RU2593014C2

RU2593014C2 - Способ производства проантоцианидиновой полимерной композиции

Info

Publication number: RU2593014C2
Application number: RU2013134704/15A
Authority: RU
Inventors: Мубин Ахмад ХАН; Джонатан Дэвид Марк АТКИНСОН; Сукумар СИНХА; Викас ПАРАШАР; Випин Кумар Пандей; Снехал ШАХ
Original assignee: Гленмарк Фармасьютикалс Лимитед
Priority date: 2011-01-27
Filing date: 2012-01-17
Publication date: 2016-07-27
Also published as: AR084940A1; BR112013018688B1; BR112013018688A2; RU2013134704A; WO2012101008A1

Abstract

Изобретение относится к фармацевтической промышленности, а именно к способу производства Крофелемера, включающему определенные стадии. Стадия А включает выделение частично очищенного Крофелемера путем перемешивания смеси сырого латекса растительного происхождения или вымороженного порошка латекса растительного происхождения и воды при температуре в диапазоне от 35°С до 45°С. Стадия Б включает очистку частично очищенного Крофелемера с использованием методики колоночной хроматографии. Вышеописанный способ обеспечивает получение Крофелемера, который является более эффективным, экономичным, экологически безвредным и обеспечивает продукт с низким содержанием примесей. 43 з.п. ф-лы, 4 табл., 14 пр.

Description

По данной заявке испрашивается приоритет по предварительной заявке Индии №233/MUM/2011, поданной 27 января 2011; 245/MUM/2011, поданной 28 января 2011; 569/MUM/2011, поданной 1 марта 2011; и предварительной заявке США №61/444,803, поданной 21 февраля 2011; 61/445,046, поданной 22 февраля 2011; 61/452,730 поданной 15 марта 2011, все из которых включены в настоящий документ посредством отсылки во всей своей полноте.

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к способу выделения и очистки проантоцианидиновой полимерной композиции, причем композиция имеет высокую чистоту и пригодна для использования в фармацевтически эффективных составах. В частности, изобретение относится к способу производства Крофелемера (Crofelemer), пригодного для применения в фармацевтическом составе и имеющего уровень чистоты и концентрацию, которые позволяют его применение терапевтически эффективным образом.

Настоящее изобретение также относится к проантоцианидиновой полимерной композиции, и, в частности, Крофелемеру, получаемому способом по этому изобретению. Дополнительно, изобретение также обеспечивает проантоцианидиновую полимерную композицию и/или проантоцианидиновые полимеры и, в частности, Крофелемер, полученный (прямо или косвенно) с помощью способа по изобретению.

Уровень техники

Проантоцианидин и проантоцианидиновые полимеры представляют собой фенольные вещества, обнаруженные в виде бесцветных или коричневатых встречающихся в природе веществ в большом числе растений, особенно в растениях с древовидным характером роста (например, Croton species и Calophyllum inophylum). Общая химическая структура полимерного проантоцианидина состоит из линейных цепей 5, 7, 3′, 4′-тетрагидрокси или 5, 7, 3′, 5′-пентагидрокси-флавоноид-3-ольных звеньев, связанных друг с другом посредством общих связей С(4)-(6) и/или С(4)-С(8), как показано ниже

Биосинтетические исследования показали, что проантоцианидиновые полимеры состоят из мономерных звеньев типа, показанного ниже, См. Fletcher et al., 1977, J.C.S. Perkin, 1:1628

Мономерное звено (в общем названное «лейкоантоцианидин») полимерной цепи может быть основано на любой из двух стереохимии С-кольца, в положении 2 и/или 4, обозначенном цис (названном эпикатехинами) или транс (названном катехином). Таким образом, полимерные цепи основаны на различных структурных звеньях, которые создают широкое разнообразие полимерных проантоцианидинов и большое число возможных изомеров.

Проантоцианидины обладают разнообразными биологическими активностями, включая противоопухолевую, противовоспалительную, антивозрастную, антиоксидантную, противоаллергическую, антибактериальную и усиливающую рост волос активности.

Крофелемер является представителем этого класса проантоцианидинов. Он представляет собой фенольный полимер, выделенный из красного и вязкого латекса видов растения Croton lechleri (Euphorbiaceae). Этот латекс, обычно называемый «Sangre de Drago» или «Sangre de Grado» («кровь дракона»), является одним из наиболее распространенных традиционных растительных лекарственных средств в Латинской Америке. Наряду с содержанием Крофелемера, также было обнаружено, что «Sangre de Drado» также содержит алкалоид, идентифицированный как таспин. Таспин (регистрационный номер CAS 602-07-33; 8-диметокси-1-[2-(диметиламино)этил][1]бензопирано[5,4,3cde][1]бензопиран-5,10-дион), как было также показано, имеет различные фармацевтические свойства, такие как бактериостатические свойства, свойства заживления ран, цитотоксичность, иммуносупрессионную активность, ингибирование ацетилхолинэстеразы и ингибирующие эффекты на активность опухолевого ангиогенеза.

Крофелемер представляет собой полимерную композицию с регистрационным номером CAS 148465-45-6 и химически представлен следующей структурной формулой:

где структура мономерных звеньев представляет собой:

В качестве полимерной композиции Крофелемер может дополнительно содержать одну или более примесей, например таспин или другие примеси, такие как ацетон, н-бутанол и диацетоновый спирт.

В патенте США №5211944 было впервые описано выделение водорастворимой проантоцианидиновой полимерной композиции из Croton spp. и применение композиции в качестве противовирусного агента. Проантоцианидиновая полимерная композиция, как было показано, обладает противовирусной активностью против различных вирусов, включая, респираторно-синцитиальный вирус, вирусы гриппа, парагриппа и герпеса. В последнее время было обнаружено, что Крофелемер является пригодным в лечении диареи, и в настоящее время разрабатывается для лечения секреторной диареи. Секреторные диареи (также известные как водянистые диареи) представляют собой главный источник смертности и заболеваемости по всему миру, особенно в развивающихся странах, и особенно в отношении младенцев и маленьких детей. Секреторная диарея вызывается различными патогенами, включая бактерии, вирусы и простейшие, а также другими неинфекционными этиологиями, такими как аномальная клеточная пролиферация в желудочно-кишечном тракте, например рак. Она характеризуется повышенной секрецией водянистых жидкостей в кишечник, приводящей к потере жидкости и электролитов через желудочно-кишечный тракт. Это может привести к серьезному обезвоживанию.

Разработка Крофелемера в качестве средства для лечения диареи представляет значительный прогресс в лечении ряда состояний, при которых диарея, и в особенности секреторная диарея, является симптомом. Клинические исследования показали, что Крофелемер активен в лечении диареи у людей, живущих с ВИЧ и СПИДом и Синдромом Раздраженного Кишечника (IBS), и связан с острой инфекционной диареей (включая холеру) и диареей у детей. Таким образом, существует значительная медицинская необходимость в Крофелемере и, следовательно, в эффективных, экономически выгодных и экологически чистых способах получения Крофелемера и композиций Крофелемера. Способы выделения проантоцианидиновых полимерных композиций известны в данной области техники. В частности, в Патенте США №5211944 раскрывается подробно способ выделения проантоцианидиновой полимерной композиции. В Патенте США №7323195 также раскрывается способ выделения проантоцианидиновой полимерной композиции. Однако, несмотря на эти раскрытия, крупномасштабное производство проантоцианидиновых полимеров, таких как Крофелемер, и связанных с ними композиций является трудной и сложной задачей с точки зрения экономически выгодного производства, а также в отношении утилизации отходов и выхода. Таким образом, остается необходимость в усовершенствованном способе выделения проантоцианидиновой полимерной композиции, такой как композиция Крофелемера, с высокой чистотой и высоким выходом для применения в фармацевтических составах. Неожиданно авторы смогли улучшить способы предшествующего уровня техники для производства Крофелемера в отношении качества полученного продукта. В способе по настоящему изобретению используется повышенная температура (по сравнению со способами предшествующего уровня техники), и этот способ дает Крофелемер, имеющий улучшенные чистоту и выход.

Цель изобретения

Таким образом, целью этого изобретения является обеспечение способа производства проантоцианидиновой полимерной композиции, такой как Крофелемер, с повышенной чистотой, например, с пониженными уровнями таспина.

Таким образом, также целью этого изобретения является обеспечение способа производства проантоцианидиновой полимерной композиции, такой как Крофелемер, с улучшенным выходом.

Еще другой целью этого изобретения является обеспечение способа производства проантоцианидиновой полимерной композиции, такой как Крофелемер, который является более экологически чистым, чем любой из ранее раскрытых способов.

Дополнительной целью этого изобретения является обеспечение способа производства проантоцианидиновой полимерной композиции, такой как Крофелемер, который является более эффективным, чем любой из ранее раскрытых способов.

Еще другой целью этого изобретения является обеспечение способа производства проантоцианидиновой полимерной композиции, такой как Крофелемер, который является более экономически выгодным, чем любой из ранее раскрытых способов.

Настоящее изобретение относится к способу производства проантоцианидиновой полимерной композиции, такой как Крофелемер, который направлен на каждый из упомянутых выше объектов в отдельности или в любой их комбинации.

Раскрытие изобретения

Настоящее изобретение относится к способу выделения и очистки проантоцианидиновой полимерной композиции, причем композиция имеет высокую чистоту и пригодна для использования в фармацевтически эффективных составах. В частности, изобретение относится к эффективному, экономичному и/или экологически чистому способу производства Крофелемера, подходящему для фармацевтических составов и имеющему уровень чистоты и концентрацию, которые позволяют его применение терапевтически эффективным образом.

Настоящее изобретение также относится к проантоцианидиновой полимерной композиции, и, в частности, Крофелемеру, получаемому по способу по изобретению. Дополнительно, изобретение также обеспечивает проантоцианидиновую полимерную композицию и/или проантоцианидиновые полимеры и, в частности, Крофелемер, полученные (либо прямо, либо косвенно) с помощью способа по изобретению.

В одном аспекте настоящее изобретение обеспечивает Крофелемер, имеющий индекс полидисперсности в диапазоне от 0,9 до 1,2, получаемый способом, включающим стадии:

А) выделения частично очищенного Крофелемера путем перемешивания смеси сырого латекса растительного происхождения или сублимированного (лиофилизированного) порошка латекса растительного происхождения и воды или смешивающегося с водой растворителя(ей) при температуре в диапазоне от 15°C до 60°C; и

Б) очистки частично очищенного Крофелемера с использованием методики колоночной хроматографии.

В другом аспекте настоящее изобретение обеспечивает Крофелемер, в котором присутствует таспин в количестве менее чем 500 м.д.; получаемый способом, включающим стадии:

В еще одном аспекте настоящего изобретения обеспечивается Крофелемер, имеющий содержание основного вещества более чем 85%, получаемый способом, включающим стадии:

В еще одном аспекте настоящего изобретения обеспечивается Крофелемер, имеющий менее 0,15% примеси, получаемый способом, включающим стадии:

Б) очистки частично очищенного Крофелемера с использованием методики колоночной хроматографии. В одном варианте выполнения этого аспекта Крофелемер имеет менее чем 0,15% примеси, как измерено при RRT 0,07.

В еще другом аспекте настоящего изобретения обеспечивается Крофелемер, имеющий содержание воды в диапазоне от 7% до 17% (масс.%), получаемый способом, включающим стадии:

Б) очистки частично очищенного Крофелемера с использованием методики колоночной хроматографии. В одном варианте выполнения этого аспекта содержание воды анализировали методикой KF.

В еще другом аспекте настоящее изобретение обеспечивает способ производства Крофелемера, который включает стадии:

А) выделения частично очищенного Крофелемера путем перемешивания смеси сырого латекса растительного происхождения или лиофилизированного порошка латекса растительного происхождения и воды или смешивающегося с водой растворителя(ей) при температуре в диапазоне от 15°C до 60°C; и

В еще другом аспекте настоящего изобретения обеспечивается способ выделения частично очищенного Крофелемера (как описано на стадии (А) вышеупомянутых аспектов изобретения), включающий стадии:

а) перемешивания смеси сырого латекса растительного происхождения или вымороженного порошка латекса растительного происхождения и воды или смешивающегося с водой растворителя(ей) при температуре в диапазоне от 15°C до 60°C;

(б) отделения жидкой фазы;

(в) необязательно, концентрирования жидкой фазы для получения твердого, жидкого или концентрированного сиропа; и

(г) необязательно, добавления воды или смешивающегося с водой растворителя(ей) к твердому, жидкому или концентрированному сиропу.

В еще другом аспекте настоящего изобретения обеспечивается Крофелемер, имеющий индекс полидисперсности в диапазоне от 0,9 до 1,2, получаемый способом, включающим стадии:

Б) очистки частично очищенного Крофелемера с использованием одной колонки КМ-Сефароза, где отношение CM-Sepharose к подаваемому материалу в колонке CM-Sepharose находится в диапазоне от около 3,5:1 до 11:1, или с использованием набора из двух колонок CM-Sepharose и Sephadex LH-20, где отношение КМ-Сефароза, к подаваемому материалу в колонке CM-Sepharose находится в диапазоне от около 3,5:1 до 11:1, и отношение Sephadex LH-20 к подаваемому материалу в колонке Sephadex LH-20 находится в диапазоне от около 8:1 до 90:1.

В еще другом аспекте настоящего изобретения обеспечивается Крофелемер, в котором присутствует таспин в количестве менее чем 500 м.д.; получаемый способом, включающим стадии:

Б) очистки частично очищенного Крофелемера с использованием одной колонки КМ-Сефароза где отношение CM-Sepharose к подаваемому материалу в колонке CM-Sepharose находится в диапазоне от около 3,5:1 до 11:1, или с использованием набора из двух колонок CM-Sepharose и Sephadex LH-20, где отношение КМ-Сефароза к подаваемому материалу в колонке CM-Sepharose находится в диапазоне от около 3,5:1 до 11:1, и отношение Sephadex LH-20 к питанию в колонке Sephadex LH-20 находится в диапазоне от около 8:1 до 90:1.

