NO179894B

NO179894B - Fremgangsmåte ved fremstilling av procyanidololigomerer

Info

Publication number: NO179894B
Application number: NO892673A
Authority: NO
Inventors: Enrico Frangi; Marco Bertani; Giuseppe Mustich; Gianfranco Tuccini
Original assignee: Tecnofarmaci Spa; Indena Spa
Priority date: 1988-06-28
Filing date: 1989-06-27
Publication date: 1996-09-30
Also published as: CA1337565C; EP0348781B1; JPH0248593A; JP2799734B2; FI893117A; FI893117A0; PT90990A; PT90990B; NO179894C; FI92976C; GR3006066T3; NO892673D0; FI92976B; ATE81014T1; EP0348781A3; EP0348781A2; IT8821134A0; IT1219732B; DE68903056T2; NO892673L

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører fremgangsmåte ved fremstilling av vegetabilske ekstrakter av den art som er angitt i krav l's ingress.

Ekstraktene fra Vitis vinifera druekjerner som inneholder nevnte oligomerer, er allerede blitt brukt i terapien, især som vasobeskyttere ved behandling av lidelser i den retinale eller koroidale sirkulasjon og av venolymfatiske lidelser; det har vist seg at de øker motstanden i kar og kapillarer og minsker permeabiliteten i dem.

Procyanidololigomerer er polyfenoler som avledes fra flavanoler, som man får ved oksydativ kondensasjon av forskjellige flavanoliske enheter som kan være like eller forskjellige, især ved kondensasjon av (+)-katekin, epi-katekin og gallokatekin. De finnes i forskjellige vegeta-bilier såsom vinranker, epletre, strandfuru, hagtorn, kinatre, eukalyptus.

Ekstraktene som er fremstilt i henhold til fremgangsmåter som er kjent i faget, især de som er beskrevet i FR-A-2,092,743 og FR-A-2,372,823 angående Vitis vinifera eller de som er beskrevet i FR 1,427,100 og i US patent 4,698,360 som angår strandfuru, har vist seg å inneholde, i tillegg til oligomerene med polymerisasjonsgrad 2 til 5, kondensasjonsderivater med høyere molekylvekt, til tross for behandling med en natriumkloridmettet vandig løsning, og fremfor alt monomerer i den ikke ubetydelige andel av 20 til 3 0 vektprosent. Disse sistnevnte betrak-tes som uønskede substanser.

Ekstraktene fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse som erholdes ved en egnet behandling av ekstraktene som er kjent ifølge teknikkens stand, inneholder mindre enn 1,5 vektprosent av monomerer og viser en høyere farmakologisk aktivitet enn utgangsekstraktene siden de anrikes i den procyanidololigomeriske fraksjon.

Skjønt flere fremgangsmåter for å ekstrahere flavanoliske oligomerer eller lignende substanser som fins i vegetabilske materialer, er blitt beskrevet se f.eks. FR pa-tenter 968,589, 1,03 6,922 og 1,427,100 og GB patent 1,541,469 er det ikke nærliggende å få i industriskala og med økonomisk akseptable utbytter ekstrakter som er nesten fri fra monomerer, uten betraktelige tap eller end-ringer i dimerene og de andre oligomerene, hvis fysiko-kjemiske egenskaper er meget like. Ved fremgangsmåte ifølge foreliggende oppfinnelse overvinnes denne vanske-lighet for første gang.

Oppfinnelsen er særpreget ved det som er angitt i krav l's karakteriserende del. Ytterligere trekk fremgår av kravene 2-6.

I henhold til foreliggende oppfinnelse separeres monomerene enten ved ultrafiltrering av en vandig løsning av ekstraktene erholdt i henhold til konvensjonelle fremgangsmåter på membraner med en uteslutningsgrense på 600-3 000, eller ved selektiv ekstrahering av ovennevnte ekstrakter med en eter, såsom metyl-tert-butyleter eller med en vannuløselig blanding av en alifatisk ester, såsom etylacetat eller amylacetat eller en eter, såsom metyl-tert-butyleter med et aromatisk hydrokarbon, såsom benzen eller toluen.

