FI92976C

FI92976C - Menetelmät prosyanidolin oligomeerifraktioiden valmistamiseksi

Info

Publication number: FI92976C
Application number: FI893117A
Authority: FI
Inventors: Enrico Frangi; Marco Bertani; Giuseppe Mustich; Gianfranco Tuccini
Original assignee: Indena Spa; Tecnofarmaci Spa
Priority date: 1988-06-28
Filing date: 1989-06-27
Publication date: 1995-02-10
Also published as: NO179894B; NO892673D0; NO892673L; IT8821134A0; EP0348781A2; EP0348781A3; GR3006066T3; ATE81014T1; CA1337565C; IT1219732B; DE68903056D1; ES2052819T3; FI92976B; JPH0248593A; EP0348781B1; DE68903056T2; FI893117A; PT90990A; NO179894C; PT90990B

Description

92976

Menetelmät prosyanidolin oligomeerifraktioiden valmistamiseksi Förfaranden för framställning av oligomeriska procyanidolfraktioner 5

Keksinnön kohteena on menetelmä vitis vinifera -rypäleiden siemenistä 10 uutettujen, alle 1,5 paino-% flavanolimonomeereja sisältävien prosyani-dolioligomeerien valmistamiseksi.

Vitis vinifera-rypäleiden siemenistä saatuja, mainittuja oligomeereja sisältäviä uutteita ollaan jo käytetty hoitomenetelmissä, erityisesti 15 verisuonien suojaamiseen hoidettaessa verkkokalvon tai silmän suonikal-von verenkierrossa esiintyviä häiriöitä sekä venolymfaattista vajaatoimintaa. Nämä uutteet lisäävät veri- ja hiussuonten kestävyyttä ja pienentävät niiden läpäisevyyttä.

20 Prosyanidolin oligomeerit ovat flavanoleista saatavia polyfenoleja, joita muodostuu useiden, joko samanlaisten tai erilaisten flavaloni-yksiköiden hapettavan kondensoitumisen seurauksena, erityisesti (+)katekiinin, epikatekiinin ja gallokatekiinin kondensoituessa. Niitä esiintyy eri kasveissa, kuten viiniköynnöksessä, omenapuussa, maritime 25 pine-, hawthorn- (orapihlaja), cinchona- (kiinankuoripuu) ja eukalyptuspuissa .

Tekniikan nykytason mukaisilla menetelmillä, erityisesti patenttijulkaisujen FR-A-2 092 743 ja FR-A-2 372 823 mukaisesti Vitis 30 vinifera-köynnöksestä tai patenttijulkaisujen FR 1 427 100 ja US

4 698 360 mukaisesti maritime pine-puusta valmistetut uutteet sisältävät oligomeerien, joiden polymeroitumisaste on 2-5, lisäksi molekyy-lipainoltaan suurempia kondensaatiojohdannaisia natriumkloridin kylläisellä vesiliuoksella käsittelemisestä huolimatta, sekä ennen kaikkea 35 huomattavia määriä, eli 20-30 paino-% monomeereja, joita pidetään epä-suotavina aineina.

2 92976

Keksinnön mukainen menetelmä on pääasiassa tunnettu siitä, että A) kasvimateriaalia uutetaan veden ja asetonin, metanolin tai muiden alkoholien välisillä seoksilla niin kauan, kunnes kaikki katekiinijoh- 5 dannaiset ovat uuttuneet; B) liuotin väkevöidään vakuumissa haihduttamalla painoon, joka on noin 50 % kasvimateriaalin lähtöpainosta; 10 C) vaiheessa B) saatu tiiviste suodatetaan, öljymäisten ja polymeeristen tanniinijäännösten poistamiseksi; D) vaiheessa C) saatu tiiviste ultrasuodatetaan kalvojen läpi, joiden läpäisyraja on 100000-1000; 15 E) vaiheessa D) saatu permeaatti, josta molekyylipainoltaan suuret aineet on poistettu, ultrasuodatetaan kalvojen läpi, joiden kalvojen läpäisyraja on 3000 - 600; 20 F) vaiheessa E) saatua permeaattia puhdistetaan valinnaisesti edelleen ultrasuodattamalla siten, että kalvojen läpäisyrajaa rajoitetaan jäljempänä kuvattujen toimenpiteiden mukaisesti, tai fraktioimalla permeaatti selektiivisillä orgaanisilla liuottimilla, • 25 D2) vaihtoehtoisesti, vaiheesta C) saatu vesiliuos voidaan uuttaa suo raan etyyliasetaatilla ja sitten orgaanisesta faasista saatu jäännös, veden lisäämisen jälkeen, käsitellään vaiheiden D) ja/tai E) mukaisissa kalvoprosesseissa; tai 30 D3) vaiheesta C) saatu vesiliuos, jonka pitoisuus on asetettu alueelle 10-50 %, voidaan uuttaa alifaattisen esterin ja aromaattisen hiilivedyn tai sopivan eetterin välisellä, veteen sekoittumattomalla seoksella; G) haihdutetaan orgaaninen faasi pienempään tilavuuteen ja suoritetaan ~ 35 konsentraatin insolubilisointi klooratuilla liuottimilla.