В еще другом аспекте настоящего изобретения обеспечивается Крофелемер, имеющий содержание основного вещества более чем 85%, получаемый способом, включающим стадии:

Б) очистки частично очищенного Крофелемера с использованием одной колонки КМ-Сефароза, где отношение CM-Sepharose к подаваемому материалу в колонке CM-Sepharose находится в диапазоне от около 3,5:1 до 11:1, или с использованием набора из двух колонок CM-Sepharose и Sephadex LH-20, где отношение КМ-Сефароза к подаваемому материалу в колонке CM-Sepharose находится в диапазоне от около 3,5:1 до 11:1, и отношение Sephadex LH-20 к питанию в колонке Sephadex LH-20 находится в диапазоне от около 8:1 до 90:1.

В еще другом аспекте настоящего изобретения обеспечивается Крофелемер, имеющий менее чем 0,15% примеси, получаемый способом, включающим стадии:

Б) очистки частично очищенного Крофелемера с использованием одной колонки КМ-Сефароза, где отношение CM-Sepharose к подаваемому материалу в колонке CM-Sepharose находится в диапазоне от около 3,5:1 до 11:1, или с использованием набора из двух колонок CM-Sepharose и Sephadex LH-20, где отношение КМ-Сефароза к подаваемому материалу в колонке CM-Sepharose находится в диапазоне от около 3,5:1 до 11:1, и отношение Sephadex LH-20 к питанию в колонке Sephadex LH-20 находится в диапазоне от около 8:1 до 90:1. В одном варианте выполнения этого аспекта Крофелемер имеет менее чем 0,15% примеси, как измерено при RRT 0,07.

В еще другом аспекте настоящего изобретения обеспечивается Крофелемер, имеющий содержание воды в диапазоне 7-17% (масс.%), получаемый способом, включающим стадии:

Б) очистки частично очищенного Крофелемера с использованием одной колонки CM-Sepharose, где отношение CM-Sepharose к питанию в колонке CM-Sepharose находится в диапазоне от около 3,5:1 до 11:1, или с использованием набора из двух колонок CM-Sepharose и Sephadex LH-20, где отношение CM-Sepharose к питанию в колонке CM-Sepharose находится в диапазоне от около 3,5:1 до 11:1, и отношение Sephadex LH-20 к питанию в колонке Sephadex LH-20 находится в диапазоне от около 8:1 до 90:1. В одном варианте выполнения этого аспекта содержание воды анализировали по методике KF.

В еще другом аспекте настоящего изобретения обеспечивается Крофелемер, имеющий чистоту более чем около 98%.

В еще другом аспекте настоящего изобретения обеспечивается Крофелемер, имеющий содержание основного вещества более чем около 85%.

В еще другом аспекте настоящего изобретения обеспечивается Крофелемер, имеющий индекс полидисперсности в диапазоне от 0,9 до 1,2.

В еще другом аспекте настоящего изобретения обеспечивается Крофелемер, в котором таспин присутствует в количестве менее чем 500 м.д., как измерено с помощью ВЭЖХ.

В еще другом аспекте настоящего изобретения обеспечивается Крофелемер, имеющий менее чем 0,15% примеси. В одном варианте выполнения этого аспекта Крофелемер имеет менее чем 0,15% примеси, как измерено при RRT 0,07.

В еще другом аспекте настоящего изобретения обеспечивается Крофелемер, имеющий содержание воды в диапазоне от 7% до 17% (масс.%). Предпочтительно содержание воды анализировали по способу KF.

В еще другом аспекте настоящего изобретения обеспечивается Крофелемер, имеющий содержание воды от около 7 до около 17 процентов по массе и имеющий общее содержание примеси органических соединений менее чем около 1%, как измерено с помощью ВЭЖХ.

В еще другом аспекте настоящего изобретения обеспечивается Крофелемер, содержащий менее чем 1000 м.д. любого из ацетона, н-бутанола, диацетонового спирта и любых их комбинаций.

Другой аспект настоящего изобретения обеспечивает аморфный Крофелемер, имеющий формулу

где структура мономерных звеньев представляет собой

Еще другой аспект настоящего изобретения обеспечивает аморфный Крофелемер, имеющий содержание воды от 7 до 17 процентов по массе (предпочтительно проанализированное по способу KF).

В еще другом аспекте настоящего изобретения обеспечивается аморфный Крофелемер, имеющий:

i) индекс полидисперсности в диапазоне от 0,9 до 1,2;

ii) таспин, присутствующий в количестве менее чем 500 м.д.;

in) содержание основного вещества более чем 85%;

iv) менее чем 0,15% примеси (предпочтительно измеренное при RRT 0.07);

v) содержание воды в диапазоне от 7% до 17% (масс.%) (предпочтительно, как проанализировано по способу KF);

получаемый способом, включающем стадии:

Б) очистки частично очищенного Крофелемера с использованием одной колонки КМ-Сефароза, где отношение CM-Sepharose к подаваемому материалу в колонке CM-Sepharose находится в диапазоне от около 3,5:1 до 11:1, или с использованием набора из двух колонок CM-Sepharose и Sephadex LH-20, где отношение КМ-Сефароза к подаваемому в колонке CM-Sepharose находится в диапазоне от около 3,5:1 до 11:1, и отношение Sephadex LH-20 к питанию в колонке Sephadex LH-20 находится в диапазоне от около 8:1 до 90:1.

Настоящее изобретение также относится к способу производства очищенных проантоцианидиновых полимерных композиций для применения в фармацевтически эффективных составах. В частности, представленные в настоящем документе способы производства чистого Крофелемера, используют методику колоночной очистки.

В одном аспекте настоящего изобретения обеспечивается Крофелемер, имеющий:

iii) содержание основного вещества более чем 85%;

v) содержание воды в диапазоне от 7% до 17% (масс.%) (предпочтительно проанализированное по способу KF);

vi) в аморфной форме, получаемый по способу, включающему стадии:

(а) обеспечения раствора сырого латекса растительного происхождения или лиофилизированного порошка латекса растительного происхождения;

(б) экстрагирования раствора сырого латекса растительного происхождения или лиофилизированного порошка латекса растительного происхождения органическим растворителем;

(в) отделения органического растворителя и (г) концентрирования водного слоя для получения твердого вещества; альтернативно отделения водного слоя и (г) концентрирования органического растворителя для получения твердого, жидкого или концентрированного сиропа;

(д) растворения твердого, жидкого или концентрированного сиропа в воде или смешивающихся с водой растворителях и удаления нерастворимых частиц, если присутствуют, из раствора;

(е) очистки раствора с использованием одной колонки CM-Sepharose, где отношение CM-Sepharose к питанию в колонке CM-Sepharose находится в диапазоне от около 3,5:1 до 11:1, или с использованием набора из двух колонок, выбранных из CM-Sepharose и Sephadex LH-20, где отношение CM-Sepharose к питанию в колонке CM-Sepharose находится в диапазоне от около 3,5:1 до 11:1, и отношение Sephadex LH-20 к питанию в колонке Sephadex LH-20 находится в диапазоне от около 8:1 до 90:1;

Другой аспект настоящего изобретения обеспечивает способ производства Крофелемера, включающий стадии:

(б) экстрагирования раствора сырого латекса растительного происхождения или лиофилизированного порошка латекса растительного происхождения с органическим растворителем;

Подробное описание изобретения

В Патенте США №5211944 (патент US′944) подробно раскрывается способ выделения проантоцианидиновой полимерной композиции. В патенте US′944 описано выделение водорастворимой проантоцианидиновой полимерной композиции из Croton spp. и применение композиции в качестве противовирусного агента. В соответствии со способом, раскрытым в патенте US′944, желаемую проантоцианидиновую полимерную композицию получают из различных растений, включая, но не ограничиваясь, классы Filices, Coniferae, Monocotyledoneae и Dicotyledonae. Они могут быть получены с использованием целого дерева или растения, коры, стеблей, корней или латекса. Пример раскрывает проантоцианидиновую полимерную композицию, полученную из латекса Croton lechleri.

В патенте США №7325195 (US′195) раскрывается способ выделения проантоцианидиновой полимерной композиции из растения Croton lechleri.

К сожалению, эти известные способы не позволяют удобно, в больших масштабах, эффективно и экономично получать проантоцианидиновую полимерную композицию, такую как Крофелемер. Утилизация отходов в настоящее время также является важным фактором, поскольку она стала неотъемлемой и основной частью нормативных вопросов, связанных с фармацевтической и/или химической промышленностью во всем мире. Это создает необходимость в экологически чистых способах получения того же самого.

Авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили, что лиофилизация сырого латекса или добавление воды к латексу растительного происхождения в ходе выделения частично очищенного Крофелемера помогает увеличить выход и снизить необходимость в стадиях обработки, которые в конечном итоге снижают затраты на производство Крофелемера.

Исходный материал, использованный для получения в настоящем документе, представлял собой латекс растительного происхождения, полученный из деревьев Croton lechleri. Деревья С. lechleri были подсочены и вырублены около деревни San Pablo de Cuyana на реке Nanay в 100 километрах от Iquitos, Peru. Латекс получали в течение 24 часов нанесением зарубок на деревья. Природное происхождение и источник исходного материала, использованного в настоящем документе, является важным фактором в отношении затрат на производство. Латексный материал должен быть доставлен в различные страны и в пределах различных стран (например, Индию) для крупномасштабного производства для фармацевтического применения. Таким образом, латекс замораживают для получения вымороженного твердого вещества (порошка), который можно более удобно транспортировать, или может быть использован сырой латекс растительного происхождения для производства Крофелемера.

Исходный материал, использованный в настоящем документе, представляет собой латекс растительного происхождения, который получен из коры Croton lechleri. Сырой латекс растительного происхождения, частично очищенный латекс растительного происхождения, концентрированный сырой латекс растительного происхождения или концентрированный частично очищенный латекс растительного происхождения может содержать загрязнение или может представлять собой лиофилизированный порошок, полученный из латекса растительного происхождения.

Как используется в настоящем документе, «загрязнение» означает осадок, образованный при хранении. Сырой латекс растительного происхождения может быть получен из коры Croton lechleri. Этот латекс собирают и хранят в бочках. При хранении выделенный осадок называется «загрязнением». Это загрязнение обычно отделяют.

Как используется в настоящем документе, «сублимационная сушка» или «лиофилизация» включает замораживание растворов или суспензии термочувствительных материалов с последующей первичной и вторичной сушкой. Методика основана на сублимации воды при температуре ниже нуля в вакууме без плавления раствора.

Настоящее изобретение относится к способу выделения и очистки проантоцианидиновой полимерной композиции, причем композиция имеет высокую чистоту и пригодна для использования в фармацевтически эффективных составах. В частности, изобретение относится к эффективному, экономичному и/или экологически чистому способу производства Крофелемера, подходящему для фармацевтических составов и имеющему уровень чистоты и концентрацию, которые позволяет его применение терапевтически эффективным образом.

В еще другом аспекте настоящее изобретение обеспечивает Крофелемер, имеющий индекс полидисперсности в диапазоне от 0,9 до 1,2, получаемый способом, включающим стадии:

Б) очистки частично очищенного Крофелемера с использованием одной колонки СМ-Sepharose, где отношение CM-Sepharose к питанию в колонке CM-Sepharose находится в диапазоне от около 3,5:1 до 11:1, или с использованием набора из двух колонок CM-Sepharose и Sephadex LH-20, где отношение CM-Sepharose к питанию в колонке CM-Sepharose находится в диапазоне от около 3,5:1 до 11:1, и отношение Sephadex LH-20 к питанию в колонке Sephadex LH-20 находится в диапазоне от около 8:1 до 90:1.

А) выделения частично очищенного Крофелемера путем перемешивания смеси сырого латекса растительного происхождения или лиофилизиро ванного порошка латекса растительного происхождения и воды или смешивающегося с водой растворителя(ей) при температуре в диапазоне от 15°C до 60°C; и

Б) очистки частично очищенного Крофелемера с использованием одной колонки КМ-Сефароза, где отношение CM-Sepharose к подаваемому материалу в колонке CM-Sepharose находится в диапазоне от около 3,5:1 до 11:1, или с использованием набора из двух колонок CM-Sepharose и Sephadex LH-20, где отношение КМ-Сефароза к подаваемому материалу в колонке CM-Sepharose находится в диапазоне от около 3,5:1 до 11:1, и отношение Sephadex LH-20 к подаваемому материалу в колонке Sephadex LH-20 находится в диапазоне от около 8:1 до 90:1.

В еще другом аспекте настоящего изобретения обеспечивается Крофелемер, имеющий менее чем 0,15%, получаемый способом, включающим стадии:

Б) очистки частично очищенного Крофелемера с использованием одной колонки КМ-Сефароза, где отношение CM-Sepharose к подаваемому материалу в колонке CM-Sepharose находится в диапазоне от около 3,5:1 до 11:1, или с использованием набора из двух колонок CM-Sepharose и Sephadex LH-20, где отношение КМ-Сефароза к подаваемому материалу в колонке CM-Sepharose находится в диапазоне от около 3,5:1 до 11:1, и отношение Sephadex LH-20 к подаваемому материалу в колонке Sephadex LH-20 находится в диапазоне от около 8:1 до 90:1. В одном варианте выполнения этого аспекта Крофелемер имеет менее чем 0,15% примеси, как измерено при RRT 0,07.

А) выделения частично очищенного Крофелемера путем перемешивания смеси сырого латекса растительного происхождения или вымороженного (лиофилизированного) порошка латекса растительного происхождения и воды или смешивающегося с водой растворителя(ей) при температуре в диапазоне от 15°C до 60°C; и

Б) очистки частично очищенного Крофелемера с использованием одной колонки КМ-Сефароза, где отношение CM-Sepharose к подаваемому материалу в колонке CM-Sepharose находится в диапазоне от около 3,5:1 до 11:1, или с использованием набора из двух колонок CM-Sepharose и Sephadex LH-20, где отношение КМ-Сефароза к подаваемому материалу в колонке CM-Sepharose находится в диапазоне от около 3,5:1 до 11:1, и отношение Sephadex LH-20 к подаваемому материалу в колонке Sephadex LH-20 находится в диапазоне от около 8:1 до 90:1. В одном варианте выполнения этого аспекта, содержание воды анализировали по методике KF.

В еще другом аспекте настоящего изобретения обеспечивается Крофелемер, имеющий менее чем 0,15% примеси (предпочтительно измеренное при RRT 0,07).

В еще другом аспекте настоящего изобретения обеспечивается Крофелемер, имеющий содержание воды в диапазоне от 7% до 17% (масс.%). Предпочтительно содержание воды анализируют по способу KF.