Generelt karakteriseres fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen ved følgende trinn: A) Ekstahering av det vegetabilske materiale med blandinger av vann med aceton, metanol eller andre alkoholer til det ikke er mer igjen av katekinderivatene; 80% vandig aceton ble valgt som løsningsmiddel. B) Konsentrering av løsningsmiddelet ved inndamping under vakuum til en vekt som er ca 50 vektprosent av utgangsvekten av det vegetabilske materialet. C) Filtrering av konsentratet fra trinn B), eventuelt etter at det hadde stått i kjøleskap i 24 timer, for å fjerne enhver oljeaktig og garvesur polymerrest. D) Ultrafiltrering av konsentratet fra trinn C) under nitrogenatmosfære gjennom rørformede eller kapilare membraner med cut-off 100 000 til 1 000. E) Ultrafiltering av permeatet fra trinn D), fra hvilket de høymolekylære substanser er blitt fjernet, gjennom spiralformede membraner med cut-off 3 000 til 600.

P) Valgfri videre fraksjonering av permeatet fra trinn E) ved ultrafiltrering idet man begrenser membranenes cut-off, i henhold til fremgangsmåte som er beskrevet i det følgende, eller man underkaster permeatet fraksjonering med selektive organiske løsningsmidler.

Permeatet fra trinn D) ovenfor inneholder før de avslut-tende rensinger (hvordan de enn utføres) fremdeles monomere substanser, i tilfellet Vitis vinifera (+)-katekin °9 (-)-epikatekin og i lavere mengder uønskede polymere substanser. For å få en god demonomeriseringsgrad innebæ-rer den mest bekvemme fremgangsmåte en videre ultrafiltrering på spiralformede membraner med cut-off 600 til 3 000 og tilbake-ekstrahering av konsentratet med etylacetat. Det endelige produkt som er demonomerisert og uten garvesyre, oppnås ved inndampning av den organiske fase til redusert volum og oppløsning av konsentratet i kloroform eller andre klorinerte løsningsmidler, såsom metylenklorid, dikloretan etc. Alternativt kan vannfasen fra trinn C) ekstraheres med etylacetat, og residuet fra den organiske fase underkastet, etter oppløsning med vann, membranfremgangsmåten fra trinn D) og/eller E). Den vandige løsning fra trinn C) som er regulert til en konsentrasjon på 10-50% kan ekstraheres med løsningsblandin-ger som består av etylacetat/toluen eller andre aromatiske hydrokarboner, i forholdet 5-9 deler av det første løsningsmiddel og 5-1 deler av det andre. Ekstraheringen fortsettes med nevnte blandinger inntil det ikke finnes mer igjen av de monomere substanser. Etter at man har oppnådd et egnet forhold mellom de to løsningsmidler, basert på fordelings koeffisientene, tilbake-ekstraheres den organiske fase med vann for å gjenvinne mengden av dimeriske forbindelser som tilfeldigvis er blitt ekstrahert ved ko-oppløsning. De kombinerte vannfaser ekstraheres med rent etylacetat, den organiske fase inndampes under vakuum til redusert sluttvolum, og konsentratet felles i et klorinert løsningsmiddel.

Alternativt kan blandingene av etylacetat med hydrokarboner med fordel erstattes av andre estere, såsom iso-propylacetat, amylacetat, etylformiat etc, eller alifatiske etere, og metyl-tert-butyleter er foretrukket. Estere samt etere fjerner selektivt uønskede monomere fraksjoner i tillegg til ethvert lypofilt materiale som vanligvis finnes i vegetabilske ekstrakter. Den påfølgen-de ekstrahering med etylacetat er selektiv for de oligomere substanser og ikke for de polymere, hvorved man i henhold til en av de ovenstående fremgangsmåter erholder et produkt som er praktisk talt fritt for monomere, som kan være allergeniske, samt for polymere som har en garv-ende virkning hvilket er irriterende for slimhinnene.

Ved å benytte seg av selektiviteten hos ovennevnte løs-ningsmidler og blandinger derav kan man fremstille ekstrakter som har de samme kjemiske egenskaper, ved å utfø-re fraksjoneringen ved hjelp av en fast matrise som selektivt absorberer fenolderivatene som kan reelueres fra nevnte matrise etter homogene klasser.

