofiliserte pattedyrceller

Info

Publication number: NO301596B1
Application number: NO911533A
Authority: NO
Inventors: Robert H Raynor; Jr Stephen F Healy; Kenneth H Kortright
Original assignee: Coulter Corp
Priority date: 1988-10-20
Filing date: 1991-04-18
Publication date: 1997-11-17
Also published as: JP2912400B2; ATE199625T1; EP0444159A1; JPH04501112A; ES2019727A6; DE68929286D1; AU633029B2; IE893341L; EP0444159A4; ZA897924B; IE62544B1; CA1335362C; WO1990004329A1; NO911533L; DE68929286T2; US5059518A; IL92057A0; NO911533D0; CN1038691C; MX166481B

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører en ny fremgangsmåte for fremstilling av lyofiliserte pattedyrceller som vil beholde cellemembran-strukturintegritet og celleoverflate antigenisitet når rekonstituert.

Fremgangsmåter for lyofilisering eller frysetørking for konservering av liposomer inneholdende biologiske aktive molekyler og for bakterielle kulturer, er kjent. Fremstilling av farmasøytiske tabletter ved anvendelse av lyofiliserings-fremgangsmåtene er også kjent. I US-patent nr. 4.678.812 er en fremgangsmåte for fremstilling av tabletter nyttige i diagnostiske anvendelser ved anvendelse av trehalose som en eksipient og stabilisator beskrevet. US-patent nr. 4.712.310 beskriver en fremgangsmåte for fremstilling av tabletter som er nyttige som reagensbærere for diagnostiske analyser.

Fremgangsmåter for innkapsling av materialer så som me-dikamenter, nukleinsyrer, proteiner, indikatormolekyler, enzymer o.l. i liposomer, er beskrevet i tidligere patenter. Eksempler på slike patenter er US-patent-nr. 4.515.736 og 4.411.894. US-patent nr. 3.261.761, 4.206.200 og 4.246.349 beskriver lyofiliseringsprosedyrer for bakterier. I dette samme studieområdet er den publiserte europeiske patent-søknaden nr. 0 259 739, publiserte 16. mars 1988, med tittel "Improved Stability of freezedried cultures."

Tidligere teknikk beskriver anvendelse av sukkerforbindelser i lyofiliseringsanvendelser for en stabiliseringsfunksjon. Sukkeret trehalose er også nevnt å være nyttig i denne funksjonen. I international søknad, publisert under PCT, nr. W0 86/03938, publisert 17. juli 1986, er det beskrevet anvendelse av trehalose som et konserveringsmiddel både inne i liposomer og eksternt i oppløsning, i løpet av frysetørk-ing. Denne anvendelsen av trehalose både eksternt og internt i liposomer er den angitte utførelsesformen.

Ingen av de tidligere teknologiene som er beskrevet vurderer konservering av pattedyrceller og spesielt humane celler. Humane celler, så som blodceller, har distinkt membranstruk-tur sammenlignet med membranstrukturen til bakterier eller liposomer. Når det gjelder bakterier, er celleveggen en meget tykk ikke-lipidvegg der funksjonen er å beskytte cellefluid-innholdet fra slike negative påvirkninger som varme, osmotiske trykkforandringer og til og med frysetørking i fravær av et konserveringsmiddel så som sukker. Mange bakteriestammer kan dermed motstå stresset ved frysing og tørking i fravær av et unikt konserverende beskyttende eller belegg på grunn av deres rigide cellevegg.

Når det gjelder liposomer er fluidområdet innesluttet av énlamellære eller flerlammelære lipidvesikler. Veggene til vesiklene er dannet av et biomolekylært lag av én eller flere lipidkomponenter som har polare hoder og ikke-polare haler. I en vandig oppløsning er de polare hodene til det ene laget orientert utover for å rekke inn i det omgivende mediet, og den upolare haledelen til lipidene assosierer med hverandre for dermed å tilveiebringe en polar overflate og en upolar kjerne i veggen til vesikkelen. Énlamellære liposomer har et biomolekylært lag, mens multilamellære liposomer generelt har en mengde vesentlig konsentriske biomolekylære lag. Liposomet er dermed en sfærisk mikrostruktur dannet når blandinger av fosfolipider med eller uten steroider er dispergert i de vandige oppløsningene. De er antatt for anvendelse for innkapsling av et middel for kjent levering til et in vivo-sted.