В еще другом аспекте настоящего изобретения обеспечивается Крофелемер, содержащий менее чем 1000 м.д. любого из ацетона, н-бутанола, диацетонового спирта и их комбинаций.

В еще другом аспекте настоящего изобретения обеспечивается аморфный Крофелемер, имеющий формулу

В еще другом аспекте настоящего изобретения обеспечивается аморфный Крофелемер, имеющий содержание воды от 7 до 17 процентов по массе. Предпочтительно содержание воды анализируют по способу KF.

а) индекс полидисперсности в диапазоне от 0,9 до 1,2;

б) таспин, присутствующий в количестве менее чем 500 м.д.;

в) содержание основного вещества более чем 85%;

г) менее чем 0,15% примеси (предпочтительно измеренное при RRT 0.07);

в) содержание воды в диапазоне от 7% до 17% (масс.%) (предпочтительно, проанализированное по способу KF);

получаемый способом, включающем стадии:

Другой аспект настоящего изобретения обеспечивает способ получения Крофелемера, включающий стадии:

В еще другом аспекте настоящего изобретения обеспечивается способ получения Крофелемера, включающий стадии:

Еще другой аспект настоящего изобретения обеспечивает способ выделения частично очищенного Крофелемера (как описано в настоящем документе на стадии (А)), включающий стадии:

(б) отделения жидкой фазы;

Способ выделения частично очищенного Крофелемера на стадии (А) может включать один или более вариантов выполнения. Необходимо понимать, что варианты выполнения изобретения ниже являются иллюстративными для настоящего изобретения и не предназначены для ограничения формулы изобретения конкретными вариантами выполнения изобретения, приведенными в качестве примера. Также необходимо понимать, что варианты выполнения изобретения, определенные в настоящем документе, могут быть использованы независимо или в сочетании с любым определением, пунктом формулы изобретения или любым другим вариантом выполнения изобретения, определенным в настоящем документе. Таким образом, изобретение охватывает все возможные комбинации и перестановки различных независимо описанных вариантов выполнения изобретения.

В одном варианте выполнения изобретения способ включает выделение частично очищенного Крофелемера из сырого латекса растительного происхождения.

В одном варианте выполнения изобретения способ включает выделение частично очищенного Крофелемера из лиофилизированного латекса растительного происхождения;

В одном варианте выполнения изобретения стадия (а) включает добавление воды или смешивающегося с водой растворителя(ей) к сырому латексу растительного происхождения или лиофилизированному латексу растительного происхождения. Полученная смесь может быть перемешана при температуре в диапазоне от 15°C до 60°C или выше в течение периода от 5 минут до около одного или нескольких часов. В этом варианте выполнения изобретения смесь предпочтительно подогревают или нагревают при температуре от около 35°C до 45°C в течение от 30 до 60 минут, наиболее предпочтительно при 40°C в течение 60 минут. В этом варианте осуществления изобретения стадия выделения может быть необязательно с последующими отделением, концентрированном и добавлением воды или смешивающегося с водой растворителя(ей) для получения твердого, жидкого или концентрированного сиропа.

В одном варианте выполнения изобретения стадия (б) включает отделение жидкой фазы с использованием, но не ограничиваясь, способа(ов), известного в данной области техники, такого как фильтрование, осаждение, центрифугирование и/или декантация или любой их комбинации.

В одном варианте выполнения изобретения стадия разделения (б) может быть проведена путем фильтрования, которое может быть выполнено с использованием фильтрующего средства. В этом варианте выполнения изобретения фильтрующий материал содержит одно или более из диатомовой земли, древесного угля, бентонита, целлюлозы, стекла, песка или фильтровальной бумаги или коммерчески доступного фильтра (например, спарклер-фильтра).

В одном варианте выполнения изобретения стадия разделения (б) может быть проведена путем седиментации, которая может быть выполнена путем выдерживания смеси латекса растительного происхождения в покое в течение от одной или более минут и вплоть до нескольких часов с или без охлаждения, предпочтительно с охлаждением при температуре в диапазоне от 5°C до 15°C, предпочтительно при 10°C. В этом варианте выполнения изобретения осадку возможно позволяют осесть в течение периода времени по меньшей мере 1 час, предпочтительно более чем 1 час, более предпочтительно период времени составляет от 10 до 20 часов, наиболее предпочтительно 15 часов.

В одном варианте выполнения изобретения стадия отделения (б) может быть проведена с использованием методики центрифугирования. Центрифугирование раствора, суспензии или смеси может быть проведено при температуре охлаждения, такой как 10°C со скоростью от 100 до 10000 оборотов в минуту (об/мин), предпочтительно с любой скоростью в диапазоне от 2000 об/мин до 4000 об/мин, более предпочтительно с использованием 3000 об/мин с последующей декантацией.

В одном варианте выполнения изобретения стадия отделения (б) может быть проведена с использованием одного или любой комбинации способа(ов), известного в данной области техники и независимо выбранного из фильтрования, осаждения, центрифугирования и/или декантации, как указано выше. В этом варианте выполнения изобретения предпочтительно отделение с использованием любой комбинации способа(ов), которая может быть выполнена в последовательности: фильтрование, осаждение с последующими центрифугированием и декантацией.

В одном варианте выполнения изобретения на стадии (в) жидкую фазу концентрируют для получения концентрированного сиропа, жидкого или твердого вещества, которые могут быть использованы на следующей стадии. В этом варианте выполнения изобретения концентрированно жидкой фазы может быть проведено с использованием, но не ограничиваясь, процессов или способов или их комбинаций, известных в данной области техники, таких как ультрафильтрация и/или с использованием роторного испарителя или их комбинации(ий). В этом варианте выполнения изобретения предпочтительно используемые способы представляют собой ультрафильтрацию с последующим роторным выпариванием.

В одном варианте выполнения изобретения ультрафильтрацию проводят с полупроницаемой мембраной.

В одном варианте выполнения изобретения полупроницаемая мембрана позволяет прохождение растворенных веществ с молекулярной массой в диапазоне от 1 до 1000 Да. В этом варианте выполнения изобретения является предпочтительным, чтобы полупроницаемая мембрана позволяла прохождение растворенных веществ вплоть до молекулярной массы, выбранной из группы, состоящей из 500 Да и 1 кДа, и является предпочтительной полупроницаемая мембрана, которая позволяет прохождение растворенных веществ вплоть до молекулярной массы 1 кДа.

В одном варианте выполнения изобретения концентрирование и сушка могут быть выполнены предпочтительно с использованием роторного испарителя при температуре приблизительно 37°C (±2°C) или любой другой температуре или с использованием любых других подходящих методик сушки, включающих, но не ограничиваясь, сушку на лотке или распылительную сушку.

В одном варианте выполнения изобретения обработка на стадии (в), которой является концентрирование и сушка для получения концентрированного сиропа или жидкой или твердой формы, может быть выбрана из группы, состоящей из ультрафильтрации с последующей сушкой сублимационная сушкам, выпаривания с нагреванием, выпаривания без нагревания, выпаривания под вакуумом, выпаривания без вакуума, сушки на лотке, распылительной сушки и любых их комбинаций.

В одном варианте выполнения изобретения, в котором на стадии (г) вода или смешивающийся с водой растворитель(и) (например, приблизительно 5 мл на грамм латекса) может быть добавлена к концентрированному сиропу или жидкому или твердому веществу с или без перемешивания, предпочтительно с перемешиванием для получения желаемого раствора, который может содержать или не содержать нерастворимый материал в виде частиц. Этот раствор может быть отфильтрован, если нерастворимые частицы присутствуют в растворе. Фильтрование может быть выполнено с использованием фильтрующего средства. В этом варианте выполнения изобретения фильтрующий материал содержит одно или более из диатомовой земли, древесного угля, бентонита, целлюлозы, стекла, песка или фильтровальной бумаги или коммерчески доступного фильтра (например, спарклер-фильтра).

Способ очистки частично очищенного Крофелемера на стадии (Б) может включать один или более вариантов выполнения. Необходимо понимать, что варианты выполнения изобретения ниже являются иллюстративными для настоящего изобретения и не предназначены для ограничения формулы изобретения конкретными вариантами выполнения изобретения, приведенными в качестве примера. Также необходимо понимать, что варианты выполнения изобретения, определенные в настоящем документе, могут быть использованы независимо или в сочетании с любым определением, пунктом формулы изобретения или любым другим вариантом выполнения изобретения, определенным в настоящем документе. Таким образом, изобретение охватывает все возможные комбинации и перестановки различных независимо описанных вариантов выполнения изобретения.

В одном варианте выполнения изобретения очистка может быть проведена с использованием хроматографические методик, таких как, но не ограничиваясь, ионообменная хроматография и/или эксклюзионная хроматография или их комбинация с использованием воды и/или смешивающегося с водой растворителя в качестве элюента. В этом варианте выполнения изобретения предпочтительной использованной хроматографической методикой является ионообменная хроматография при использовании предназначенных для этого адсорбента, мартиала, матрицы или смолы или может использоваться из коммерческого источника для того же самого; более предпочтительно использованная в настоящем документе смола представляет собой CM-Sepharose.

В одном варианте выполнения изобретения эсклюзионная хроматография представляет собой Sephadex LH-20.

Очистка на колонке может быть проведена с использованием одной колонки CM-Sepharose Fast Flow Column или с использованием набора из двух колонок CM-Sepharose Fast Flow Column и Sephadex LH-20. Две колонки из набора могут быть использованы совместно последовательно или по отдельности.

В одном варианте выполнения изобретения очистка выполняется с использованием одной колонки CM-Sepharose, где отношение КМ-Сефароза к подаваемому материалу в колонке CM-Sepharose находится в диапазоне от около 3,5:1 до 11:1.

В одном варианте выполнения изобретения очистка выполняется с использованием набора из двух колонок CM-Sepharose и Sephadex LH-20, где отношение КМ-Сефароза к подаваемому материалу в колонке CM-Sepharose находится в диапазоне от около 3,5:1 до 11:1, и отношение Sephadex LH-20 к подаваемому материалу в колонке Sephadex LH-20 находится в диапазоне от около 8:1 до 90:1.

В одном варианте выполнения изобретения отношение CM-Sepharose к питанию в колонке составляет по меньшей мере около 3,5:1, более предпочтительно в соотношении по меньшей мере 4:1 (например, 4 мл или 4 г CM-Sepharose для 1 г питания латекса растительного происхождения). В предпочтительном варианте выполнения изобретения отношение СМ-Sepharose к питанию в колонке составляет по меньшей мере около 6:1 (например, для 6 мл или 6 г CM-Sepharose для 1 г питания латекса растительного происхождения).

В одном варианте выполнения изобретения отношение CM-Sepharose к питанию в колонке находится в диапазоне от около 3,5:1 до 11:1, предпочтительно соотношение находится в диапазоне от около 4:1 до 9:1.

В одном варианте выполнения изобретения отношение CM-Sepharose к питанию в колонке составляет менее чем 11:1, предпочтительно соотношение составляет менее чем 9:1.

В одном варианте выполнения изобретения суспензия CM-Sepharose может быть помещена в колонку для получения объема слоя по меньшей мере 35 мл (для 10 г твердого подаваемого материала латекса растительного происхождения или субстрата), предпочтительно по меньшей мере около 40,0 мл на 10 г питания латекса растительного происхождения или субстрата.

В одном варианте выполнения изобретения CM-Sepharose может быть помещена в колонку для получения ширины слоя (внутреннего диаметра колонки) по меньшей мере около 3,2 см (для 10 г твердого питания латекса растительного происхождения или субстрата), предпочтительно по меньшей мере 3,4 см на 10 г питания латекса растительного происхождения.

В одном варианте выполнения изобретения суспензия CM-Sepharose может быть помещена в колонку для получения подходящей высоты слоя (или длины колонки) по меньшей мере около 4,2 см (для 10 г твердого питания латекса растительного происхождения или субстрата), предпочтительно по меньшей мере 4,5 см на 10 г питания латекса растительного происхождения или субстрата.

В одном варианте выполнения изобретения отношение Sephadex LH-20 к питанию в колонке составляет по меньшей мере от около 8:1 до 90:1, более предпочтительно в соотношении по меньшей мере от 12:1 до 90:1 (например, 12 г CM-Sepharose для 1 г питания латекса растительного происхождения).

В одном варианте выполнения изобретения Sephadex LH-20 помещают в колонку для получения длины колонки или высоты слоя по меньшей мере около 8 см (для 10 г питания твердого латекса растительного происхождения или субстрата, использованного в ионообменной колонке), предпочтительно по меньшей мере 13 см на 10 г субстрата или питания.

В одном варианте выполнения изобретения Sephadex LH-20 помещают в колонку для получения внутреннего диаметра колонки или ширины слоя по меньшей мере около 3,2 см (для 10 г питания твердого латекса растительного происхождения или субстрата, использованого в ионообменной колонке), предпочтительно по меньшей мере 3,4 см на 10 г субстрата или питания.

В одном варианте выполнения изобретения Sephadex LH-20 помещается в колонку для подходящего объема слоя по меньшей мере около 110 мл (для 10 г питания твердого латекса растительного происхождения или субстрата, использованного в ионообменной колонке), предпочтительно по меньшей мере 118 мл на 10 г субстрата или питания.

В одном варианте выполнения изобретения материал загружен в ионообменную колонку (например, CM-Sepharose), и колонку промывают очищенной водой. Затем материал элюируют из колонки водным раствором ацетона, тем самым загружая материал в эксклюзионную колонку (например, Sephadex LH-20).

Эксклюзионная колонка может быть затем отсоединена от колонки с ионообменной смолой, и материал элюируют водным раствором ацетона.

Элюенты могут быть выбраны из воды и смешивающегося с водой растворителя(ей) и их комбинации. Предпочтительный элюент, использованный в настоящем документе, представляет собой воду и последующий водный раствор ацетона (предпочтительно 50%-ный ацетоном в воде, более предпочтительно 45%-ный ацетоном в воде, наиболее предпочтительно 30%-ный ацетоном в воде).

