DK158994B

DK158994B - Analogifremgangsmaade til fremstilling af enzymderivater indeholdende et streptokinase/plasminogen-kompleks

Info

Publication number: DK158994B
Application number: DK468880A
Authority: DK
Inventors: Richard Anthony Godwin Smith; John Gordon Winchester
Original assignee: Beecham Group Ltd
Priority date: 1979-11-05
Filing date: 1980-11-04
Publication date: 1990-08-13
Also published as: HK65886A; DK468880A; US4808405A; IE50174B1; DE3065190D1; DK158994C; IL61408A0; IL61408A; EP0028489B1; AU534017B2; IE802277L; JPS5678590A; NO803304L; NL930029I1; CS391991A3; JPH0316114B2; ES496586A0; NO163867B; NL930029I2; HU185223B

Description

DK 158994 B

Den foreliggende opfindelse angår en analogifremgangsmåde til fremstilling af et hidtil ukendt enzymderivat indeholdende et binært kompleks mellem ufragmenteret streptokinase med en molekylvægt på ca.

47.000 og plasminogen, hvor der ikke er interne peptidbindingsspalt-5 ninger i streptokinasekomponenten og i plasminogenkomponenten, i hvilket kompleks det katalytiske sted, som er essentielt for fibrino-lytisk aktivitet, er blokeret med en gruppe, som kan fjernes ved hydrolyse således, at pseudo-første ordenshastighedskonstanten for hydrolysen af derivatet er i området 10sekund'*- til 10'·* sekund'*-10 i isotonisk vandige medier med pH-værdi 7,4 ved 37°C, hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved, at man blander streptokinase med plasminogen i nærværelse af et overskud af et blokeringsmiddel med formlen A-B eller formlen E-F, hvor A betegner en gruppe, som er selektiv for det katalytiske sted, der er essentielt for fibrino-15 lytisk aktivitet, og som er i stand til at overføres fra gruppen B til det katalytiske sted, og B betegner en gruppe, som letter tilknytningen af A til enzymet; E betegner en lokaliseringsgruppe, som lokaliserer midlet på det katalytiske sted, og F betegner en gruppe, som er i stand til at overføres fra lokaliseringsgruppen til det 20 katalytiske sted, og derefter eventuelt isolerer de således dannede enzymderivater med det forbehold, at den gruppe, der blokerer det katalytiske sted, ikke er en p-guanidinobenzoyl gruppe. De ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen fremstillede derivater er nyttige ved behandlingen af venøs thrombose.

25 Det er kendt, at komplekser dannet mellem streptokinase og plasminogen kan anvendes som thrombolytiske midler ved den terapeutiske behandling af venøs thrombose. Plasminogen er et p1asma-0-globulin, som er den inaktive precursor for det fibrinolytiske enzym plasmin. Streptokinase er et sekretionsprodukt af hæmolytiske streptococci og 30 kan produceres billigt i store mængder. Når streptokinase og plasminogen blandes, dannes der først et meget stærkt, men ikke-covalent, bundet binært kompleks mellem disse to. Derefter sker der en konfor-mationsmæssig forandring i plasminogenkomponenten, som afdækker et katalytisk sted med proteolytisk aktivitet. Dette katalytiske sted 35 forårsager derefter peptidbindingsspaltninger, først i streptokinase-

DK 158994 B

2 komponenten og dernæst i plasminogenet, som omdannes til plasmin. Det endelige kompleks, der fremkommer, når streptokinase og plasminogen blandes, og som løst er blevet betegnet "streptokinase/plasminogen-kompleks", er derfor i virkeligheden et kompleks mellem fragmenteret 5 streptokinase og plasmin. Der kendes for tiden ingen metode til isolering af det til at begynde med dannede binære kompleks af streptokinase og plasminogen med et katalytisk sted, før der sker indre peptidbindingsspaltninger, eftersom dette labile kompleks straks nedbrydes. Disse komplekser er imidlertid blevet påvist med deres 10 katalytiske sted blokeret ved blanding af streptokinase og plasminogen i nærværelse af acyleringsmidlet p-nitrophenyl-p'-guanidinoben-zoat (jfr. DK McClintrock og P H Bell, Biochem Biophys Res Comm 43, 694-702, 1979).

I europæisk patentansøgning nr. 79301773 beskrives fibrinolytiske 15 enzymderivater, hvori det katalytiske sted, der er essentielt for den fibrinolytiske aktivitet, er blokeret med en gruppe, som kan fjernes ved hydrolyse under visse betingelser. Et egnet fibrinolytisk enzym, der er beskrevet i ovenstående europæiske patentansøgning, er strep-tokinase/plasminogen-kompleks. Da dette kompleks dannes ved, at man 20 først blander streptokinaset og plasminogenet og derefter blokerer det katalytiske sted, er det produkt, der beskrives i den nævnte patentansøgning, en blokeret form af "streptokinase/plasminogen-komplekset" , dvs. en blokeret form af et kompleks mellem fragmenteret streptokinase og plasmin.