3 92976

Keksinnön mukaiset uutteet, jotka saadaan käsittelemällä sopivalla tavalla tekniikan nykytason mukaisia uutteita, sisältävät vähemmän kuin 1,5 paino-% monomeereja ja niiden farmakologinen aktiivisuus on suurempi lähtömateriaalina toimiviin uutteisiin verrattuna, koska niissä 5 prosyanidolin oligomeerifraktion pitoisuus on suurentunut.

Vaikka alalla ollaankin jo kuvattu lukuisia menetelmiä flavanolioligo-meerien tai muiden samankaltaisten, kasvimateriaalissa esiintyvien aineiden uuttamiseksi (katso esimerkiksi ranskalaiset patenttijulkaisut 10 FR 968 589, 1 036 922 ja 1 427 100 sekä brittiläinen patenttijulkaisu BG 1 541 469), niin lähes täysin monomeeria sisältämättömien uutteiden tuottaminen teollisessa mitassa ja taloudellisesti hyväksyttävinä saantoina ei ole kuitenkaan itsestäänselvää ilman dimeerien ja muiden, fysikaalis-kemiallisilta ominaisuuksiltaan selvästi samankaltaisten 15 oligomeerien huomattavia häviöitä tai muokkautumista. Keksinnön mukaisella menetelmällä päästään ensimmäisen kerran eroon tästä ongelmasta.

Keksinnön mukaisesti monomeerit erotetaan joko siten, että perinteisillä menetelmillä saatujen uutteiden vesiliuos ultrasuodatetaan kal-20 voilla, joiden läpäisyraja ("cut-off") on 600-3000, tai siten, että nämä uutteet uutetaan selektiivisesti eetterillä, kuten metyyli-tert.-butyyli-eetterillä tai alifaattisen esterin, kuten etyyliasetaatin tai amyyliasetaatin, tai eetterin, kuten metyyli-tert.-butyyli-eetterin, ja aromaattisen hiilivedyn, kuten bentseenin tai tolueenin, välisellä : 25 veteen sekoittumattomalla seoksella.

Yleisesti, keksinnön mukaisten menetelmien tunnusomaisia piirteitä ovat vaiheet, joissa: 30 A) kasvimateriaalia uutetaan veden ja asetonin, metanolin tai muiden alkoholien välisillä seoksilla niin kauan, kunnes kaikki katekiinijoh-dannaiset ovat uuttuneet, edullisen liuotinseoksen ollessa asetonin 80 % vesiliuos; 35 B) liuotin väkevöidään vakuumissa haihduttamalla painoon, joka on noin 50 % kasvimateriaalin lähtöpainosta; 4 92976 C) vaiheessa b) saatu tiiviste suodatetaan, valinnaisesti jääkaapissa 24 tunnin ajan seisottamisen jälkeen, öljymäisten ja polymeeristen tanniinijäännösten poistamiseksi; 5 D) vaiheessa c) saatu tiiviste ultrasuodatetaan typpi-ilmakehässä putkimaisten kalvojen tai kapillaarikalvojen läpi, joiden kalvojen lä-päisyraja on 100000-1000; E) vaiheessa d) saatu permeaatti, josta molekyylipainoltaan suuret 10 aineet on poistettu, ultrasuodatetaan kierukaksi kelottujen kalvojen läpi, joiden kalvojen läpäisyraja on 3000-600; F) vaiheessa e) saatua permeaattia puhdistetaan valinnaisesti edelleen ultrasuodattamalla siten, että kalvojen läpäisyrajaa rajoitetaan jäl- 15 jempänä kuvattujen toimenpiteiden mukaisesti, tai fraktioimalla permeaatti selektiivisillä orgaanisilla liuottimilla.