Фракции собирают и исследуют с помощью детектора. Фракции, содержащие проантоцианидиновые полимерные (например, Крофелемер) материалы, объединяют. Проантоцианидиновые полимеры (например, Крофелемер), полученные, как описано в настоящем документе, могут быть проанализированы или обнаружены любыми способами, известными в данной области техники. Например, проантоцианидиновые полимеры могут быть обнаружены с помощью ультрафиолетового поглощения (лямбда-макс). Определенные проантоцианидиновые мономеры и полимеры, например, имеющие широкие пики около от 200 до около 300 нм, например между около 200 и около 215 нм (например, около 205-210 нм) и между около 260 и около 295 нм (например, около 275-280 нм). Фракции, содержащие проантоцианидиновые полимеры, могут иметь дополнительные основные максимумы УФ-поглощения от около 400 нм до около 500 нм.

В одном варианте выполнения изобретения концентрированно элюента может быть проведено с использованием, но не ограничиваясь, процессов или способов или их комбинации, известных в данной области техники, таких как ультрафильтрация и/или с помощью роторного испарителя или их комбинации.

В одном варианте выполнения изобретения полупроницаемая мембрана позволяет прохождение растворенных веществ с молекулярной массой в диапазоне от 1 до 1000 Да. В этом варианте выполнения изобретения полупроницаемая мембрана позволяет прохождение растворенных веществ вплоть до молекулярной массы, выбранной из группы, состоящей из 500 Да и 1 кДа, предпочтительна полупроницаемая мембрана, которая позволяет прохождение растворенных веществ вплоть до молекулярной массы 1 кДа.

Предпочтительно, концентрирование с последующей сушкой может быть проведено с использованием роторного испарителя при температуре приблизительно 37°C (±2°C) или любой другой температуре или любой другой подходящей методикой сушки, включая, но не ограничиваясь, сушку на лотке или распылительную сушку.

В одном варианте выполнения изобретения способы концентрирования и сушки для получения твердого вещества могут быть выбраны из группы, состоящей из ультрафильтрации, сушки сублимационная сушкам, выпаривания с нагреванием, выпаривания без нагревания, выпаривания под вакуумом, выпаривания без вакуума, сушки на лотке, распылительной сушки и их комбинаций.

Процессы, раскрытые в настоящем документе, обеспечивают Крофелемер, имеющий чистоту более чем около 90% (по хроматографической чистоте, которая может быть, например, определена путем анализа обнаруживаемых компонентов по сравнению со справочным стандартом с использованием хроматографии), предпочтительно более чем около 95%, предпочтительно более чем около 98%, предпочтительно более чем около 99%, более предпочтительно более чем около 99,9% и наиболее предпочтительно более чем около 99,95%. Например, чистота Крофелемер составляет от около 98% до около 99,9% или от около 99,5% до около 99,99%.

В предпочтительном варианте выполнения изобретения Крофелемер, полученный в соответствии с изобретением, имеет более низкую концентрацию таспина, чем концентрация таспина в исходном материале (например, латексе растительного происхождения). Например, количество таспина, который присутствует в исходном латексе, может быть уменьшено посредством способа в соответствии с изобретением. Уровни таспина в Крофелемере, полученном в соответствии с изобретением, могут быть в диапазоне от 1% по хроматографической чистоте и менее до низких обнаруживаемых пределов. Например, верхний уровень для количества таспина в Крофелемере может быть 1,0%, 0,9%, 0,8%, 0,7%, 0,6%, 0,5%, 0,4%, 0,3%, 0,2%, 0,1% или 0,05% по хроматографической чистоте или любым количеством между или ниже перечисленных количеств до предела обнаружения. В предпочтительном варианте выполнения изобретения уровни таспина в Крофелемере составляют ниже 0,1% по хроматографической чистоте (т.е. 1000 м.д.). Крофелемер имеет 0,1% таспина по хроматографической чистоте и 0% таспина по хроматографической чистоте (т.е. необнаруживаемое количество таспина), когда получают в соответствии со способом по изобретению. В одном предпочтительном варианте выполнения изобретения Крофелемер имеет уровни таспина менее чем 500 м.д..

В одном варианте выполнения изобретение включает Крофелемер, имеющий общее содержание примеси органических веществ менее чем около 1 процента площади по высокоэффективной жидкостной хроматографии.

В одном варианте выполнения изобретение включает Крофелемер с повышенной гомогенностью. Например, в одном варианте выполнения изобретения Крофелемер имеет индекс полидисперсности в диапазоне от 0,9 до 1,2.

В одном варианте выполнения изобретение включает аморфный Крофелемер, имеющий содержание воды от около 7 до около 17 процентов по массе и имеющий общее содержание примеси органических веществ менее чем около 1 процента площади по высокоэффективной жидкостной хроматографии.

В одном варианте выполнения изобретения обеспечивается полученный Крофелемер, имеющий менее чем 0,15% примеси. Предпочтительно, полученный Крофелемер имеет менее чем 0,15% примеси, измеренное при RRT 0.07.

Как известно специалисту в данной области техники, управление производственными примесями значительно улучшается при понимании их химических структур и путей синтеза и при идентификации параметров, которые влияют на количество примесей в конечном продукте.

Примеси определяют спектроскопическим путем и другими физическими способами, и затем примеси связывают с положением пика на хроматограмме (или пятна на пластине ТСХ). После этого примесь может быть идентифицирована по ее положению на хроматограмме, которое обычно измеряется в минутах между введением образца на колонку и элюированием конкретного компонента через детектор, известное как «время удерживания» («rt»). Этот период времени варьируется в зависимости от состояния приборов и многих других факторов. Для смягчения влияния, которое такие вариации имеют на точное определение, практики используют «относительное время удерживания» («RRT») для идентификации примесей.

В другом аспекте настоящего изобретения Крофелемер имеет содержание воды от около 7 до около 17 процентов по массе и имеет общее содержание примеси органических соединений менее чем около 1% по ВЭЖХ.

В другом аспекте настоящего изобретения Крофелемер содержит менее чем 1000 м.д. любого из ацетона, н-бутанола, диацетонового спирта или любой их комбинации(ий).

Настоящее изобретение также относится к по существу чистой проантоцианидиновой полимерной композиции. Для целей этого изобретения по существу чистый представляет собой более чем около 98% чистоты, предпочтительно, проантоцианидиновая полимерная композиция по настоящему изобретению имеет более чем около 99% чистоту.

В одном варианте выполнения настоящее изобретение относится к способу производства по существу чистого Крофелемера, который будет использоваться для терапевтически эффективной фармацевтической композиции. Крофелемер предпочтительно получают из латекса из Croton spp, предпочтительно Croton lechleri.

Выделение и очистка проантоцианидиновой полимерной композиции желаемой чистоты представляет собой сложную задачу из-за сходных химических свойств многих других изомеров, а также их соответствующих примесей.

Авторы настоящей заявки обнаружили, что повторение способов предшествующего уровня техники не приводит к желаемой проантоцианидиновой полимерной композиции с высокой чистотой. Авторы настоящего изобретения преодолели проблему, связанную с выделением чистого Крофелемер, по альтернативному способу выделения и очистки Крофелемер.

Выделение Крофелемер в первую очередь включает очистку на системе из двух колонок, в которой материал сначала подают на хроматографическую систему, состоящую из ионообменной смолы, которая дополнительно соединена с колонкой, состоящей из смолы для эксклюзионной хроматографии.

Ионообменная смола, такая как CM-Sepharose Fast Flow, служит для удаления катионных примесей из материала, тогда как смола для эксклюзионной хроматографии, такая как LH-20, очищает полимерную композицию и обеспечивает композицию в желаемом диапазоне молекулярной массы.

Неожиданно авторы настоящей заявки обнаружили, что эффективное смешивание исходного материала с подходящей системой растворителей, которая может включать воду или воду в комбинации со смешивающимся с водой растворителем, и затем его пропускание через систему из двух колонок обеспечивает Крофелемер с высокой чистотой и улучшенным аналитическим профилем.

Было обнаружено, что неполное смешивание исходного материала до загрузки в колонку приводит к неэффективному использованию слоя смолы. Дополнительно было обнаружено, что нерастворимые частицы, присутствующие в питающем растворе, закупоривают колонку и значительно влияют на эффективность смолы. Было обнаружено, что из-за наличия нерастворимых частиц, питающий раствор не контактирует со многими активными сайтами смолы. Таким образом, неспособность достигнуть минимального времени контакта может привести к прохождению катионных примесей, таких как таспин, и других примесей через колонку на следующий уровень.

Для преодоления указанных выше проблем авторы настоящей заявки разработали способ, который включает растворение исходного материала в подходящей системе растворителей, таких как вода, и фильтрование через спарклер-фильтр для удаления нерастворимых твердых частиц. Питающий раствор, который по существу не содержит нерастворимые частицы, затем применяют к системе двухступенчатой хроматографии.

Для эффективного функционирования системы колонок требуется, чтобы система колонок оставалась в «мокром» состоянии. Высушивание колонки может привести к растрескиванию композиции колонки, и было обнаружено, что это может привести к получению проантоцианидиновой полимерной композиции с меньшей чистотой.

В одном аспекте настоящего изобретения выделяют проантоцианидиновую полимерную композицию (например, Крофелемер) в высокочистом состоянии способом, который включает:

(а) обеспечение раствора латекса растительного происхождения;

(б) добавление органического растворителя(ей) к раствору латекса растительного происхождения;

(в) отделение органического растворителя и концентрированно водного слоя для получения твердого вещества; альтернативно

(в) отделение водного слоя и концентрированно органического растворителя для получения твердого вещества;

(г) растворение твердого вещества в водном растворителе;

(д) удаление нерастворимых частиц из раствора (г);

(е) предоставление раствора на хроматографию; и

(ж) выделение проантоцианидиновой полимерной композиции.

В одном варианте выполнения изобретения Крофелемер выделяют из Croton lechleri. В другом варианте выполнения изобретения Крофелемер выделяют из Calophyllum inophylum. Латексный материал может содержать также загрязнение, которое может быть, необязательно, удалено.

В одном варианте выполнения изобретения латекс выдерживают при температуре ниже комнатной (например, ниже 25°C) в течение периода времени, чтобы позволить осадку осесть, который, например, составляет от около 1 часа до около 30 дней. Латекс затем смешивают с водой при температуре ниже комнатной (например, при 2-8°C) и позволяют отстояться в течение по меньшей мере 12 часов или возможно смешивают с метилэтилкетоном. Осажденный твердый материал отделяют и собирают супернатант. Необязательно, супернатант может быть пропущен через фильтр для удаления твердого материала. Операция может быть осуществлена при температуре ниже комнатной.

В одном варианте выполнения изобретения содержимое стадии (а), где используется вода, смешивается со смешивающимся или несмешивающимся растворителем(ями), выбранным из метанола, этанола, пропанола, бутанола, пентанола, гексанола, этиленгликоля, пропиленгликоля, этилацетата, дихлорметана, трихлорметана, тетрахлорметана, дихлорэтана, диэтилового эфира, ацетона, диметилформамида, диметилсульфоксида, простого эфира, их смесей и подобного. Водный слой предпочтительно смешивали с несмешивающимся растворителем. В одном варианте выполнения изобретения несмешивающийся растворитель представляет собой н-бутанол. Водный слой последовательно промывали н-бутанолом.

В одном варианте выполнения изобретения слой, содержащий Крофелемер, может быть обработан ультрафильтрацией с последующим выпариванием с или без нагревания, выпариванием с или без вакуума, сушкой сублимационная сушкам, распылительной сушкой и подобным, включая комбинации методик обработки, для получения твердого продукта.

В одном варианте выполнения изобретения твердое вещество, полученное на стадии (в), смешивают с подходящим растворителем, таким как вода или смесь воды и смешивающегося с водой растворителя. В предпочтительном варианте выполнения изобретения растворитель представляет собой воду.

Нерастворимые частицы затем удаляются фильтрованием раствора через подходящую среду, такую как спарклер-фильтр.

В одном варианте выполнения изобретения полученный на стадии (д) раствор подвергают колоночной хроматографии.

В одном варианте выполнения изобретения выделение Крофелемера в первую очередь включает очистку на системе из двух колонок, в которой материал сначала подают в хроматографическую систему, состоящую из ионообменной смолы, которая дополнительно соединена с колонкой, состоящей из смолы для эксклюзионной хроматографии.

В одном варианте выполнения изобретения ионообменная смола может быть СМ-Sepharose, которая представляет собой карбоксиметил-модифицированную агарозу.

В одном варианте выполнения изобретения колонка, использованная в хроматографии, содержит одну колонку CM-Sepharose Fast Flow Column или набор из двух колонок CM-Sepharose Fast Flow Column и Sephadex LH-20.

В одном варианте выполнения изобретения элюирование твердой фазы осуществляли системой растворителей, выбранных из группы, состоящей из воды, ацетона, метанола, этанола, гликоля и их смесей. В предпочтительном варианте выполнения изобретения использованный элюент представляет собой воду.

В одном варианте выполнения изобретения материал загружают в ионообменную колонку и колонку промывают очищенной водой. Затем материал элюируют из колонки водным раствором ацетона, тем самым загружая материал в эксклюзионную колонку.

В одном варианте выполнения изобретения вторая колонка состоит из смолы для эксклюзионной хроматографии, которая представляет собой, например, Sephadex LH-20, которая представляет собой гидроксипропилированный перекрестно-сшитый декстран. Эксклюзионную колонку затем отсоединяют от ионообменной колонки и материал элюируют водным раствором ацетона. Фракции собирают и исследуют с помощью детектора. Фракции, содержащие материал Крофелемера, объединяют. На следующей стадии Крофелемер выделяют в твердой форме.

В одном варианте выполнения изобретения выделение может быть проведено обработкой, которая выбрана из группы, включающей ультрафильтрацию, сушку вымораживанием, выпаривание с нагреванием, выпаривание без нагревания, выпаривание с вакуумом, выпаривание без вакуума, распылительную сушку и их комбинации.

Крофелемер, полученный, как раскрыто в настоящем документе, может быть проанализирован любыми способами, известными в данной области техники. Например, Крофелемер может быть обнаружен с помощью ультрафиолетового поглощения (лямбда-макс). Крофелемер имеет широкие пики около от 200 до около 300 нм, например между около 200 и около 215 нм (напримероколо 205-210 нм) и между около 260 и около 295 нм (например, около 275-280 нм). Фракции, содержащие Крофелемер, могут иметь дополнительные основные максимумы УФ-поглощения от около 400 нм до около 500 нм, от между 425 и 475 нм и около 460 нм.