Liposomcelleveggen er en kunstig bi-lipidmembran sammenlignet med den til en human celle. Sammensetningen av en human cellemembran er mye mer omfattende. I tillegg til en bi-lipidmembranstruktur, har den humane cellemembranen mange ytterligere protein og glykoproteinmolekyler interkalert i dets bi-lag. Disse proteinholdige molekylene er av spesiell interesse på grunn av at de tilveiebringer celleoverflate- antigener eller determinantseter som ikke er tilstede i en kunstig liposom. Investigering av humane celleoverflatemarkø-rer er det vanskeligste innen immunanalyser og andre hematologiske målinger vedrørende humane blodceller. Den samme distingsjonen over liposomer sees ved anvendelse av hybridomcellelinjer og monoklonale antistoffer. En annen distinksjon som bør bli observert er forskjellen mellom komplekse fluidinnhold til en pattedyrcelle og den til en liposom. Når det gjelder en human blodcelle, eksisterer cellen bare i et isotonisk fluidmedium som ikke er tilfelle for liposom som kan eksistere i et hvilket som helst medium, inkludert ikke-isotoniske oppløsninger.

Lyofil iseringsfremgangsmåten innbefattet i oppfinnelsen er unik på grunn av at pattedyrceller blir lyofilisert uten negativ forandring av morfologien til cellen, og uten å gjøre cellemembranen permeabel etter konjugasjon til en probe eller markør for anvendelse i en analyse, når den er en kontroll-celle. Nevnte lyofiliseringsfremgangsmåte virker videre på en slik måte at den stabiliserer den proteinholdige strukturen til cellemembranen og dets orientering innenfor celleveggen, slik at membran-overflate-proteinmarkørene ikke blir ødelagte. På grunn av den kjente svake karakteren til cellemembranen til pattedyrceller, antas resultatene oppnådd ved lyofiliseringsmetoden i foreliggende oppfinnelse å være uventede og overraskende effektive når det gjelder stabilitet og lagringstiden til den lyofiliserte pattedyrcellen som blir oppnådd samt at fysiologiske funksjonelle karaktertrekk etter rehydrering sammenlignet med friske celler blir beholdt.

Foreliggende oppfinnelse vedrører følgelig en fremgangsmåte for fremstilling av lyofiliserte pattedyrceller som vil beholde cellemembran-strukturintegritet og celleoverflate-antigenisitet når rekonstituert, kjennetegnet ved at man utfører følgende trinn: Å. Samler et forutbestemt prøveantall av celler suspendert i et valgt volum av fosfatbufret albumin; B. utsetter cellesuspensjonen for sentrifugering for å oppnå en cellepellet; C. inkuberer cellepelleten i en oppløsning av trehalose i et isotonisk fluid i en forutbestemt tidsperiode ved omgivende romtemperatur for å oppnå en cellesuspensjon; D. innfører cellesuspensjonen til en beholder, avkjøler en angitt redusert temperatur og fryser dette ved omtrent -70°C i omtrent 1 time;

E. fjerner beholderen til et lyofiliseringsapparat for

en bestemt lyofiliseringscyklus; og deretter

F. lagrer beholderen som inneholder de lyofiliserte cellene ved kjøleskapstemperaturer mellom 2-8°C for påfølgende rekonstitusjon i destillert vann in situ.

Ved utførelse av foreliggende fremgangsmåte blir sukkeret trehalose i en isotonisk oppløsning anvendt som et konserveringsmiddel eller beskyttende belegg på den ytre overflaten av en pattedyrcelle. Belegging av den indre overflaten av cellemembranen vil ikke være mulig. Karaktertrekkene med god stabilitet og lagringstid som blir oppnådd, muliggjør at oppfinnelsen blir anvendt for fremstilling av kontrollceller for immunologiske analyser for anvendelse når det gjelder å forsikre riktig prøvepreparering for flow-cytometrianalyser av pattedyrceller, blodcelletelling, størrelsesberegning og analyse av undergrupper av blodcellebestanddeler, så som røde celler og hvite celler og i DNA-analyse for forskjellige celletyper. Forskjellige celletyper kan dermed bli lyofilisert og dermed rekonstituert for vellykkede biologiske celle-analyser.

I Stefi Wisburd, "Death Defying Dehydration", Science News, Vol. 133, nr. 7, s. 97-112, 13. februar 1988, er det beskrevet en fremgangsmåte for frysetørking av liposomer ved anvendelse av trehalose som beskrevet i nevnte internasjonale søknad under PCT nr. W086/03938. Publikasjonen beskrev forskning utført med mirkoorganismer og viser at trehalose, et lavmolekylvekt-sukker, ble produsert i høye konsentrasjo-ner i disse mikroorganismene når de ble dehydrert. Det ble antatt at trehalose virket som en lipidstabilisator for å øke stabiliteten til kunstige cellemembraner eller liposomer. Publikasjonen advarer at trehalose ikke behøver å være et nyttig tilsetningsstoff i alle situasjoner, og at toksikologi av trehalose kan oppstå.