Edellä kuvatusta vaiheesta D) saatu permeaatti sisältää edelleen mono-meerisia aineita ennen lopullisia puhdistusvaiheita (jotka toteutetaan 20 joka tapauksessa), Vitis vinifera-köynnöksen tapauksessa (+)-katekiinia ja (-)-epikatekiinia, sekä pieniä määriä polymeerisiä aineita. Monomee-rien hyvään poistumisasteeseen pääsemiseksi tarkoituksenmukaisemmassa menetelmässä tiiviste ultrasuodatetaan edelleen kierukaksi kelotuilla kalvoilla, joiden läpäisyraja on 600-3000, ja se uutetaan vastavirtaan • 25 etyyliasetaatilla. Lopullinen tuote, joka ei sisällä monomeereja eikä tanniinia, saadaan haihduttamalla orgaaninen faasi tilavuuden pienentämiseksi ja saattamalla tiiviste liukenemattomaan muotoon kloroformilla tai muulla klooratulla liuottimella, kuten metyleenikloridillä, dikloo-rietaanilla, jne. Vaihtoehtoisesti, vaiheesta C) saatu vesiliuos voi-30 daan uuttaa suoraan etyyliasetaatilla ja sitten orgaanisesta faasista saatu jäännös, veden lisäämisen jälkeen, käsitellään vaiheiden D) ja/tai E) mukaisissa kalvoprosesseissa; vaiheesta C) saatu vesiliuos, jonka pitoisuus on asetettu alueelle 10-50 %, voidaan uuttaa liuotin-seoksilla, jotka koostuvat etyyliasetaatista ja tolueenista tai muusta 35 aromaattisesta hiilivedystä suhteessa 5-9 osaa ensimmäistä liuotinta ja 5-1 osaa toista liuotinta; uuttamista tällä seoksella jatketaan niin 5 92976 kauan, kunnes monomeeriset aineet on saatu poistetuiksi täydellisesti. Sen jälkeen, kun näiden kahden liuottimen välinen sopiva, jakaantumis-kertoimiin perustuva suhde on löytynyt, orgaaninen faasi uutetaan vastavirtaan vedellä niiden dimeeristen yhdisteiden talteensaamiseksi, 5 jotka dimeeriset yhdisteet uuttuivat mahdollisesti vahingossa samanaikaisen liukoistamisen aikana; yhdistetyt vesifaasit uutetaan puhtaalla etyyliasetaatilla, orgaaninen faasi haihdutetaan vakuumissa lopullisen tilavuuden pienentämiseksi ja tiiviste saostetaan klooratulla liuottimena .

10

Vaihtoehtoisesti, etyyliasetaatin ja hiilivetyjen väliset seokset voidaan edullisesti korvata muilla estereillä kuten isopropyyliasetaatil-la, amyyliasetaatilla, etyyliformaatilla, jne. tai alifaattisilla eettereillä, metyyli-tert.-butyyli-eetterin ollessa edullinen. Sekä este-15 rit että eetterit poistavat selektiivisesti epätoivottuja monomeeri- fraktioita mahdollisten, kasviuutteissa tavallisesti läsnäolevien lipo-fiilisten materiaalien ohella; tämän jälkeen seuraava uuttaminen etyyliasetaatilla on oligomeerisille aineille selektiivinen toimenpide polymeerisiin materiaaleihin verrattuna, jolloin jonkin edellä esitetyn 20 menetelmän mukaisesti voidaan saada tuote, joka ei sisällä juuri lainkaan mahdollisesti allergeenisia monomeereja eikä tanniinin tavoin vaikuttavia, limakalvoja ärsyttäviä polymeerejä.

Käyttämällä hyväksi edellä mainittujen liuottimien ja liuotinseosten 25 selektiivisyyttä kemiallisilta ominaisuuksiltaan samanlaisia uutteita voidaan valmistaa toteuttamalla fraktiointi kiinteän matriisin avulla, joka matriisi absorboi selektiivisesti fenolijohdannaiset, ja josta matriisista ne voidaan eluoida uudestaan homogeenisina fraktioina.