25 Det har nu vist sig, at et blokeret derivat af det til at begynde med producerede binære kompleks mellem streptokinase og plasminogen kan isoleres ved at blande de to i nærværelse af overskud af blokerings-middel, og at et sådant derivat er nyttigt som thrombolytisk middel. Endvidere er det mere homogent, mere effektivt og dets dannelse 30 lettere at overvåge end det blokerede "streptokinase/ plasminogen- kompleks", der er beskrevet i europæisk patentansøgning nr. 79301773.

Som anført ovenfor er en p-guanidinobenzoylgruppe blevet anvendt af McClintock og Bell til acylering af det til at begynde med dannede kompleks mellem streptokinase og plasminogen. Det resulterende blo-35 kerede derivat blev imidlertid kun dannet under aktiv-sted-titrering-

DK 158994 B

3 er af komplekset. Der er ikke blevet rapporteret isolering af dette derivat. Endvidere er der ikke nogen antydning i den kendte teknik af, at sådanne blokerede derivater kunne anvendes som fibrinolytiske midler.

5 Streptokinasekomponenten i det ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen fremstillede enzymderivat er nativt ufragmenteret streptokinase med en molekylvagt på ca. 47.000. Det hidtil kendte "streptokinase/plas-minogen-kompleks" indeholder fragmenteret streptokinase, som har en molekylvægt på mindre end 40.000.

10 Det karakteristiske træk ved det her fremstillede enzymderivat er, at der efter reduktion og elektroforetisk analyse i nærværelse af na-triumdodecylsulfat kun kan påvises to polypeptidkæder, den ene svarende til streptokinase, molekylvægt ca. 47.000, og den anden til plasminogen. I modsætning hertil viser en sådan analyse af det hidtil 15 kendte "streptokinase/plasminogen-kompleks" mindst tre polypeptid-komponenter, som svarer til streptokinasefragmentet, med en molekylvægt på mindre end 40.000, og den tunge og lette kæde af plasmin.

Plasminogenet til anvendelse ved fremstilling af det her fremstillede enzymderivat kan være et hvilket som helst plasminogen, som danner et 20 bimolekylært kompleks med streptokinase, f.eks. humant plasminogen, katteplasminogen, hundeplasminogen eller kaninplasminogen. Der foretrækkes humant plasminogen.

Det essentielle træk ved den blokerende gruppe for det katalytiske sted i det her fremstillede enzymderivat er, at det skal være fjer-25 neligt ved hydrolyse ved en hastighed, hvor pseudo-første ordenshastighedskonstanten for hydrolysen ikke er mindre end 10 sekund"^ og ikke over 10"^ sekund"^. Hastighedskonstanten bør fortrinsvis være i området 10- 10sekund-

Derivater med en pseudo-første ordenshastighedskonstant på over 10"^ 30 sekund-·^· frigør uacceptabelt høje niveauer af frit enzym, før de knyttes til fibrin. Derivater med pseudo-første ordenshastighedskonstanter på mindre end ΙΟ"** sekund"^ frigører enzym for langsomt til at være af nogen klinisk anvendelighed.

DK 158994 B

4

De her fremstillede enzymderivater kan anvendes som enten profylaktiske eller terapeutiske midler. Til profylaktiske formål foretrækkes et derivat med en ringe hydrolysehastighed og derfor lang halveringstid. Sådanne derivater, der egner sig til dette formål, har pseudo-5 første ordenshastighedskonstanter for hydrolyse i området 5 x 10"^ - 1 x 10"·* sekund"^- og halveringstid på 3,5 - 16 timer. Til terapeutiske formål foretrækkes et hurtigere hydrolyserende derivat, dvs. et derivat med en pseudo-første ordenshastighedskonstant for hydrolyse i området 5 x 10'^ - 7 x 10'^ sekund'^·, hvilket svarer til 10 en omtrentlig halveringstid på 30 minutter - 2 timer.

Pseudo-første ordenshastighedskonstanten bestemmes ved at hydrolysere enzymderivatet under fysiologiske betingelser, dvs. i isotoniske vandige medier med pH-værdi 7,4 og ved 37°C. Med regelmæssige mellemrum udtages der alikvoter, som inkuberes med et chromogent eller 15 fluorogent proteasesubstrat såsom S-2251 (H-D-Val-Leu-Lys-p-nitroani-lid 2HC1) , og hastigheden for substratets omdannelse måles.

