NO163867B

NO163867B - Fremgangsmaate for fremstilling av et enzymderivat.

Info

Publication number: NO163867B
Application number: NO803304A
Authority: NO
Inventors: Richard Anthony Godwin Smith; John Gordon Winchester
Original assignee: Beecham Group Ltd
Priority date: 1979-11-05
Filing date: 1980-11-04
Publication date: 1990-04-23
Also published as: HK65886A; JPS5678590A; ES8204467A1; IE50174B1; NO803304L; ES496586A0; JPH0316114B2; DE3065190D1; GR72121B; IE802277L; NZ195469A; CS391191A3; NO163867C; NL930029I2; IL61408A0; AR224786A1; ZA806641B; CA1174621A; HU185223B; AU534017B2

Description

Oppfinnelsen vedrører en fremgangsmåte for fremstilling av et enzymderivat som omfatter et binært kompleks mellom streptokinase og plasminogen, idet komplekset har det katalytiske sete som er essensielt for fibrinolytisk aktivitet, blokkert av en gruppe som kan fjernes ved hydrolyse, slik at den pseudo-første-orden-hastighetskonstant for hydrolyse av derivatet ligger i området IO-<6> til 10~<3> sek-<1> i isotoniske vandige medier ved pH 7,4 ved 37°C. Disse derivater er anvendelige ved behandling av venetrombose.

Det er kjent at komplekser som er dannet mellom streptokinase og enzymet plasminogen kan anvendes som trombolytiske midler i terapeutisk behandling av venetrombose. Plasminogen er et plasma-3-globulin som er den inaktive forløper for det fibrinolytiske enzym plasmin. Streptokinase er et sekretpro-dukt av hemolytiske streptokokker og kan produseres på en bil-lig måte i store mengder. Hvis streptokinase og plasminogen blandes, dannes det innledningsvis et meget sterkt, men ikke-kovalent,bundet binært kompleks mellom de to. Det inntreffer så en overensstemmende forandring i plasminogenkomponenten, hvilket avdekker et katalytisk sete som har proteolytisk aktivitet. Dette katalytiske sete forårsaker så peptidbinding-oppsplittinger, først i streptokinasekomponenten og deretter i plasminogenet, som omdannes til plasmin. Sluttkomplekset som ble resultatet når streptokinase og plasminogen blandes,

og som løst er blitt betegnet "streptokinase/plasminogen-kompleks", er derfor i virkeligheten et kompleks mellom fragmentert streptokinase og plasmin. Det er for tiden ingen metode som er kjent for å isolere det innledningsvis dannede binære kompleks av streptokinase og plasminogen med et kataly-

tisk sete før interne peptidbinding-oppsplittinger inntreffer, fordi dette labile kompleks umiddelbart nedbrytes. Imidler-

tid er slike komplekser påvist med sitt katalytiske sete blokkert ved blanding av streptokinase og plasminogen i nær-

vær av acyleringsmidlet p-nitrofenyl-p'-guanidinobenzoat (se D.K.McClintock og P.H.Bell: Biochem.Biophys.Res.Comm. 43, 694-702, 1979).

I europeisk patentsøknad nr. 79301773.2 beskrives fibrinolytiske enzymderivater i hvilke det katalytiske sete som er essensielt for fibrinolytisk aktivitet er blokkert av en grup-

pe som kan fjernes ved hydrolyse under visse betingelser.

Ett egnet fibrinolytisk enzym som der er beskrevet, er streptokinase/plasminogen-kompleks. Da det nevnte kompleks produseres ved først å blande streptokinasen og plasminogenet og

deretter blokkere det katalytiske sete, er det produkt som er

- beskrevet i patentskriftet en blokkert form av det nevnte "streptokinase/plasminogen-kompleks", dvs. at det er en blokkert form av et kompleks mellom fragmentert streptokinase og plasmin.

Det er nå funnet at et blokkert derivat av det innledningsvis produserte binære kompleks mellom streptokinase og plasminogen kan isoleres ved å blande de to i nærvær av overskudd av blokkeringsmiddel, og at det er nyttig som tromboly-tisk middel. Videre er det mer homogent, mer effektivt og dets dannelse lettere å styre enn det blokkerte "streptokinase/plasminogen-kompleks" som er beskrevet i ovennevnte europeiske patentsøknad.