30 Kiinteänä matriisina voidaan käyttää polystyreenihartsia, kuten absorboivaa AmberliteR-hartseja tai edullisesti DuoliteR S-761-hartseja.

Tämän menetelmän mukaisesti vaiheesta C) saatu liuos johdetaan valitulla hartsilla täytetyn kolonnin läpi, käyttäen noin 0,5 litraa kantajaa liuoksessa läsnäolevan kuivan jäännöksen kutakin 10 g:aa kohden. Sen 35 jälkeen, kun lähtöliuos on saatu absorboitumaan hartsiin, hartsi pestään huolellisesti vedellä suolojen, sokereiden, orgaanisten happojen 6 92976 ja raskaiden polymeerifraktioiden poistamiseksi täydellisesti, mainittujen polymeeritraktioiden kulkeutuessa ulos hartsista eteerisen esteen seurauksena; hartsia pesemistä etyyliasetaatin ja alifaattisten tai aromaattisten hiilivetyjen seoksella, edullisesti suhteessa 7:3, niin 5 kauan, kunnes monomeeriset aineet on saatu täysin poistetuiksi. Keksinnön mukainen uute saadaan eluoimalla tämän jälkeen vesipitoisella me-tanolilla tai vesipitoisella asetonilla, minkä jälkeen tuloksena oleva eluaatti väkevöidään veteen. Vesipitoinen tiiviste uutetaan edellä kuvattujen menettelytapojen mukaisesti etyyliasetaatilla ja väkevöinnin 10 jälkeen jäännös saostetaan klooratuilla liuottimilla.

Tekniikan nykytason mukaisiin uutteisiin verrattuna edellä kuvattujen menetelmien mukaisesti saadun uutteen siedettävyys on erittäin hyvä ja se vaikuttaa erittäin hyvin sydän-verenkiertojärjestelmässä sekä pinta-15 ja syväverenkierrossa esiintyviin patologisiin tiloihin. Tätä uutetta voidaan sisällyttää kaikkiin tavallisiin nestemäisiin ja kiinteisiin farmaseuttisiin valmisteisiin.

Seuraavat esimerkit havainnollistavat keksinnön yksityiskohtia, keksin-20 töä kuitenkaan rajoittamatta.

Esimerkki 1

Monomeereja sisältämättömän uutteen valmistaminen lähtien Vitis vinife-.. 25 ra-rypäleiden kuivista siemenistä.

100 kg Vitis vinifera-rypäleiden siemeniä upotetaan huoneen lämpötilassa 150 litraan asetonia, joka sisältää 20 % vettä. Uuttoliuotin suodatetaan ja uuttaminen toistetaan neljään kertaan tai niin moneen ker-30 taan, että kaikki fenolijohdannaiset on saatu uuttumaan, mikä tarkiste-: taan viimeisestä uutosta otetusta näytteestä yhdisteellä FeCl3 ja var mistamalla, että kuivajäännös on alle 0,05 %. Vesipitoiset asetonili-uokset yhdistetään ja asetoni poistetaan tislaamalla vakuumissa niin kauan, kunnes orgaaninen liuotin on saatu poistetuksi täydellisesti; 35 lopullisen väkevöinnin aikana muodostuu runsaasti sakkaa, jota seisotetaan jääkapissa 4 °C:n lämpötilassa 24 tuntia, ja joka tämän jälkeen 7 92976 sentrifugoidaan; tämä kiintoaine käsittää lipofiiliset tuotteet sekä erittäin polymeroituneen tanniinimateriaalin. Vesiliuoksen (43 1) pH asetetaan arvoon 6 40 % natriumhydroksidillä NaOH typpi-ilmakehässä, ja se ultrasuodatetaan putkimaisella kalvolla, jonka läpäisyraja on 100000 5 (Enichem UF-100F) alle 20 °C:n lämpötilassa, ja sitä dialysoidaan käyttäen 57 litraa vettä. Tämä permeaatti, josta polymeerit on poistettu, tehdään happamaksi pH-arvoon 3,5 25 % rikkihapolla H2S04 ja sitä väke-vöidään käänteisosmoosilla käyttäen kierukaksi kelottua kalvoa Desal B241-111, kunnes kuivajäännös on 30 %. Tätä vesipitoista tiivistettä 10 uutetaan jatkuvasti etyyliasetaatin ja tolueenin seoksella suhteessa 8:2 (v/v) käyttäen erottimena neste/neste-sentrifugia, niin kauan, kunnes monomeeriset aineet on saatu poistetuiksi täydellisesti; tätä liuosta, josta monomeerit on poistettu, uutetaan jatkuvasti etyyliasetaatilla niin kauan, kunnes oligomeerit on saatu poistetuiksi 15 täydellisesti. Orgaaninen faasi väkevöidään vakuumissa 1,5 litraksi ja se saostetaan 4,5 litralla metyleenikloridia. Tuote sentrifugoidaan ja sitä kuivataan 24 tuntia 50 °C:n lämpötilassa vakuumissa, minkä jälkeen se painaa 0,42 kg. Tämä puhdistettu uute sisältää monomeerisia aineita vähemmän kuin 1 %.