Hydrolysen følges, indtil substratets omdannelseseshastighed når et maksimum. Hastighedskonstanten k beregnes derefter ved grafisk at afbilde

At 20 log- (1- /A ) som funktion af t, &e ' max hvor A er den maksimale hastighed, ved hvilken en alikvot omdanner max substratet, og At er den hastighed, ved hvilken en alikvot omdanner substratet ved tiden t.

Egnede grupper til blokering af det katalytiske sted er acylgrupper 25 såsom benzoyl, substituerede benzoylgrupper, acryloyl eller substituerede acryloylgrupper. Pseudo-første ordenshastighedskonstanten for hydrolysen af et hvilket som helst bestemt substitueret benzoylenzym-derivat kan bestemmes på basis af Hamme tt-o-værdien for en hvilken som helst substituent, når først pseudo-første ordenshastighedskon-30 stanten for to eller flere substituerede benzoylderivater er blevet målt, forudsat, at der ikke er nogen speciel samvirken mellem en bestemt substituent og enzymet.

DK 158994 B

5

Det er almindeligt anerkendt, at Hammett-værdier for meta- og para-substituenter (am og σρ) giver en acceptabel forudsigelse af hydrolysehastighederne. Endvidere kan am~ og σρ-værdierne opsummeres med rimelig nøjagtighed til beregning af kinetiske egenskaber af andre 5 substituerede benzoylgrupper, som bærer mere end én substituent.

Hammett-værdier for ortho-substituenter (aQ) kan ikke opsummeres med samme pålidelighed som am- og σρ-værdier på grund af steriske effekter. Når imidlertid ortho-substituenten er lille og derfor giver en negligibel sterisk effekt, såsom i tilfælde af fluor, methyl og 10 methoxy, kan aQ-værdien inden for almindeligt accepterede fejlgrænser anvendes alene eller summeres med am- og/eller σρ-værdien til beregning af reaktionshastighederne.

Under disse begrænsninger er en substitueret benzoylgruppe, hvori phenylringen bærer én eller flere substituenter, især meta- og/eller 15 parasubstituenter, hvor summen af Hammett σ-værdierne er i området 0,1 - -1,1, en egnet blokeringsgruppe i overensstemmelse med den foreliggende opfindelse.

Egnede benzoyl- og substituerede benzoylgrupper er benzoyl, eventuelt substitueret med halogen, g-alkyl, Cp g-alkoxy, g-alkanoyloxy 20 og/eller g-alkanoylamino(RCONH-). Som eksempler kan nævnes benzoyl, p-fluorbenzoyl, o-, m- eller p-toluoyl, o-, m-eller p-methoxy-benzoyl (f.eks. anisoyl), o-, m- eller p-ethoxybenzoyl, 2,4-dimeth-oxybenzoyl, 3,4-dimethylbenzoyl, 4-butylbenzoyl, 3-methyl-4-methoxy-benzoyl, o-acetoxybenzoyl (f.eks. acetylsalicyloyl) og p-acetamido-25 benzoyl. En yderligere aromatisk gruppe er naphthoyl.

Undtagelsen fra denne almindelige regel er, hvor benzylgruppen indeholder en basisk del såsom amino, dimethylamino eller guanidino.

Sådanne derivaters hydrolysehastighed er op til ti gange langsommere end den beregnede værdi.

30 En anden serie acylgrupper, som kan anvendes i overensstemmelse med den foreliggende opfindelse, er acryloyl og substitueret acryloyl, især cinnamoyl og substituerede cinnamoylgrupper, som bærer én eller flere substituenter, især meta- og/eller para-substituenter, hvor

DK 158994 B

6 summen af Hammett-er-værdierne er i området -1,0 til +0,15, med de ovenfor nævnte begrænsninger.

Egnede substituerede aeryloylgrupper er g -alkylacryloyl, furyl- acryloyl, cinnamoyl og ^-alkyl-cinnamoy1. Som specifikke eksempler 5 kan nævnes 3,3-dimethylacryloyl, 2-furyl-3-acryloyl, cinnamoyl og p-methylcinnamoyl.

Det her fremstillede enzymderivat fremstilles ved at blande streptokinase med plasminogen i nærværelse af et blokeringsmiddel, som har formlen A-B eller formlen E-F, hvor A betegner en gruppe, som er 10 selektiv for det katalytiske sted, der er essentielt for den fibrino-lytiske aktivitet, og som er i stand til at overføre fra gruppen B til det katalytiske sted, og B betegner en udtrædende gruppe ("leaving group"), som letter A's tilknytning af enzymet; E betegner en lokaliseringsgruppe, som lokaliserer midlet på det katalytiske sted, 15 og F betegner en gruppe, som er i stand til at overføre fra den lokaliserende gruppe til det katalytiske sted, hvorefter man eventuelt isolerer det således dannede derivat med det forbehold, at den gruppe, der blokerer det katalytiske sted, ikke er en p-guanidinoben-zoylgruppe.