В одном варианте выполнения изобретения высокочистый Крофелемер имеет чистоту более чем около 98%, конкретно, более чем около 99%, более конкретно, более чем около 99,9% и наиболее конкретно, более чем около 99,95%, как измерено по ВЭЖХ. Например, чистота Крофелемер составляет от около 98% до около 99,9% или от около 99,5% до около 99,99%.

В одном варианте выполнения изобретения Крофелемер, раскрытый в настоящем документе, имеет содержание основного вещества более чем около 85%.

Диапазон молекулярной массы и распределение полимера обычно устанавливается с использованием гель-проникающей хроматографии (GPC) и характеризуется среднечисловой молекулярной массой (Мn), средневесовой молекулярной массой (Mw) и индексом полидисперсности. Индекс полидисперсности представляет собой меру широты распределения молекулярной массы.

В одном варианте выполнения изобретение включает Крофелемер с повышенной гомогенностью. Например, в одном варианте выполнения изобретения полученный Крофелемер имеет индекс полидисперсности в диапазоне от 0,9 до 1,2.

В одном варианте выполнения изобретения Крофелемер, полученный в соответствии с изобретением, имеет более низкую концентрацию таспина, чем концентрация таспина в исходном латексном материале. Например, количество таспина, который присутствует в исходном латексе, может быть уменьшено посредством способа согласно изобретению. Уровни таспина в Крофелемер, полученном согласно изобретению, могут быть в диапазоне от 1% по хроматографической чистоте и менее до значений ниже обнаруживаемых пределов. Например, верхний уровень количества таспина в Крофелемере может быть 0,9%, 0,8%, 0,7%, 0,6%, 0,5%, 0,4%, 0,3%, 0,2%, 0,1% или 0,05% по хроматографической чистоте или любое количество между или ниже перечисленных количеств ниже до предела обнаружения. В предпочтительном варианте выполнения изобретения уровни таспина в Крофелемере составляют ниже 0,05% по хроматографической чистоте (т.е. 500 м.д.).

Согласно одному варианту выполнения изобретения обеспечивается Крофелемер, полученный с менее чем 0,15% примесей (предпочтительно измеренное при RRT 0,07).

Согласно одному варианту выполнения изобретения примесь, измеренная при RRT 0,07, может быть использована в качестве справочного маркера для определения чистоты Крофелемера и остаточного количества воды.

Согласно одному варианту выполнения изобретения обеспечивается Крофелемер, в котором содержание воды составляет около 7-17% (масс.%). Предпочтительно содержание воды проанализировано по способу K.F.

Согласно одному варианту выполнения изобретения Крофелемер сушат под вакуумом.

Согласно одному варианту выполнения изобретения Крофелемер сушат под вакуумом, и температура для вакуумной сушки составляет ниже чем 40°С.

В предпочтительном варианте выполнения изобретения температура для вакуумной сушки составляет 20-35°C.

В еще другом аспекте настоящего изобретения Крофелемер находится в аморфной форме.

В еще другом аспекте настоящего изобретения аморфный Крофелемер имеет содержание воды от около 7 до около 17 процентов по массе.

В еще другом аспекте настоящего изобретения аморфный Крофелемер имеет содержание воды от около 7 до около 17 процентов по массе и имеет общее содержание примеси органических соединений менее чем около 1 процента площади по ВЭЖХ.

В еще другом аспекте настоящего изобретения Крофелемер содержит от около 50 м.д. до около 1000 м.д. любого остаточного растворителя. В предпочтительном варианте выполнения изобретения Крофелемер содержит от около 100 м.д. до около 1000 м.д. любого из ацетона, н-бутанола, диацетонового спирта (т.е., 4-гидрокси-4-метил-2-пентанона).

Настоящее изобретение также относится к способу производства очищенных проантоцианидиновых полимерных композиций для применения в фармацевтически эффективных составах. В частности, представленное в настоящем документе представляет собой способы производства чистого Крофелемера с использованием методики колоночной очистки.

В патенте США №7325195 раскрывается способ выделения проантоцианидиновой полимерной композиции из растения Croton lechleri. Латекс из Croton lechleri смешивают с очищенной водой и затем оставляют для осаждения любого нерастворимого материала из раствора латекса. Супернатант откачивают от остатка и затем экстрагируют н-бутанолом несколько раз. После каждой экстракции спиртовую фракцию сливают, а водную фазу сохраняют. Водную фазу концентрируют, например, с использованием ультрафильтрационного устройства с отделяющей мембраной 1 кДа. Ретентат из ультрафильтрации затем концентрируют досуха, например, используя лоточные сушилки, при приблизительно 37°C (±2°C). Высушенный материал впоследствии растворяют в воде и затем хроматографируют в системе из двух колонок, в которой материал проходит последовательно через CM-Sepharose, а затем колонку LH-20. В частности, растворенный материал загружают в катионообменную колонку и затем промывают очищенной водой. Проантоцианидиновый полимерный материал элюируют из катионообменной колонки водным раствором ацетона (предпочтительно 30% ацетоном), тем самым загружая проантоцианидиновый полимерный материал в эксклюзионную колонку. Фракции собирают и контролируют с помощью УФ-детектора, например, при длине волны 460 нм. Фракции, содержащие проантоцианидиновый полимерный материал, объединяют и концентрируют, например, путем ультрафильтрации с использованием, например, отделяющей мембраны 1 кДа (как описано выше для стадии ультрафильтрации до хроматографических стадий). Ретентат затем возможно концентрируют досуха, используя подходящий способ сушки, такой как, но не ограничиваясь, роторный испаритель при температуре примерно 37°C (±2°C). Другие подходящие методики сушки включают, но не ограничиваясь, сушку на лотке и распылительную сушку.

Авторы настоящей заявки обнаружили, что повторение способов предшествующего уровня техники не приводит к желаемой проантоцианидиновой полимерной композиции с высокой чистотой. Проблема, связанная с получением желаемого продукта, была исследована и, как было обнаружено, связана с колоночной очисткой, высотой слоя и соотношением питания к хроматографическому материалу, используемому для заполнения колонки.

Авторы настоящего изобретения оптимизировали длину колонки (высоту слоя), внутренний диаметр колонки (ширину слоя) и объем колонки (объем слоя) в отношении получения желаемого Крофелемера с высокой чистотой и консистенцией для использования в терапевтически эффективных фармацевтических композициях.

Проантоцианидиновая полимерная композиция может содержать нежелательный таспин в большом количестве. Таспин представляет собой алкалоид, также обнаруженный в видах Croton, и как сообщалось, пригоден в качестве противовоспалительной композиции, но имеет другие побочные эффекты, которые делают его нежелательным. Таким образом, желательно сохранять его содержание на минимальном уровне. Также желательно разработать способ, который позволит минимизировать содержание таспина в конечной проантоцианидиной полимерной композиции.

Ионообменная смола, такая как CM-Sepharose Fast Flow, служит для удаления катионных примесей, таких как таспин, из материала, тогда как смола для эксклюзионной хроматографии, такая как LH-20, очищает полимерную композицию и обеспечивает композицию в желаемом диапазоне молекулярной массы. В одном аспекте настоящего изобретения Крофелемер, имеющий:

ii) таспин в количестве менее чем 500 м.д.;

v) содержание воды в диапазоне 7-17% (масс.%) (предпочтительно проанализированное по способу K.F);

vi) в аморфной форме, получают по способу, включающему стадии:

(а) обеспечения раствора сырого латекса растительного происхождения или вымороженного (лиофилизированного) порошка латекса растительного происхождения;

(б) экстрагирования раствора сырого латекса растительного происхождения или вымороженного (лиофилизированного) порошка латекса растительного происхождения органическим растворителем(ями);

(в) отделения органического растворителя и (г) концентрирования водного слоя для получения твердого, жидкого или концентрированного сиропа; альтернативно отделения водного слоя и (г) концентрирования органического растворителя для получения твердого, жидкого или концентрированного сиропа;

(е) очистки раствора с использованием одной колонки CM-Sepharose, где отношение CM-Sepharose к питанию в колонке CM-Sepharose находится в диапазоне от около 3,5:1 до 11:1; или с использованием набора из двух колонок, выбранных из CM-Sepharose и Sephadex LH-20, где отношение CM-Sepharose к питанию в колонке CM-Sepharose находится в диапазоне от около 3,5:1 до 11:1, и отношение Sephadex LH-20 к питанию в колонке Sephadex LH-20 находится в диапазоне от около 8:1 до 90:1;

В другом аспекте настоящего изобретения способ производства Крофелемера включает стадии:

(б) экстрагирования раствора сырого латекса растительного происхождения или вымороженного (лиофилизированного) порошка латекса растительного происхождения с органическим растворителем;

(в) отделения органического растворителя и (г) концентрирования водного слоя для получения твердого вещества; альтернативно, отделения водного слоя и (г) концентрирования органического растворителя для получения твердого, жидкого или концентрированного сиропа;

Исходный материал, сырой латекс растительного происхождения или сумлимированный (лиофилизированный) порошок латекса растительного происхождения представляет собой латекс из Croton spp. или Calophyllum spp. Сырой латекс растительного происхождения, частично очищенный латекс растительного происхождения, концентрированный сырой латекс растительного происхождения или концентрированный частично очищенный латекс растительного происхождения может содержать загрязнение, полученное из латекса растительного происхождения.

В одном варианте выполнения изобретения Крофелемер из Croton lechleri. В другом варианте выполнения изобретения Крофелемер из Calophyllum inophylum. Латексный материал может содержать также загрязнение, которое может быть, необязательно, удалено.

Как используется в настоящем документе, «загрязнение» относится к осадку, сформированному при хранении. Сырой латекс растительного происхождения может быть получен из коры Croton lechleri. Этот латекс собирают и хранят в бочках. При хранении выпавший осадок называется «загрязнение». Это загрязнение обычно отделяют.

В одном варианте выполнения изобретения, где на стадии (а) латекс выдерживают при температуре ниже комнатной (например, ниже 25°C) в течение периода времени, чтобы позволить осесть осадку, который, например, составляет от около 1 часа до около 30 дней. Латекс затем смешивают с водой при температуре ниже комнатной (например, при 2-8°C) и дают отстояться в течение по меньшей мере 12 часов или возможно смешивают с метилэтилкетоном. Осажденный твердый материал отделяют, а супернатант собирают. Необязательно, супернатант может быть пропущен через фильтр для удаления твердого материала. Операция может быть осуществлена при температуре ниже комнатной.

В одном варианте выполнения изобретения на стадии (б) красный раствор супернатанта со стадии (а) экстрагируют смешивающимся или несмешивающимся с водой растворителем(ями), выбранным из метанола, этанола, пропанола, бутанола, пентанола, гексанола, этиленгликоля, пропиленгликоля, этилацетата, дихлорметана, трихлорметана, тетрахлорметана, дихлорэтана, диэтилового эфира, ацетона, диметилформамида, диметилсульфоксида, простого эфира, их смесей. Водный слой предпочтительно смешивали с несмешивающимся растворителем. В одном варианте выполнения изобретения несмешивающийся растворитель представляет собой н-бутанол. Водный слой последовательно промывают н-бутанолом.

В одном варианте выполнения изобретения на стадии (с) слой, содержащий Крофелемер, может быть обработан с помощью ультрафильтрации с последующим выпариванием на стадии (г) с или без нагревания, выпариванием с или под вакуумом, сушкой сублимационная сушкам, распылительной сушкой и подобного, включая комбинации методик обработки, с получением твердого, жидкого или концентрированного сиропа.

В одном варианте выполнения изобретения стадия (с) включает отделение водного слоя путем использования, но не ограничиваясь, способа(ов), известного в данной области техники, такого как фильтрование, осаждение, центрифугирование и/или декантация или их комбинации.

В одном варианте выполнения изобретения стадия разделения (с) может быть проведена путем фильтрования, которое может быть выполнено с использованием фильтрующего средства. В этом варианте выполнения изобретения фильтрующий материал содержит одно или более из диатомовой земли, древесного угля, бентонита, целлюлозы, стекла, песка или фильтровальной бумаги или коммерчески доступного фильтра (например, спарклер-фильтра).

В одном варианте выполнения изобретения стадия разделения (с) может быть выполнена путем седиментации, которая может быть проведена путем выдерживания смеси латекса растительного происхождения в покое в течение от пары минут до нескольких часов с или без охлаждения, предпочтительно с охлаждением при температуре диапазоне от 5°C до 15°C, предпочтительно при 10°C. В этом варианте выполнения изобретения, осадок может осесть в течение периода времени по меньшей мере 1 час или более, предпочтительно более чем один час, более предпочтительно период времени составляет от 10 до 20 часов, наиболее предпочтительно 15 часов.

В одном варианте выполнения изобретения стадия отделения (с) может быть проведена по методике центрифугирования. Центрифугирование раствора, суспензии или смеси может быть выполнено при охлаждающей температуре, такой как 10°C со скоростью от 100 до 10000 оборотов в минуту (об/мин), предпочтительно с любой скоростью в диапазоне от 2000 об/мин до 4000 об/мин, более предпочтительно с использованием 3000 об/мин с последующей декантацией.

В одном варианте выполнения изобретения стадия разделения (с) может быть выполнена с использованием одного или комбинации более чем одного способа(ов), известного в данной области техники и независимо выбранного из группы фильтрования, осаждения, центрифугирования и/или декантации, как обсуждалось выше. В этом варианте выполнения изобретения предпочтительно отделение с использованием комбинации способа(ов) может быть выполнено в последовательности: фильтрование, осаждение с последующими центрифугированием и декантацией.

В одном варианте выполнения изобретения на стадии (г) жидкий слой концентрируют с получением твердого, жидкого или концентрированного сиропа, который может быть использован на следующей стадии. В этом варианте выполнения изобретения концентрирование водного слоя может быть выполнено с использованием, но не ограничиваясь, процессов или способов или их комбинации, известных в данной области техники, таких как ультрафильтрация, и/или с помощью роторного испарителя или их комбинации. В этом варианте выполнения изобретения способы, используемые предпочтительно, представляют собой ультрафильтрацию с последующим роторным выпариванием.