20

Esimerkki 2 100 kg Vitis vinifera-rypäleiden siemeniä uutetaan esimerkissä 1 kuvatulla tavalla. Putkimaisen kalvon, jonka läpäisyraja on 100000 (Enichem , 25 UF-100F), läpi ultrasuodattamisen jälkeen saatu permeaatti tehdään happamaksi pH-arvoon 3,5 ja ultrasuodatetaan kierukaksi kelotulla kalvolla Desal U20-G20, minkä jälkeen liuos dialysoidaan käyttäen 20 tilavuutta vettä liuoksen lähtötilavuuteen verrattuna. Tätä tiivistettä (josta monomeeriset aineet on poistettu) väkevöidään edelleen siten, 30 että kuivajäännökseksi saadaan 30 %. Vesipitoista tiivistettä uutetaan etyyliasetaatilla niin kauan, kunnes oligomeerit on saatu poistetuiksi täydellisesti; orgaaninen faasi väkevöidään 1,5 litraksi, kaadetaan 4,5 litraan metyleenikloridia. Saostuneet oligomeerit suodatetaan ja kuivataan 50 °C:n lämpötilassa 24 tunnin ajan, jolloin saadaan 0,45 kg samaa 35 lopputuotetta kuin esimerkissä 1.

8 92976

Esimerkki 3 100 kg Vitis vinifera-rypäleiden siemeniä uutetaan esimerkissä 1 kuvatulla tavalla. Vesiliuos sentrifugoidaan epätoivottujen polymeeristen 5 aineiden poistamiseksi, minkä jälkeen sitä uutetaan jatkuvasti etyyliasetaatilla käyttäen erottimena neste/neste-sentrifugia, niin kauan, kunnes uuttuvat fenoliset aineet on saatu poistetuiksi täydellisesti. Orgaanista faasia väkevöidään, siihen ioninvaihdettua vettä lisäten, liuottimen poistamiseksi siten, että lopulliseksi tilavuudeksi saadaan 10 150 1.

Vesiliuos, jonka pH on 3,5, voidaan käsitellä joko esimerkin 1 mukaisesti ultrasuodattamalla käyttäen putkimaisia kalvoja, joiden läpäisy-raja on 100000, sekä käänteisosmoosilla, tai esimerkin 2 mukaisesti 15 ultrasuodattamalla käyttäen kalvoa, jonka läpäisyraja on 100 000, sekä kierukaksi kelottua kalvoa Desal U20-G20. Väkevöidyt vesiliuokset käsitellään esimerkkien 1 ja 2 mukaisilla toimenpiteillä.

Esimerkki 4 20 100 kg Vitis vinifera-rypäleiden siemeniä uutetaan esimerkissä 1 kuvatulla tavalla. Vesiliuos suodatetaan epätoivotun polymeerifraktion poistamiseksi, minkä jälkeen sitä uutetaan jatkuvasti etyyliasetaatilla niin kauan, kunnes mainittuun liuottimeen uuttuvat polyfenolit on saatu < 25 poistetuiksi täydellisesti; orgaaninen faasi väkevöidään rakenteeltaan tahnamaiseksi ja jäännös liuotetaan 20 1 vettä, poistaen jäljellä oleva liuotin vakuumissa. Vesiliuos absorboidaan kolonniin, joka sisältää 30 1 polystyreenihartsia Duolite S-761, ja eluointia jatketaan niin kauan, että saadaan lähes väritöntä vettä. Sitten eluointia jatketaan etyy-30 liasetaatin ja tolueenin 7:3-seoksella niin kauan, kunnes monomeeriset aineet on saatu poistetuiksi täydellisesti, tarkistamalla reaktio ohut- kerroskromatografisesti käyttäen liikkuvana faasina butyyliasetaatin, etikkahapon, muurahaishapon ja veden 8:1:1:1-seosta ja kehittäjänä kloorisulfonihappoa etikkahapossa. Oligomeerinen fraktio saadaan jatka-35 maila eluointia lähes puhtaalla etyyliasetaatilla. Pääasiassa dimeeri-siä, trimeerisiä ja tetrameerisiä aineita sisältävä orgaaninen liuos 9 92976 väkevöidään 1 litraksi ja se kaadetaan 3 litraan metyleenikloridia. Suodattamisen ja kuivaamisen jälkeen saadaan 210 g tuotetta, joka sisältää monomeereja alle 0,1 %.