Det særpregede ved oppfinnelsen er at man blander streptokinase som omfatter ufragmentert streptokinase som har en molekylvekt på ca. 47000, med plasminogen i nærvær av et overskudd av et blokkeringsmiddel av formel E-F, hvor E er en lokaliserende gruppe som lokaliserer midlet i det katalytiske sete, og F er en gruppe som har evne til overføring fra den lokaliserende gruppe til det katalytiske sete, og deretter eventuelt å isolere de derivater som således er dannet, forutsatt at den gruppe som blokkerer det katalytiske sete, ikke er p-guanidinobenzoylgruppen.

Som angitt ovenfor, har en p-guanidinobenzoylgruppe

vært anvendt av McClintock og Bell for acylering av det innledningsvis dannede kompleks mellom streptokinase og plasminogen. Imidlertid ble det resulterende blokkerte derivat bare dannet under aktivt-sete-titreringer av komplekset. Isoleringen av dette derivat er ikke rapportert. Videre finnes det i teknik-kens stand ingen antydning om at slike blokkerte derivater kunne anvendes som fibrinolytiske midler.

Streptokinasekomponenten i derivatet fremstilt i henhold til oppfinnelsen er nativ ufragmentert streptokinase som har en molekylvekt på ca. 47 000. Det tidligere kjente "streptokinase/ plasminogen-kompleks" inneholder fragmentert streptokinase som har en molekylvekt på under 40 000.

Det spesielle ved derivatet fremstilt i henhold til oppfinnelsen er at etter reduksjon og elektroforetisk analyse i nærvær av natriumdodecylsulfat er bare to polypeptidkjeder påvisbare, én som tilsvarer streptokinase, molekylvekt ca. 47 000, og det annet som tilsvarer plasminogen. I motsetning til dette viser en slik analyse av det tidligere kjente "streptokinase/plasminogen-kompleks" minst tre polypeptid-komponenter, hvilket tilsvarer streptokinasefragment, som har en molekylvekt på under 40 000, og den tunge og lette kjede hos plasmin.

Plasminogenet for anvendelse ved fremstilling av deriva-

tet i henhold til oppfinnelsen kan være hvilket som helst plasminogen som danner et bimolekylært kompleks med streptokinase, f.eks. plasminogen fra mennesker, katter, hunder eller kaniner. Human-plasminogen foretrekkes.

Det essensielle trekk ved den blokkerende gruppe for det katalytiske sete i derivatet er at det må kunne fjernes ved hydrolyse i en hastighet hvor den pseudo-første-ordens-hastighets-konstant for hydrolyse ikke er mindre enn 10-<6>sek-<1> og ikke større enn 10~<3>sek-<1>.

Derivater som har en pseudo-første-ordens-hastighetskonstant på mer enn 10~<3>sek-<1> frigjør uakseptabelt høye nivåer av fritt enzym før de fester seg til fibrinet. Derivater som har pseudo-første-ordens-hastighetskonstanter på mindre enn 10"<6>sek-<1> frigjør enzym for langsomt til å være til noen klinisk nytte.

Derivatene fremstilt ifølge oppfinnelsen kan anvendes enten som profylaktiske eller terapeutiske midler. For profylaktiske formål foretrekkes et derivat som har en lav hydrolysehastighet og derfor lang halveringstid. Slike derivater som er egnet for dette formål har pseudo-første-ordens-hastighetskonstanter for hydrolyse i området 5 x 10~<5> til 1 x IO<-5> sek-<1> og en halveringstid på 3,5-16 timer. For terapeutiske formål foretrekkes et mer hurtighydrolyserende derivat, dvs. et som har en pseudo-første-ordens-hastighetskonstant for hydrolyse i området 5 x 10~<4> til 7 x 10-<5>sek-<1> som tilsvarer en tilnærmet halveringstid på 3 0 minutter til 2 timer.