En polystyrenharpiks, såsom Amberlites® eller fortrinnsvis et Duolite® S-761 kan brukes som fast matrise. I henhold til denne fremgangsmåte får løsningen fra trinn C) renne gjennom en kolonne med den valgte harpiks, og man bruker 0,5 liter harpiks for hvert 10g tørrsubstans i løsningen. Når absorbsjonen av startløsningen er over, vaskes harpiksen grundig med vann for å fjerne fullstendig salter, sukkere, organiske syrer og høypolymere fraksjoner, som fjernes på grunn av den steriske hindring. Vasking av harpiksen fortsetter med en blanding av etylacetat og alifatiske eller aromatiske hydrokarboner, fortrinnsvis i forholdet 7:3, til de monomere substanser er fullstendig fjernet. Ekstraktet fremstilt ifølge oppfinnelsen erholdes etter påfølgende eluering med vandig metanol eller vandig aceton, og det resulterende eluat befries for metanol eller aceton. Det vandige konsentrat ekstraheres i henhold til ovenstående fremgangsmåte med etylacetat, og residuet felles etter konsentrering ved hjelp av klorinerte løsningsmidler.

Ekstraktet man får i henhold til ovennevnte fremgangsmåter, viser i sammenligning med tidligere kjente ekstrakter, en perfekt toleranse og en meget god aktivitet over-for sykdommer som er forbundet med det kardiovaskulære system og den ytre og indre blodstrøm. Dette ekstrakt er egnet for tilsetning til alle vanlige flytende og faste farmasøytiske formuleringer.

Følgende eksempler illustrerer oppfinnelsen mer detal-jert.

Eksempel 1

Fremstilling av det demonomeriserte ekstrakt utgående fra tørre druekjerner fra Vitis vinifera .

100 kg Vitis vinifera-druekjerner gjennombløtes i 150 1 aceton som inneholder 20% vann, ved værelsestemperatur. Ekstraheringsløsningen filtreres, og ekstraheringen gjen-tas 4 ganger til eller til det ikke finnes mer igjen av fenoderivater, idet man kontrollerer med FeCl3 en alikvot fra det siste ekstrakt og bekrefter av den tørre rest er mindre enn 0,05%. Hydroacetonløsningene kombineres, og acetonet dampes bort ved destillering under vakuum inntil det organiske løsningsmiddel er fullstendig fjernet.

Iløpet av den siste konsentrering danner det seg en stor felling som etter å ha stått i kjøleskap ved 4°C i 24 timer, sentrifugeres. Dette faste stoff omfatter lipofile produkter og høyt polymeriserte garvestoffer. Den vandige løsning (43 1) innstilles til pH 6 med 40% NaOH, under nitrogen og ultrafiltreres på en rørformet membran med cut-off 100 000 Emichem (UF-100F), ved en temperatur under 20°C og dialyseres med 57 1 vann. Permeatet, fra hvilket polymerene er blitt fjernet, blir surgjort med 25% og H2S04 til pH 3,5 og konsentreres ved revers osmose med spiralformet membran Desal B241-111 til 30% tørr-stoff. Det vandige konsentrat ekstraheres kontinuerlig med en etylacetat:toluen 8:2 (v/v) blanding ved hjelp av en væske/væskesentrifugeseparator inntil det ikke er mer igjen av de monomere substanser. Løsningen som er befridd for de monomere substanser, ekstraheres kontinuerlig med etylacetat inntil det ikke er mer igjen av oligomere. Den organiske fase konsentreres under vakuum til 1,5 1 og felles med 4,5 1 metylenklorid. Produktet sentrifugeres, og etter tørking i 24 t ved 50°C under vakuum veide det 0,42 kg. Dette rensede ekstrakt inneholder de monomere substanser i en mengde som er mindre enn 1%.

Eksempel 2

100 kg Vitis vinifera-druekjerner ekstaheres i henhold til fremgangsmåten i eksempel 1. Permeatet surgjøres etter ultrafiltrering på en rørformet membran med cut-off 100 000 (Enichem UF-100F) til pH 3,5 og ultrafiltreres på en spiralformet membran Desal U20-G20, og løsningen dialyseres med 20 volumdeler vann med hensyn til utgangs-volumet. Konsentratet, (fra hvilket de monomere substanser er blitt fjernet) konsentreres ytterligere til 30% tørrstoff. Det vandige konsentrat ekstraheres med etylacetat til det ikke finnes mer igjen av oligomerene. Den organiske fase helles etter konsentrering til 1,5 1 i 4,5 1 metylenklorid. De utfelte oligomere filtreres og tørkes

ved 50°C i 24 timer, og man får 0,45 kg av det samme sluttprodukt som i eksempel 1.