Nødvendigheten av nøyaktig og pålitelig kontrollmedium som kan bli analysert samtidig med testprøvene for å realisere riktig prøveprepareringsteknikk og laboratorietestinstrument-funksjon, fortsetter. I flow-cytometriske analyser er ingen etablerte kontroller tilgjengelige med unntagelse av fluorescens-kuler eller mikrosfærer som blir anvendt for å stille flow-cytomete-ropereringsparameterne. Den mest ønskelige kontrollforbindelsen er en som kan kontrollere reagens som blir anvendt og prøvepreparatorisk teknikk sammen med riktig instrumentfunksjon. For flow-cytrometiske analyser vil konserverte pattedyrceller som uttrykker nødvendig antigenisk determinant eller determinanter som skal bli analysert sammen med cellene i testprøven presentere et optimalt kontrollmedium. Tidligere bestemte verdier for kontrollcellene kan bli sammenlignet med testresultatene oppnådd av forskere.

Naturen av den f low-cytometriske analysen for alle over-flateantigener krever en preparatorisk fremgangsmåte for kontrollceller som konserverer cellulære lysspredningsmønstre og membranintegritet med minimal skade på celleoverflateanti-genene som blir studert. Det beste sammenligningsgrunnlaget for disse faktorene vil være friske celler som har de kjente egenskapene som skal bli studert. Forflytning og lagring av friske kontrollceller i et laboratoriemiljø vil derimot være upraktisk kommersielt.

Konserverte pattedyrceller, så som ved lyofilisering som kan bli forflyttet og lagret i ønsket lagringsperiode og rekonstituert eller rehydrert ved bruk med opprettholdelse av de nødvendige karaktertrekkene for anvendelse derav, vil tilveiebringe en ønskelig kontroll for flow-cytometriske analyser.

Slike lyofiliserte pattedyrkontrollceller vil også være egnede med hematologisk analyseinstrumenter, så som Coulter Counter® blodcelleanalysator forhandlet av Coulter Electronics, Inc. og Hialeah, Florida, eiet av Coulter Corporation.

Søkerne antar at fryse-tørking av pattedyrceller for anvendelse som kontrollmedia av flere grunner ikke er blitt oppnådd vellykket. Fryseparametrene påvirker bl.a. de proteinholdige molekylene i slike celler på en negativ måte, og kan ødelegge hele membranintegriteten.

Eksperimentelt arbeid som anvender forskjellige sukkerforbindelser i kombinasjon med DMSO eller glyserol for å imøtegå de negative virkningene av intracellulær frysing ble gjennomgått. Også sukkerforbindelser alene ble anvendt i lyofiliseringsprosedyren der sukkeret ble tilsatt til lyofilisringsbæreroppløsningen, så som standard normalt geiteserum for cellene i suspensjon i løpet av nedfrysningen og lyofiliseringsprosedyren som ble anvendt. Forskjellige fortynninger av sukkerforbindelsene med og uten DMSO, fosfatbuffret albumin (PBA), fetalt kalveserum, humant AB-serum og normalt geiteserum ble forsøkt.

Eksperimenter ved anvendelse av sukrose, taurin og glukose, og DMSO med sukker som en bærer, ga alle uakseptable resultater. Innslag av reduksjon i spesifikk fluorescens for noen antigener relativt til friske celler, uakseptabel lysspredning og spesifikke fluorescenskaraktertrekk, ble bestemt når fruktose ble anvendt. Behandling av cellene ved anvendelse av slike sukkerforbindelser tilveiebragte util-fredsstillende lyofiliserte celler, slik at cellene ikke var riktig preparert for å forhindre omfattende skade i løpet av nedfrysningen. Slik skade ble uttrykt i molekylære for-andringer i cellemembranproteiner, så som konformasjonsen-dringer som vil påvirke antigenekspresjonen. Kryobeskyttende midler er nødvendig for rutinemessig å forhindre slik skade som oppstår som et resultat av økte saltkonsentrasjoner og krystalldannelse i løpet av frysing av cellene. Slike kryobeskyttende midler som DMSO og glyserol samt andre serumer, ble funnet å være lite vellykket for lyofilisering av pattedyrceller.

Anvendelse av normalt geiteserum som en matrise eller bærer der cellene er suspendert i løpet av nedfrysningen eller lyofiliseringen, tilveiebragte ikke optimal overlevelse av celleoverflatemarkør. Det var antatt at proteinet i serumet ikke beskyttet cellemembranen fra oksydasjon og andre ødeleggelser. Trehalose anvendt bare i blanding med normalt geiteserum og albumin viste seg også å være lite vellykket i å løse problemene.