В одном варианте выполнения изобретения полупроницаемая мембрана позволяет прохождение растворенных веществ с молекулярной массой в диапазоне от 1 до 1000 Да. В этом предпочтительном варианте выполнения изобретения полупроницаемая мембрана позволяет прохождение растворенных веществ вплоть до молекулярной массы, выбранной из группы, состоящей из 500 Да и 1 кДа, предпочтительна полупроницаемая мембрана, которая позволяет прохождение растворенных веществ вплоть до молекулярной массы 1 кДа.

В одном варианте выполнения изобретения концентрированно и сушка могут быть выполнены предпочтительно с использованием роторного испарителя при температуре приблизительно 37°C (±2°С) или любой другой температуре или с использованием любых других подходящих методик сушки, включающих, но не ограничиваясь, сушку на лотке или распылительную сушку.

В одном варианте выполнения изобретения обработка на стадии (г), которая является концентрированием и сушкой для получения твердого, жидкого или концентрированного сиропа, может быть достигнута путем выполнения методик, выбранных из группы, состоящей из ультрафильтрации с последующей сушкой сублимационная сушкам, выпариванием с нагреванием, выпариванием без нагревания, выпариванием под вакуумом, выпаривания без вакуума, сушкой на лотке, распылительной сушкой и их комбинациями.

На стадии (д) твердое вещество, называемое в настоящем документе «питание», или концентрированный сироп, или жидкость, смешивают с подходящим растворителем, таким как вода или смесь воды и смешивающегося с водой растворителя, с или без перемешивания, предпочтительно с перемешиванием для получения желаемого раствора, который может содержать или не содержать нерастворимые твердые частицы.

В предпочтительном варианте выполнения изобретения 10 грамм твердого латекса растительного происхождения смешивают с приблизительно 125 мл воды.

Как используется в настоящем документе, использованный смешивающийся с водой растворитель(и), представляют собой предпочтительно спирт с 1-3 атомами углерода (например, этанол) или ацетон.

Нерастворимые частицы, если присутствуют, могут быть затем удалены фильтрованием раствора через подходящую среду, такую как спарклер-фильтр.

На следующей стадии полученный на стадии (д) раствор подвергают колоночной хроматографии.

В одном варианте выполнения изобретения очистку выполняют в системе из двух колонок, в которой материал сначала загружается в хроматографическую систему, состоящую из ионообменной смолы (например, CM-Sepharose Fast Flow Column), которая дополнительно соединена с колонкой, состоящей из смолы для эксклюзионной хроматографии (например, Sephadex LH-20).

В одном варианте выполнения изобретения очистку проводят в системе из одной колонки с ионообменной смолой (например, CM-Sepharose Fast Flow Column).

В одном варианте выполнения изобретения ионообменная смола может быть CM-Sepharose, которая представляет собой карбоксиметил-модифицированную агарозу.

В одном варианте выполнения изобретения смола или среда для эксклюзионной хроматографии может быть Sephadex LH-20, которая представляет собой гидроксипропилированный перекрестно-сшитый декстран.

В одном варианте выполнения изобретения отношение CM-Sepharose к питанию в колонке составляет по меньшей мере около 3,5:1, более предпочтительно в соотношении по меньшей мере 4:1 (например, 4 мл или 4 г CM-Sepharose для 1 г питания латекса растительного происхождения).

В одном варианте выполнения изобретения соотношение CM-Sepharose к питанию в колонке составляет по меньшей мере около 6:1 (например, 6 мл или 6 г CM-Sepharose для 1 г питания латекса растительного происхождения).

В одном варианте выполнения изобретения отношение CM-Sepharose к питанию в колонке составляет менее чем 11:1, предпочтительно отношение составляет менее чем 9:1.

В одном варианте выполнения изобретения суспензия CM-Sepharose может быть помещена в колонку для получения объема слоя по меньшей мере 35 мл (для 10 г твердого питания латекса растительного происхождения или субстрата), предпочтительно по меньшей мере около 40,0 мл на 10 г питания латекса растительного происхождения или субстрата.

В одном предпочтительном варианте выполнения изобретения суспензия CM-Sepharose может быть помещена в колонку для получения объема слоя по меньшей мере около 60 мл для 10 г твердого питания латекса растительного происхождения или субстрата.

В одном варианте выполнения изобретения CM-Sepharose может быть помещена в колонку для получения ширины слоя (внутреннего диаметра колонки) по меньшей мере около 3,2 см (для 10 г твердого питания латекс а растительного происхождения или субстрата), предпочтительно по меньшей мере 3,4 см на 10 г питания латекса растительного происхождения.

В одном варианте выполнения изобретения CM-Sepharose может быть помещена в колонку для получения высоты слоя, такой как, но не ограничиваясь, высоты слоя (или длины колонки) по меньшей мере около 4,2 см (для 10 г твердого питания латекса растительного происхождения или субстрата), предпочтительно по меньшей мере 4,5 см на 10 г питания латекса растительного происхождения или субстрата.

В одном варианте выполнения изобретения Sephadex LH-20 помещают в колонку для получения длины колонки или высоты слоя по меньшей мере около 8 см (для 10 г питания твердого латекса растительного происхождения или субстрата, используемого в ионообменной колонке), предпочтительно по меньшей мере 13 см на 10 г субстрата или питания.

В одном варианте выполнения изобретения Sephadex LH-20 помещают в колонку для получения внутреннего диаметра колонки или ширины слоя по меньшей мере около 3,2 см (для 10 г питания твердого латекса растительного происхождения или субстрата, используемого в ионообменной колонке), предпочтительно по меньшей мере 3,4 см на 10 г субстрата или питания.

В одном варианте выполнения изобретения Sephadex LH-20 помещают в колонку для получения объема слоя (колонки) по меньшей мере около 110 мл (для 10 г питания твердого латекса растительного происхождения или субстрата, используемого в ионообменной колонке), предпочтительно по меньшей мере 118 мл на 10 г твердого вещества или питания.

В одном из вариантов выполнения изобретения материал загружают в колонку CM-Sepharose и колонку промывают очищенной водой. Затем материал элюируют из колонки водным раствором ацетона, тем самым загружая материал на Sephadex LH-20.

Колонка Sephadex LH-20 может быть затем отсоединена от колонки CM-Sepharose, и материал элюируют водным раствором ацетона.

В одном варианте выполнения изобретения хроматографическая очистка может быть выполнена с помощью элюента(ов), которые выбраны из воды и смешивающегося с водой растворителя(ей) и их комбинации. Предпочтительный элюент, используемый в настоящем документе, представляет собой воду и затем водный раствор ацетона (предпочтительно 50%-ный ацетон в воде и/или менее чем 50%, более предпочтительно 45%-ный ацетон в воде и/или менее чем 45%, и наиболее предпочтительно 45%-ный ацетон в воде и/или 30%-ный ацетон в воде или их комбинация).

Фракции собирают и исследуют с помощью детектора. Крофелемер, полученный, как описано в настоящем документе, может быть проанализирован или обнаружен любыми способами, известными в данной области техники. Например, Крофелемер может быть обнаружен с помощью ультрафиолетового поглощения (лямбда-макс). Крофелемер имеет широкие пики от около 200 до около 300 нм, например между около 200 и около 215 нм (например, около 205-210 нм) и между около 260 и около 295 нм (например, около 275-280 нм). Фракции, содержащие Крофелемер, имеют дополнительные основные максимумы УФ-поглощения от около 400 нм до около 500 нм, от между 425 и 475 нм и около 460 нм.

На следующей стадии Крофелемер выделяют в твердой форме.

В одном варианте выполнения изобретения выделение может быть проведено путем обработки, которая выбрана из группы, состоящей из ультрафильтрации, сушки сублимационная сушкам, выпаривания с нагреванием, выпаривания без нагревания, выпаривания под вакуумом, выпаривания без вакуума, распылительной сушки и их комбинаций.

В одном варианте выполнения изобретения Крофелемер сушат под вакуумом, и температура для вакуумной сушки составляет менее чем 40°C. В предпочтительном варианте выполнения изобретения температура для вакуумной сушки составляет 20-35°C.

В одном варианте выполнения изобретения уровень таспина в Крофелемере составляет ниже 2000 м.д. по ВЭЖХ при получении в соответствии со способом по изобретению. Например, верхний уровень для количества таспина в Крофелемере может быть 2000 м.д., 1500 м.д., 1000 м.д., 500 м.д., 400 м.д., 300 м.д., 200 м.д., 100 м.д. или 50 м.д. по ВЭЖХ или любое количество между или ниже перечисленных количеств вплоть до предела обнаружения.

В одном варианте выполнения изобретения чистый Крофелемер, раскрытый в настоящем документе, имеет чистоту более чем около 90%, конкретно, более чем около 95%, более конкретно, более чем около 99% и наиболее конкретно, более чем около 99,5%, как измерено с помощью ВЭЖХ. Например, чистота Крофелемера составляет от около 90% до около 95% или от около 99% до около 99,5% или более.

В одном варианте выполнения изобретения Крофелемер, раскрытый в настоящем документе, имеет содержание основного вещества более чем около 85%, и более конкретно более чем около 90%.

В одном варианте выполнения изобретения Крофелемер, раскрытый в настоящем документе, имеет среднюю молекулярную массу между около 1100 Да (Дальтон) и около 3000 Да или, например, молекулярную массу между около 2000 Да и около 2500 Да; или, например, молекулярную массу между около 1500 Да и около 3000 Да, и полидисперсность в диапазоне от 0,5 до 1,8, или, например, в диапазоне от 0,9 до 1,2, или в диапазоне от 0,5 до 1,5, или в диапазоне от 0,8 до 1,2. В одном предпочтительном варианте выполнения изобретения Крофелемер имеет индекс полидисперсности в диапазоне от 0,9 до 1,20.

Примеры смешивающегося с водой растворителя(ей) включают, но не ограничиваясь, метанол, н-пропанол, изопропанол, этанол, диоксан, диметилсульфоксид, диметилформамид, тетрагидрофуран, ацетон, уксусную кислоту или ацетонитрил.

Проантоцианидин представляет собой группу конденсированных таннинов. Проантоцианидин включает мономерные звенья лейкоантоцианидинов. Лейкоантоцианидины включают катехины, эпикатехины, галлокатехины, галлоэпикатехины, флаванолы, флавонолы, флаван-3,4-диолы, лейкоцианидины и антоцианидины. В одном варианте выполнения изобретения проантоцианидиновый полимер включает полимеры из от около 2 до около 30 флавоноидных звеньев, от около 2 до около 15 флавоноидных звеньев, от около 2 до около 11 флавоноидных звеньев или в среднем от около 7 до около 8 флавоноидных звеньев со среднечисловой молекулярной массой от около 2000 до около 3000 Да, или, например, молекулярной массой от около 1100 дальтон до около 2900 дальтон; или, например, молекулярной массой от около 1500 Да до около 3000 Да.

В одном предпочтительном варианте выполнения изобретения проантоцианидиновая полимерная композиция по изобретению представляет собой Крофелемер. Структура Крофелемера показана ниже

Аналитические данные

Содержание основного вещества и таспина

Установление содержания основного вещества представляет собой способ анализирования или количественной оценки вещества в образце. Установление содержания основного вещества представляет собой анализ, выполняемый для определения наличия вещества и количества этого вещества. Большее содержание основного вещества может способствовать активности и клинической эффективности этого лекарственного средства. Установление содержания основного вещества проводят способом ВЭЖХ с использованием колонки С18 (150×4,6 мм) и 0,1% трифторуксусной кислоты в воде. Тетрагидрофуран, метанол и ацетонитрил использовали в качестве подвижной фазы со скоростью потока 1,5 мл/мин. Измеряют ответ для Крофелемера при УФ 280 нм и для Таспина при УФ 248 нм. Рассчитывают % Основного вещества и содержание таспина по сравнению со стандартом

Сопутствующие вещества

Термин “примеси” относится к чему-либо, что загрязнено или делает что-то другое загрязненным. В настоящее время примесям даны различные названия некоторых из терминов, такие как сопутствующие соединения, которые могут иметь тенденцию к их приуменьшению. В мире фармацевтики примесью обычно считается любой другой органический материал, помимо субстанции лекарственного средства или активного фармацевтического ингредиента (API), которое образуется при синтезе. В большинстве случаев неорганическим загрязнителям не придают адекватное значение в качестве примесей, если они не являются токсичными, такими как тяжелые металлы или мышьяк. Органические летучие примеси (OVI которые обычно состоят из остатков растворителей, а также других летучих органических примесей, использованных в синтезе) часто рассматриваются как допускаемые примеси. Взаимодействие продуктов, образовавшихся в процессах получения, и продуктов деградации (часто называемые в устной речи продуктами распада в фармацевтической промышленности; термины использованы взаимозаменяемо в настоящем тексте), которые могут образоваться до использования пациентом, является дополнительными источниками примесей. Важно признать на этой стадии, что любой материал, который приводит к снижению значения чистоты API, следует рассматривать как примесь. Таким образом, для всех намерений и целей различные загрязнители, упомянутые в настоящем документе, могут быть названы примесями и должны быть обозначены таким образом, поскольку они снижают чистоту API. Примеси являются либо встречающимися в природе, либо добавленными в процессе синтеза химического или коммерческого продукта. В процессе производства примеси могут быть преднамеренно, случайно, неизбежно или попутно добавлены в вещество. Большее число примесей, присутствующих в лекарственном средстве, может влиять на активность и клиническую эффективность этого лекарственного средства. Измерение % примеси проводят способом ВЭЖХ с использованием колонки С18 (150×4,6 мм) и 0,1% трифторуксусной кислоты в воде. Тетрагидрофуран, метанол и ацетонитрил использовали в качестве подвижной фазы со скоростью потока 1,5 мл/мин. Измеряют ответ при УФ 280 нм

Полидисперсность (D)

Полидисперсность измеряли с использованием системы ВЭЖХ с четверными градиентными насосами, УФ-детектором различных длин волн с подсоединенным устройством записи данных и интегрирированным программным обеспечением GPC.

В колонку Jordi DVB 500А°, 500×10 мм использоали подвижную фазу DMF/50 мМ муравьиной кислоты. Скорость потока 1,0 мл/минуту при УФ 280 нм выполняли введения калибровочного стандарта

в качестве широкого стандарта с использованием известных значений M_n, M_w, M_z и М_р. Получен 1^ый порядок (линейный). Для пригодности системы значение r² калибровочной кривой подтвердили при 0,99 или более,

Распределение по размерам частиц полимера рассчитано с помощью следующей формулы, Полидисперсность (D) или Гетерогенность (Н)

где Mw представляет собой среднемассовую молекулярной массой и Мn представляет собой среднечисловую молекулярную массу.