Pseudo-første-ordens-hastighetskonstanten bestemmes

ved å hydrolysere enzymderivatot under fysiologiske betingelser, dvs. i isotoniske vandige medier ved pH 7,4 og ved 37°C. Ved regulære intervaller tas alikvoter ut og inkuberes med et kromogent eller fluorogent proteasesubstrat, f.eks. S-2251 (H-D-Val-Leu-Lys-p-nitroanilid.2HC1) og omdannelseshas-tigheten av substratet måles.

Hydrolysen følges til det tidspunkt da omdannelseshastig-heten for subtratet når et maksimum. Hatighetskonstanten k beregnes så ved å avsette:

hvor Amaks er maksimumshastigheten ved hvilken en alikvot omdanner substrat og Afc er den hastighet ved hvilken en alikvot omdanner substrat ved tiden t.

Egnede grupper for blokkering av det katalytiske sete inkluderer acylgrupper, f.eks. benzoyl-, substituert-benzoyl-, akryloyl- eller substituert akryloylgrupper. Pseudo-første-ordens-hastighetskonstanten for hydrolyse for ethvert spesielt substituert benzoylenzymderivat kan anslås på basis av Hammett-a-verdien til enhver substituent så snart pseudo-første-ordens-hastighetskonstanten for to eller flere substituerte benzoylderivater er blitt målt, forutsatt at det ikke er noen spesiell vekselvirkning mellom en spesiell substituent og enzymet.

Det erkjennes generelt at Hammett-verdier for meta- og para-substituentene (o^ og a ) gir en akseptabel forutsigelse av hydrolysehastigheter. Videre kan o^- og a^-verdier oppsummeres med rimelig nøyaktighet for beregning av kinetiske egen-skaper ved andre substituerte benzoylgrupper som bærer mer enn én substituent. Hammett-verdier for ortosubstituenter (aQ)

kan ikke oppsummeres med samme pålitelighet som am~ og a - verdier på grunn av steriske effekter. Imidlertid, hvis orto-substituenten er liten og derfor produserer en neglisjerbar sterisk effekt, dvs. når det gjelder fluor, metyl og metoksy, så kan a0-verdien innen generelt aksepterte feilgrenser anvendes alene eller summeres sammen med o - og/eller a -verdier

m p

for beregning av reaksjonshastigheter.

Underkastet disse begrensninger er en substituert benzoylgruppe i hvilken fenylringen bærer en eller flere substituenter, spesielt meta- og/eller para-substituenter hvor summen av Hammett-a-verdiene er i området 0,1 til -1,1, en egnet blokkerende gruppe i overensstemmelse med oppfinnelsen.

Egnede benzoyl- og substituert-benzoylgrupper inkluderer benzoyl, eventuelt substituert med halogen, C1_g-alkyl-C1_6-alkoksy, C^.g-alkanoyloksy, og for Cj^-g-alkanoylamino (RCONH-) . Eksempler inkluderer benzoyl, p-fluorbenzoyl, o-, m- eller p-toluoyl, o-, m- eller p-metoksybenzoyl (dvs. anisoyl) , o-, m-eller p-etoksybenzoyl, 2,4-dimetoksybenzoyl, 3,4-dimetylbenzoyl, 4-butylbenzoyl, 3-metyl-4-metoksybenzoyl, o-acetoksybenzoyl (dvs. acetylsalicyloyl) og p-acetamidobenzoyl. En ytterlige-re aromatisk gruppe er naftoyl.

Unntagelsen fra denne generelle regel er der hvor benzoyl-gruppen inneholder en basisk andel, f.eks. amino, dimetylamino og guanidino. Hydrolysehastigheten til slike derivater er opp til 10 ganger mindre hurtig enn den beregnede verdi.

En annen rekke med acylgrupper som kan anvendes i overensstemmelse med oppfinnelsen, er akryloyl og substituert akryloyl, spesielt cinnamoyl og substituert cinnamoyl som bærer en eller flere substituenter, spesielt meta- og/eller para-substituenter hvor summen av Hammett-overdiene ligger i området -1,0 til +0,15, underkastet til de ovennevnte begrensninger.