Deretter ble eksperimenter utført ved anvendelse av sukkeret trehalose som del av flere bærerformler, inkludert blandinger med normalt geiteserum og albumin uten å oppnå et akseptabelt lyofilisert kontrollcellemedium. Anvendelse av sukkerforbindelser, inkludert trehalose for å stabilisere membranlipidene til cellene i løpet av lyof ilisering, viste seg å være ikke vellykket.

Fremgangsmåten innbefattet i oppfinnelsen som viste seg å være vellykket for å tilveiebringe akseptable lyofiliserte pattedyrceller, omfatter anvendelse av sukkeret trehalose i en isotonisk oppløsning for preparering av cellene for an-strengelsen ved nedfrysning og lyofiliseringsprotokollene. Lyofiliserte kontrollceller produsert ifølge oppfinnelsen, inkluderer hybridomer eller cellelinjer og perifere blod-mononukleære celler som har beholdt optimale karaktertrekk for anvendelse i flow-cytometeranalyser. En optimal trehalo- sekonsentrasjon i isotonisk oppløsning ble også bestemt med trehalose som mest akseptabelt sukker for anvendelse i fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen. Lyosfiliserte pattedyrkontrollceller og andre humane celler kan bli produsert ved nevnte lyofiliseringsfremgangsmåter.

Fremgangsmåte for produsering av lyofiliserte pattedyrceller for anvendelse som en biologisk kontroll i immunoanalyser, flow-cytometriske analyser og mikroskopiske analyser og for konservering av humane cellelinjer som har beholdt deres ønskede antigenisitet. De lyofiliserte cellene kan bli rekonstituert eller rehydrert for slikt bruk, og forbli uskadet eller negativt påvirket i deres cellemembranprotein-holdige konfigurasjon eller morfologi. Fremgangsmåten kan lyofilisere alle cellene i fysiologiske væsker og vev fra pattedyr. Noen standard prepareringsprosedyrer blir anvendt, så som oppsamling av det ønskede antallet celler som skal bli bearbeidet fra fullblod eller fra dyrkede cellelinjer, eller vev som diktert av analysen som blir utført, for en gjennomsnittlig analysekjøring og redusering av disse til en pelletform ved sentrifugering. Denne pelleten blir først suspendert i fosfatbufret albumin i en tidsperiode, og behandlet for å gjenvinne cellene i pelletform. Før lyofilisering blir cellepelleten suspendert i en oppløsning av trehalose i et isotonisk fluid preparert ved en spesifisert optimal konsentrasjon og inkubert ved romtemperatur i en gitt tidsperiode. Denne behandlingen av suspensjonen av cellene med en angitt prosent trehalose preparert i et isotonisk fluid, blir gjentatt ved romtemperatur for en angitt tidsperiode, og cellesuspensjonen blir deretter plassert i beholdere, frosset og lyofilisert i angitt tidsperiode.

Lyofiliserte celler som blir produsert på denne måten kan bli rekonstituert med en mengde destillert vann som er lik det til hele volumet av beholderen ved bruk in situ. De rekonstituerte cellene beholder deres optimale fysiologiske karaktertrekk som er egnet for anvendelse som en analytisk kontroll.

Kort beskrivelse av tegningene.

Fig. IA og IB er henholdsvis lav cytorneterhistogrammer som sammenligner en identisk frisk T-cellelinje og en T-cellelinje lyofilisert ifølge fremgangsmåten i foreliggende oppfinnelse farvet med Tll-FITC og MsIgGl-FITC-markører. Fig. 2A og fig. 2B er henholdsvis flow-cytometerhistogrammer som sammenligner en identisk B-cellelinje lyofilisert ifølge fremgangsmåten innbefattet i oppfinnelsen og en frisk B-cellelinje farvet med Bl-FITC og MsIG2a-FITC markører. Fig. 3 er et kompositt-flow-cytometerhistogram vist i fire nummererte rammer som sammenligner friske perifere blodlymfocytter og lyofiliserte perifere blodlymfocytter ved anvendelse av dobbelt farvemerkede Til og Bl monoklonale antistoffer. Fig. 4 er et kompositt-f low-cytometerhistogram vist i fire nummererte rammer som sammenligner friske og lyofiliserte perifere blodlymfocytter ved anvendelse av dobbelt farvemerkede T4 og T8 monoklonale antistoffer. Fig. 5 er en diagrammatisk presentasjon av lyofiliserings-metodetrinnene ifølge oppfinnelsen for produsering av lyofiliserte kontrollceller, cellelinjer og perifere blodlymfocytter.