20 Anvendelsen af midlet A-B udgør en direkte blokeringsmetode. Midler, der virker på denne måde, kendes.

Anvendelsen af midlet E-F repræsenterer en omvendt blokeringsmetode.

Når F er en acylgruppe, er eksempler på gruppen E p-amidinophenoxy og p-acetamidinophenoxy eller strukturelt lignende substituerede phe-25 noxygrupper indeholdende en positivt ladet del i meta- eller para-stilling.

Eksempler på omvendte blokeringsmidler er; p-amidinophenyl-p'-fluor-benzoat, p-amidinophenyl-pf-toluat, p-amidinophenyl-p'-anisat, p-ami-dinophenylbenzoat, p-amidinophenyl-cinnamat, p-amidinophenyl-p'-me-30 thylcinnamat, p-amidinophenyl-3-(2-furyl)acrylat, p-amidinophenyl-2-naphthoat, p-amidinophenyl-3,3-dimethylacrylat, p-amidinophenyl-4-butylbenzoat, p - amidinophenyl -2,4- dimethoxybenzoat, p - amidinophenyl -ace tylsalicylat, p - amidinophenyl -4 - ethoxybenzoat, p - ace tamidinophen-

DK 158994 B

7 yl-p'-anisat, p-amidinophenyl-o-toluat, p-amidinophenyl-o-anisat, p-amidinophenyl-3,4-dimethylbenzoat, p-amidinophenyl-3-methyl-4-meth-oxybenzoat og p-amidinophenyl-4-acetamidobenzoat.

De direkte og omvendte blokeringsreaktioner udføres hensigtsmæssigt i 5 vandige pufrede medier i et pH-område, som ikke er skadeligt for enzymet, blokeringsmidlet eller produktet, f.eks. fra pH-værdi 6 til pH-værdi 9, fortrinsvis ved ca. pH-værdi 7.

Reaktionen udføres almindeligvis ved at blande blokeringsmidlet med enten streptokinase eller plasminogen og derefter tilsætte den anden 10 komponent. Den molære koncentration af streptokinase bør være ca. lig med den molære koncentration af plasminogen. Med de fleste blokeringsmidler bør det anvendte forhold mellem blokeringsmiddel og streptokinase være mindst 100:1 på molær basis. Der anvendes fortrinsvis et 250 ganges overskud. Med meget reaktive omvendte eller 15 direkte blokeringsmidler kan der anvendes et lavere molært forhold.

Blokeringsreaktionen bør udføres ved moderate temperaturer, dvs. fra 0°C til 20°C.

Den tid, i hvilken reaktionen lades forløbe, afhænger af det anvendte blokeringsreagens og den temperatur, ved hvilken reaktionen udføres.

20 En hensigtsmæssig tid er ca. 0,5 - 1 time ved 0°C, men reaktionen kan lades fortsætte i længere tid.

Når reaktionen er tilendebragt, renses derivatet ved gængse metoder såsom dialyse, affinitetschromatografi og ultrafiltrering, hvorefter det udvindes ved standardmetoder såsom frysetørring fra vandige 25 medier. Om nødvendigt kan materialet, f.eks. ved sterilisering, tilpasses til intravenøs administration til mennesker.

De omvendte blokeringsmidler E-F, hvor E er p-amidinophenoxy, og F er en acylgruppe, fremstilles ved at acylere et salt af p-hydroxybenz-amidin med et acyleringsderivat med formlen F-X, hvor F har den 30 ovenfor anførte betydning, og X betegner en hydroxylgruppe eller et aktiveret acyleringsderivat deraf, eventuelt i nærværelse af en katalysator.

DK 158994 B

8

Eksempler på aktiverede acyleringsderivater er acylchloridet eller -bromidet. Disse derivater kan fremstilles ved gængse metoder.

Egnede katalysatorer til denne fremgangsmåde er tertiære og organiske baser såsom pyridin samt kondens at ions fremmende midler såsom dicyclo-5 hexylcarbodiimid.

Acyleringsreaktionen udføres almindeligvis i et polært organisk opløsningsmiddel, som er inert over for reagenser og produktet. Eksempler på egnede opløsningsmidler er N,N-dime thylformamid og di-methylsulfoxid. Alternativt kan reaktionen, når katalysatoren er en 10 væske, således som det er tilfældet med pyridin, udføres i fravær af et opløsningsmiddel.

Reaktionen udføres almindeligved ved moderate temperaturer, dvs. mindre end 70°C og almindeligvis mindre end 40°C; det er mest hensigtsmæssigt at anvende omgivelsestemperatur.

15 Den tid, det taget for reaktionen at forløbe til ende, afhænger af de specifikke reagenser, der anvendes, opløsningsmidlet og den temperatur, ved hvilken reaktionen udføres. Dette kan afgøres ved at følge reaktionen, f.eks. med tyndtlagschromatografi.