Egnede substituerte akryloylgrupper er C^_g-alkylakryloyl, furyl-akryloyl, cinnamoyl, C^_g-alkylcinnamoyl. Spesifikke eksempler inkluderer 3,3-dimetylakryloyl, 2-fury1-3-akryloyl, cinnamoyl og p-metylcinnamoyl.

Derivatet fremstilles i henhold til oppfinnelsen ved å blande streptokinase med plasminogen i nærvær av et blokkeringsmiddel som har formelen E-F, hvor E er en lokaliserende gruppe som lokaliserer midlet i det katalytiske sete, og F er en gruppe som har evne til overføring fra den lokaliserende' gruppe til det katalytiske sete; og deretter eventuelt å isolere det således dannede derivat.

Anvendelsen av midlet E-F representerer en invers blokkerings-metode. Når F er alkylgruppe, inkluderer eksempler på gruppen E p-amidinofenoksy og p-acetamidinofenoksy eller strukturelt like, substituerte fenylgrupper som inneholder en positivt ladet andel i meta- eller para-posisjon.

Eksempler på inverse blokkeringsmidler er: p-amidinofenyl-p<1->fluorbenzoat, p-amidinofenyl-p'-toluat, p-amidinofenyl-p'-anisat, p-amidinofenylbenzoat, p-amidinofenylcinnamat, p-amidinofenyl-p'-metylcinnamat, p-amidinofeny1-3-(2-furyl)-akrylat, p-amidinofenyl-2-naftoat, p-amidinofenyl-3,3-dimetyl-akrylat, p-amidinofenyl-4-butylbenzoat, p-amidinofenyl-2,4-dimetoksybenzoat, p-amidinofenylacetylsalicylat, p-amidinofenyl-4-etoksybenzoat, p-acetamidinofenyl-p'-anisat, p-amidinofenyl-o-toluat, p-amidinofenyl-o-anisat, p-amidinofenyl-3,4-dimetylbenzoat, p-amidinofenyl-3-metyl-4-metoksybenzoat og p-amidinofenyl-4-acetamidobenzoat.

De inverse blokkeringsreaksjoner utføres pas-

sende i vandige, pufrede medier ved et pH-område som ikke er skadelig for enzymet, blokkeringsmidlet eller produktet, f.eks. fra pH 6 til pH 9, og fortrinnsvis ved tilnærmet pH 7.

Reaksjonen utføres generelt ved å blande blokkeringsmidlet med enten streptokinasen eller plasminogenet og deretter tilsette den annen komponent..Molkonsentrasjonen av streptokinasen bør være tilnærmet lik den for plasminogenet. Hos de fleste blokkeringsmidler bør forholdet mellom blokkeringsmiddel og streptokinase som anvendes, være minst 100 på mol-basis. Fortrinnsvis anvendes et 250 gangers overskudd.

Blokkeringsreaksjonen bør utføres ved moderate temperaturer, dvs. fra 0 til 20°C.

Den tid som reaksjonen tillates å løpe i, er avhengig av det anvendte blokkeringsmiddel og den temperatur ved hvilken reaksjonen utføres. En passende tid er ca. 0,5-1 time ved 0°C, men reaksjonen kan tillates å fortsette lenger.

Etter at reaksjonen er fullført, renses derivatet ved standardmetoder, f.eks. dialyse, affinitetskromatografi og ultrafiltrering og gjenvinnes deretter ved standardmetoder, f.eks. frysetørking fra vandige medier. Hvis det er nødvendig, kan materialet tilpasses, f.eks. ved sterilisering. De inverse blokkeringsmidler, E-F, hvor E er p-amidinofenoksy og F er en acyl-gruppe, kan fremstilles ved acylering av et salt av p-hydroksy-benzamidin med et acyleringsderivat av formel F-X, hvor F er som tidligere definert og X er hydroksyl eller et aktivert acyleringsderivat derav, eventuelt i nærvær av en katalysator.

Eksempler på aktiverte acyleringsderivater inkluderer acyl-kloridet eller -bromidet. Disse derivater kan fremstilles ved standardmetoder.