En viss terminologi vil bli anvendt for å forklare resultatene av sammenligningstestene representert ved histogrammene vist i figurene 1 til og med 4. Disse termene er definert som følger: 1. "Bakgrunnsfluorescens" vil referer til fluorescens-gløden som blir avgitt fra et materiale i en prøve forskjellig fra den spesikke fluorescens-cellen som blir studert. 2. "Autofluorescens" er en type bakgrunnsfluorescens der fluorescensgløden som blir avgitt fra en celle, blir indusert av andre enn et fluorescenskjemikalie, så

som et farvestoff.

3. "Uspesifikk binding" refererer til fenomenet med at et fluorescens-kjemikal adherer til en celleoverflate ved hjelp av andre enn spesifikke metoder anvendt for

å oppnå binding til en celle.

4. "Lysspredning" refererer til fenomenet som oppstår i et flow cytometerinstrument når en innfallende stråle, så som fra en laserkilde, treffer en celle og noen av strålen blir reflektert i flere retninger og noen går igjennom cellen. Lyset som blir spredt, inkludert refleksjonsvinkelen og fluorescensen som oppstår på grunn av fluorescenskjemikaliet belagt på en celle, kan bli detektert og målt for å bestemme cellekaraktertrekk så som cellestørrelse eller volum, celleoverflateglatthet og granul-antallet og andre strukturer i cytoplasma til en celle. Disse karaktertrekkene er sammenlignbare med de til en normal

celle.

5. "Gjennomsnittlig kanal (MC)" betyr den gjennomsnitt-lige relative mengden fluorescens for cellene som

blir analysert.

6. "Prosent positive" betyr prosentandelen av analyserte celler med mere fluorescens enn bakgrunnsfluorscen-sen.

En liste av ingredienser anvendt ved utførelse av lyofili-seringsmetologien som innbefatter oppfinnelsen, er som følger: A. Fosfatbufret albuminoppløsning (PBA) omfattende 1

gram PBA i 100 ml fosfatbufret saltvann (PBS).

B. Trehaloseoppløsning som omfatter 10 gram trehalose i 100 ml av en isotonisk oppløsning. Foretrukket isotonisk oppløsning var tilgjengelig fra Coulter Electronics, Inc. under det registrerte varemerket ISOTON*-1--'- ogkarakterisertsom absolutt. C. Markøren "FITC" refererer til fluoresceinet isotio-cyanat. D. Markøren "RD1" refererer til en fykobiliprotein-fluorescentmarkør anvendt av Coulter Corporation.

Med referanse til fig. 5, er metodologien for å utføre oppfinnelsen beskrevet generelt. Pattedyrceller som korre-sponderer med subjektcellene som skal bli analysert blir samlet enten fra fullblod eller fra dyrkede cellelinjer eller vev, som diktert av analysen. For en gjennomsnittlig analysekjøring blir 30 x 10^ celler samlet og suspendert i en 15é PBS-oppløsning ved 4-8 °C. Suspenderte celler blir sentrifugert ved 1500 RPM i omtrent 10 minutter ved romtemperatur. Supernatanten blir dekantert og cellepelleten suspendert i en 10$ trehaloseoppløsning preparert i en isoton væske så som ISOTON® og inkubert ved romtemperatur i ti minutter, eller ved 2-8"C i ti minutter for optimale hensikter. Suspensjonen blir deretter sentrifugert ved 1500 RPM i ti minutter ved 4-8°C, og den resulterende pelleten blir påny suspendert i 10$ trehaloseoppløsing preparert i ISOTON®, bl.a. ved 4-8°C. Trehalosebehandlet cellesuspensjon blir plassert i lyofiliseringsbeholdere ved 300 ul oppløsning pr. beholder, og beholderne blir satt lokk på og avkjølt til 4°C og deretter agitert for å forsikre jevn og glatt dispersjon av cellene før de blir plassert i en fryser ved-70°C i minst én (1) time. Etter endt (1) time i fryseren, blir beholderne øyeblikkelig plassert i en lyofiliseringsap-paratur i en periode på omtrent femten (15) timer.

De lyofiliserte beholderne blir fjernet fra lyofiliseringsap-paratet etter endt femten (15) timers cyklus og lagret mellom 2-8°C. For rekonstituering blir beholderen fylt til 300 ul volumet ved anvendelse av destillert eller deionisert vann. For å utføre en kontrollcelleanalyse på et flow-cytometer blir de resuspenderte cellene farvet og deretter analysert ved standard flow-cytometerprosedyrer. Slike kontrollceller kan selvfølgelig bli anvendt i andre analysetyper eller andre egnede diagnostiske protokoller.