Når reaktionen er tilendebragt, udvindes produktet og renses ved 20 standardmetoder.

Med produktet kan der fremstilles et farmaceutisk præparat, som omfatter en farmaceutisk acceptabel bærer sammen med et enzymderivat, som omfatter et binært kompleks mellem ufragmenteret streptokinase med en molekylvægt på ca, 47.000 og plasminogen, hvor der ikke er 25 interne peptidbindingsspaltninger i streptokinasekomponenten og i plasminogenkomponenten, i hvilket kompleks det katalytiske sted, som er essentielt for den fibrinolytiske aktivitet, er blokeret med en gruppe, som kan fjernes ved hydrolyse således, at pseudo-første ordenshastighedskonstanten for hydrolysen af derivatet er i området 30 10"^ sekunder"^· til 10"^ sekunder"^- i isotoniske vandige medier ved pH-værdi 7,4 ved 37°C.

DK 158994 B

9

De ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen fremstillede enzymderivater kan anvendes i præparater, der i overensstemmelse med gængse procedurer formuleres som farmaceutiske præparater, der egner sig til intravenøs administration til mennesker.

5 Typiske præparater til intravenøs administration er opløsninger af det sterile derivat i steril isotonisk vandig puffer. Om nødvendigt kan præparatet indeholde et opløseliggørende middel for at holde derivatet i opløsning og et lokalbedøvelsesmiddel såsom lignocain til lindring af smerten på injektionsstedet. Almindeligvis vil enzymderi-10 vatet blive leveret i enhedsdosisform, f.eks. som et tørt pulver eller et vandfrit koncentrat i en hermetisk lukket beholder såsom en ampul eller en pose, der angiver mængden af enzym i aktivitetsenheder, samt har en angivelse af den tid, i løbet af hvilken det frie enzym vil blive frigjort. Når derivatet skal administreres ved in-15 fusion, vil derivatet blive leveret med en infusionsflaske indeholdende sterilt vand til injektion af farmaceutisk kvalitet. Når derivatet skal administreres ved injektion, leveres derivatet med en ampul af sterilt vand til injektion. Det injicerbare eller infuser-bare præparat fremstilles ved blanding af bestanddelene før admini-20 strationen.

Den mængde materiale, der administreres, vil afhænge af det omfang af fibrinolyse, der ønskes, og den hastighed, hvorved den ønskes, den thromboemboliske tilstands sværhedsgrad og koagulatets sted og størrelse. Således vil f.eks. en patient med lungeemboli eller en stor 25 livstruende tiltagende ileofemoralthrombus kræve administration af en bolus med hurtigtvirkende materiale. Når det på den anden side ønskes at forebygge dannelsen af postoperative thrombi, kræves der en lille mængde langsomtvirkende materiale. Den nøjagtige dosis, der skal anvendes, og administrationsmåden, kan afhængigt af omstændighederne 30 bestemmes af den læge, der overvåger behandlingen. Almindeligvis vil imidlertid en patient, som behandles for en thrombus af middelstørrelse, modtage en daglig dosis på 0,1 - 1,0 mg/kg-^ legemsvægt, enten ved injektion i op til 8 doser eller ved infusion. En fordel ved det her fremstillede derivat i forhold til hidtil kendte thrombolytiske 35 midler såsom streptokinase er, at det kan indgives ved injektion i

DK 158994 B

10 stedet for ved kontinuerlig infusion, og at det kan administreres ved kun én eller to injektioner pr. dag.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen belyses nærmere ved følgende eksempler : 5 EKSEMPEL 1.

Fremstilling af frysetørret-p-anisoyl streptokinase/plasminogen-kompleks uden interne peptidbindingsspaltninger.

Streptokinase (250.000 enheder, Kabi, Stockholm, Sverige) opløses i 0,1M trishydroxymethylmethanhydrochlorid ved pH-værdi 7,4 (2,5 ml), 10 og der tilsættes en opløsning af 0,1M p-amidinophenyl-p'-anisat i dimethylsulfoxid (0,25 ml). Der fremkommer en svag uklarhed. Til denne blanding sættes 0,5 ml af en opløsning af humant lys-plasminogen (8,99 mg/ml i den ovennævnte puffer) (Kabi, Stockholm), og opløsningen blandes grundigt og hurtigt. Efter henstand i is i 15 15 minutter opbevares opløsningen i is, indtil den anvendes. Efter ca. 2 timers forløb fortyndes 0,4 ml (40.000 enheder) af materialet med 3,0 ml af en opslæmning af L-lysin-sepharose 4B (en 33% våd vægt/rumfang-suspension i den ovennævnte puffer) og henstår ved 0°C i 1 time.