Диацетоновое содержание:

Диацетоновое содержание в Крофелемере определяют с помощью Газового Хроматографа, оборудованного детектором ПИД и автоматическим пробоотборником с использованием колонки НР-5 (5% фенил 95% метил полисилоксан) с размерами: 30 mts×0,32 мм×0,5 мкм.

Содержание воды (по способу или методике KF):

Karl Fischer Instrument представляет собой прибор, используемый для определения содержания воды в образце. Титрование по Karl Fischer (по Карлу Фишеру) является классическим способом титрования в аналитической химии, в котором используется кулонометрическое или объемное титрование для определения следовых количеств воды в образце.

Наполняют сосуд для титрования 15-20 мл метанола. Нажимают кнопку Start на приборе и ждут, пока на дисплее не появится «drift OK». Изменяют параметры на «KFT mode» и начинают. Добавляют примерно 30,0 мг воды, вводят массу и нажимают кнопку Start. Когда титрование завершится, на дисплее отобразится показание бюретки. Записывают показание бюретки и вычисляют K.F. Factor (т.е., K.F. Factor=масса воды в мг / показание бюретки). Изменяют прибор на «KF mode». Нажимают кнопку Start. Измельчают материал, чтобы сделать его однородным. Помещают около 150 мг испытуемого образца в сосуд для титрования и вводят массу образца. Снова нажимают Enter. Когда титрование завершится, на дисплее отобразится показание бюретки. Записывают показание бюретки. Рассчитывают содержание воды в исследуемом образце с помощью следующего уравнения:

Фармацевтические композиции

Фармацевтическая композиция(и), описанная в настоящем документе, содержит Крофелемер и один или более фармацевтически приемлемых эксципиентов, носителей, разбавителей или их смесь. Крофелемер, как описано в настоящем документе, может быть ассоциирован с одним или более фармацевтически приемлемыми эксципиентами, носителями, разбавителями или их смесью в форме капсулы, саше, бумаги или в любом другом контейнере.

Примеры подходящих носителей включают, но не ограничиваясь, воду, солевые растворы, спирты, полиэтиленгликоли, полигидроксиэтоксилированное касторовое масло, арахисовое масло, оливковое масло, желатин, лактозу, terra alba, сахарозу, декстрин, карбонат магния, сахар, циклодекстрин, амилозу, стеарат магния, тальк, желатин, агар, пектин, камедь из акации, стеариновую кислоту или низшие алкиловые эфиры целлюлозы, кремниевую кислоту, жирные кислоты, амины жирных кислот, моноглицериды и диглицериды жирных кислот, эфиры пентаэритрита и жирных кислот, полиоксиэтилен, гидроксиметилцеллюлозу и поливинилпирролидон.

Носитель или разбавитель может включать материал, обеспечивающий замедленное высвобождение, такой как глицерилмоностеарат или глицерилдистеарат, один или в смеси с воском.

Фармацевтическая композиция может также включать один или более фармацевтически приемлемых вспомогательных агентов, смачивающие агенты, эмульгаторы, суспендирующие агенты, консервирующие агенты, соли для влияния на осмотическое давление, буферы, подсластители, ароматизаторы, красители или любую комбинацию вышеперечисленного. Фармацевтическая композиция по патентной заявке может быть приготовлена таким образом, чтобы обеспечить быстрое, замедленное или отсроченное высвобождение активного ингредиента после введения субъекту с применением способов, известных в данной области техники.

Фармацевтические композиции по настоящей патентной заявке могут быть получены обычными методиками, например, как описано в Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20^th Ed., 2003 (Lippincott Williams & Wilkins). Например, Крофелемер смешивают с носителем, или разбавляют носителем, или заключают в носитель, который может быть в форме ампулы, капсулы, саше, бумаги или другого контейнера. Когда носитель служит разбавителем, он может быть твердым, полутвердым или жидким материалом, который действует как средство доставки, наполнитель или среда для активного соединения. Активное соединение адсорбируется на гранулированном твердом контейнере, например, в саше.

Фармацевтические композиции могут быть в обычных формах, например, в виде капсул, таблеток, аэрозолей, растворов, суспензий или продуктов для местного применения.

Путь введения может быть любым способом, который эффективно транспортирует Крофелемер к подходящему или желаемому месту действия. Подходящие пути введения включают, но не ограничиваясь, оральный, назальный, легочный, буккальный, субдермальный, внутрикожный, трансдермальный, парентеральный, ректальный, депо, подкожный, внутривенный, внутриуретральный, внутримышечный, интраназальный, офтальмологический (такой, как в офтальмологическом растворе) или местный (такой, как в мази для местного применения). Пероральный путь является предпочтительным.

Твердые пероральные формы включают, но не ограничиваясь, таблетки, капсулы (мягкие или твердые желатиновые), драже (содержащие активный ингредиент в форме порошка или пеллет), пастилки и леденцы. Таблетки, драже или капсулы, содержащие тальк и/или углеводный носитель или связующее вещество или подобное, являются особенно подходящими для перорального применения. Предпочтительные носители для таблеток, драже или капсул включают лактозу, кукурузный крахмал и/или картофельный крахмал. Сироп или эликсир используется в тех случаях, когда используют подслащенное средство доставки.

Жидкие составы включают, но не ограничиваясь, сиропы, эмульсии, мягкие желатиновые и стерильные инъекционные жидкости, такие как водные или неводные жидкие суспензии или растворы.

Для парентерального применения особенно подходящими являются инъецируемые растворы или суспензии, предпочтительно водные растворы с Крофелемером, растворенным в полигидроксилированном касторовом масле.

Подходящими дозами Крофелемера для применения в лечении заболеваний и расстройств, описанных в настоящем документе, могут быть определены специалистами в соответствующей области техники. Терапевтические дозы обычно находят посредством исследования с различными дозами на людях на основании предварительных данных, полученных в исследованиях на животных. Дозы должны быть достаточными для получения желаемого терапевтического эффекта, не вызывая нежелательных побочных эффектов. Например, ежедневная доза Крофелемера может варьироваться от около 0,1 до около 30,0 мг/кг. Способ применения, дозированные формы, подходящие фармацевтические эксципиенты, наполнители или носители могут быть также широко используемыми и подбираемыми специалистами в данной области техники. Все изменения и модификации предусматриваются в рамках настоящей патентной заявки.

В одном варианте выполнения изобретения фармацевтическая композиция в соответствии с настоящим изобретением применяется в лечении диареи, в особенности секреторной диареи. В одном предпочтительном варианте выполнения изобретения фармацевтическая композиция в соответствии с настоящим изобретением для лечения диареи, связанной с ВИЧ/СПИД, синдромом раздраженного кишечника, острой инфекцией и диареей у детей.

Экспериментальная часть

Исходный материал в виде сырого латекса растительного происхождения, используемый в следующих примерах, представляет собой латекс растительного происхождения, полученный из коры Croton lechleri. Деревья Croton lechleri были подсочены и вырублены около деревни San Pablo de Cuyana на реке Nanay в 100 километрах от Iquitos, Peru. Латекс получали в течение 24 часов нанесением зарубок на деревья.

В настоящем документе использованы следующие аббревиатуры:

ВЭЖХ(HPLC):	высокоэффективная жидкостная хроматография
ПИД (FID):	Пламенно-ионизационный детектор
об/мин (RPM):	оборотов в минуту
мл:	миллилитры
г:	грамм
гм:	грамм
кг:	килограмм
°C:	градусов Цельсия

Пример 1

Стадия А: Шесть объемов воды добавляют к сырому латексу растительного происхождения (250 мл), включающему загрязнение, и полученную смесь перемешивают при 40°C в течение 30 минут и затем фильтруют. Фильтрат выдерживают в покое в течение 15 часов при 2-10°С. Раствор подвергают центрифугированию в течение 10 минут при 10°C и 3000 об/мин с последующей декантацией маточного раствор (1750 мл).

Стадия В: 500 мл очищенной воды добавляют к маточному раствору. Смесь (2250 мл) подвергают колоночной очистке с использованием 300 мл колонки Sepharose (1,2 объема латекса). Осуществляют элюирование с использованием 1500 мл воды с последующим 30% водным ацетоном (1100 мл). Первые 300 мл элюента сливают и затем отбирают 750 мл элюента (темного цвета) и концентрируют с получением 10,0-11,0 г Крофелемера.

Пример 2

Стадия А: 250 мл раствора сырого латекса растительного происхождения, содержащего загрязнение, лиофилизируют с получением приблизительно 45-55 г сухого порошка латекса. 50 г вымороженного латекса перемешивают с 2250 мл очищенной воды при 40°C в течение двух часов. Раствор охлаждают до комнатной температуры и фильтруют с получением 2250 мл маточного раствора.

Стадия В: Массу подвергают колоночной очистке с использованием колонки Sepharose (300 мл, 6 объемов сухого латекса). Проводят элюирование с использованием 2000 мл воды с последующим 30% водным ацетоном (1100 мл). Первые 300 мл элюента сливают и затем отбирают 750 мл элюента (темного цвета) и концентрируют с получением 10,0-11,0 г Крофелемера.

Пример 3

Стадия А: Сырой латекс растительного происхождения (35 кг) смешивают с водой (240 л). Результирующую смесь перемешивают при 40°C в течение 60 минут. Смесь охлаждают до комнатной температуры и фильтруют через спарклер-фильтр с получением прозрачного раствора. Прозрачный раствор подвергают ультрафильтрации и концентрирированию вплоть до 50 л.

Стадия В: 215 л очищенной воды добавляют к концентрированной массе. Результирующий раствор подвергают колоночной очистке с использованием колонки Sepharose (36 л). Изначально, колонку промывают 240 л очищенной воды и элюирование проводят с использованием 30%-ного водного ацетона (125 л). Первые 30-36 л элюента сливают и затем отбирают 90 л элюента (темного цвета) и концентрируют с получением 0,9 кг Крофелемера.

Пример 4

Стадия А: 500 мл раствора сырого латекса растительного происхождения, содержащего загрязнение, лиофилизируют с получением приблизительно 100-110 г сухого порошка латекса. 100 г вымороженного латекса перемешивают с 4500 мл очищенной воды при 40°C в течение двух часов. Раствор охлаждают до комнатной температуры и фильтруют с получением 5000 мл маточного раствора.

Стадия В: Маточный раствор подвергают колоночной очистке с использованием колонки Sepharose (600 мл, 6 объемов сухого латекса). Изначально, колонку промывают 4 л очищенной воды и элюирование проводят с использованием 30%-ного водного ацетона (2200 мл). Первые 500 мл элюента сливают и затем отбирают 1500 мл элюента (темного цвета) и концентрируют с получением 20,0-22,0 г Крофелемера.

Аналитические данные для Примеров 1-4 приведены в Таблице 1.

Таблица 1
Аналитические данные	Пример 1	Пример 2	Пример 3	Пример 4
Содержание воды	14,44%	-	11,12%	9,89%
Мп (Да) (среднечисловая молекулярная масса)	2097	2058	2411	2195
PD (индекс полидисперсности)	1,03	1,03	1,004	1,03
Содержание основного вещества	90,17%	92,72%	94,25%	93,61%
Таспин м.д.	50	BDL	170.65	44
Галлокатехин	0.04%	0.021%	0.029%	0.02%
Эпигаллокатехин	0.07%	0.062%	0.068%	0.04%
Катехин	0.01%	BDL	BDL	BDL
Эпикатехин	0.02%	BDL	BDL	0.06%
Процианадин-В1	0.02%	BDL	ND	BDL
Процианадин-В2	BDL	BDL	ND	BDL
Примеси при RRT 0,07	0.01%	BDL	BDL	BDL
BDL = ниже предела обнаружения; ND = не обнаружено

Справочный Пример-1: Приготовление Крофелемера

Стадия 1:

450 кг латекса смешивают с 925 л воды. Полученную смесь тщательно перемешивают при 2-8°C в течение часа и оставляют отстаиваться при 2-8°C в течение 12 часов. Слои разделяют. Верхний слой смешивают с 200 л н-бутанола. Смесь хорошо перемешивают. Слои разделяют. Водную фазу дважды экстрагируют 200 л н-бутанола каждый раз. Водную фазу пропускают через спарклер-фильтр и затем концентрируют при пониженном давлении с получением твердого вещества.

Стадия 2:

10 г твердого материала перемешивают в 125 мл очищенной воды. Полученный раствор используют в Сравнительных Примерах 1.1-1.7.

Справочный Пример 1.1. Полученный раствор материала используют в хроматографической системе, содержащей 118,0 мл колонку CM-Sepharose (где Высота Слоя = 13 см и ширина Слоя = 3,4 см), соединенную последовательно со 118 мл колонкой LH-20 (где Высота Слоя = 13 см и ширина Слоя = 3,4 см).

Справочный Пример 1.2. Полученный раствор материала используют в хроматографической системе, содержащей 59 мл колонку CM-Sepharose (где Высота Слоя = 6,5 см и ширина Слоя = 3,4 см), соединенную последовательно со 118 мл колонкой LH-20 (где Высота Слоя = 13 см, ширина Слоя = 3,4 см).

Справочный Пример 1.3. Полученный раствор материала используют в хроматографической системе, содержащей 41,3 мл колонку CM-Sepharose (где Высота Слоя = 4,55 см и ширина Слоя = 3,4 см), соединенную последовательно со 118 мл колонкой LH-20 (где Высота Слоя = 13 см и ширина Слоя = 3,4 см).

Справочный пример 1.4. Полученный раствор материала используют в хроматографической системе, содержащей 35,4 мл колонку CM-Sepharose (где Высота Слоя = 3,9 см и ширина Слоя = 3,4 см), соединенную последовательно со 118 мл колонкой LH-20 (где Высота Слоя = 13 см и ширина Слоя = 3,4 см).

Справочный Пример 1.5. Полученный раствор материала используют в хроматографической системе, содержащей 29,5 мл колонку CM-Sepharose (где Высота Слоя = 3,25 см, Ширина Слоя = 3,4 см), соединенную последовательно со 118 мл колонкой LH-20 (где Высота Слоя = 13 см и ширина Слоя = 3,4 см).