Egnede katalysatorer for denne fremgangsmåte inkluderer tertiære organiske baser, f.eks. pyridin og kondensasjonsfrem-kallende midler, f.eks. dicykloheksylkarbodiimid.

Acyleringsreaksjonen utføres vanligvis i et polart orga-nisk løsningsmiddel som er inert overfor reagensene og produktet. Eksempler på egnede løsningsmidler inkluderer N,N-dimetyl-formamid og dimetylsulfoksyd. Alternativt, hvis katalysatoren er en væske, som når det gjelder pyridin, så kan reaksjonen ut-føres i fravær av løsningsmiddel.

Reaksjonen utføres generelt ved moderate temperaturer, dvs. mindre enn 70°C oggenerelt mindre enn 40°C. Omgivelsestempera-tur er mest bekvemt.

Tiden for at reaksjonen skal forløpe fullstendig bestemmes av de spesifikke reagenser som anvendes, løsningsmidler og temperaturen som reaksjonen utføres ved. Dette kan bestemmes ved å følge reaksjonen, f.eks. ved tynnsjiktkromatografi.

Når reaksjonen er fullført, utvinnes produktet og renses ved standardmetoder.

Følgende eksempler illustrerer fremstilling av derivater i henhold til oppfinnelsen.

Eksempel 1

Fremstilling av frysetørket p- anisovl- streptokinase/ plasminogen- kompleks uten interne peptid- binding-oppsplittin<g>er.

Streptokinase (250 000 enheter) ble oppløst i 2,5 ml av 0,1 M trishydroksymetylmetan-hydroklorid pH 7,4, og 0,25 ml av en løsning av 0,1 M p-amidinofenyl-p'-anisat i dimetylsulfoksyd ble tilsatt. Resultatet ble en svak blakning. Til denne blanding ble tilsatt 0,25 ml av en løsning av human-lys-plasminogen (8,99 mg/ml) i ovennevnte puffer, og løsningen ble blandet grundig og hurtig. Etter henstand på is i 15 minutter ble løsningen lagret på is inntil bruk. Etter tilnærmet 2 timer ble 0,4 ml (40 000 enheter) av materialet fortynnet med 3,0 ml av en oppslemming av L-lysin-sefarose 4B (en 33 vekt/vol.% våt suspensjon i ovennevnte puffer) og stod ved 0°C i 1 time. Gelen ble filtrert på en. glass-sintertrakt ved 4°C under sug og ble vasket med 100 ml av pufferen. Gelen ble eluert under svakt sug med den samme puffer som inneholdt 0,1 M c-aminokap-ronsyre (3 porsjoner å 5 ml). De kombinerte filtrater ble di-alysert i 2 timer ved 4°C mot ammoniumbikarbonatpuffer (50 mM pH 7,0) som inneholdt 2,5 vekt/vol.% mannitol. Produktet ble så frysetørket til 0,799 g av et hvitt faststoff. Tilnærmet 195 mg av dette materiale ble analysert ved hjelp av "slab"-gel-polyakrylamidgel-elektroforese under anvendelse av 10 vekt/vol.% geler i nærvær av natriumdodecylsulfat. To hoved-polypeptidbånd ble observert tilsvarende lys-plasminogen (M.V. 84 000) og streptokinase (M.V. 47 000). Det var også et spor av kontaminerende human-serum-albumin som stam-met fra det kommersielle streptokinasepreparat.

Eksempel 2

Fremstilling av et farmasøytisk, lyofilisert preparat som inneholder p- anisoyl-( streptokinase- plasminogen)-aktivatorkompleks.

Streptokinase- [45,4 ml av en 9,95 mg/ml løsning i 0,03M natriumfosfat og 0,12M natriumglutamat ved pH 7,5] ble blandet med 110 ml av en lysin/mannitol-puffer ved pH 7,0 og 60 ml

. steril glycerol og omrørt i 5 minutter ved 4°C. En steril-

filtrert løsning av p-amidinofenyl-p'anisat i DMSO (15 ml, 20mM) ble så tilsatt i løpet av 2 minutter og blandingen omrørt i 5 minutter ved 4°C. Human-lysplasminogen (71 ml, 11,4 mg/ml) ble tilsatt i løpet av 2 minutter og blandingen omrørt i 60 minutter ved 4°C.