Gelen filtreres på en glasfiltertragt ved 4°G under sugning og vaskes 20 med pufferen (100 ml). Gelen elueres under svag sugning med samme puffer indeholdende 0,1M e-aminocaprylsyre (3 portioner på 5 ml). De kombinerede filtrater dialyseres i 2 timer ved 4°C mod ammonium-bicarbonatpuffer (50 mM pH-værdi 7,0) indeholdende 2,5% w/v mannitol. Produktet frysetørres derefter til 0,799 g af et hvidt fast stof. Ca.

25 195 mg af dette materiale analyseres ved pladegel af polyacrylamid- gel-elektroforese under anvendelse af 10% w/v-geler i nærværelse af natriumdodecylsulfat. Der iagttages to hovedpolypeptidbånd svarende til lys-plasminogen (molekylvægt 84.000) og streptokinase (molekylvægt 47.000). Der iagttages også spor af forurenende humant serum -30 albumin afledt fra det kommercielle streptokinasepræparat.

EKSEMPEL 2.

DK 158994 B

11

Fremstilling af et farmaceutisk lyofiliseret præparat indeholdende p-anisoyl-(streptokinase-plasminogen)aktivatorkompleks.

Streptokinase (45,4 ml af en 9,95 mg/ml opløsning i 0,03M natrium-5 phosphat og 0,12M natriumglutamat ved pH-værdi 7,5) blandes med en lysin/mannitol-puffer (110 ml) ved pH-værdi 7,0 og sterilt glycerol (60 ml) og omrøres i 5 minutter ved 4°C. Derefter tilsættes en steril filtreret opløsning af p-amidinophenyl-p'-anisat i dimethylsulfoxid (15 ml, 20 mM) i løbet af 2 minutter, og blandingen omrøres i 5 10 minutter ved 4°C. Humant lys-plasminogen (71 ml, 11,4 mg/ml - Kabi, Stockholm) tilsættes i løbet af 2 minutter, og blandingen omrøres i 60 minutter ved 4°C.

Humant serumalbumin (klinisk kvalitet) (18,9 ml, 20% w/v) tilsættes derefter til blandingen, og det hele omrøres i 2 minutter ved 4°C.

15 Rumfanget af væske i reaktionsbeholderen bringes op på 400 ml ved tilsætning af lysin/mannitol-puffer. Væsken diafiltreres derefter i ca. 2 1/2 time ved 18°C, indtil der er samlet 2400 ml diafiltrat.

Væsken filtreres gennem 14 cm Millipore 0,22 μ sterilt filter (med et groft forfilter) og overføres til et sterilt reservoir. Alikvoter på 20 5,0 ml fordeles hurtigt i sterile 20 ml's frysetørringsglas (klart glas), der påføres to-trinshætter, og glassene fryses på frysetørre-bakker ved -40°C. Frysetørringen sker over mindst 24 timer, -og hætterne lukkes derefter under steril N2, hvorpå de forsegles.

Sammensætningen i hvert glas er følgende: 25 p-anisoyl- (streptokinase-plasminogen)- aktivatorkompleks 4 - 6 mg L-lysin.HCl 22,8 mg D-mannitol 50 mg p - amidinophenyl -p' - anisat <50 /tg 30 natriumchlorid spor EKSEMPEL 3.

DK 158994 B

12 På lignende måde som beskrevet i eksempel 1 fremstilles 3-methyl, 4-methoxybenzoyl- (streptokinase-plasminogen) -aktivatorkompleks under anvendelse af p-amidinophenyl-3-methyl, 4-methoxybenzoesyre i stedet 5 for p-amidinophenyl-p'-anisat.

EKSEMPEL 4.

Fremstilling af frysetørret 3,5-dimethyl-4-methoxybenzoyl streptoki-nase/plasminogen-kompleks uden indre peptidbindingsspaltninger.

Streptokinase (20 ml af en 3,58 mg/ml opløsning i 0,03M natriumphos-10 phat, 0,12M natriumglutamat, pH-værdi 7,5) blandes med glycerol (20 ml) og omrøres i 5 minutter ved 4°C. Der tilsættes p-amidinophenyl- 3,5-dimethyl-4-methoxybenzoesyre.HCl (21,7 mg) i dimethylsulfoxid, og blandingen omrøres i 5 minutter ved 4°G. Der tilsættes humant lys-plasminogeh (144 mg i 25 ml, 20 mM L-lysin.HCl, 1% w/v D-mannitol, 15 pH-værdi 7,0), og blandingen omrøres ved 4°G i 2 timer. Der tilsættes humant serumalbumin (3 ml af en 20% w/v opløsning i vand), blandingen fortyndes til 250 ml med lysin/mannitol-puffer og diafiltreres i 2 1/2 time ved 4°C, hvorved der fås 1130 ml diafiltrat. Den resterende opløsning frysetørres, hvorved der fås 3,018 g af et hvidt pulver, 20 som ved deacylering giver et frit aktivatorindhold på ca. 23,5 /ig/mg.