5 Vaihtoehtoisesti, kolonni pestään metanolilla puhtaan etyyliasetaatin sijasta; alkoholifaasi väkevöidään pieneksi tilavuudeksi ja jäännös laimennetaan 30 litralla vettä; vesifaasi uutetaan vastavirtaan eyy-liasetaatilla noudattaen esimerkeissä 1 ja 2 esitettyä menettelytapaa tuotteen saamiseksi. Tässä tapauksessa saadaan 405 g tuotetta, joka on 10 lähes samaa kuin edellä kuvattu tuote.

Esimerkki 5 100 kg Vitis vinifera-rypäleiden siemeniä uutetaan esimerkissä 1 kuva-15 tulla tavalla. Sen jälkeen, kun polymeeriset aineet on poistettu sent-rifugoimalla, vesiliuos, jonka kuivajäännös on noin 8 %, laimennetaan siten, että sen kuivajäännökseksi saadaan noin 5 %, ja se käsitellään kromatografisesti kolonnilla, joka sisältää 50 1 Duolite S-761-hartsia, ja joka pestään huolellisesti noin 500 litralla vettä uutteessa suurina 20 määrinä läsnäolevien suolojen ja sokereiden poistamiseksi täydellisesti. Sitten oligomeerien puhdistaminen toteutetaan esimerkissä 4 kuvatulla tavalla, pesemällä kolonnia ensin etyyliasetaatin ja tolueenin seoksella, sitten metanolilla; metyleenikloridilla saostamisen jälkeen saadaan 423 g oligomeerifraktiota, joka on samankaltaista kuin muissa 25 esimerkeissä saatu fraktio.

Esimerkki 6 100 kg Vitis vinifera-rypäleiden siemeniä uutetaan esimerkissä 1 kuva-30 tulla tavalla. Vesiliuos suodatetaan polymeerimateriaalin poistamisek-* si, minkä jälkeen se uutetaan 10 x 50 litran annoksella etyyliasetaatin ja tolueenin 8:2-seosta; rasvamateriaalit ja monomeerit sisältävä orgaaninen faasi pestään vastavirtaan 20 litralla vettä; yhdistetyt vesi-faasit uutetaan 10 x 50 litran annoksella etyyliasetaattia, joka on 35 kyllästetty vedellä; orgaaninen faasi väkevöidään rakenteeltaan tahna-maiseksi ja jäännös sekoitetaan 7 litraan vettä, poistaen jäännösliuo- 10 92976 tin vakuumissa haihduttamalla. Hieman samea vesiliuos käsitellään 759 g:11a natriumkloridia NaCl; tällöin muodostuu sakka, jota seisotetaan liuoksessa jääkaapissa 24 tunnin ajan, ja joka erotetaan sitten suodattamalla. Suodos uutetaan 10 x 7 litran annoksella etyyliasetaattia; 5 orgaaninen liuos väkevöidään 1 litraksi ja tiiviste kaadetaan 3 litraan metyleenikloridia. Edellä olevissa esimerkeissä kuvatuilla tavoilla suodattamisen ja kuivaamisen jälkeen saadaan 402 g lopullista tuotetta, joka on samaa kuin edellä saadut tuotteet.