Human-serum-albumin (klinisk kvalitet) (18,9 ml av

20 vekt/vol.%) ble så tilsatt til blandingen og det hele omrørt

i 2 min. ved 4°c. Volumet av reaksjonskarvæsken ble bragt til 400 ml ved tilsetning av lysin/mannitolpuffer. Væsken ble så diafiltrert i ca. 2 1/2 timer ved 18°C inntil 2400 ml av diafiltrat var oppsamlet. yæsken ble filtrert gjennom 14 cm Millipore 0,22 \ i sterilt filter (med et grovt pre-filter) og overført til et sterilt reservoar. 5,0 ml-alikvoter ble dis-pensert hurtig inn i sterile 20 ml frysetørkeglassbeholdere (klarglass), totrinns-hetter ble påsatt og glassbeholderne fryst på frysetørkehyller ved -4°C. Frysetørkingen foregikk i minst 24 timer, og hettene ble lukket under steril ^ og deretter forseglet.

Sammensetningen i hver glassbeholder var som følger:

Eksempel 3

På lignende måte som i eksempel 1 ble 3-metyl, 4-metoksybenzoyl-(streptokinase-plasminogen)-aktivatorkompleks fremstilt under anvendelse av p-amidinofenyl-3-metyl, 4-metoksybenzoesyre istedenfor p-amidinofenyl-p'-anisat.

Eksempel 4

Fremstilling av frysetørket 3, 5- dimetyl- 4- metoksybenzoyl-streptokinase/ plasminogen- kompleks uten interne peptidbinding- oppsplittinger

Streptokinase (20 ml av en 3,58 mg/ml løsning i 0,03 M natriumfosfat, 0,12 M natriumglutamat pH 7,5) ble blandet med 20 ml glycerol og omrørt i 5 minutter ved 4°C. 21,7 mg av

. p-amidinofenyl-3,5-metyl-4-metoksybenzoesyre.HCl i 3,0 ml

dimetylsulfoksyd ble tilsatt og blandingen omrørt i 5 min. ved 4°C. Human-lys-plasminogen (144 mg i 25 ml, 20 mM L-lysin.HCl, 1 vekt/vol.% D-mannitol pH 7,0) ble tilsatt og blandingen om-rørt ved 4°C i 2 timer. Human-serum-albumin (3 ml) av en 20 vekt/vol.% løsning i vann) ble tilsatt, blandingen fortynnet til 250 ml med lysin/mannitol-pufferen og diafilteret i 2 1/2 timer ved 4°C da 1130 ml av diafiltrat ble oppnådd. Restløs-ningen ble frysetørket slik at man fikk 3,018 g av et hvitt pul-ver som, da det ble deacylert, ga et innhold av fri aktivator på tilnærmet 2 3,5 yg/mg.

Biologiske data

Derivatene som ble fremstilt i henhold til eksemplene

1 til 3 ble sammenlignet med p-anisoylderivatet av det kjente "streptokinase/human-plasminogenkompleks" fremstilt som beskrevet i eksempel 22 i europeisk patentsøknad nr. 79301773.2, og med umodifisert streptokinase-plasminogen-aktivatorkompleks, ved systemisk administrering av hver forbindelse til en kanin med en radioaktivt merket blodpropp lokalisert i dens nedre vena cava. Den metode som ble brukt var den som er beskrevet i ovennevnte europeiske patentsøknad, med unntagelse av at tromben bevares ved hjelp av en ulltråd snarere enn ved sam-mensnørende ligaturer.

De gjennomsnittlige lyse-tall ble bestemt på grupper av varierende antall dyr, og disse resultater er vist i tabell I nedenunder.

Disse resultater viser at i denne modell er derivatene

fra eksemplene 1 og 2 nesten dobbelt så effektive med hensyn til oppløsning av tromber som det derivat som ble fremstilt ved blokkering av det fragmenterte streptokinase/plasmin-kompleks.