Eksempel 3

100 kg Vitis vinifera-druekjerner ekstraheres i henhold til fremgangsmåten i eksempel 1. Etter sentrifugering av de uønskede polymere substrater ekstraheres vannfasen kontinuerlig med etylacetat i væske/væskesentrifuge-separator, inntil det ikke fins mer igjen av fenolsub-stansene som skal ekstraheres. Den organiske fase konsentreres idet man tilsetter demineralisert vann for å fjerne løsningsmiddelet og for et sluttvolum på 150 1.

Den vandige løsning med pH 3,5 kan enten utsettes for behandling ifølge eksempel 1 idet man bruker rørformede membraner med cut-off 100 000 og reversosmose, eller for en behandling i henhold til fremgangsmåten i eksempel 2, med en membran med cut-off 100 000 og en spiralformet membran Desal U20-G20. De konsentrerte vannfaser behandles i henhold til fremgangsmåtene i eksemplene 1 og 2.

Eksempel 4

100 kg Vitis vinifera-druekjerner ekstraheres i henhold til fremgangsmåten i eksempel 1. Etter å ha filtrert av de uønskede polymere fraksjoner ekstraheres vannfasen kontinuerlig med etylacetat inntil det ikke er mer igjen av polyfenolene som skal ekstraheres med nevnte løsnings-middel. Den organiske fase konsentreres til en pastalignende konsistens, og residuen oppløses i 20 1 vann, og man fjerner det gjenværende løsningsmiddel under vakuum. Den vandige løsning absorberes på en kolonne som inneholder 3 0 1 polystyrenharpiks Duolite S-761, og man fortsetter elueringen inntil man får et nesten misfarget vann. Elueringen fortsetter med en blanding av etylacetat/- toluen 7:3 til all monomersubstans er fjernet, idet man

kontrollerer reaksjonen ved hjelp av tynnsjiktskromato-grafi og bruker butylacetat/eddiksyre/maursyre/vann 8:1:1:1 som elueringsmiddel og klorsulfonsyre i eddiksyre som fremkaller. Den oligomere fraksjon erholdes ved å fortsette elueringen med praktisk talt ren etylacetat. Den organiske løsning som inneholder til størstedelen dimere, trimere og tetramere substanser, konsentreres til 1 1 og helles i 3 1 metylenklorid. Etter filtrering og tørking får man 210 g av et produkt som inneholder monomere i en mengde av mindre 0,1%.

Alternativt vaskes kolonnen med metanol istedet for rent etylacetat. Alkoholfasen konsentreres til et lite volum og residuet fortynnes med 3 0 1 vann. Vannfasen tilbake-ekstraheres med etylacetat, og man følger fremgangsmåten i eksemplene 1 og 2 for å få produktet. I dette tilfellet får man 405 g produktet hvilket er nesten samme som beskrevet ovenfor.

Eksempel 5

100 kg Vitis vinifera-druekjerner ekstraheres i henhold til fremgangsmåten i eksempel 1. Etter sentrifugering av de polymere substanser fortynnes vannfasen som har en tørrsubstans på ca 8%, til en tørrsubstans på 5% og krom-atograferes på en kolonne som inneholder 50 1 Duolite S-761, i det man vasker grundig med ca 500 1 vann for å fullstendig fjerne salter og sukkere som er tilstede i store mengder i ekstraktet. Deretter utfører man rensin-gen av oligomerene som i eksempel 4 vasker kolonnen først etylacetat/toluen, deretter med etanol. Etter felling med metylenklorid får man 443 g av den oligomere fraksjon hvilket er det samme som er oppnådd i de andre eksempler.