Biologiske data.

De derivater, som fremstilles i henhold til eksemplerne 1-3 sammenlignes med p - anisoyIderivatet af det kendte "streptokinase/humant plasminogen-kompleks", der er fremstillet som beskrevet i eksempel 22 25 i europæisk patentansøgning nr. 79301773, og med umodificeret streptokinase-plasminogen aktivatorkompleks, idet hver forbindelse systematisk administreres til en kanin med et radioaktivt mærket koagu-lat lokaliseret i kaninens inferior vena cava. Den anvendte metode er som beskrevet i den ovennævnte europæiske patentansøgning, bortset 30 fra, at thrombus tilbageholdes med en uldtråd i stedet for med snørende ligaturer.

DK 158994 B

13

De gennemsnitlige lysistal bestemmes i grupper af forskellige antal dyr, og disse resultater er vist i nedenstående tabel I:

Tabel I

Antal dyr Gennemsnitlig 5 lysis (%) 1. Kontroller, der har fået saltvand 8 3 ± 1 2. Umodificeret "streptokinase-plasmi-10 nogen aktivatorkompleks" fremstillet ud fra ækvimolære mængder af begge pro- 6 20+4 teiner ved 0eC i 10 minutter og injiceret umiddelbart derefter 15 3. Umodificeret commercielt streptokinase-plasminogen aktivatorkompleks 5 14 ± 4 (Behringwerke) 4. p-anisoyl-(streptokinase-plasmino-20 gen aktivatorkompleks) med interne peptidbindingsspaltninger fremstillet 5 24+8 som beskrevet i eksempel 22 i europæisk patentansøgning nr. 79301773 25 5. p-anisoyl-(streptokinase-plasmino gen aktivatorkompleks) uden peptidbindingsspaltninger fremstillet som 5 42 +6 beskrevet i eksempel 1 30 6. et farmaceutisk lyofiliseret præparat af p-anisoyl-(streptokinase-plasmi- 13 41 ± -6 nogen aktivatorkompleks) fremstillet som beskrevet i eksempel 2 35 7. 3-methyl, 4-methoxybenzoyl-(streptokinase-plasminogen aktivatorkompleks) 5 29 ± 5 fremstillet som beskrevet i eksempel 3

Disse resultater viser, at derivaterne i henhold til eksempel 1 og 2 40 i denne model er næsten dobbelt så virksomme til lysering af thrombi

DK 158994 B

14 som det derivat, der fremstilles ved blokering af det fragmenterede streptokinase-plasmin-kompleks.

Desuden viser tabel I også, at de aktiv-sted-acylerede derivater af streptokinase-plasminogen aktivatorkomplekser er mere aktive end 5 tilsvarende umodificerede komplekser, selv når det umodificerede kompleks er så frisk fremstillet som muligt.

Der udvikles en anden dyremodel til afprøvning af fibrinolytiske midler. I denne model dannes en thrombus omkring en implanteret uldtråd, som er forankret i lårvenen hos en beagle-hund. Blod suges 10 fra venesegmentet (efter isolering med ligaturer) via en kollateral 125 venekanyle. Det opsugede blod mærkes radioaktivt med I-humant fibrinogen, (jfr. europæisk patentansøgning nr. 79301773.2) og geninjiceres i det evakuerede venesegment sammen med kaninhj erne thromboplastin. Efter koagulering fjernes ligaturerne, og den resulterende 15 radioaktivt mærkede occlusive thrombus holdes på plads af tråden.

Tabel II sammenfatter de resultater, der opnås, når disse hunde behandles med forskellige fibrinolytiske midler. Den endelige lysis bestemmes radiokemisk efter udskæring af eventuelt tilbageværende thrombus ved forsøgets slutning. Tabel II viser, at p-anisoyl strep-20 tokinase-plasminogen-komplekset, der fremstilles i henhold til den foreliggende opfindelse, er væsentlig mere aktivt i to dosisniveauer end det frisk fremstillede umodificerede aktivatorkompleks i samme do s i snive auer.

Kemiske Data.

25 Tabel III giver tilsyneladende første ordenskonstanter for deacyle-ringen af aktivsted-substituerede streptokinase-plasminogen aktivatorkomplekser ved 37°C/pH-værdi 7,4. De anførte data viser, at de-acyleringshastighedskonstanten har relation til substituerede benz-oylgruppers elektroniske struktur. Almindeligvis forøger elektrontil-30 bageholdende substituenter deacyleringshastigheden, og elektronafgivende grupper nedsætter processens hastighed.

DK 158994 B

15

Tabel II

Aktivitet af enzymderivater i en hundemodel for venøs thrombose.