I tillegg til dette viser tabell I også at aktivt-sete-acylerte derivater av streptokinase-plasminogen-aktivatorkomplekser er mer aktive enn sine umodifiserte motstykker selv når det umodifiserte kompleks er så nylaget som mulig.

En annen dyremodell ble utviklet for testing av fibrinolytiske midler. I denne modell ble en trombe dannet rundt en implantert ulltråd som var forankret i den femorale vene hos en beagle-hund. Blod ble aspirert fra venesegmentet (etter isole-ring ved hjelp av ligaturer) via en kollateral venekanyle.

125

Det aspirerte blod ble radiomerket med J-human-fibrinogen,

(se europeisk patentsøknad nr. 79301773.2) og reinjisert inn

i det evakuerte venesegment sammen med tromboplastin fra kanin-hjerne. Etter koaguleringen ble ligaturene fjernet og den resulterende radiomerkede oklusive trombe holdt på plass ved hjelp av tråden. Tabell II nedenunder oppsummerer de resultater som ble oppnådd da disse hunder ble behandlet med for-skjellige fibrinolytiske midler. Endelig lyse ble bestemt ra-diokjemisk etter fjerning av eventuell gjenværende trombe ved slutten av forsøket. Tabell II viser at p-anisoyl-streptokinase/plasminogen-komplekset fremstilt i henhold til oppfinnel-

sen er signifikant mer aktivt ved to dosenivåer enn det nyla-gede umodifiserte aktivatorkompleks ved de samme dosenivåer.

Kjemiske data

Tabell III gir tilsynelatende første-ordens-hastighets-konstanter for deacyleringen av aktivt-sete-substituerte streptokinase/plasminogen-aktivatorkomplekser ved 37°C/pH 7,4. Dataene illustrerer at deacyleringshastighetskonstanten står

i forhold til den elektroniske struktur av den substituerte benzoylgruppe. Generelt øker elektron-tilbaketrekkende substituenter deacyleringshastigheten, og elektrondonerende grupper gjør at prosessen går langsommere.

Claims

1. Fremgangsmåte for fremstilling av et enzymderivat som omfatter et binært kompleks mellom streptokinase og plasminogen, idet komplekset har det katalytiske sete som er essensielt for fibrinolytisk aktivitet, blokkert av en gruppe som kan fjernes ved hydrolyse, slik at den pseudo-førsteorden-hastighetskonstant for hydrolyse av derivatet ligger i området 10~<6> til IO-<3> sek-<1 >i isotoniske vandige medier ved pH 7,4 ved 37'C, karakterisert ved å blande streptokinase som omfatter ufragmentert streptokinase som har en molekylvekt på ca. 47000, med plasminogen i nærvær av et overskudd av et blokkeringsmiddel av formel E-F, hvor E er en lokaliserende gruppe som lokaliserer midlet i det katalytiske sete, og F er en gruppe som har evne til overføring fra den lokaliserende gruppe til det katalytiske sete, og deretter eventuelt å isolere de derivater som således er dannet, forutsatt at den gruppe som blokkerer det katalytiske sete, ikke er p-guanidinobenzoylgruppen.

2. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved at det som enzym-derivat fremstilles p-anisoyl-streptokinase/plasminogen-kompleks uten intern peptidbindingsspalting.

3. Fremgangsmåte som angitt i krav 1 til 2, karakterisert ved at det som middel E-F anvendes p-amidinofenyl-p'-anisat.

4. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved at det som gruppe som kan fjernes ved hydrolyse, anvendes en som er valgt blant benzoyl, 2-toluyl, 4-fluorbenzoyl, 3-metyl-4-anisoyl, 3,5-dimetyl-4-anisoyl, 4-nitrobenzoyl og 4-klorbenzoyl.

5. Fremgangsmåte som angitt i krav 1 eller 2, karakterisert ved at det anvendes en plasminogen-komponent som omfatter human-plasminogen.

6. Fremgangsmåte som angitt i krav 2 eller 5, karakterisert ved at det som plasminogen anvendes human-lys-plasminogen.