Eksempel 6

100 kg Vitis vinifera-druekjerner ekstraheres i henhold

til fremgangsmåten i eksempel 1. Etter å ha filtrert av det polymere materialet ekstraheres vannløsningen med 10 x 50 1 porsjoner av en blandingen av etylacetat/toluen 8:2. Den organiske fase som inneholder fettlignende materiale og monomerer, vaskes tilbake med 100 1 vann. De kombinerte vannfaser ekstraheres med 10 x 50 1 porsjoner etylacetat som er mettet med vann, den organiske fase konsentreres til pastalignende konsistens, og residuet tas opp i 7 1 vann, og det gjenværende løsningsmiddelet inndampes under vakuum. Den lett grumsede vannløsning behandles med 750 g natriumklorid. En felling dannes som filtreres etter at den har stått i kjøleskap i 24 timer. Filtratet ekstraheres med 10 x 7 1 porsjoner etylacetat. Den organiske fase konsentreres til l 1 og konsentratet helles i 3 1 metylenklorid. Etter filtrering og tørking i henhold til fremgangsmåtene som er beskrevet i ovenfor-nevnte eksempler får man 402 g av sluttproduktet hvilket er det samme som beskrevet tidligere.

Eksempel 7

100 kg Vitis vinifera-druekjerner ekstraheres i henhold til fremgangsmåten i eksempel 2. Permeatet fra den spiralformede membran Desal U20-G20 fra eksempel 2 og/eller den vandige løsning som man har fått med etylacetat/- toluen 8:2 blandinger i henhold til fremgangsmåten i eksempel 1, ultrafiltreres på en spiralformet membran U2 0-G5 etter konsentrering til et pastalignende residium og oppløsning i vann. Den konsentrerte vannløsning er etter dialyse nesten fri for monomere og inneholder oligomerene som ekstraheres med etylacetat. Den organiske løsning konsentreres til 0,1 1 og felles med 0,5 1 metylenklorid.

Man får 3,81 g av et produkt som inneholder 38% dimere substanser og 1% monomere katekiner.

Claims

1. Fremgangsmåte ved fremstilling av vegetabilske ekstrakter inneholdende procyanidol-oligomerer og mindre enn 1,5 vektprosent flavanolmonomerer, karakterisert ved følgende trinn: A) ekstraksjon av plantematerialet med blandinger av vann med aceton, metanol eller andre alkoholer inntil katekinderivatene er ekstrahert; B) konsentrasjon av løsningsmiddelet ved avdunstning under vakuum til en vekt på ca 50% av plantematerialets utgangsvekt; C) filtrering av konsentratet fra trinn B) for å fjerne eventuelle oljeaktige og garvesure polymerrester; D) ultrafiltrering av konsentratet fra trinn C) på membraner med en uteslutningsgrense på 100000-1000, E) ultrafiltrering av konsentratet fra trinn D), fra hvilket høymolekylære substanser er fjernet ved membraner med en uteslutningsgrense på 3000-600; F) valgbar videre fraksjonering av permeatet fra trinn E) ved ultrafiltrering ved å begrense uteslutningsgrensen av membranene i samsvar med de nedenfor nevnte fremgangsmåter eller ved å utsette permeatet for fraksjonering med selektive organiske løsningsmidler; D2) alternativt kan vannløsningen fra trinn C) ekstraheres med etylacetat, og resten fra den organiske fase kan etter substitusjon med vann utsettes for membran-prosessene ifølge trinnene D) og/eller E); eller D3) vannløsningen fra trinn C), som er justert til en konsentrasjon på 10-50%, kan ekstraheres med i vann ikke-blandbare løsningsmiddelblandinger av en alifatisk ester og et aromatisk hydrokarbon eller en passende eter, og ekstraksjon av vannfasen med ren etylacetat; G) avdunstning av den organiske fase til et mindre volum og insolubilisering av konsentratet med klorerte løs-ningsmidler.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at det anvendes membraner med en uteslutningsgrense på 3 000-600 for å fjerne monomerene.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1 og 2, karakterisert ved at for ultrafiltrerin-gen anvendes rørformede, kapillarformede, spiralformede eller plane membraner.

4. Fremgangsmåte ifølge krav 1 til 3, karakterisert ved at permeatet fra ultra-filtreringen konsentreres, og deretter ekstraheres det fullstendig med etylacetat, hvoretter oligomerene til-slutt gjenvinnes fra den organiske fase ved å konsentrere den og utfelle med klorerte hydrokarboner.

5. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at ekstraksjonsløs-ningsmiddelet fra trinn D3 består av 5-9 volumdeler etylacetat og 5-1 volumdeler toluen.

6. Fremgangsmåte ifølge krav 1 og 5, karakterisert ved at ekstraksjonen i trinn D3 utføres ved eluering av flavanolekstraktet, som er avsatt på en kromatografisk kolonne, med ovennevnte løsningsmiddel.