Effektiviteten til de lyofiliserte cellene produsert ved fremgangsmåten innbefattet i oppfinnelsen, vil fremkomme fra den detaljerte diskusjonen med referanse til flow-cytometerhistogrammer av tegningene fig. 1 til og med 4 som følger: Illustrert i figurene IA og IB flow-cytometerhistogrammer, der identiske friske og lyofiliserte T-cellelinjer identifisert som PB 44, ble farvet og sammenlignet i et EPIC® flow-cytometer forhandlet av Coulter Corporation of Hialeah, Florida. To separate mengder av PB 44 T-celler ble preparert med to ukers mellomrom og ble lyofilisert i henhold til metodologien i denne oppfinnelsen. Cellene ble rekonstituert eller rehydrert ved anvendelse av deionisert vann og farvet med celleoverflatemarkører ved anvendelse av farvet monoklonalt antistoff MsIgGl-FITC og det farvede monoklonale antistoffet Tll-FITC, tilgjengelig fra Coulter Corporation under registrert varemerke COULTER CLONE®. Fremgangsmåten for direkte immunofluorescens-celleoverflatefarving som blir anvendt, er beskrevet i detalj i en "Coulter Procedures Book", side 4 tilgjengelig fra Coulter Corporation. Etter farving ble disse rekonstituerte lyofiliserte cellene analysert i et EPICS® flow-cytometer for å bestemme prosent positivitet og relativ mengde av gjennomsnittlig kanalfluorescens for hvert antistoff. Friske dyrkede PB 44 T-celler oppnådd på samme dag som analysen ble utført, ble analysert og likeledes analysert for sammenligning av resultatene med de til de analyserte farvede lyofiliserte cellene. Histogram-resultatene er som følger: PB 44 T- cellen

Prosent reaktivltet på lyofiliserte T-celler var ekvivalent med det til friske T-celler som ble analysert. Gjennomsnittlig cellefluorescens i hvert tilfelle var også vesentlig ekvivalent, idet det lille avviket på 84 til 92 ikke er tilstrekkelig for å interferere med akseptable analyse-resultater. Den innlysende likheten mellom histogrammet ifølge fig. IA for friske T-celler og histogrammet ifølge fig. IB for lyofiliserte T-celler, er å bemerke. Lyofiliseringsmetoden innbefattet i oppfinnelsen tilveiebringer klart de ønskelige fordelene med oppfinnelsen.

Ytterligere analyser på EPICS® flow-cytometer ved anvendelse av en serie COULTER CLONE® monoklonale antistoffer med friske og lyofiliserte T-celler av PB 44 cellelinjen, ble utført. Fremgangsmåten for fremstilling av de farvede cellene som ble anvendt, var som tidligere beskrevet. Resultatene av de ytterligere analysene var som følger:

PB 44 T- celle- resultater

Prosent reaktivitet på lyofiliserte PB 44 celler var vesentlig ekvivalent med det til friske celler for hver av de undersøkte antistoffene. I tillegg, gjennomsnittlig kanalver-dier som angir et mål på relativ fluorescens-intensitet til de farvede cellene, var like for lyofiliserte som friske celler. I noen tilfeller utviste de lyofiliserte cellene en større grad av uspesifikk fluorescens vurdert ved farving med IgGl-FITC isotypkontroll. Denne fluorescensgraden er derimot på grunn av dets lave intensitet betraktet som utilstrekkelig for å interferere med akseptable analysefortolkninger.

I figurene 2A og 2B er flow-cytometriske histogrammer illustrert, der en identisk frisk og lyofilisert B-cellelinje identifisert som PB 11 ble farvet og sammenlignet i et EPICS® flow-cytometer ved anvendelse av Bl-FITC. To separate mengder PB 11 B-celler preparert to uker fra hverandre ble lyofilisert i henhold til oppfinnelsen. Cellene ble rehydrert ved anvendelse av deionisert vann og farvet med Bl-FITC og B4- FITC cellemarkører, også tilgjengelig fra Coulter Corporation under varemerket "COULTER CLONE". Farveprosedyren var den samme som beskrevet med hensyn på figurene IA og IB. Etter farving ble de rehydrerte lyofiliserte cellene analysert i EPICS® instrument for å bestemme prosent positivitet og relativ mengde gjennomsnittlig kanalfluorescens for hvert antistoff. Friske PB 11 B-celler, oppnådd fra dyrkningsbe-holdere på samme dag som analysen ble utført på, ble analysert og analysert likt for sammenligning av data med de til analysefarvede lyofiliserte celler. Resultatene av Bl-FITC og B4-FITC data er som følger:

PB 11 B- celler

Prosent reaktivitet og gjennomsnittlig kanalfluorescens på lyofiliserte B-celler, var ekvivalent som for friske celler. Lyofiliserte celler utviste en større grad av uspesifikk fluorescens i isotypekontrollen, men dette er forårsaket av uspesifikk bakgrunnsfarving observert med denne cellelinjen på en dag-til-dag-basis. Denne grad av uspesifikk fluorescens interfererer ikke med analysefortolkningene på grunn av dets lave intensitet.