10 Esimerkki 7 100 kg Vitis vinifera-rypäleiden siemeniä uutetaan esimerkissä 2 kuvatulla tavalla. Esimerkin 2 mukaisesta, kierukaksi kelotulla kalvolla Desal U20-G20 toteutetusta ultrasuodatuksesta saatu permeaatti ja/tai 15 esimerkin 1 mukaisesta, etyyliasetaatin ja tolueenin 8:2-seoksella toteutetusta toimenpiteestä saatu vesiliuos väkevöidään rakenteeltaan tahnamaiseksi ja liuotin korvataan vedellä, minkä jälkeen ne ult-rasuodatetaan kierukaksi kelotulla kalvolla U20-G20. Dialyysin jälkeen saatu väkevöity vesiliuos ei sisällä juuri lainkaan monomeereja ja se 20 sisältää etyyliasetaatilla uuttuneet oligomeerit. Orgaaninen liuos väkevöidään 0,1 litraksi ja saostetaan 0,5 litralla metyleenikloridia. Tällöin saadaan 3,81 g tuotetta, joka sisältää 38 % dimeerisiä aineita ja noin 1 % monomeerisia katekiineja.

25

Claims

92976

1. Menetelmä vitis vinifera -rypäleiden siemenistä uutettujen, alle 1,5 paino-% flavanolimonomeereja sisältävien prosyanidolioligomeerien val-5 alistamiseksi, tunnettu siitä, että A) kasvimateriaalia uutetaan veden ja asetonin, metanolin tai muiden alkoholien välisillä seoksilla niin kauan, kunnes kaikki katekiinijoh-dannaiset ovat uuttuneet; 10 B) liuotin väkevöidään vakuumissa haihduttamalla painoon, joka on noin 50 % kasvimateriaalin lähtöpainosta; C) vaiheessa B) saatu tiiviste suodatetaan, öljymäisten ja polymeeris-15 ten tanniinijäännösten poistamiseksi; D) vaiheessa C) saatu tiiviste ultrasuodatetaan kalvojen läpi, joiden läpäisyraja on 100000-1000;

20 E) vaiheessa D) saatu permeaatti, josta molekyylipainoltaan suuret aineet on poistettu, ultrasuodatetaan kalvojen läpi, joiden kalvojen läpäisyraja on 3000 - 600; F) vaiheessa E) saatua permeaattia puhdistetaan valinnaisesti edelleen 25 ultrasuodattamalla siten, että kalvojen läpäisyrajaa rajoitetaan jäljempänä kuvattujen toimenpiteiden mukaisesti, tai fraktioimalla permeaatti selektiivisillä orgaanisilla liuottimilla, D2) vaihtoehtoisesti, vaiheesta C) saatu vesiliuos voidaan uuttaa suo-30 raan etyyliasetaatilla ja sitten orgaanisesta faasista saatu jäännös, veden lisäämisen jälkeen, käsitellään vaiheiden D) ja/tai E) mukaisissa kalvoprosesseissa; tai D3) vaiheesta C) saatu vesiliuos, jonka pitoisuus on asetettu alueelle ^ 35 10-50 %, voidaan uuttaa alifaattisen esterin ja aromaattisen hiilivedyn tai sopivan eetterin välisellä, veteen sekoittumattomalla seoksella; i 92976 G) haihdutetaan orgaaninen faasi pienempään tilavuuteen ja suoritetaan konsentraatin insolubilisointi klooratuilla liuottimilla.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, 5 että monomeerien poistamiseen käytettyjen kalvojen läpäisyraja on 3000-600.

3. Patenttivaatimusten 1 ja 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että ultrasuodatukseen käytetään putkimaisia kalvoja, kapillaa- 10 rikalvoja, kierukaksi kelottuja kalvoja tai tasomaisia kalvoja.

4. Patenttivaatimusten 1-3 mukainen menetelmä, tunne ttu siitä, että ultrasuodatuksesta saatu permeaatti väkevöidään, ja sitten se uutetaan täydellisesti etyyliasetaatilla, minkä jälkeen oligomeerit 15 otetaan lopulta talteen orgaanisesta faasista väkevöimällä se ja saos-tamalla klooratuilla hiilivedyillä.

5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että vaiheen D3 uuttoliuotin koostuu 5-9 tilavuusosasta etyyliasetaat- 20 tia ja 5-1 tilavuusosasta tolueenia.

6. Patenttivaatimusten 1 ja 5 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu uuttaminen vaiheessa D3 toteutetaan eluoimalla edellä mainitulla liuottimella kromatografiakolonniin pidätetty flava- 25 noliuute. 92976