Справочный Пример 1.6. Полученный раствор материала используют в хроматографической системе, содержащей 14,7 мл колонку CM-Sepharose (где Высота Слоя = 1,62 см и ширина Слоя = 3,4 см), соединенную последовательно со 118 мл колонкой LH-20 (где Высота Слоя = 13 см и ширина Слоя = 3,4 см).

Справочный пример 1.7. Полученный раствор материала используют в хроматографической системе, содержащей 7,2 мл колонку CM-Sepharose (где Высота Слоя = 0,8 см и ширина Слоя = 3,4 см), соединенную последовательно со 118 мл колонкой LH-20 (где Высота Слоя = 13 см и ширина Слоя = 3,4 см).

После подачи питания в верхнюю часть колонки, колонки промывают 230 мл очищенной воды и 680 мл 30% ацетона. Колонки разделяют. Проантоцианидиновую полимерную композицию элюируют из колонки LH-20 450 мл 45% ацетона. Фракции, содержащие целевую проантоцианидиновую полимерную композицию, концентрируют досуха и далее сушат. Аналитические данные для Справочных Примеров 1.1-1.7 приведены в Таблице 2.

Таблица 2
Параметр	Справочный пример	Справочный пример	Справочный пример	Справочный пример	Справочный пример	Справочный пример	Справочный пример
Параметр	1.1	1.2	1.3	1.4	1.5	1.6	1.7
Размер питания (г)	10	10	10	10	10	10	10
Диаметр колонки (см)	3,4	3,4	3,4	3,4	3,4	3,4	3,4
Высота слоя CM-Sepharose (см)	13	6,5	4,55	3,9	3,25	1,62	0,8
Объем колонки (мл)	118,0	59,0	41,3	35,4	29,5	14,7	7.2
Таспин (м.д.)	150	150	131	1152	2073	17738	23601
Основное вещество	89,06%	90,01%	100,48%	103,11%	95,06%	94,08%	89,10%

Справочный Пример 2: Получение Крофелемера (US 7323195)

Стадия А:

450 кг латекса смешивают с 925 л воды. Полученную смесь тщательно перемешивают при 2-8°C в течение часа и оставляют отстаиваться при 2-8°C в течение 12 часов. Слои разделяют. Верхний слой затем смешивают с 200 л н-бутанола. Смесь хорошо перемешивают. Слои разделяют. Водную фазу дважды реэкстрагируют 200 л н-бутанола каждый раз. Водную фазу пропускают через спарклер-фильтр и затем концентрируют при пониженном давлении.

Стадия В:

Материал со стадии А (6 кг) перемешивают в 75 л очищенной воды. Полученный материал используют в хроматографической системе, содержащей 35 л колонку СМ-Sepharose, соединенную последовательно с 70 л колонкой LH-20. После подачи питания в верхнюю часть колонки колонки промывают 140 л очищенной воды и 408 л 30% ацетона. Колонки разделяют. Проантоцианидиновую полимерную композицию элюируют из колонки LH-20 272 л 45% ацетона. Фракции, содержащие желаемую проантоцианидиновую полимерную композицию, концентрируют досуха и далее сушат.

Аналитические данные собраны для следующих партий. Аналитические детали для композиции конечно проантоцианидиновой полимерной композиции приведены в таблице 3.

Таблица 3
№ партии	Всего примесей (%)	Содержание таспина (%)	Ср. Мол. Масса (Да)
1	3,43	3,03	2496
2	4,43	3,66	2737
3	11,7	1,00	3183

Пример 5 Получение Крофелемера

Стадия А:

Содержащие латекс барабаны выдерживают при 2-8°C в течение не менее чем 48 часов перед использованием. 450 кг латекса смешивают с 925 л предварительно охлажденной воды. Полученный раствор тщательно перемешивают при 2-8°C в течение часа и затем оставляют отстаиваться при 2-8°C в течение 12 часов. Полученный осадок отделяют. Супернатант фильтруют через спарклер-фильтр и затем смешивают с 200 л н-бутанола. Смесь хорошо перемешивают. Слои разделяют. Водную фазу дважды реэкстрагируют 200 л н-бутанола каждый раз. Водную фазу концентрируют досуха при пониженном давлении.

Стадия В:

Материал со стадии А растворяют в 75 л очищенной воды и раствор фильтруют через спарклер-фильтр. Операцию повторяют для удаления суспендированных частиц. Растворенный материал используют в хроматографической системе, содержащей 35 л колонку CM-Sepharose Fast Flow, соединенную последовательно с 70 л колонкой LH-20. После подачи питания в верхнюю часть колонки колонки промывают 140 л очищенной воды и 408 л 30% ацетона.

Колонки разделяют. Проантоцианидиновую полимерную композицию элюируют из колонки LH-20 272 л 45% ацетона. Фракции концентрируют и сушат с получением Крофелемера.

Аналитически детали для нескольких представителей партий Крофелемера приведены в следующей таблице 4.

Аналитические данные для нескольких представителей партий из Примера 5 указаны в таблице 4.

Таблица 4
№ партии	Основное вещество (%)	Остаточные растворители (м.д.)			Содержание воды KF (%)	Таспин (%)	Всего примесей (%)	Ср. Мол. Масса (да)
№ партии	Основное вещество (%)	ацетон	н-бутанол	диацетоновый спирт	Содержание воды KF (%)	Таспин (%)	Всего примесей (%)	Ср. Мол. Масса (да)
1	104,4	7	3	55	14,2	0	0,15	1935
2	99,9	16	3	37	14,2	0	0,07	1929
3	101,7	9	3	59	14,2	0	0,09	1943
4	100,3	3	0	36	10,9	0	0,08	1965
5	101	0	0	38	12,2	0	0,04	1997
6	103,7	4	2	55	12,3	0	0,04	2161
7	102,9	0	0	53	10,3	0	0,01	2012
8	104	8	0	56	12,2	0	0,01	1998
9	100,7	6	0	37	11,8	0	0,01	1993
10	101	0	0	23	11,4	0	0,01	2041

Claims

1. Способ производства Крофелемера, включающий стадии:
А) выделения частично очищенного Крофелемера путем перемешивания смеси сырого латекса растительного происхождения или вымороженного (лиофилизированного) порошка латекса растительного происхождения и воды при температуре в диапазоне от 35°С до 45°С; и
Б) очистки частично очищенного Крофелемера с использованием методики колоночной хроматографии.

2. Способ по п. 1, в котором процесс выделения частично очищенного Крофелемера на стадии (А) включает стадии:
а) перемешивания смеси сырого латекса растительного происхождения или вымороженного порошка латекса растительного происхождения и воды при температуре в диапазоне от 35°С до 45°С;
(б) отделения жидкой фазы; и
(в) необязательно, концентрирования жидкой фазы для получения твердого, жидкого или концентрированного сиропа;

3. Способ по п. 2, в котором стадию (б) выполняют с использованием фильтрования, седиментации, центрифугирования и/или декантации или их комбинаций.

4. Способ по п. 2, в котором стадию (б) выполняют фильтрованием с фильтрующим средством.

5. Способ по пункту 2, в котором стадию (б) выполняют с использованием седиментации.

6. Способ по п. 5, в котором седиментацию выполняют путем выдерживания смеси латекса растительного происхождения, раствора или суспензии в покое в течение периода времени по меньшей мере 1 час с охлаждением при температуре в диапазоне от 2°С до 10°С.

7. Способ по п. 2, в котором стадию (б) выполняют с использованием методики центрифугирования.

8. Способ по п. 7, в котором центрифугирование раствора, суспензии или смеси выполняют при температуре, такой как 10°С, используя скорость в диапазоне от 100 до 10000 оборотов в минуту (об/мин) с последующей декантацией.

9. Способ по п. 7, в котором центрифугирование выполняют в течение 10 мин при 10°С и при скорости 3000 об/мин, с последующей декантацией.

10. Способ по п. 2, в котором стадию (б) выполняют с использованием комбинации способа(ов) в последовательности: фильтрование, седиментация с последующим центрифугированием и декантацией.

11. Способ по п. 2, в котором стадию (в) выполняют с использованием ультрафильтрации и/или с использованием роторного испарителя или их комбинации.

12. Способ по п. 2, в котором стадию (в) выполняют путем ультрафильтрации с последующей сушкой вымораживанием, выпариванием с нагреванием, выпариванием без нагревания, выпариванием под вакуумом, выпариванием без вакуума, центробежной сушкой, распылительной сушкой и их комбинациями для получения твердого, жидкого или концентрированного сиропа.

13. Способ по п. 1, в котором стадию (Б) выполняют с использованием ионообменной хроматографии и/или эксклюзионной хроматографии или их комбинации.

14. Способ по п. 1, в котором стадию (Б) выполняют с помощью ионообменной хроматографии с использованием колонки с КМ-Сефарозой.

15. Способ по п. 1, в котором стадию (Б) выполняют с использованием ионообменной хроматографии и эксклюзионной хроматографии.

16. Способ по п. 15, в котором стадию (Б) выполняют с использованием комбинации ионообменной хроматографии с использованием колонки с КМ-Сефарозой и эксклюзионной хроматографии с использованием колонки с Сефадексом LH-20.

17. Способ по п. 1, в котором стадию (Б) выполняют с использованием одной колонки с КМ-Сефарозой, где отношение КМ-Сефарозы к нагрузке колонки с КМ-Сефарозой находится в диапазоне от 3,5:1 до 11:1.

18. Способ по п. 1, в котором стадию (Б) выполняют с использованием набора из двух колонок с КМ-Сефарозой и с Сефадексом LH-20, где отношение КМ-Сефарозы к нагрузке колонки с КМ-Сефарозой находится в диапазоне от 3,5:1 до 11:1, и отношение Сефадекса LH-20 к нагрузке колонки с Сефадексом LH-20 находится в диапазоне от 8:1 до 90:1.

19. Способ по п. 17 или 18, в котором отношение КМ-Сефарозы к нагрузке в колонке составляет по меньшей мере 4:1.

20. Способ по п. 17 или 18, в котором отношение КМ-Сефарозы к нагрузке в колонке составляет по меньшей мере 6:1.

21. Способ по п. 17 или 18, в котором отношение КМ-Сефарозы к нагрузке в колонке составляет менее чем 9:1.

22. Способ по п. 17 или 18, в котором объем слоя колонки КМ-Сефарозой, полученного после помещения суспензии КМ-Сефарозы, составляет по меньшей мере 35 мл на 10 г нагрузки латекса растительного происхождения или субстрата.

23. Способ по п. 17 или 18, в котором объем слоя колонки КМ-Сефарозой, полученного после помещения суспензии КМ-Сефарозы, составляет 60,0 мл на 10 г нагрузки латекса растительного происхождения или субстрата.

24. Способ по п. 17 или 18, в котором ширина слоя (внутренний диаметр колонки) колонки с КМ-Сефарозой, полученного после заполнения суспензией КМ-Сефарозы, составляет по меньшей мере 3,2 см на 10 г нагрузки латекса растительного происхождения или субстрата.

25. Способ по п. 17 или 18, в котором ширина слоя колонки с КМ-Сефарозой составляет по меньшей мере 3,4 см на 10 г нагрузки латекса растительного происхождения или субстрата.

26. Способ по п. 17 или 18, в котором высота слоя (длина колонки) колонки с КМ-Сефарозой, полученного после помещения суспензии КМ-Сефарозы, составляет по меньшей мере 4,2 см на 10 г нагрузки латекса растительного происхождения или субстрата.

27. Способ по п. 17 или 18, в котором высота слоя колонки с КМ-Сефарозой составляет 4,5 см на 10 г нагрузки латекса растительного происхождения или субстрата.

28. Способ по п. 18, в котором отношение Сефадекса LH-20 к нагрузке в колонке составляет по меньшей мере 12:1.

29. Способ по п. 18, в котором объем слоя колонки с Сефадексом LH-20, полученного после помещения суспензии Сефадекса LH-20, составляет по меньшей мере 110 мл на 10 г нагрузки латекса растительного происхождения или субстрата.

30. Способ по п. 29, в котором объем слоя составляет 118 мл на 10 г нагрузки латекса растительного происхождения или субстрата.

31. Способ по п. 18, в котором ширина слоя или внутренний диаметр колонки с Сефадексом LH-20, полученного после помещения суспензии Сефадекса LH-20, составляет по меньшей мере 3,4 см на 10 г нагрузки латекса растительного происхождения или субстрата.

32. Способ по п. 18, в котором высота слоя или длина колонки с Сефадексом LH-20, полученного после помещения суспензии Сефадекса LH-20, составляет по меньшей мере 13 см на 10 г нагрузки латекса растительного происхождения или субстрата.

33. Способ по п. 1, в котором стадию (Б) выполняют с использованием элюента, выбранного из воды с последующим водным раствором ацетона.

34. Способ по п. 33, в котором элюент представляет собой воду с последующим 30% водным раствором ацетона.

35. Способ по п. 1, в котором на стадии (Б) фракции собирают с обнаруживаемым поглощением при между 200-300 нМ и дополнительными максимумами УФ-поглощения от около 400-500 нМ с использованием УФ-спектроскопии.

36. Способ по п. 1, в котором на стадии (Б) концентрирование элюента выполняют с использованием ультрафильтрации и/или с использованием роторного испарителя или их комбинации.

37. Способ по п. 1, в котором Крофелемер имеет чистоту более чем 98%.

38. Способ по п. 1, в котором Крофелемер имеет содержание основного вещества более чем 85%.

39. Способ по п. 1, в котором Крофелемер с индексом полидисперсности находится в диапазоне от 0,9 до 1,20.

40. Способ по п. 1, в котором Крофелемер имеет таспин, присутствующий в количестве менее чем 500 м.д., предпочтительно, как измерено с помощью ВЭЖХ.

41. Способ по п. 1, в котором Крофелемер имеет менее чем 0,15% примеси, предпочтительно, как измерено при RRT 0,07.

42. Способ по п. 1, в котором Крофелемер имеет содержание воды в диапазоне от 7 до 17 масс. %, предпочтительно, как проанализировано по способу KF.

43. Способ по п. 1, в котором Крофелемер находится в аморфной форме.

44. Способ по п. 1, в котором Крофелемер имеет содержание воды от около 7 до около 17 процентов по массе и имеет общее содержание примеси органических соединений менее чем около 1%, предпочтительно измеренное с помощью ВЭЖХ.