Med referanse til fig. 3, sammenligner kompositt-flow-cytometerhistogrammet, angitt i fire rammer, betegnet med tallene 1), 2), 3) og 4) friske perifere blodlymfocytter (PBLS) og lyofiliserte blodlymfocytter ved anvendelse av dobbel farve Til og Bl COULTER CLONE® monoklonale antistoffer. Cellene ble separert ved Ficoll-Hypaque® standard-metodologi. Lyofilisering og farving av cellene var i samsvar med slike prosedyrer som tidligere er beskrevet, og cellene ble analysert. Konkluderte resultater var som følger: Prosent reaktivitet av lyofiliserte prepareringer av perifere blodlymfocytter var vesentlig ekvivalent med den til friske PBLS for hvert antistoff som ble testet. Gjennomsnittlig kanalfluorescens var også vesentlig ekvivalent.

Med referanse til figur 4, sammenligner kompositt-flow-cytometrihistogrammet vist i fire nummererte rammer, friske og lyofiliserte perifere blodlymfocytter (PBLS) ved anvendelse av dobbeltfarvede T4 og T8 COULTER CLONE® monoklonale antistoffer. De samme preparatoriske prosedyrene som beskrevet for figur 3, ble anvendt i disse analysene. Konkluderte resultater var som følger:

Prosent reaktivitet til lyofiliserte PBLS var vesentlig ekvivalent med det til friske PBLS for hver av de undersøkte monoklonale antistoffene. Gjennomsnittlig kanalfluorescens var også vesentlig ekvivalent for begge typene av PBLS, til tross for at T8 farvet monoklonalt antistoff på lyofiliserte PBLS var noe redusert, men dette intefererte ikke med analysene eller sammenligningen.

Lagringstidstester ble utført der lyofiliserte pattedyrceller ble lagret i et kjøleskap ved mellom 2-8°C. Resultatene oppnådd fra denne studien viste virkelig tidsstabilitet på det lyofiliserte produktet i overskudd av fem (5) måneder.

To stabiliserte prepareringer av humane T og B celler lyofilisert i henhold til oppfinnelsen, ble testet i EPICS® f low-cytometer for å bekrefte grad av deres strukturelle preservering sammenlignet med friske human T og B cellepre-pareringer. En blanding bestod av 80$ T-celler og 20% B-celler, og den andre blandingen bestod av 50% av hver av T og B-cellene. De lyofiliserte cellene ble rekonstituert med destillert vann og deres lysspredningsmønstre på flow-cytometre ble illustrert, dvs. forover-vinkel-lysspredning (FALS) og 90 lysspredning. Det samme lysspredningstest-mønsteret ble illustrert for tilsvarende prepareringer av friske T og B-celler i EPICS® flow-cytometer. De illustrerte testresultatene viste at lysspredningsmønstrene til de lyofiliserte celleblandingene var lik de til tilsvarende friske celleblandinger og dette tyder på god strukturell konservering av lyofiliserte celler.

Testene viser også at celleoverflate-antigenisiteten til cellene ikke var dårligere. COULTER CLONE® monoklonale antistoffer, egnede for farving, ble anvendt som omfattet T4, T8, Til, Bl, B4, 12 og 4B4 monoklonaler.

En serie tester ble utført der lyofiliserte celler ble positivt farvet og testet i et EPIC® flow-cytometer som biologiske kontroller for DNA-analyse. Friske og lyofiliserte celler ble farvet og testet for å analysere for cellecyklus-utvikling i friske og lyofiliserte cellepopulasjoner.

Friske og lyofiliserte celler ble oppnådd på forskjellige dager og fra forskjellige givere (betegnet PBL), og forskjellige kulturer betegnet PB11 og PB44 ble oppnådd. De illustrerte resultatene av de testene viser egnetheten av de lyofiliserte cellene for anvendelse som kontrollceller for cellecyklusanalyse. Noen avvik i cellecyklusanalyse mellom friske og lyofiliserte cellesammenligninger kan være på grunn av forskjeller i tidsperioder for oppnåelse av cellene som blir testet.

Fra sammenligningsanalysene mellom celler lyofilisert ifølge oppfinnelsen og tilsvarende friske celler, kan følgende konklusjoner oppnås: 1. Disse lyofiliserte cellene kan bli anvendt for in vitro-diagnostisk analyse i kvalitetskontroll av

flow-cytometriprosedyrer.