Enzymderivat Dosis Antal dyr Gennemsnitlig IU/kg lysis % 5 _ 1. Kontroller, der får saltvand - 7 22 ± 10 2. Umodificeret "streptokinase-10 plasminogen aktivatorkompleks" fremstillet ud fra ækvimolære 1500 5 10+2 mængder af de to proteiner ved 0°C i 10 minutter og injiceret straks derefter 15 _ 3. Ditto 2500 5 25 ± 18 4. p-anisoyl-(streptokinase- plasminogen) -aktivatorkompleks 1500 5 79+14 20 fremstillet som beskrevet i eksempel 2 5. Ditto 2500 5 85+14 25 6. Streptokinase 1500 3 24+21

Claims

1. Analogifremgangsmåde til fremstilling af et enzymderivat indeholdende et binært kompleks mellem ufragmenteret streptokinase med en 20 molekylvægt på ca. 47.000 og plasminogen, hvor der ikke er interne peptidbindingsspaltninger i streptokinasekomponenten og i plasmino-genkomponenten, i hvilket kompleks det katalytiske sted, som er essentielt for fibrinolytisk aktivitet, er blokeret med en gruppe, som kan fjernes ved hydrolyse således, at pseudo-første ordenshastig-25 hedskonstanten for hydrolysen af derivatet er i området 10"^ sekund-^ til 10-3 sekund-1 i isotonisk vandige medier med pH-værdi 7,4 ved 37°C, kendetegnet ved, at man blander streptokinase med plasminogen i nærværelse af et overskud af et blokeringsmiddel med form-30 len A-B eller formlen E-F, hvor A betegner en gruppe, som er selektiv for det katalytiske sted, der er essentielt for fibrinolytisk aktivitet, og som er i stand til at overføres fra gruppen B til det katalytiske sted, og B betegner en gruppe, som letter tilknytningen DK 158994 B af A til enzymet; E betegner en lokaliseringsgruppe, som lokaliserer midlet på det katalytiske sted, og F betegner en gruppe, som er i stand til at overføres fra lokaliseringsgruppen til det katalytiske sted, og derefter eventuelt isolerer de således dannede enzymderi-5 vater, med det forbehold, at den gruppe, der blokerer det katalytiske sted, ikke er en p-guanidinobenzoyl-gruppe.

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at plasminogenkomponenten er humant plasminogen.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 1 eller 2, kendetegnet ved, at pseudo-første ordenshastighedskonstanten er i området 10'-* til 10*^ sekund'^·.

4. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 1-3, kendetegnet ved, at den gruppe, der kan fjernes ved hydro- 15 lyse, er en acylgruppe.

5. Fremgangsmåde ifølge krav 4, kendetegnet ved, at acylgruppen er en benzoyl-, substitueret benzoyl-, acryloyl- eller substitueret acryloylgruppe.

5 Acylgruppe k3 (sekund-·1· ved pH-værdi 7,4, 37°C) Benzoyl 3,5 x 10'^ 2-toloyl 1,9 x 10-4 10 4-anisoyl 2,9 x 10-4 4-fluorbenzoyl 2,6 x 10"4 3,methyl-4-anisoyl 1,2 x 10-4 3,5,dimethyl-4-anisoyl 1,6 x 10-4 4-nitrobenzoyl ca. 2,3 x 10-^ 15 4-chlorbenzoyl 2,5 x 10" 3

6. Fremgangsmåde ifølge krav 5, 20 kendetegnet ved, at acylgruppen er en benzoylgruppe eller en substitueret benzoylgruppe med én eller flere meta- og/eller para-substituenter, hvor summen af Hammett-CTm- og -σρ-værdierne er i området fra +0,1 til -1,1.

7. Fremgangsmåde ifølge krav 6, 25 kendetegnet ved, at acylgruppen er benzoyl, som eventuelt er substitueret med halogen, g-alkyl, g-alkoxy, g-elkanoy1- oxy eller g-alkanoylamino.

8. Fremgangsmåde ifølge krav 5, kendetegnet ved, at acylgruppen er acryloyl, eventuelt 30 substitueret med g-alkyl, furyl, phenyl eller _ g -alkylphenyl. DK 158994 B

9. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 1-8, kendetegnet ved, at gruppen E er p-amidinophenoxy eller p-acetamidophenoxy.

10. Fremgangsmåde ifølge krav 9, 5 kendetegnet ved, at gruppen F er en eventuelt substitueret benzoylgruppe eller en eventuelt substitueret acryloylgruppe.

11. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 1-7 eller 9 - 10, kendetegnet ved, at der fremstilles et p-anisoyl strepto-10 kinase/plasminogen-kompleks.

12. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 1 - 11, kendetegnet ved, at der fremstilles et kompleks, hvori plasminogen er humant lys-plasminogen.