2. Disse lyofiliserte cellene kan virke som positivt farvede biologiske kontroller for celleoverflate-markøranalyser ved flow-cytometerinstrumentering. I disse funksjonene kan de bli anvendt for å vurdere reagensintegritet, prøveprepareringsteknikk og riktig flow-cytometer-funksjon. De kan virke som cellekontroller for spesialiserte paneler av monoklonale antistoffer overfor cellulære akti-veringsantigener og leukemiantigener. De kan virke som standarder ved kvantifisering av antigentetthet

på celleoverflatene.

3. Disse lyofiliserte cellene kan virke som positivt farvede biologiske kontroller for DNA-analyse for å vurdere reagensintegritet, prøveprepareringsteknikk og riktig flow-cytometerfunksjon. De kan også virke som standarder for cellecyklusanalyser av cellepopulasjoner.

Det antas at den beholdt morfologien og celleoverflate-antigenisiteten til disse lyofiliserte cellene vil muliggjøre anvendelse derav også som kontrollceller i andre analysetyper, så som ELISA og mikroskopitype. Det antas at cellene fremstilt ved lyofiliseringsfremgangsmåten ifølge oppfinnelsen, kan bli anvendt for immunoanalyse av alle normale og unormale pattedyrceller så som cancer-celler. Dette er tilfelle dersom analysemediet, så som et monoklonalt antistoff, er tilgjengelig for deteksjon for å fullføre analysen. Lyofiliseringsmetoden innbefattet i oppfinnelsen kan også produsere lyofiliserte kontrollceller egnede for anvendelse for hematologiske partikkelanalyser. Vevs-celler kan også bli konservert ifølge fremgangsmåten i. foreliggende oppfinnelse.

Et antall fordeler kan oppnås ved anvendelse av disse lyofiliserte kontrollcellene i flow-cytometri sammenlignet med anvendelsen av fluorescenskuler eller mikrosfærer som tidligere. Fluorescensmikrosfærer er ikke egnede for anvendelse som en kontroll for prøvepreparering, er ikke nyttige for valg av riktige flow-cytometeroppsett for lysspredningsanalyser av cellene, og der fluorescens er intracellulær og ikke på celleoverflaten. De lyofiliserte cellene er mere strukturelt like friske celler analysert ved flow-cytometriske prosedyrer.

Konserverte celler lyofilisert ifølge denne oppfinnelsen krever ikke absolutte lagringsbetingelser eller omfattende håndteringsprosedyrer for rehydrering som oppstår for normale perifere blodceller (PBL) konservert ved anvendelse av kryobeskyttende midler og lagret ved lette nitrogentempera-turer.

Claims

1. Fremgangsmåte for fremstilling av lyofiliserte pattedyrceller som vil beholde cellemembran-strukturintegritet og celle-overf lateantigenisitet når rekonstituert,karakterisert vedat man utfører følgende trinn: A. Samler et forutbestemt prøveantall av celler suspendert i et valgt volum av fosfatbufret albumin; B. utsetter cellesuspensjonen for sentrifugering for å oppnå en cellepellet; C. inkuberer cellepelleten i en oppløsning av trehalose i et isotonisk fluid i en forutbestemt tidsperiode ved omgivende romtemperatur for å oppnå en cellesuspensjon; D. innfører cellesuspensjonen til en beholder, avkjøler en angitt redusert temperatur og fryser dette ved omtrent -70°C i omtrent 1 time; E. fjerner beholderen til et lyofiliseringsapparat for en bestemt lyofiliseringscyklus; og deretter F. lagrer beholderen som inneholder de lyofiliserte cellene ved kjøleskapstemperaturer mellom 2-8°C for påfølgende rekonstitusjon i destillert vann in situ.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisertved at cellesuspensjonen avledet fra trinn B først blir utsatt for trinn B for å produsere en cellepellet og cellepelleten blir igjen behandlet under prosedyren ifølge trinn C før den resulterende cellesuspensjonen utsettes for trinn D.

3. Fremgangsmåte ifølge kravene 1 eller 2,karakterisert vedat man inkuberer i 10$ trehalose i isotonisk oppløsning.

4. Fremgangsmåte ifølge kravene 1 eller 2,karakterisert vedat cellepelleten suspenderes i fosfatbufret albumin i 1 time ved 4°C.

5. Fremgangsmåte ifølge krav 3,karakterisertved at cellepelleten inkuberes i 10$ trehalose isotonisk oppløsning i omtrent 30 minutter ved omgivende romtemperatur.

6. Fremgangsmåte ifølge kravene 1 eller 2,karakterisert vedat lyofiliseringscyklusen som anvendes er på omtrent 15 timer.